一种适应无血清培养基环境的WAYNE293LVPRO细胞及其应用的制作方法

一种适应无血清培养基环境的wayne293 lvpro细胞及其应用
技术领域：
1.本发明属于细胞领域，具体涉及一种适应无血清培养基环境、倍增时间短、细胞生长密度高，病毒包装效率高的wayne293 lvpro细胞及其应用。


背景技术：

2.随着细胞和基因治疗行业的发展，利用病毒载体对目的基因进行导入的方法以及成为人类治疗先天性遗传病、白血病、癌症等重大疾病的新的方向。
3.目前病毒载体的制备主要采用以hek293为宿主细胞，利用阳离子聚合物等化学试剂进行瞬时转染的方法进行。这是由于hek293相较于其他细胞来说，在瞬时转染的效率以及病毒包装产量都有一定的优势。但是目前大部分已经上市的基因和细胞治疗药物采用的仍然是贴壁培养，如在hke293细胞培养的过程中采用胎牛血清 基础培养基的方式。贴壁培养的在产业化的后期有着难以克服的困难，因为细胞的数量受制于培养瓶的表面积，故在大规模工业化生产的过程中想要对病毒载体的生产规模进行放大，投入的设备及人工将极大的增加病毒载体的制备成本，同时，由于贴壁培养的工艺目前仍需加入动物来源成分胎牛血清作为必须的细胞培养原料，这将会在基因和细胞治疗产品的安全性方面带来不可避免的风险。
4.另外，在现有的无血清悬浮培养hek293技术平台上，由于对后续的瞬时转染效率的追求，一般会减少甚至完全取消抗结团剂在培养基中的使用，而hek293细胞作为一种人胚肾细胞，在进行无血清悬浮培养的过程中又极易产生细胞结团的情况，从而极大的影响细胞活率，密度以及转染效率。
5.所以，找到一种可以在不含抗结团剂的无血清培养基中悬浮培养的hek293细胞，同时具有倍增时间短，生长密度高以及病毒包装效率高等特性的hek293细胞是对细胞及基因治疗领域进行工业化开发的重要支持。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的是提供一种可以在不含抗结团剂的无血清培养基中悬浮培养的hek293细胞，同时具有倍增时间短，生长密度高以及病毒包装效率高等特性的hek293细胞
‑
人胚胎肾细胞wayne 293。
7.本发明的人胚胎肾细胞wayne 293于2021年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为：cgmcc no.22348。
8.本发明的第二个目的是提供上述人胚胎肾细胞wayne 293作为宿主细胞在蛋白表达生长、病毒载体的表达生产或疫苗生产中的应用。
9.所述的蛋白可以为抗体。
10.本发明的第三个目的是提供上述人胚胎肾细胞wayne 293作为宿主细胞在制备细胞或基因治疗领域药物中的应用。
11.本发明的人胚胎肾细胞wayne 293可以在不含抗结团剂的无血清培养基中悬浮培养的hek293细胞，同时具有倍增时间短，生长密度高以及病毒包装效率高等特性，是对细胞及基因治疗领域进行工业化开发的重要支持。
12.人胚胎肾细胞wayne 293于2021年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为：cgmcc no.22348。
附图说明：
13.图1是本发明的wayne 293lvpro细胞的筛选流程；
14.图2是96孔板中的单克隆生长情况图；
15.图3是wayne 293lvpro细胞与hek293细胞的生长曲线；
16.图4是高通量系统筛选wayne 293单克隆细胞lv载体表达量；
17.图5是wayne 293lvpro细胞lv病毒表达产量，run1、2、3分别表示用同样的条件重复三次表达结果，证明该结果重复性好，稳定性高，结果可信；
18.图6是wayne293 lvpro细胞与原始hek293细胞病毒包装效率对比。
具体实施方式：
19.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
20.实施例1：
21.本发明的wayne 293lvpro细胞的筛选流程如图1所示，具体步骤如下：
22.1、对贴壁的hek293细胞(ecacc 85120602)在培养基(quacell cd02培养基，购自中山康天晟合生物科技有限公司)中进行无血清悬浮驯化，使得hek293细胞适应悬浮生长状态。
23.具体驯化方法如下：
24.a、细胞复苏
25.关键设备：摇床、生物安全柜
26.细胞复苏方法：将培养基置36.5～37.5℃水浴加热30～40min。取1支传代稳定的hek293细胞群体冻存管，迅速置于36.5～37.5℃水浴中，缓慢震荡使其完全融化；冻存管表面75％乙醇喷洒后传入已经紫外照射(≥30min)的生物安全柜内，吸取细胞液转移至50ml离心管中，加入5ml的培养基混匀，1000rpm条件下离心5min；弃去上清液，再吸取已水浴的dmem培养基(quacell) 10％(终浓度体积分数)的胎牛血清(quacell)共20ml加入离心管中，重悬细胞液；然后将细胞悬液转移至t75摇瓶中，摇匀后取样；转移至二氧化碳培养箱中静置培养，培养条件如表1所示。每天取样间隔控制在24小时
±
2小时之内，在细胞密度达到1
‑
2e6 cells/ml，活率大于90％的水平时进行细胞传代，传代密度为5e5 cells/ml。
27.表1
[0028][0029]
b、悬浮驯化(t75培养瓶培养)
[0030]
悬浮驯化(t75培养瓶培养)方法：将培养基置36.5～37.5℃水浴加热30～40min。取步骤a复苏的hek293细胞，吸取t75培养瓶中的20ml细胞液转移至50ml离心管中，加入5ml的驯化培养基混匀，1000rpm条件下离心5min；弃去上清液，再吸取已水浴的驯化培养基20ml加入离心管中，重悬细胞液；然后将细胞悬液转移至t75摇瓶中，摇匀后取样；转移至二氧化碳培养箱中静置培养，培养条件如表2。每天取样间隔控制在24小时
±
2小时之内，在细胞密度达到1
‑
2e6 cells/ml，活率大于90％的水平时进行细胞传代，传代密度为5e5cells/ml。所述的驯化培养基是cd02培养基(quacell) 10％(终浓度体积分数)的胎牛血清(quacell)，混合均匀。
[0031]
在传代过程中逐步减少培养基中血清的使用量，按照每次传代减少10％(血清含量的10％)的水平进行减血清驯化，直至培养基中血清含量为0时，下一次传代转移到quacell cd02培养基中进行悬浮培养，观察细胞状态，传代多次后活率保持在90％以上，驯化完成。由此得到适应悬浮生长的hek293细胞。
[0032]
表2
[0033][0034]
2、对悬浮生长的hek293细胞进行连续传代，使得hek293从开始的48小时倍增时间，缩短到26小时左右的倍增时间，同时最高细胞密度可以长到1
×
107cells/ml。
[0035]
具体步骤如下：
[0036]
a、125ml摇瓶培养
[0037]
125ml摇瓶培养方法：将悬浮生长的20ml密度为1*e6 cells/ml hek293细胞液转移至125ml细胞培养摇瓶中，添加wayne293培养基，使细胞液扩增至30ml摇匀取样，于摇床中培养，培养条件如表3，每天对细胞进行取样计数，记录细胞密度和活率数据，在细胞密度达到1
‑
2e6 cells/ml，活率大于90％的水平时进行细胞传代，传代密度为5e5 cells/ml。
[0038]
表3
[0039][0040][0041]
b.500ml摇瓶培养
[0042]
关键设备：摇床、生物安全柜
[0043]
500ml摇瓶培养方法：将125ml摇瓶中的30ml细胞液转移至500ml细胞培养摇瓶中，添加wayne293培养基，使细胞液扩增至120ml摇匀取样，于摇床中培养，培养条件见表4。每天对细胞进行取样计数，记录细胞密度和活率数据，在细胞密度达到1
‑
2e6 cells/ml的水平时进行细胞传代，传代密度为5e5 cells/ml。
[0044]
表4
[0045][0046]
c、摇瓶培养
[0047]
关键设备：摇床、生物安全柜
[0048]
方法：将500ml摇瓶中的120ml细胞液转移至1l细胞培养摇瓶中，添加wayne293培养基，使细胞液扩增至400ml摇匀取样，于摇床中培养，培养条件见表5，每天对细胞进行取样计数，记录细胞密度和活率数据，在细胞密度达到1
‑
2e6 cells/ml的水平时进行细胞传代，传代密度为5e5 cells/ml。
[0049]
表5
[0050][0051]
由此获得悬浮的hek293细胞从开始的48小时倍增时间，缩短到26小时左右的倍增时间，同时最高细胞密度可以长到1
×
107cells/ml。
[0052]
d、分装冻存
[0053]
关键设备：生物安全柜、液氮罐、台式水平离心机、2
‑
8℃冰箱、
‑
20℃冰箱、
‑
80℃冰箱
[0054]
分装冻存方法：细胞培养结束后，加入胰蛋白酶
‑
edta消化，使细胞不再附着在培养瓶表面，收集细胞液，1000rpm条件下离心5min，弃去上清液，收集离心沉淀物，离心沉淀物用冻存液重悬，要求得到的重悬细胞密度达到1.3
×
107cells/ml
‑
1.8
×
107cells/ml(冻存液配方：90％新鲜wayne293培养基 10％dmso)。重悬液分装于冻存管中，每支1ml，贴上标签放入降温盒中按照公认的降温顺序降温。降温盒放置到
‑
80℃冰箱保持24小时左右。在
‑
80℃冰箱降温结束后置于液氮罐中保藏，双人双锁管理。
[0055]
3、对步骤2获得的hek293细胞用quacell公司的cd02培养基进行有限稀释，将细胞稀释到5cells/ml的密度。然后利用单细胞打印技术进行96孔板的单克隆铺板，并用细胞成像系统确定细胞的单克隆源性，可以得到3000个以上的hek293悬浮细胞单克隆细胞，这些单克隆细胞中的一些在96孔板中表现出了快速生长的特性，收集这些快速生长的hek293细胞(图2)。
[0056]
4、对步骤3收集的具有快速生长的hek293细胞利用高通量筛选系统对它们进行病毒包装效率测试，测试完后选取包装效率高的进行传代培养，传代培养后的hek293细胞再用高通量筛选系统对它们进行病毒包装效率测试，如此重复若干次。
[0057]
是用96孔深孔板对步骤3收集的具有快速生长的hek293细胞进行悬浮培养进行病毒包装效率测试，使用quacell公司的wayne293培养基进行传代培养并进行病毒包装效率测试。
[0058]
具体方法如下：
[0059]
a、病毒包装效率测试
[0060]
使用带gfp荧光蛋白标签的四质粒病毒包装系统(invitrogen公司virapower
tm lentiviral expression systems)按照1ug质粒：4ul pei比例对96孔深孔板中的1ml密度为1
‑
2e6 cells/ml hek293细胞进行瞬时转染，48小时后收集上清液，再将收集到的上清按照体积比1:10的比例加入到提前准备好的贴壁293t细胞中，利用上清中的慢病毒感染293t细胞，将慢病毒中的目的基因(gfp)导入到293t细胞中，再根据293t细胞中表达gfp绿色荧光蛋白的比例判断96孔深孔板中表达的病毒滴度水平(计算公式：tu/ml＝(f
×
ci/v)
×
d)，从而判断出96孔板中的单克隆细胞的病毒包装效率(图4)。
[0061]
b、传代培养为：
[0062]
125ml摇瓶传代培养
[0063]
关键设备：二氧化碳培养箱、生物安全柜
[0064]
125ml摇瓶培养方法：选取96孔板中病毒包装效率高的单克隆细胞的细胞液转移至125ml细胞培养摇瓶中，添加wayne293培养基，使细胞液扩增至30ml摇匀取样，于摇床中培养，培养条件见表6，在细胞密度达到1
‑
2e6 cells/ml的水平时进行细胞传代，传代密度为5e5cells/ml。
[0065]
表6
[0066][0067]
然后再结合细胞倍增时间、细胞生长最高密度，在其中筛选出倍增时间短、细胞生长密度高，病毒包装效率高的hek293悬浮细胞，命名为人胚胎肾细胞wayne 293，以下简写为：wayne 293lvpro细胞。
[0068]
5、本发明的wayne 293lvpro细胞和原始hek293细胞的性能比较
[0069]
a、本发明的wayne 293lvpro细胞和原始hek293细胞，在wayne293培养基中进行批培养，其细胞生长曲线如图3所示，其倍增时间为22
‑
24小时。
[0070]
批培养方法：
[0071]
关键设备：二氧化碳培养箱、生物安全柜
[0072]
批培养方法：将复苏的1ml密度为1e7cells/ml的细胞液转移至125ml细胞培养摇瓶中，添加wayne293培养基，使细胞液扩增至30ml摇匀取样，于摇床中培养，培养条件见表7，每天取样进行统计。
[0073]
表7
[0074][0075]
b、按照步骤4中的利用高通量筛选系统对wayne 293lvpro细胞和原始hek293细胞进行病毒包装效率测试，结果如图5和6所示，从图5和6可以看出，本发明的wayne 293lvpro细胞lv病毒包装效率远远大于原始的hek293细胞。
[0076]
将人胚胎肾细胞wayne 293于2021年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为：cgmcc no.22348。