1.本技术涉及生物医药领域，具体的涉及包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段和/或sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段的融合蛋白、组合物及其应用。
背景技术：
：：2.目前，控制新冠疫情的方式是实施检疫、隔离和保持物理距离。因此迫切需要针对covid-19的有效疫苗，以减轻与sars-cov-2感染相关的死亡率和发病率的巨大负担。3.sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。rbd作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。4.sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)为病毒s蛋白n端的一段序列，其可与宿主细胞的蛋白或糖蛋白结合，介导病毒入侵宿主细胞，故该段区域可能包含诱导中和抗体产生的表位。技术实现要素：5.本技术提供了一种包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段和/或sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段的融合蛋白、组合物及其应用，其具有下列性质的一种或多种：1)融合蛋白具有免疫原性；2)包含融合蛋白的covid-19亚单位疫苗免疫原性更强，能诱导产生更多的中和抗体。6.一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。7.在某些实施方式中，所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。8.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。9.在某些实施方式中，所述rbd与野生型sar-cov-2的rbd相比，在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。10.在某些实施方式中，所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。11.在某些实施方式中，所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。12.在某些实施方式中，所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。13.在某些实施方式中，所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。14.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。15.在某些实施方式中，所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。16.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。17.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述p2或其功能活性片段在框内融合。18.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。19.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。20.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。21.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。22.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。23.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。24.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。25.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。26.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。27.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72中任一项所示的氨基酸序列。28.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。29.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。30.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。31.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。32.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述乙肝表面抗原或其功能活性片段在框内融合。33.在某些实施方式中，所述的融合蛋白包含seqidno:1-17、80和86中任一项所示的氨基酸序列。34.另一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。35.在某些实施方式中，所述ntd源自sars-cov-2野生型或其突变体。36.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。37.在某些实施方式中，所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。38.在某些实施方式中，所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。39.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。40.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。41.在某些实施方式中，所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。42.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。43.在某些实施方式中，所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。44.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。45.在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段与所述p2或其功能活性片段在框内融合。46.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。47.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。48.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。49.在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。50.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。51.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。52.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。53.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。54.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。55.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72任一项所示的氨基酸序列。56.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。57.在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。58.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。59.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。60.在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段与所述乙肝表面抗原或其功能活性片段在框内融合。61.在某些实施方式中，所述的融合蛋白包含seqidno:20-36、81和87中任一项所示的氨基酸序列。62.另一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。63.在某些实施方式中，所述的融合蛋白还包括一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。64.在某些实施方式中，所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。65.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。66.在某些实施方式中，所述rbd与野生型sar-cov-2的rbd相比，在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。67.在某些实施方式中，所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。68.在某些实施方式中，所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。69.在某些实施方式中，所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。70.在某些实施方式中，所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。71.在某些实施方式中，所述ntd源自sars-cov-2野生型或其突变体。72.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。73.在某些实施方式中，所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。74.在某些实施方式中，所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。75.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。76.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。77.在某些实施方式中，所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。78.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。79.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段在框内融合。80.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。81.在某些实施方式中，所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。82.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。83.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。84.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性片段的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。85.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。86.在某些实施方式中，所述噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基包含seqidno:78所示的氨基酸序列。87.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。88.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。89.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。90.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。91.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段的n端与所述p2或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述p2或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性的c端直接或间接地相连。92.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。93.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。94.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。95.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。96.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。97.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72任一项所示的氨基酸序列。98.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。99.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。100.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。101.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。102.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。103.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。104.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。105.在某些实施方式中，所述的融合蛋白包含seqidno:39-44、79、85和96中任一项所示的氨基酸序列。106.另一方面，本技术提供了一种免疫原性组合物，其包含所述的融合蛋白。107.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含第一组分，所述第一组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含融合蛋白。108.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含第一组分，所述第一组分包含融合蛋白；以及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。109.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含第一组分，所述第一组分包含所述的融合蛋白；以及第二组分，所述第二组分包含所述的融合蛋白。110.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物，其按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。111.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物，其包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。112.另一方面，本技术提供了一种免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。113.在某些实施方式中，所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。114.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。115.在某些实施方式中，所述rbd与野生型sar-cov-2的rbd相比，在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。116.在某些实施方式中，所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。117.在某些实施方式中，所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。118.在某些实施方式中，所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。119.在某些实施方式中，所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。120.在某些实施方式中，所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。121.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。122.在某些实施方式中，所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。123.在某些实施方式中，所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。124.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。125.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。126.在某些实施方式中，所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。127.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物，其按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。128.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物，其包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。129.在某些实施方式中，所述rbd包含seqidno:18-19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。130.在某些实施方式中，所述ntd包含seqidno:37-38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。131.另一方面，本技术提供了一种药物组合物，其包含所述的融合蛋白，或所述的免疫原性组合物，及任选地药学上可接受的赋形剂。132.另一方面，本技术提供了一种所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。133.在某些实施方式中，所述疫苗用于预防和/或治疗covid-19。134.另一方面，本技术提供了一种所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物，用于治疗和/或预防covid-19。135.另一方面，本技术提供了一种制备covid-19亚单位疫苗的方法，其包括：136.1)提供所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物；以及137.2)使1)中所述融合蛋白或免疫原性组合物与药学上可接受的佐剂混合。138.另一方面，本技术提供了一种检测sars-cov-2中和抗体的方法，其包括：139.1)向受试者施用所述的covid-19亚单位疫苗；以及140.2)检测1)中所述受试者在接受所述covid-19亚单位疫苗后体内产生的中和抗体。141.另一方面，本技术提供了一种治疗和/或预防covid-19的方法，其包括向受试者施用所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物或所述的covid-19亚单位疫苗。142.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。附图说明143.本技术所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本技术所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：144.图1显示的是用sds-page电泳与wb验证rbd-p2-6*his蛋白的结果图。145.图2显示的是用sds-page电泳与wb验证ntd-p2-6*his(gp101150-8)蛋白的结果图。146.图3显示的是用sds-page电泳与wb验证ntd-rbd-foldon-8*his蛋白的结果图。147.图4显示的是ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株)测序结果氨基酸序列比对。148.图5显示的是ntd-rbd-foldon(gamma突变株)蛋白的尺寸排阻层析图谱。149.图6显示的是sds-page电泳与westernblot验证ntd-rbd-foldon(gamma突变株)蛋白结果图。150.图7显示的是ntd-rbd-foldon-6×his(beta突变株)测序结果氨基酸序列比对。151.图8显示的是ntd-rbd-foldon(beta突变株)蛋白的尺寸排阻层析图谱。152.图9显示的是sds-page电泳与westernblot验证ntd-rbd-foldon(beta突变株)蛋白结果图。具体实施方式153.以下由特定的具体实施例说明本技术发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本技术发明的其他优点及效果。154.术语定义155.在本技术中，术语“融合蛋白”通常是指通过基因工程技术得到的具有生物学功能活性的蛋白分子。在本技术中，所述融合蛋白可以是rbd或其功能活性片段与下列任一序列组成的融合蛋白：p2或其功能活性片段、foldon结构域或其功能活性片段、铁蛋白或其功能活性片段、乙肝表面抗原hbsag或其功能活性片段。在本技术中，融合蛋白可以是ntd或其功能活性片段与下列任一序列组成的融合蛋白：p2或其功能活性片段、foldon结构域或其功能活性片段、铁蛋白或其功能活性片段、乙肝表面抗原hbsag或其功能活性片段。在本技术中，融合蛋白可以是ntd或其功能活性片段和rbd或其功能活性片段组成的融合蛋白。在本技术中，融合蛋白可以是ntd或其功能活性片段、rbd或其功能活性片段与下列任一片段组成的融合蛋白：p2或其功能活性片段、foldon结构域或其功能活性片段、铁蛋白或其功能活性片段、乙肝表面抗原hbsag或其功能活性片段。156.gisaid将毒株hcov-19/wuhan/wiv04/2019(wiv04)的全基因组序列(epi_isl_402124)做为正式的参考序列。一般将wiv04毒株定义为野生株或原始株。在本技术中，术语“sars-cov-2野生型”通常指wiv04毒株。157.在本技术中，术语“p2”通常是指破伤风毒素的表位肽。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。158.在本技术中，术语“foldon结构域”通常是指在噬菌体t4纤维蛋白的c末端的残基。在本技术中，foldon结构域可以是噬菌体t4纤维蛋白的c末端的27个残基或突变体。在本技术中，foldon结构域可以是噬菌体t4纤维蛋白的c末端的27个残基截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。159.在本技术中，术语“铁蛋白”、“ferritin”通常是指粉纹夜蛾铁蛋白或幽门螺旋杆菌铁蛋白。在本技术中，粉纹夜蛾铁蛋白具有重链和轻链(ferritinlc和ferritinhc)。在本技术中，幽门螺旋杆菌铁蛋白具有单链结构。在本技术中，铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的轻链”、“lc”可以与“ferritinlc”互换使用。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的重链”、“hc”可以与“ferritinhc”互换使用。160.在本技术中，术语“乙肝表面抗原(hbsag)”通常是指乙肝病毒最外层包膜中的一种外壳蛋白。例如，乙肝表面抗原的氨基酸序列可以为ncbi中的蛋白序列检索号aaa45524、anj76941、caa24234或aac34729对应的序列，也可以适宜地截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸，或有蛋白的突变，例如缺失、置换或插入一个或多个氨基酸。161.在本技术中，术语“功能活性片段”通常是指与rbd、ntd、p2、foldon结构域、铁蛋白、乙肝表面抗原hbsag具有相似生物学活性的片段。162.在本技术中，术语“免疫原性组合物”通常是指一种亚单位组合物。在本技术中，亚单位组合物是在将组分混合形成抗原性组合物之前，其中组分已经被分离并纯化到至少50％、至少60％、70％、80％、90％纯度的组合物。例如，亚单位组合物可以是水溶性蛋白的水溶液。例如，所述亚单位组合物可包含洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含非-离子、两性离子或离子洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含脂类。在一些情形中，免疫原性组合物可包括rbd或其功能活性片段和ntd或其功能活性片段。在一些情形中，免疫原性组合物可包括rbd或其功能活性片段和包含ntd或其功能活性片段的融合蛋白。在一些情形中，免疫原性组合物可包括包含rbd或其功能活性片段的融合蛋白和ntd或其功能活性片段。在一些情形中，免疫原性组合物可包括包含rbd或其功能活性片段的融合蛋白和包含ntd或其功能活性片段的融合蛋白。在本技术中，所述免疫原性组合物还可包括佐剂。例如，所述的佐剂可以包括铝盐(例如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝)，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。例如，所述的免疫原性组合物还可以选择为th1型应答优先诱导物。例如，th1型应答优先诱导物可以包括单磷酰脂质a或其衍生物。例如，所述佐剂可以是单磷酰脂质a(例如，3-脱-o-酰化单磷酰脂质a(3d-mpl))和铝盐的组合。一种佐剂增强系统可以包括单磷酰脂质a和皂苷衍生物的组合，特别是wo94/00153公开的qs21和3d-mpl的组合，或者如wo96/33739公开的用胆固醇将qs21猝灭从而使反应原性较弱的一种组合物。例如，所述佐剂还可以是wo95/17210中所述的佐剂，其在水包油乳剂中含有qs21、3d-mpl和生育酚。例如，所述佐剂可以是吐温80、山梨糖醇三油酸酯和角鲨烯混合后于高压条件下进行微流化形成的均一小滴状乳液。例如，所述佐剂可包含寡核苷酸的未甲基化cpg(wo96/02555)。163.在本技术中，术语“重量份”通常是指免疫原性组合物的第一组分和第二组分的重量比。在本技术中，免疫原性组合物每剂量可含有如下成份：第一组分5-60μg和第二组分5-60μg。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第一组分。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第二组分。164.在本技术中，术语“rbd”是指sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域。在本技术中，所述rbd可为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)310-560氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以截短n端或c端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本技术中，所述rbd可为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)319-541氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短n端或c端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本技术中，所述rbd可为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)331-524氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短n端或c端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。165.在某些实施方式中，所述rbd可以包含sars-cov-2(gamma突变体)的rbd。166.在某些实施方式中，所述rbd可以包含sars-cov-2(beta突变体)的rbd。167.在某些实施方式中，所述rbd可以包含sars-cov-2(wuhan-1)的rbd。168.在本技术中，术语“ntd”即sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端的结构域。在本技术中，所述ntd可以为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)13-353氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短n端或c端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。例如，所述ntd可以为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)13-303氨基酸之间的肽段或其突变体。在本技术中，所述ntd可以为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)14-304氨基酸之间的肽段或其突变体。在本技术中，所述ntd可以为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)18-353氨基酸之间的肽段或其突变体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，所述ntd可以包含sars-cov-2(gamma突变体)的ntd。在某些实施方式中，所述ntd可以包含sars-cov-2(beta突变体)的ntd。在某些实施方式中，所述ntd可以包含sars-cov-2(wuhan-1)的ntd。169.在本技术中，术语“s蛋白”，也称为“spike蛋白”或“刺突蛋白”，通常是指冠状病毒的衣壳表面糖蛋白。sars-cov-2通过s蛋白与ace2受体结合并侵入细胞。s蛋白由1213个氨基酸组成，含有一个跨膜区，包含来自冠状病毒的衣壳表面糖蛋白从n端起或从第14位氨基酸起至少到1213氨基酸片段，或者来自其它sars病毒的相应区域。s1蛋白是s蛋白的亚单位1，主要指从n端或第14位氨基酸起到第685氨基酸片段。170.在本技术中，所述突变体可以包含目前已知的任意一种或几种sar-cov-2突变株(突变体)。例如，所述gamma突变株可以参考genbank登录号为qrn46961.1的b.1.1.28谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述gamma突变株可以参考genbank登录号为qlf80256.1的b.1.1.28谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述gamma突变株可以参考genbank登录号为qve55289.1的p.1谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述gamma突变株可以为gamma突变株501y.v3，其表面糖蛋白氨基酸序列可以如seqidno:88所示。171.例如，所述beta突变株可以参考genbank登录号为qua12570.1的b.1.351谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述beta突变株可以参考genbank登录号为qiz15537.1的b.1谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述beta突变株可以参考genbank登录号为qvi03430.1的b.1.351谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述beta突变株可以为501y.v2beta突变株，其表面糖蛋白氨基酸序列如seqidno:82所示。172.在本文中所使用的术语“血凝素/血凝素蛋白/ha”通常是指可使红血球凝集的抗体或其他物质，在流感病毒、麻疹病毒(以及许多其他细菌和病毒)表面等均能找到，可附着于不同动物的红血球，而使红血球凝集，严重时可致死。在本文中是指流感病毒的表面糖蛋白hemagglutinin(ha)。每年who官网均会公布当年流感序列的预测，本文参考的是2021-2022年度的北半球的流感序列，即gisaid官网可查询的流感病毒a型(h1n1)epi1661231|ha|a/wisconsin/588/2019|epi_isl_404460，a型(h3n2)epi1843589|ha|a/cambodia/e0826360/2020|epi_isl_944639，b型epi1394970|ha|b/washington/02/2019|epi_isl_347829和b型epi529345|ha|b/phuket/3073/2013|epi_isl_161843。173.在本技术中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。174.在本技术中，术语“左右”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。175.在本技术中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将dna或rna插入细胞中的载体、主要用于复制dna或rna的载体，以及主要用于dna或rna的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。176.在本技术中，术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本技术所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本技术所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本技术所述的融合蛋白即可。所述宿主细胞可以通过使用本技术所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如cos细胞，中国仓鼠卵巢(cho)细胞，hela细胞，hek293细胞，cos-1细胞，ns0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是cho细胞。177.发明详述178.融合蛋白179.一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。180.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的rbd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以在k417、l452、t478、e484和n501中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。181.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417t、l452r、t478k、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。例如，所述rbd可以包含seqidno:83所示的氨基酸序列。在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含beta突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417n、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。例如，所述rbd可以包含seqidno:76所示的氨基酸序列。182.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以包含破伤风毒素的表位肽。183.例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。例如，所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。184.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。185.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可与所述rbd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。186.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。187.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可与所述p2或其功能活性片段在框内融合。188.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。189.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个氨基酸残基或突变体。在本技术中，foldon结构域可以是噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个残基截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。190.例如，所述foldon结构域或其功能活性片段可以包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。191.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。192.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端直接或间接相连。193.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。194.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。195.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。196.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段可包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。197.在本技术中，铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的轻链”、“lc”可以与“ferritinlc”互换使用。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的重链”、“hc”可以与“ferritinhc”互换使用。在本技术中，“幽门螺杆菌铁蛋白”可以与“hpferritin”互换使用。198.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链可包含seqidno:70所示的氨基酸序列。199.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链可包含seqidno:71所示的氨基酸序列。200.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。201.在本技术中，所述幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段可包含seqidno:72所示的氨基酸序列。202.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含seqidno:70-72中任一项所示的氨基酸序列。203.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。204.例如，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。205.例如，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。206.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。207.在本技术中，术语“乙肝表面抗原(hbsag)”通常是指乙肝病毒最外层包膜中的一种外壳蛋白。例如，乙肝表面抗原的氨基酸序列可以为ncbi中的蛋白序列检索号aaa45524、anj76941、caa24234或aac34729对应的序列，也可以适宜地截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸，或有蛋白的突变，例如缺失、置换或插入一个或多个氨基酸。208.例如，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可包含seqidno:73所示的氨基酸序列。209.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。210.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。211.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。212.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以与所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段在框内融合。213.在本技术中，所述“直接或间接相连”通常是指两段序列直接相连和间接相连这两种不同的连接方式，其中的直接相连是指两段序列之间的连接没有任何人为添加的其余序列，如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等的参与。间接相连则是指两段序列是通过人为添加连接序列，例如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等手段实现的两段序列的连接方式。在某些实施方式中，所述柔性linker可以包含gsgsg(seqidno:89)的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述连接序列可以包含sftvekgiyqtsnf(seqidno:90)的氨基酸序列。214.在本技术中，所述融合蛋白还可以包含信号肽。在某些实施方式中，可以在所述融合蛋白的n段添加mgwsciilflvatatgvhs(seqidno:91)的信号肽序列。215.在本技术中，所述的融合蛋白可包含seqidno:1-17、80和86中任一项所示的氨基酸序列。216.另一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。217.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的ntd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以在l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i中的一个或多个氨基酸突变。218.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd可以包含l18f、t20n、p26s、d138y和r190s氨基酸突变。例如，所述ntd可以包含seqidno：84所示的氨基酸序列。219.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含例如beta突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。在某些实施方式中，所述ntd可以包含seqidno：77所示的氨基酸序列。220.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以包含破伤风毒素的表位肽。221.例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。例如，所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。222.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。223.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。224.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。225.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以与所述p2或其功能活性片段在框内融合。226.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。在某些实施方式中，所述噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基可以包含seqidno:78所示的氨基酸序列。227.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个氨基酸残基或突变体。在本技术中，foldon结构域可以是噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个残基截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。228.例如，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。229.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。230.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端直接或间接相连。231.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。232.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。233.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。234.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段可包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。235.在本技术中，铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的轻链”、“lc”可以与“ferritinlc”互换使用。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的重链”、“hc”可以与“ferritinhc”互换使用。在本技术中，“幽门螺杆菌铁蛋白”可以与“hpferritin”互换使用。236.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链可包含seqidno:70所示的氨基酸序列。237.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链可包含seqidno:71所示的氨基酸序列。238.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。239.在本技术中，所述幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段可包含seqidno:72所示的氨基酸序列。240.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含seqidno:70-72中任一项所示的氨基酸序列。241.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。242.例如，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。243.例如，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。244.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。245.在本技术中，术语“乙肝表面抗原(hbsag)”通常是指乙肝病毒最外层包膜中的一种外壳蛋白。例如，乙肝表面抗原的氨基酸序列可以为ncbi中的蛋白序列检索号aaa45524、anj76941、caa24234或aac34729对应的序列，也可以适宜地截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸，或有蛋白的突变，例如缺失、置换或插入一个或多个氨基酸。246.例如，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可包含seqidno:73所示的氨基酸序列。247.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。248.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。249.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。250.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以与所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段在框内融合。251.在本技术中，所述“直接或间接相连”通常是指两段序列直接相连和间接相连这两种不同的连接方式，其中的直接相连是指两段序列之间的连接没有任何人为添加的其余序列，如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等的参与。间接相连则是指两段序列是通过人为添加连接序列，例如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等手段实现的两段序列的连接方式。在某些实施方式中，所述柔性linker可以包含gsgsg(seqidno:89)的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述连接序列可以包含sftvekgiyqtsnf(seqidno:90)的氨基酸序列。252.在本技术中，所述融合蛋白还可以包含信号肽。在某些实施方式中，可以在所述融合蛋白的n段添加mgwsciilflvatatgvhs(seqidno:91)的信号肽序列。253.在本技术中，所述的融合蛋白可包含seqidno:20-36、81和87中任一项所示的氨基酸序列。254.另一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。255.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的rbd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以在k417、l452、t478、e484、和n501中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。256.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417t、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。例如，所述rbd可以包含seqidno：83所示的氨基酸序列。在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含beta突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417n、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。例如，所述rbd可以包含seqidno：76所示的氨基酸序列。257.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的ntd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以在l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i中的一个或多个氨基酸突变。258.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd可以包含l18f、t20n、p26s、d138y和r190s氨基酸突变。例如，所述ntd可以包含seqidno：84所示的氨基酸序列。259.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含beta突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。例如，所述ntd可以包含seqidno：77所示的氨基酸序列。260.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。261.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地连接。262.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段的c端与所述ntd或其功能活性片段的n端直接或间接地连接。263.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段在框内融合。264.在本技术中，所述的融合蛋白还可以包括一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。265.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可包含破伤风毒素的表位肽。266.例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。267.例如，所述破伤风毒素的表位肽可包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。268.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。269.例如，所述rbd或其功能活性片段的n端可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地连接，且所述p2或其功能活性片段的n端可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地连接。270.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段和所述ntd或其功能活性片段在框内融合。271.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。在某些实施方式中，所述噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基包含seqidno:78所示的氨基酸序列。272.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个氨基酸残基或突变体。在本技术中，foldon结构域可以是噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个残基截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。273.例如，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。274.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。275.例如，所述foldon结构域或其功能活性片段的n端可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。276.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和所述ntd或其功能活性片段在框内融合。277.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段的n端与所述p2或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述p2或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性的c端直接或间接地相连。278.在本技术中，所述p2或其功能活性片段、foldon结构域或其功能活性片段、所述rbd或其功能活性片段和所述ntd或其功能活性片段在框内融合。279.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。280.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。281.在本技术中，铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的轻链”、“lc”可以与“ferritinlc”互换使用。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的重链”、“hc”可以与“ferritinhc”互换使用。在本技术中，“幽门螺杆菌铁蛋白”可以与“hpferritin”互换使用。282.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链可包含seqidno:70所示的氨基酸序列。283.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链可包含seqidno:71所示的氨基酸序列。284.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。285.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含seqidno:70-72任一项所示的氨基酸序列。286.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。287.例如，所述铁蛋白或其功能活性片段的n端可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。288.例如，所述幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段的n端可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。289.在本技术中，所述幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段和所述ntd或其功能活性片段在框内融合。290.在本技术中，术语“乙肝表面抗原(hbsag)”通常是指乙肝病毒最外层包膜中的一种外壳蛋白。例如，乙肝表面抗原的氨基酸序列可以为ncbi中的蛋白序列检索号aaa45524、anj76941、caa24234或aac34729对应的序列，也可以适宜地截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸，或有蛋白的突变，例如缺失、置换或插入一个或多个氨基酸。291.在本技术中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段可包含seqidno:73所示的氨基酸序列。292.在本技术中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。293.在本技术中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段的n端可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。294.在本技术中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和所述ntd或其功能活性片段在框内融合。295.在本技术中，所述“直接或间接相连”通常是指两段序列直接相连和间接相连这两种不同的连接方式，其中的直接相连是指两段序列之间的连接没有任何人为添加的其余序列，如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等的参与。间接相连则是指两段序列是通过人为添加连接序列，例如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等手段实现的两段序列的连接方式。在某些实施方式中，所述柔性linker可以包含gsgsg(seqidno:89)的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述连接序列可以包含sftvekgiyqtsnf(seqidno:90)的氨基酸序列。296.在本技术中，所述融合蛋白还可以包含信号肽。在某些实施方式中，可以在所述融合蛋白的n段添加mgwsciilflvatatgvhs(seqidno:91)的信号肽序列。297.在本技术中，所述的融合蛋白包含seqidno:39-44、79、85和96中任一项所示的氨基酸序列。298.免疫原性组合物299.另一方面，本技术提供了一种免疫原性组合物，其包含所述的融合蛋白。300.在本技术中，术语“免疫原性组合物”通常是指一种亚单位组合物。在本技术中，亚单位组合物是在将组分混合形成抗原性组合物之前，其中组分已经被分离并纯化到至少50％、至少60％、70％、80％、90％纯度的组合物。例如，亚单位组合物可以是水溶性蛋白的水溶液。例如，所述亚单位组合物可包含洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含非-离子、两性离子或离子洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含脂类。在一些情形中，免疫原性组合物可包括rbd或其功能活性片段和ntd或其功能活性片段。在一些情形中，免疫原性组合物可包括rbd或其功能活性片段和包含ntd或其功能活性片段的融合蛋白。在一些情形中，免疫原性组合物可包括包含rbd或其功能活性片段的融合蛋白和ntd或其功能活性片段。在一些情形中，免疫原性组合物可包括包含rbd或其功能活性片段的融合蛋白和包含ntd或其功能活性片段的融合蛋白。在一些情形中，所述免疫原性组合物还可以包含一种或几种人流感病毒血凝素蛋白ha。在本技术中，所述ha可以包含seqidno:92-95中任一项所述的氨基酸序列。301.在某些实施方式中，所述的流感血凝素选自的流感毒株为每一年在who官网上公布的流行毒株，例如2021年who官网公布的流行毒株指的是a型(h1n1)epi1661231|ha|a/wisconsin/588/2019|epi_isl_404460，a型(h3n2)epi1843589|ha|a/cambodia/e0826360/2020|epi_isl_944639，b型epi1394970|ha|b/washington/02/2019|epi_isl_347829和b型epi529345|ha|b/phuket/3073/2013|epi_isl_161843。在一个实施方式中制备预防流感和新冠病毒疫苗组合物包括上述各型别ha蛋白50ug及突变的ntd-rbd-foldon蛋白50μg及疫苗组合中常用的佐剂，例如as03佐剂。302.例如，所述免疫原性组合物可以包含第一组分和第二组分，所述第一组分可以包含本技术所述的rbd或其功能活性片段及ntd或其功能活性片段的融合蛋白，所述融合蛋白还可以包含一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段；所述第二组分可以包含所述rbd或其功能活性片段，所述ntd或其功能活性片段，或任选地一种或几种人流感病毒血凝素蛋白ha。303.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的rbd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以在k417、l452、t478、e484和n501中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。304.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417t、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。例如，所述rbd可以包含seqidno:83所示的氨基酸序列。在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含beta突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417n、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。在某些实施方式中，所述rbd可以包含seqidno:76所示的氨基酸序列。305.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的ntd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以在l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i中的一个或多个氨基酸突变。306.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd可以包含l18f、t20n、p26s、d138y和r190s氨基酸突变。例如，所述ntd可以包含seqidno:84所示的氨基酸序列。307.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含beta突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。例如，所述ntd可以包含seqidno:77所示的氨基酸序列。308.在本技术中，所述免疫原性组合物还可包括佐剂。例如，所述的佐剂可以包括铝盐(例如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝)，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。例如，所述的免疫原性组合物还可以选择为th1型应答优先诱导物。例如，th1型应答优先诱导物可以包括单磷酰脂质a或其衍生物。例如，所述佐剂可以是单磷酰脂质a(例如，3-脱-o-酰化单磷酰脂质a(3d-mpl))和铝盐的组合。一种佐剂增强系统可以包括单磷酰脂质a和皂苷衍生物的组合，特别是wo94/00153公开的qs21和3d-mpl的组合，或者如wo96/33739公开的用胆固醇将qs21猝灭从而使反应原性较弱的一种组合物。例如，所述佐剂还可以是wo95/17210中所述的佐剂，其在水包油乳剂中含有qs21、3d-mpl和生育酚。例如，所述佐剂可以是吐温80、山梨糖醇三油酸酯和角鲨烯混合后于高压条件下进行微流化形成的均一小滴状乳液。例如，所述佐剂可包含寡核苷酸的未甲基化cpg(wo96/02555)。309.在本技术中，所述的免疫原性组合物包含第一组分，所述第一组分包含所述的融合蛋白；以及第二组分，所述第二组分包含所述的融合蛋白。310.在本技术中，所述的免疫原性组合物，其可按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。311.在本技术中，所述的免疫原性组合物，其可包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。312.在本技术中，术语“重量份”通常是指免疫原性组合物的第一组分和第二组分的重量比。在本技术中，免疫原性组合物每剂量可含有如下成份：第一组分5-60μg和第二组分5-60μg。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第一组分。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第二组分。313.另一方面，本技术提供了一种免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。314.在本技术中，所述的免疫原性组合物，其可按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。315.在本技术中，所述的免疫原性组合物，其可包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。316.在本技术中，所述rbd可包含seqidno:18-19中任一项所示的氨基酸序列。317.在本技术中，所述ntd包含seqidno:37-38中任一项所示的氨基酸序列。318.在本技术中，术语“重量份”通常是指免疫原性组合物的第一组分和第二组分的重量比。在本技术中，免疫原性组合物每剂量可含有如下成份：第一组分5-60μg和第二组分5-60μg。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第一组分。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第二组分。319.在一些情形中，所述免疫原性组合物可以包含第一组分ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg；以及第二组分ntd-foldon蛋白20～100μg，或rbd-foldon蛋白20～100μg，或流感病毒血凝素蛋白15～80μg。320.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含ntd-rbd-foldon(gamma突变株)蛋白20～100μg，ntd-foldon(gamma突变株)蛋白20～100μg，以及冻干保护剂，所述的冻干保护剂按照1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)的配方配制。321.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含ntd-rbd-foldon(gamma突变株)蛋白20～100μg，rbd-foldon(gamma突变株)蛋白20～100μg，以及冻干保护剂，所述的冻干保护剂按照1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)的配方配制。322.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含ntd-rbd-foldon(gamma突变株)蛋白20～100μg，流感病毒血凝素蛋白15～180μg，以及冻干保护剂，所述的冻干保护剂按照1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)的配方配制。323.另一方面，本发明提供了一种疫苗，其包含所述的融合蛋白，或所述的免疫原性组合物，及任选地药学上可接受的佐剂。324.在某些实施方式中，所述疫苗包含0.5ml的融合蛋白或免疫原性组合物，及0.5ml任选地药学上可接受的佐剂。325.本发明所述的佐剂选自角鲨烯、mf59、as03、单磷脂酰脂质a、鞭毛蛋白、cpg-odn、胞壁酰二肽、以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。这些佐剂均是本领域所熟知并可通过若干商业渠道获得的。326.在某些实施方式中，所述佐剂是氢氧化铝佐剂。327.在某些实施方式中，所述佐剂是mf59佐剂。328.在某些实施方式中，所述佐剂优选地是as03佐剂。329.所述as03佐剂的成分包括10.69mg的角鲨烯、11.86mg的α-生育酚、4.86mg的聚山梨酯80、3.53mg的氯化钠、0.09mg的氯化钾、0.51mg的磷酸氢二钠、0.09mg的磷酸二氢钾。330.所述mf59佐剂的成分包括4.5％的角鲨烯，0.5％tween80，0.5％span85。331.在某些实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及as03佐剂。332.在某些实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg，h1n1毒株的ha15～45μg，h3n2毒株的ha15～45μg，和b/washington/02/2019毒株的ha15～45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及as03佐剂。333.在某些实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg，h1n1毒株的ha15～45μg，h3n2毒株的ha15～45μg，b/washington/02/2019毒株的ha15～45μg，和b/phuket/3073/2013毒株的ha15～45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及as03佐剂。334.在某些实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg，h1n1毒株的ha15～45μg，h3n2毒株的ha15～45μg，和b/washington/02/2019毒株的ha15～45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及mf59佐剂。335.在某些实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg，h1n1毒株的ha15～45μg，h3n2毒株的ha15～45μg，b/washington/02/2019毒株的ha15～45μg，和b/phuket/3073/2013毒株的ha15～45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及mf59佐剂。336.在某些优选的实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白50μg，h1n1毒株的ha45μg，h3n2毒株的ha45μg，b/washington/02/2019毒株的ha45μg，和b/phuket/3073/2013毒株的ha45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及as03佐剂。337.在某些优选的实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白50μg，h1n1毒株的ha45μg，h3n2毒株的ha45μg，b/washington/02/2019毒株的ha45μg，和b/phuket/3073/2013毒株的ha45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及mf59佐剂。338.在本技术中，所述rbd-ntd-foldon(beta突变株)可以包含seqidno:79所示的氨基酸序列。在本技术中，所述rbd-ntd-foldon(gamma突变株)可以包含seqidno:85所示的氨基酸序列。在本技术中，所述rbd-ntd-foldon(wuhan-1)可以包含seqidno:96所示的氨基酸序列。339.在本技术中，所述免疫原性组合物还可以包含一种或几种人流感病毒血凝素蛋白ha。在本技术中，所述ha可以包含seqidno:92-95中任一项所述的氨基酸序列。340.在本技术中，所述rbd还可以包含seqidno:97-108中任一项所示的氨基酸序列。341.在本技术中，所述ntd还可以包含seqidno:109-111中任一项所示的氨基酸序列。342.核酸分子、药物组合物、应用343.另一方面，本技术还提供了一种或多种分离的核酸分子，其可以编码本技术所述的融合蛋白。在某些实施方式中，所述核酸分子可以包含mrna。344.另一方面，本技术提供了一种药物组合物，其包含所述的融合蛋白，或所述的免疫原性组合物，及任选地药学上可接受的赋形剂。345.所述药学上可接受的载体可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。346.在本技术中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。347.所述药物组合物可以用于抑制或延缓疾病或病症的发展或进展，和/或可以减轻和/或稳定疾病或病症的状态。348.本技术所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述融合蛋白、或所述的免疫原性组合物。349.所述预防和/或治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的疾病或病症和/或其任何并发症而所需的剂量。350.在本技术中，术语“有效量”通常是指可以缓解或者消除受试者的疾病或症状，或者可以预防性地抑制或防止疾病或症状发生的药物的量。通常，可根据受试者的体重、年龄、性别、饮食、排泄速率、过往病史、现用治疗、给药时间、剂型、给药方法、给药途径、药物组合、所述受试者的健康状况和交叉感染的潜力、过敏、超敏和副作用、和/或上皮(或内皮)组织疾病发展的程度等来确定具体的有效量。本领域技术人员(例如，医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求按比例降低或升高剂量。351.在本技术中，所述受试者可以包括人或非人动物。例如，所述非人动物可以选自下组：猴、鸡、鹅、猫、狗、小鼠和大鼠。此外，非人动物也可以包括任何除人以外的动物物种，例如家畜动物，或啮齿类动物，或灵长类动物，或家养动物，或家禽动物。所述人可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族，或各种种族的杂合体。又例如，所述人可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。352.可以根据在实验动物中的有效量推测在人类中的有效量。例如，freireich等人描述了动物和人的剂量的相互关系(基于每平方米身体表面的毫克数)(freireichetal.，cancerchemother.rep.50，219(1966))。身体表面积可以从患者的身高和体重近似确定。参见例如scientifictables，geigypharmaceuticals，ardsley，n.y.，537(1970)。353.另一方面，本技术提供了一种所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。354.在本技术中，所述疫苗可用于预防和/或治疗covid-19。355.另一方面，本技术提供了一种所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物，用于治疗和/或预防covid-19。356.另一方面，本技术提供了一种制备covid-19亚单位疫苗的方法，其包括：357.1)提供所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物；以及358.2)使1)中所述融合蛋白或免疫原性组合物与药学上可接受的佐剂混合。359.另一方面，本技术提供了一种检测sars-cov-2中和抗体的方法，其包括：360.1)向受试者施用所述的covid-19亚单位疫苗；以及361.2)检测1)中所述受试者在接受所述covid-19亚单位疫苗后体内产生的中和抗体。362.另一方面，本技术提供了一种治疗和/或预防covid-19的方法，其包括向受试者施用所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物或所述的covid-19亚单位疫苗。363.本技术还涉及以下的具体实施方式：364.1.融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。365.2.根据实施方式1所述的融合蛋白，其中所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。366.3.根据实施方式2所述的融合蛋白，其中所述sar-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。367.4.根据实施方式1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd与野生型sars-cov-2的rbd相比，在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。368.5.根据实施方式1-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。369.6.根据实施方式1-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。370.7.根据实施方式1-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。371.8.根据实施方式1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。372.9.根据实施方式1-8任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。373.10.根据实施方式9所述的融合蛋白，其中所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。374.11.根据实施方式1-10任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。375.12.根据实施方式1-11任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述p2或其功能活性片段在框内融合。376.13.根据实施方式1-12任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。377.14.根据实施方式1-13任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。378.15.根据实施方式1-14任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。379.16.根据实施方式1-15任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。380.17.根据实施方式1-16任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。381.18.根据实施方式17所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。382.19.根据实施方式18所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。383.20.根据实施方式18-19任一项所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。384.21.根据实施方式1-20任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。385.22.根据实施方式1-21任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72中任一项所示的氨基酸序列。386.23.根据实施方式1-22任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。387.24.根据实施方式1-23任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。388.25.根据实施方式1-24任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。389.26.根据实施方式1-25任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。390.27.根据实施方式1-26任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述乙肝表面抗原或其功能活性片段在框内融合。391.28.根据实施方式11-27任一项所述的融合蛋白，其中所述直接或间接相连可以包含通过连接子相连。392.29.根据实施方式28所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含刚性接头，柔性接头或其他序列。393.30.根据实施方式28-29任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含seqidno:89-90中任一项所示的氨基酸序列。394.31.根据实施方式1-30任一项所述的融合蛋白，其包含seqidno:1-17、80和86中任一项所示的氨基酸序列。395.32.融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。396.33.根据实施方式32所述的融合蛋白，其中所述ntd源自sars-cov-2野生型或其突变体s蛋白的ntd。397.34.根据实施方式33所述的融合蛋白，其中所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。398.35.根据实施方式32-34中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。399.36.根据实施方式32-35中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。400.37.根据实施方式32-36中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。401.38.根据实施方式32-37中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r190s氨基酸突变。402.39.根据实施方式32-38中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。403.40.根据实施方式32-39中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。404.41.根据实施方式32-40任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。405.42.根据实施方式41所述的融合蛋白，其中所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。406.43.根据实施方式32-42任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。407.44.根据实施方式32-43任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd或其功能活性片段与所述p2或其功能活性片段在框内融合。408.45.根据实施方式32-44任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。409.46.根据实施方式32-45任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。410.47.根据实施方式32-46任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。411.48.根据实施方式32-47任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd或其功能活性片段与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。412.49.根据实施方式32-48任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。413.50.根据实施方式49所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。414.51.根据实施方式50所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。415.52.根据实施方式50-51任一项所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。416.53.根据实施方式32-52任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。417.54.根据实施方式32-53任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72任一项所示的氨基酸序列。418.55.根据实施方式32-54任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。419.56.根据实施方式32-55任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd或其功能活性片段与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。420.57.根据实施方式32-56任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。421.58.根据实施方式32-57任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。422.59.根据实施方式32-58任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd或其功能活性片段与所述乙肝表面抗原或其功能活性片段在框内融合。423.60.根据实施方式43-59任一项所述的融合蛋白，其中所述直接或间接相连可以包含通过连接子相连。424.61.根据实施方式60所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含刚性接头，柔性接头或其他序列。425.62.根据实施方式60-61任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含seqidno:89-90中任一项所示的氨基酸序列。426.63.根据实施方式32-62中任一项所述的融合蛋白，其包含seqidno:20-36、81和87中任一项所示的氨基酸序列。427.64.融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。428.65.根据实施方式64所述的融合蛋白，其中所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。429.66.根据实施方式65所述的融合蛋白，其中所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。430.67.根据实施方式64-66中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。431.68.根据实施方式64-67中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。432.69.根据实施方式64-68中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。433.70.根据实施方式64-69中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。434.71.根据实施方式64-70中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。435.72.根据实施方式64-71任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd源自sars-cov-2野生型或其突变体。436.73.根据实施方式72所述的融合蛋白，其中所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。437.74.根据实施方式64-73中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。438.75.根据实施方式64-74中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。439.76.根据实施方式64-75中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。440.77.根据实施方式64-76中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r190s氨基酸突变。441.78.根据实施方式64-77中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。442.79.根据实施方式64-78中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。443.80.根据实施方式64-79任一项所述的融合蛋白，其还包括一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。444.81.根据实施方式64-80任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。445.82.根据实施方式64-81任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段在框内融合。446.83.根据实施方式64-82任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。447.84.根据实施方式83所述的融合蛋白，其中所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。448.85.根据实施方式64-84任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。449.86.根据实施方式64-85任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。450.87.根据实施方式64-86任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性片段的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。451.88.根据实施方式64-87任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。452.89.根据实施方式64-88任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。453.90.根据实施方式64-89任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。454.91.根据实施方式64-90任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。455.92.根据实施方式64-91任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。456.93.根据实施方式64-92任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段的n端与所述p2或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述p2或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性的c端直接或间接地相连。457.94.根据实施方式64-93任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。458.95.根据实施方式94所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。459.96.根据实施方式95所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。460.97.根据实施方式95-96任一项所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。461.98.根据实施方式64-97任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。462.99.根据实施方式64-98任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72任一项所示的氨基酸序列。463.100.根据实施方式64-99任一项所述地融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。464.101.根据实施方式64-100任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。465.102.根据实施方式64-101任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。466.103.根据实施方式64-102任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。467.104.根据实施方式64-103任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。468.105.根据实施方式64-104任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。469.106.根据实施方式81-105任一项所述的融合蛋白，其中所述直接或间接相连可以包含通过连接子相连。470.107.根据实施方式106所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含刚性接头，柔性接头或其他序列。471.108.根据实施方式81-107所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含seqidno:89-90中任一项所示的氨基酸序列。472.109.根据实施方式64-108中任一项所述的融合蛋白，其包含seqidno:39-44、79、85和96中任一项所示的氨基酸序列。473.110.免疫原性组合物，其包含实施方式1-109中任一项所述的融合蛋白。474.111.根据实施方式110所述的免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含实施方式1-109中任一项所述的融合蛋白。475.112.根据实施方式110所述的免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含实施方式1-109中任一项所述的融合蛋白；以及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。476.113.根据实施方式110所述的免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含实施方式1-109中任一项所述的融合蛋白；以及第二组分，所述第二组分包含实施方式1-109中任一项所述的融合蛋白。477.114.根据实施方式110-113任一项所述的免疫原性组合物，其按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。478.115.根据实施方式110-114任一项所述的免疫原性组合物，其包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。479.116.免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。480.117.根据实施方式116所述的免疫原性组合物，其中所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。481.118.根据实施方式117所述的免疫原性组合物，其中所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。482.119.根据实施方式116-118中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。483.120.根据实施方式116-119中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。484.121.根据实施方式116-120中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。485.122.根据实施方式116-121中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。486.123.根据实施方式116-122中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。487.124.根据实施方式116-123任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd源自sars-cov-2野生型或其突变体。488.125.根据实施方式124所述的免疫原性组合物，其中所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。489.126.根据实施方式116-125中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。490.127.根据实施方式116-126中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。491.128.根据实施方式116-127中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。492.129.根据实施方式116-128中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r190s氨基酸突变。493.130.根据实施方式116-129中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。494.131.根据实施方式116-130中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。495.132.根据实施方式116-131任一项所述的免疫原性组合物，其按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。496.133.根据实施方式111-132任一项所述的免疫原性组合物，其包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。497.134.根据实施方式116-133任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd包含seqidno:18-19中任一项所示的氨基酸序列。498.135.根据实施方式116-134任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含seqidno:37-38中任一项所示的氨基酸序列。499.136.一种或多种分离的核酸分子，其编码权利要求1-109中任一项所述的融合蛋白。500.137.根据权利要求136所述的核酸分子，其包含mrna。501.138.药物组合物，其包含实施方式1-109任一项所述的融合蛋白，或实施方式110-135中任一项所述的免疫原性组合物，或实施方式136-137中任一项所述的核酸分子，及任选地药学上可接受的赋形剂。502.139.实施方式1-109任一项所述的融合蛋白或实施方式110-135任一项所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。503.140.根据实施方式139所述的用途，其中所述疫苗用于预防和/或治疗covid-19。504.141.实施方式1-109任一项所述的融合蛋白，或实施方式110-135任一项所述的免疫原性组合物，或实施方式136-137中任一项所述的核酸分子，用于治疗和/或预防covid-19。505.142.一种制备covid-19亚单位疫苗的方法，其包括：506.1)提供实施方式1-109任一项所述的融合蛋白或实施方式110-135任一项所述的免疫原性组合物；以及507.2)使1)中所述融合蛋白或免疫原性组合物与药学上可接受的佐剂混合。508.143.一种检测sars-cov-2中和抗体的方法，其包括：509.1)向受试者施用实施方式142所述的covid-19亚单位疫苗；以及510.2)检测1)中所述受试者在接受所述covid-19亚单位疫苗后体内产生的中和抗体。511.144.一种治疗和/或预防covid-19的方法，其包括向受试者施用实施方式1-109任一项所述的融合蛋白，或实施方式110-135任一项所述的免疫原性组合物，或实施方式136-137中任一项所述的核酸分子，或实施方式142所述的covid-19亚单位疫苗。512.本技术还提供了以下实施方案：513.1.融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。514.2.根据实施方案1所述的融合蛋白，其中所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。515.3.根据实施方案2所述的融合蛋白，其中所述sar-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。516.4.根据实施方案1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd与野生型sars-cov-2的rbd相比，在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。517.5.根据实施方案1-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。518.6.根据实施方案1-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。519.7.根据实施方案1-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。520.8.根据实施方案1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。521.9.根据实施方案1-8中任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。522.10.根据实施方案1-9中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述多肽在框内融合。523.11.根据实施方案1-10中任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。524.12.根据实施方案11所述的融合蛋白，其中所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。525.13.根据实施方案1-12中任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。526.14.根据实施方案1-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。527.15.根据实施方案1-14中任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白、幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。528.16.根据实施方案15所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。529.17.根据实施方案16所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。530.18.根据实施方案1-17中任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72中任一项所示的氨基酸序列。531.19.根据实施方案1-18中任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。532.20.根据实施方案9-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述直接或间接相连包含通过连接子相连。533.21.根据实施方案20所述的融合蛋白，其中所述连接子包含刚性接头，柔性接头或其他序列。534.22.根据实施方案20-21中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子包含seqidno:89-90中任一项所示的氨基酸序列。535.23.根据实施方案1-22中任一项所述的融合蛋白，其包含seqidno:1-17、80和86中任一项所示的氨基酸序列。536.24.免疫原性组合物，其包含实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白。537.25.根据实施方案24所述的免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含权利1-23中任一项所述的融合蛋白，及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。538.26.根据实施方案25所述的免疫原性组合物，其按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。539.27.根据实施方案25-26中任一项所述的免疫原性组合物，其包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。540.28.根据实施方案24-27中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含至少一种人流感病毒血凝素蛋白ha。541.29.根据实施方案28所述的免疫原性组合物，其中所述ha包含seqidno:92-95中任一项所述的氨基酸序列。542.30.一种或多种分离的核酸分子，其编码实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白。543.31.根据实施方案30所述的核酸分子，其包含mrna。544.32.药物组合物，其包含实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白，实施方案24-29中任一项所述的免疫原性组合物，或实施方案30-31中任一项所述的核酸分子，及任选地药学上可接受的赋形剂。545.33.实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白、实施方案24-29中任一项所述的免疫原性组合物、实施方案30-31中任一项所述的核酸分子、或实施方案30所述的药物组合物在制备疫苗中的用途。546.34.根据实施方案33所述的用途，其中所述疫苗用于预防和/或治疗covid-19。547.35.一种制备covid-19亚单位疫苗的方法，其包括：548.36.提供实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白、实施方案24-29中任一项所述的免疫原性组合物或实施方案30-31中任一项所述的核酸分子；以及549.37.使1)中所述的免疫原性组合物与药学上可接受的佐剂混合。550.38.一种检测sars-cov-2中和抗体的方法，其包括：551.1)向受试者施用实施方案35所述的covid-19亚单位疫苗；以及552.2)检测1)中所述受试者在接受所述covid-19亚单位疫苗后体内产生的中和抗体。553.不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本技术的融合蛋白、免疫原性组合物、制备方法和用途等，而不用于限制本技术发明的范围。此外，实施例中无论是否有6个或8个his标签或n端的信号肽，不影响保护范围，熟悉本领域的技术人员根据本技术发明的内容对实施例进行非本质的改进和调整，仍属于本技术发明的保护范围。554.实施例555.实施例1构建rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒556.信号肽添加：mgvpavpeassprwgtlllaiflaasrglvaa(seqidno：74)。载体选择:pcdna3.1( )，按照宿主cho细胞进行密码子优化。557.片段的克隆。rbd-p2-6*his的引物通过pcr的方法扩增得到片段pcr产物,通过多段重组的方法重组到目的载体pcdna3.1( )(bamhi-xhoi酶切载体)中，得到rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒。反应体系如表1所示。558.表1处理好的目的片段与载体连接反应体系559.名称体积酶切后载体5μl纯化的pcr产物5μl无缝组装mix10μl总体积20μl560.以上连接液在52℃恒温环境下连接30min，得到rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒。561.转化的方法：(1)将浓度在100ng/μl的rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒吸取1-3μl加入到100μl的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。(2)42℃水浴90s不要摇动。(3)冰浴中放置3分钟左右。(4)每管中加入500-800μl37℃预温lb培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。562.rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒的验证：(1)制备含相应抗性的琼脂平板。(2)取100μl菌液，然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。(4)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行pcr鉴定，将阳性克隆菌液送测序。563.克隆质粒的鉴定方法：pcr扩增rbd-p2-6*his片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成预期扩增的片段长度为861bp，pcr反应采用20μl体系：引物0.5μl，模板菌液2μl，聚合酶缓冲液0.5μl，buffer3μl，ddh2o14μl。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液pcr方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得861bp、5372bp两个片段。564.rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒抽提：接1％含rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒的大肠杆菌细胞(stbl3)于2mllb培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100ug质粒。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得861bp、5372bp两个片段。565.实施例2细胞转染及rbd-p2-6*his蛋白纯化566.在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞，避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增cho细胞(来自thermo公司的expicho)直到细胞密度达到4×106–6×106个/ml。第-1天：细胞扩增，扩增培养细胞到3×106–4×106个/ml，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106–10×106个/ml,存活率到95–99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/ml，50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。使用opti-prosfm培养基制备转染试剂和rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒复合物(4℃)，例：1mlcho细胞准备40μlopti-prosfm添加0.8ugrbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒混匀放置5min；准备40μlopti-prosfm添加3μlexpifectaminecho试剂混匀放置5min，室温下1–5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后18-22小时，添加enhancer和expichofeed，执行标准实验方案。例：1ml细胞添加6μlenhancer和0.24mlexpichofeed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后8天收集，进行后续纯化。567.蛋白纯化。培养基离心，上清添加ni柱，振荡孵育2h，经过重力空柱管柱进行亲和层析纯化。平衡缓冲液：“pbs”,ph7.4，清洗10cv；清洗缓冲液：“pbs”,ph7.4with20mmimidazole，清洗10cv；洗脱缓冲液：“pbs”,ph7.4with500mmimidazole，洗脱1cv，重复5次，得到rbd-p2-6*his纯化蛋白，如表2所示。568.表2蛋白纯化后的浓度和体积569.p101150-7concentration(mg/ml)volume(ml)rbd-p2-6*his0.051570.sds-page电泳与wb验证。a.1.0mmpage胶，上样量8μl，跑胶顺序：m.molecularweightmarker.me.culturemedium.ft.flowthrough.w.wash.e.elutedfractions。b.电泳:将rbd-p2-6*his纯化蛋白与上样缓冲液混合(rbd-p2-6*his纯化蛋白:5x上样缓冲液＝4:1)，煮沸5min，进行点样。首先100v恒压电泳，可以看到marker逐渐变成一条细线。待marker进入分离胶后，将电压调到300v继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25min)。c.转膜，撬开玻璃板，小心取出凝胶。pvdf膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20v恒压转移，50kda蛋白需20min。分子量越大需时间越长。d.抗体孵育，转膜后取出pvdf膜，可以看到marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100mlpbst)封闭1小时，用pbst漂洗2x5min。一抗(anti-hismab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100mltbs)稀释，放在小盒中孵育，4℃脱色摇床中反应2h。取出pvdf膜,pbst漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。pbst漂洗4x10min。均使用摇床震动。e.显色，ecl显色:每一块pbst膜，用a液1ml和b液10μl混合后滴在膜上，5min后在化学发光成像系统中拍照记录，如图1所示。571.实施例3构建ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒572.信号肽添加：mfvflvllplvs(seqidno：75)，载体选择:pcdna3.1( )。按照宿主cho细胞进行密码子优化。ntd-p2-6*his的引物通过pcr的方法扩增得到片段pcr产物,通过多段重组的方法重组到目的载体pcdna3.1( )(bamhi-xhoi酶切载体)中，得到ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒。反应体系如表3所示。573.表3处理好的目的片段与载体连接反应体系574.名称体积酶切后载体5μl纯化的pcr产物5μl无缝组装mix10μl总体积20μl575.转化的方法：将浓度在100ng/μl左右的ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒吸取1-3μl加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。42℃水浴90s不要摇动；冰浴中放置3分钟左右；每管中加入500-800μl37℃预温lb培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。576.ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒的验证：(1)制备含相应抗性的琼脂平板。(2)取100μl菌液，然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。(4)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行pcr鉴定，将阳性克隆菌液送测序。577.克隆质粒的鉴定方法：pcr扩增ntd-p2-6*his片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成预期扩增的片段长度为1005bp，pcr反应采用20μl体系：引物0.5μl，模板菌液2μl，聚合酶缓冲液0.5μl，buffer3μl，ddh2o14μl。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液pcr方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得1005bp、5372bp两个片段。578.ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒抽提。接1％含ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒的大肠杆菌细胞(stbl3)于2mllb培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100ug质粒。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得1005bp、5372bp两个片段。579.实施例4细胞转染及ntd-p2-6*his(gp101150-8)蛋白纯化580.在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞；避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增cho细胞直到细胞密度达到4×106–6×106个/ml。第-1天：cho细胞扩增，扩增培养细胞到3×106–4×106个/ml，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106–10×106个/ml,存活率到95–99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/ml，50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。使用opti-prosfm培养基制备转染试剂和ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒复合物(4℃)，例：1ml细胞准备40μlopti-prosfm添加0.8ugntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒混匀放置5min；准备40μlopti-prosfm添加3μlexpifectaminecho试剂混匀放置5min，室温下1–5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后18-22小时，添加enhancer和expichofeed，执行标准实验方案。例：1ml细胞添加6μlenhancer和0.24mlexpichofeed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后8天收集，进行后续纯化。581.蛋白纯化，培养基离心，上清添加ni柱，振荡孵育2h，经过重力空柱管柱进行亲和层析纯化。平衡缓冲液：“pbs”,ph7.4，清洗10cv；清洗缓冲液：“pbs”,ph7.4with20mmimidazole，清洗10cv；洗脱缓冲液：“pbs”,ph7.4with500mmimidazole，洗脱1cv，重复5次，得到ntd-p2-6*his(gp101150-8)纯化蛋白，结果如表4所示。582.表4ntd-p2-6*his(gp101150-8)纯化蛋白的浓度和体积583.p101150-8浓度(mg/ml)体积(ml)ntd-p2-6*his0.031584.sds-page电泳与wb验证。a.1.0mmpage胶，上样量8μl，跑胶顺序：m.molecμlarweightmarker.me.cμlturemedium.ft.flowthrough.w.wash.e.elutedfractions。b.电泳:将ntd-p2-6*his(gp101150-8)纯化蛋白与上样缓冲液混合(ntd-p2-6*his(gp101150-8)纯化蛋白:5x上样缓冲液＝4:1)，煮沸5min，进行点样。首先100v恒压电泳，可以看到marker逐渐变成一条细线。待marker进入分离胶后，将电压调到300v继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25min)。c.转膜。撬开玻璃板，小心取出凝胶。pvdf膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20v恒压转移，50kda蛋白需20min。分子量越大需时间越长。d.抗体孵育。转膜后取出pvdf膜，可以看到marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100mlpbst)封闭1小时，用pbst漂洗2x5min。一抗(anti-hismab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100mltbs)稀释，放在小盒中孵育，4'c脱色摇床中反应2h。取出pvdf膜,pbst漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。pbst漂洗4x10min。均使用摇床震动。e.显色。ecl显色:每一块pbst膜，用a液1ml和b液10μl混合后滴在膜上，5min后在化学发光成像系统中拍照记录，如图2所示。585.实施例5构建ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒586.信号肽添加：mfvflvllplvs(seqidno：75)，载体选择:pcdna3.1( )。按照宿主cho细胞进行密码子优化。ntd-rbd-foldon-8*his的引物通过pcr的方法扩增得到片段pcr产物，通过多段重组的方法重组到目的载体pcdna3.1( )(bamhi-xhoi酶切载体)中，得到ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒。反应体系如表5所示。587.表5处理好的目的片段与载体连接反应体系588.名称体积酶切后载体5μl纯化的pcr产物5μl无缝组装mix10μl总体积20μl589.转化的方法：将浓度在100ng/μl左右的ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒吸取1-3μl加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。42℃水浴90s不要摇动；冰浴中放置3分钟左右；每管中加入500-800μl37℃预温lb培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。590.ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒的验证：(1)制备含相应抗性的琼脂平板。(2)取100μl菌液,然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。(4)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行pcr鉴定，将阳性克隆菌液送测序。591.克隆质粒的鉴定方法：pcr扩增ntd-rbd-foldon-8*his片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成预期扩增的片段长度为1761bp，pcr反应采用20μl体系：引物0.5μl，模板菌液2μl，聚合酶缓冲液0.5μl，buffer3μl，ddh2o14μl。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液pcr方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得1761bp、5372bp两个片段。592.ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒抽提。接1％含ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒的大肠杆菌细胞(stbl3)于2mllb培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100ug质粒。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得1761bp、5372bp两个片段。593.实施例6细胞转染及蛋白纯化594.在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞；避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增cho细胞直到细胞密度达到4×106–6×106个/ml。第-1天：细胞扩增，扩增培养细胞到3×106–4×106个/ml，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106–10×106个/ml，存活率到95–99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/ml，50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。595.使用opti-prosfm培养基制备转染试剂和ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒复合物(4℃)，例：1ml细胞准备40ulopti-prosfm添加0.8ugntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒混匀放置5min；准备40ulopti-prosfm添加3ulexpifectaminecho试剂混匀放置5min，室温下1–5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后18-22小时，添加enhancer和expichofeed，执行标准实验方案，例：1ml细胞添加6ulenhancer和0.24mlexpichofeed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后8天收集，进行后续纯化。596.蛋白纯化：培养基离心，上清添加ni柱，振荡孵育2h，经过重力空柱管柱进行亲和层析纯化。平衡缓冲液：“pbs”,ph7.4，清洗10cv；清洗缓冲液：“pbs”,ph7.4with20mmimidazole，清洗10cv；洗脱缓冲液：“pbs”,ph7.4with500mmimidazole，洗脱1cv，重复5次，得到ntd-rbd-foldon-8*his纯化蛋白，结果如表6所示。597.表6ntd-rbd-foldon-8*his纯化蛋白的浓度和体积598.p101150-5concentration(mg/ml)volume(ml)nr-foldon-8*his0.050.5599.sds-page电泳与wb验证。a.1.0mmpage胶，上样量8ul，跑胶顺序：m.molecularweightmarker.me.culturemedium.ft.flowthrough.w.wash.e.elutedfractions。b.电泳:将ntd-rbd-foldon-8*his纯化蛋白与上样缓冲液混合(nr-foldon-8*his纯化蛋白:5x上样缓冲液＝4:1)，煮沸5min，进行点样。首先100v恒压电泳，可以看到marker逐渐变成一条细线。待marker进入分离胶后，将电压调到300v继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25min)。c.转膜，撬开玻璃板，小心取出凝胶。pvdf膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20v恒压转移，50kda蛋白需20min。分子量越大需时间越长。d.抗体孵育转膜后取出pvdf膜，可以看到marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100mlpbst)封闭1小时，用pbst漂洗2x5min。一抗(anti-hismab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100mltbs)稀释，放在小盒中孵育，4'c脱色摇床中反应2h。取出pvdf膜,pbst漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。pbst漂洗4x10min.均使用摇床震动。e.显色，ecl显色:每一块pbst膜，用a液1ml和b液10μl混合后滴在膜上，5min后在化学发光成像系统中拍照记录，如图3所示。600.实施例7构建载体和蛋白表达601.参照上述实施例，构建如下需要表达的目的片段，并表达纯化蛋白，如表7所示。602.表7不同的目的片段603.基因名称构建方式seqidnorbd-hbsag-6*his全基因合成45ntd-hbsag-6*his全基因合成46rbd-foldon-6*his全基因合成47ntd-foldon-6*his全基因合成48ntd-rbd-foldon-8*his全基因合成49s-foldon-8*his全基因合成50rbd-p2-6*his全基因合成51ntd-p2-6*his全基因合成52s1-p2-8*his全基因合成53rbd-p2-foldon-6*his全基因合成54ntd-p2-foldon-6*his全基因合成55s1-p2-foldon-6*his全基因合成56rbd-ferritinlc-6*his全基因合成57rbd-ferritinhc-flag全基因合成58rbd194-hbsagpcr克隆59ntd-ferritinhc核酸序列pcr克隆60ntd-ferritinlc核酸序列pcr克隆61ntdferritin核酸序列全基因合成62rbdferritin核酸序列全基因合成63604.实施例8疫苗组合物的制备605.0.04mg/ml的rbd蛋白，0.04mg/ml的ntd蛋白；2％至15％(w/v)蔗糖；0.01％至0.05％(w/v)吐温80；和ph为5.0至7.0的5mm至25mm组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。606.实施例9疫苗组合物的制备607.0.04mg/ml的rbd-p2蛋白，0.04mg/ml的ntd-p2蛋白；2％至15％(w/v)山梨糖醇；0.01％至0.05％(w/v)聚山梨酯20；和ph为5.5至7.0的5mm至20mm组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。608.实施例10疫苗组合物的制备609.0.04mg/ml的rbd蛋白，0.04mg/ml的ntd-p2蛋白；2％至15％(w/v)蔗糖；0.01％至0.05％(w/v)吐温80；和ph为4.5至5.5的5mm至25m琥珀酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。610.实施例11疫苗组合物的制备611.0.04mg/ml的rbd-p2蛋白，0.04mg/ml的ntd蛋白；2％至15％(w/v)山梨糖醇；0.01％至0.05％(w/v)聚山梨酯20；和ph为5.5至7.0的5mm至20mm组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。612.实施例12疫苗组合物的制备613.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含氢氧化铝佐剂，浓度为1mg/ml。614.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物中加入cpg1018佐剂，浓度为6mg/ml，cpg佐剂(cpg由上海生工生物公司按cpg1018序列合成)。615.实施例13疫苗组合物的制备616.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.5ml，50μg的mpl，500μg氢氧化铝，150mm的nacl，8mm的二水磷酸氢二钠，加注射用水至0.5ml。617.实施例14疫苗组合物的制备618.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.25ml，成份包括10.69mg的角鲨烯，11.86mg的α-生育酚，4.86mg的吐温80，3.53mg的nacl，0.09mg的kcl，0.51mg的na2hpo4，0.09mg的kh2po4和注射用水。619.实施例15疫苗组合物的制备620.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.5ml，成份包括50μg的mpl，50μg的qs-21，1mg的dopc二油酰磷脂酰胆碱，0.25mg的胆固醇，0.15mg的无水磷酸二钠，0.54mg的磷酸二氢钾，4.385mg的氯化钠，和注射用水。621.实施例16疫苗组合物的制备622.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.5ml，成份包括9.75mg角鲨烯、1.175mg司盘85、1.175mg吐温80、0.66mg二水合柠檬酸三钠和0.04mg一水合柠檬酸，和注射用水。623.实施例17不同抗原与佐剂的小鼠免疫实验624.抗原蛋白结合不同佐剂用于免疫小鼠，蛋白诱导的中和抗体水平通过elisa测定确定。小鼠分组及免疫方案如表8所示。625.表8小鼠分组表[0626][0627]其中的ntd蛋白序列为seqidno：20中1-291氨基酸，rbd的序列为seqidno：1中1-223氨基酸，al(oh)3佐剂、cpg佐剂、cpg al(oh)3佐剂参照实施例12的浓度，as01的组成参照实施例15，as04的组成参照实施例13，小鼠免疫后28天后检测结果如表9所示。结果显示，rbd ntd诱导产生中和抗体的水平更强。[0628]表9小鼠免疫后28天后检测结果[0629][0630]实施例18不同抗原与佐剂的免疫原性评价实验[0631]抗原蛋白与mf59佐剂共同用于免疫日本大耳朵白兔，蛋白诱导的中和抗体水平通过elisa测定确定。日本大耳朵白兔分组及免疫方案如表10所示。[0632]表10日本大耳白兔免疫分组表[0633][0634]ntd-p2的序列见seqidno：20，rbd-p2的序列参照seqidno：1，ntd-foldon的序列见seqidno：22，rbd-foldon的序列见seqidno：3，ntd-ferritinlc的序列见seqidno：23，rbd-ferritin的序列参照seqidno：5，ntd-hbsag的序列参照seqidno：25，rbd-hbsag的序列参照seqidno：6，佐剂mf59参照实施例16。[0635]ntd-rbd-p2的序列参照seqidno：40序列，但c端无his标签，ntd-rbd-foldon的序列参照seqidno：41序列，但c端无his标签，ntd-rbd-p2-foldon的序列参照seqidno：42序列，但c端无his标签，ntd-rbd-ferritin的序列参照seqidno：43序列，ntd-rbd-hbsag的序列参照seqidno：44序列。日本大耳朵白兔免疫28天后的检测结果如表11所示，说明融合蛋白具有免疫原性。[0636]表11日本大耳白兔免疫28天后的检测结果[0637][0638][0639]实施例19不同抗原与佐剂的免疫原性评价实验[0640]抗原蛋白与不同佐剂共同用于免疫恒河猴，蛋白诱导的中和抗体水平通过elisa测定确定。恒河猴分组及免疫方案如下，阳性对照为新冠的灭活苗。恒河猴免疫28天后的检测结果如表12所示。[0641]表12恒河猴免疫结果[0642][0643]实施例20小鼠中重组新冠疫苗候选抗原诱导中和抗体产生的效果检测[0644]以wuhan-1序列为基础，选择ntd和rbd作为候选抗原。检测单独ntd、单独rbd、ntd和rbd共免疫、ntd-rbd融合蛋白(以下简称nr)，以及ntd-rbd-foldon融合蛋白(以下简称nr-foldon)的免疫原性，结果如表14所示。结果显示，nr-foldon抗原和bfa03佐剂联合免疫balb/c小鼠后，能够显著有效诱导机体产生高滴度的中和抗体(基于sars-cov-2病毒株及vsv假病毒检测系统)和抗原特异性igg抗体，其中，对武汉原型株以及d614g、gamma突变株的中和效果显著优于其他抗原。[0645]表13balb/c小鼠中重组新冠疫苗候选抗原实验设计概况[0646][0647][0648]表14balb/c小鼠中重组新冠疫苗候选抗原的筛选结果[0649][0650]备注：1.基于sars-cov-2毒株的新冠病毒中和抗体检测，下同。[0651]2.假病毒类型：原型株(wuhan-1)、主要流行毒株(d614g)；voc变异毒株：英国突变株(alpha，b.1.1.7)、南非突变株(beta，b.1.351)、巴西突变株(gamma，p.1)、印度突变株(delta，b.1.617.2)；voi变异毒株：秘鲁突变株(lambda，c.37)，下同。[0652]实施例21不同佐剂的免疫效果检测[0653]选择al(oh)3、bfa01、bfa02、bfa03、bfa04、cpg/al(oh)3与nr-foldon抗原配伍免疫balb/c小鼠，检测血清中中和抗体及抗原特异性igg抗体。研究结果表明，在候选佐剂中，bfa03佐剂的免疫效果最佳且显著优于传统铝佐剂(氢氧化铝佐剂)，也优于以铝盐佐剂为基础的复合佐剂系统。[0654]表15balb/c小鼠中重组新冠疫苗候选佐剂实验设计概况[0655][0656][0657]备注：1.人用剂量(0.5ml)佐剂中主要成分的含量，balb/c小鼠中的免疫剂量为1/5hd。[0658]表16balb/c小鼠中重组新冠疫苗候选佐剂的实验结果[0659][0660]实施例22小鼠实验中不同剂量的免疫效果检测[0661]将1/10及1/5人用剂量(即4μg和8μg)nr-foldon抗原，分别与1/5或1/10人用剂量bfa03佐剂联合免疫balb/c小鼠。结果显示，在抗原剂量固定的前提下，1/10hd佐剂免疫产生中和抗体滴度低于1/5hd佐剂，各组不具有统计学差异，在一定程度上认为抗原和佐剂需要配比合适时可以诱导更强的免疫反应。[0662]表17balb/c小鼠中重组新冠疫苗剂量考察结果[0663][0664][0665]实施例23兔子实验中不同剂量的免疫效果检测[0666]以1人用剂量bfa03佐剂(0.5ml)分别与20μg和40μg两个不同剂量的nr-foldon抗原联合免疫日本大耳白兔，结果如表18所示，40μg抗原免疫产生的抗体滴度较高。[0667]表18不同剂量佐剂免疫日本大耳白兔结果[0668][0669]选择1hd(0.5ml)、1/2hd、1/4hdbfa03佐剂，分别与1hdnr-foldon抗原联合免疫日本大耳白兔，结果如表19所示，1hd的佐剂与1hd抗原免疫诱导机体产生的中和抗体及结合抗体水平最高，降低佐剂剂量则会降低免疫效果。[0670]表19不同剂量佐剂免疫日本大耳白兔结果[0671][0672]实施例24抗原佐剂组合对新冠病毒不同变异株的中和作用检测[0673]recov疫苗(nr-foldon抗原/bfa03佐剂)免疫不同种属动物产生的中和抗体滴度gmt结果如下，由表可知，所确定的抗原佐剂组合对sars-cov-2病毒和不同的变异株均具有较好的中和作用。[0674]表20不同种属动物产生的中和抗体滴度结果[0675][0676][0677]使用gamma突变株s蛋白ntd及rbd和beta突变株s蛋白ntd及rbd的效果检测[0678]实施例25构建ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株)和ntd-rbd-foldon-6×his(beta突变株)重组表达质粒[0679]如seqidno：85所示的ntd-rbd-foldon(gamma突变株)添加信号肽mgwsciilflvatatgvhs(seqidno:91)和6×his；如seqidno:79所示的ntd-rbd-foldon(beta突变株)添加信号肽mgwsciilflvatatgvhs(seqidno:91)和6×his，全长氨基酸序列由无锡药明生物技术股份有限公司进行密码子优化，并通过pcr进行全基因合成得到ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株)和ntd-rbd-foldon-6×his(beta突变株)的dna片段。经凝胶纯化后，将纯化后的dna片段重组到目的载体pcdna3.1( )中，得到ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株)和ntd-rbd-foldon-6×his(beta突变株)重组表达质粒。并通过sanger测序验证，序列100％正确，测序结果见图1和图7。[0680]转化宿主菌：(1)将浓度在100ng/μl的ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株)或ntd-rbd-foldon-6×his(beta突变株)重组表达质粒吸取1～3μl加入到100μl的大肠杆菌e.colitop10感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。(2)42℃水浴90s不要摇动。(3)冰浴中放置3分钟左右。(4)每管中加入500～800μl37℃预温lb培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。[0681]重组表达质粒抽提并测序：(1)制备含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板。(2)取100μl菌液培养后用无菌玻璃涂布器轻轻划lb琼脂平板(含100μg/ml氨苄青霉素)，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12～16小时可出现菌落。(4)从平板上挑取一个单克隆接种至300mllb培养基中扩大培养，采用nucleobondxtramaxief试剂盒按照说明书进行质粒大量制备。并测序验证目的基因，测序结果与设计的基因组序列一致。[0682]实施例26细胞转染及蛋白纯化[0683]细胞转染：[0684]在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞，避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增cho细胞(来自thermo公司的expicho)直到细胞密度达到4×106～6×106个/ml。转染的第-1天：调整细胞密度到3×106～4×106个/ml，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106～10×106个/ml，存活率达95～99％进行转染。新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/ml，在50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。使用optiprotmsfm培养基制备转染试剂和ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株/beta突变株)重组表达质粒复合物(4℃)，例：1mlcho细胞准备40μloptiprotmsfm添加0.8μgntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株/beta突变株)重组表达质粒，混匀放置5分钟；准备40μloptiprotmsfm添加3μlexpifectaminetmcho试剂混匀放置5分钟，室温下1～5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后18-22小时，添加enhancer和expichofeed，执行标准实验方案。例：1ml细胞添加6μlenhancer和0.24mlexpichofeed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后6天收集，进行后续纯化。[0685]蛋白纯化：[0686]采用固定化金属离子亲和层析(imac)和尺寸排阻层析(sec)相结合的方法进行纯化。采用装载niso4的hitrap5mlchelatinghp层析柱(美国ge公司)。鳌合层析介质预处理后装柱，分别用50mmol/ledta、0.2mol/lnaoh、超纯水洗柱。5倍以上的裂解缓冲液平衡后，细胞裂解上清直接上柱，以溶液a(20mmol/lpb，ph7.4，0.15mol/lnacl)与溶液b(20mmol/lpb，ph7.4，0.15mol/lnacl，0.5mol/l咪唑)为流动相进行梯度洗脱(溶液b的浓度从4％(体积)增大至100％(体积))。收集目标组分，继续进行sec分离。采用hiload26/60superdex-200pre-grade凝胶柱(美国ge公司)。以溶液c(20mmol/lpb，ph7.4，0.15mol/lnacl)为流动相洗脱1个柱体积，洗脱速率为2.5ml/min。sec纯化后的层析图谱见图5和图8。[0687]得到ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白，蛋白纯化结果如表21所示，经纯化后的目的蛋白纯度可达93.6％(gamma突变株)95％(beta突变株)。[0688]表21蛋白纯化结果[0689][0690]sds-page电泳和westernblot验证：[0691]a.1.0mmpage胶，上样量8μl，跑胶顺序：m.molecularweightmarker.me.culturemedium.ft.flowthrough.w.wash.e.elutedfractions。b.电泳：将ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白与上样缓冲液混合(ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白:5×上样缓冲液＝4:1)，煮沸5分钟，进行点样。首先100v恒压电泳，可以看到marker逐渐变成一条细线。待marker进入分离胶后，将电压调到300v继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25分钟)。c.转膜，撬开玻璃板，小心取出凝胶。pvdf膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20v恒压转移，50kda蛋白需20分钟。分子量越大需时间越长。d.抗体孵育，转膜后取出pvdf膜，可以看到marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100mlpbst)封闭1小时，用pbst漂洗2×5min。一抗(anti-hismab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100mltbs)稀释，放在小盒中孵育，4℃脱色摇床中反应2h。取出pvdf膜，pbst漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。pbst漂洗4×10min。均使用摇床震动。e.显色，ecl显色：每一块pbst膜，用a液1ml和b液10μl混合后滴在膜上，5分钟后在化学发光成像系统中拍照记录，如图6和图9所示。从sds-page电泳图和westernblot的结果图可知，经sec分离后ntd-rbd-foldon(beta突变株)溶液的电泳泳道上最大的条带是ntd-rbd-foldon(beta突变株)，ntd-rbd-foldon(gamma突变株)溶液的电泳泳道上最大的条带是ntd-rbd-foldon(gamma突变株)，且其主要以三聚体的形式存在，westernblot结果可见对应的目的条带。[0692]实施例27构建载体和蛋白表达[0693]参照上述实施例，构建如表22所示需要表达的目的片段，并表达纯化蛋白。[0694]表22不同的目的片段[0695][0696][0697]实施例28免疫原性组合物的制备[0698]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白，1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。[0699]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白，50μg的rbd-foldon(beta突变株/gamma突变株)纯化蛋白；1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。[0700]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白，50μg的ntd-foldon(beta突变株/gamma突变株)纯化蛋白；1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。[0701]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白，50μg的ntd-rbd-foldon(wuhan-1)纯化蛋白；1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。[0702]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白；135μg的ha蛋白(45μg的h1n1的ha蛋白，45μg的h3n2的ha蛋白，45μg的b/washington/02/2019的ha蛋白)；1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。选用的ha蛋白如表23所示。[0703]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白；180μg的ha蛋白(45μg的h1n1的ha蛋白，45μg的h3n2的ha蛋白，45μg的b/washington/02/2019的ha蛋白，45μg的b/phuket/3073/2013的ha蛋白)；1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。选用的ha蛋白如表23所示。[0704]表23联用的流感毒株[0705][0706]实施例29疫苗的制备[0707]前述任一项实施例所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含氢氧化铝佐剂，浓度为1mg/ml。[0708]前述任一项实施例所述的免疫原性组合物，进一步包含佐剂as03，佐剂瓶为0.5ml，成分包括10.69mg的角鲨烯、11.86mg的α-生育酚、4.86mg的聚山梨酯80、3.53mg的氯化钠、0.09mg的氯化钾、0.51mg的磷酸氢二钠、0.09mg的磷酸二氢钾和注射用水。[0709]前述任一项实施例所述的免疫原性组合物，进一步包含佐剂mf59，佐剂瓶为0.5ml，成分包括4.5％的角鲨烯，0.5％tween80，0.5％span85和注射用水。[0710]实施例30疫苗的小鼠免疫实验(beta突变株)[0711]分别选用实施例28所述的免疫原性组合物结合as03佐剂，按照2/25人用剂量进行小鼠免疫，以ntd-rbd-foldon(wuhan-1)蛋白制备的免疫原性组合物结合as03佐剂作为对照，诱导的中和抗体水平通过基于vsv(水疱性口炎病毒)系统的新冠假病毒中和抗体检测方法测定。小鼠分组及免疫方案如表24所示。[0712]表24小鼠免疫分组表[0713][0714][0715]as03佐剂的配制参考实施例29，小鼠免疫第28天后，通过眼眶静脉采血的方式获得血清，利用基于vsv的假病毒检测系统检测中和抗体滴度，分别采用新冠病毒主要流行株(d614g)假病毒、新冠病毒alpha突变株(b.1.1.7)假病毒、新冠病毒beta突变株(501y.v2)假病毒、新冠病毒gamma突变株(501y.v3)假病毒进行中和实验，考察疫苗对不同新冠病毒变异株的中和效果，检测结果如表25所示。结果显示，以ntd-rbd-foldon(wuhan-1)为抗原结合as03佐剂诱导产生的中和抗体对主要流行株假病毒和gamma突变株假病毒的中和效果较好(gmt远高于10000)，而对于alpha突变株假病毒和beta突变株假病毒的中和效果较差(gmt远低于10000)；以ntd-rbd-foldon(beta突变株)为抗原结合as03佐剂诱导产生的中和抗体对beta突变株假病毒和gamma突变株假病毒均有较好的中和效果(gmt远高于10000)，更加令人意外的是，尤其是对于gamma突变株假病毒的中和抗体gmt高达20944，但其对主要流行株假病毒和alpha突变株假病毒的中和效果稍弱。可见，以ntd-rbd-foldon(beta突变株)为免疫原的单价疫苗对4种新冠病毒突变株均有良好的免疫效果，其尤其可作为一种新的应对sars-cov-2突变株(尤其是南非和gamma突变株)的covid-19候选疫苗，更高效地诱导产生保护性中和抗体对抗新冠突变株的免疫逃逸。[0716]而以ntd-rbd-foldon(beta突变株)联合ntd-rbd-foldon(wuhan-1)为免疫原的二价疫苗相比于ntd-rbd-foldon(beta突变株)单价疫苗和ntd-rbd-foldon(wuhan-1)单价疫苗，诱导产生的中和抗体水平整体提升，既增强了ntd-rbd-foldon(wuhan-1)单价疫苗对beta突变株假病毒的作用效果，又增强了ntd-rbd-foldon(beta突变株)单价疫苗对主要流行株假病毒和英国流行株假病毒的作用效果。此二价疫苗具有作用范围更广，作用效果更强的特点，更适合作为一种应对covid-19的候选疫苗发挥作用。[0717]表25小鼠免疫28天后检测结果[0718][0719][0720]实施例31疫苗的小鼠免疫实验(gamma突变株)[0721]选用实施例28所述的免疫原性组合物结合as03佐剂，按照2/25人用剂量进行小鼠免疫，诱导的中和抗体水平通过基于vsv(水疱性口炎病毒)系统的新冠假病毒中和抗体检测方法测定。小鼠分组及免疫方案如表26所示。[0722]表26小鼠免疫分组表[0723][0724]as03佐剂的配制参考实施例29，小鼠免疫第28天后，通过眼眶静脉采血的方式获得血清，利用基于vsv的假病毒检测系统检测中和抗体滴度，分别采用新冠病毒主要流行株(d614g)假病毒、新冠病毒alpha突变株(b.1.1.7)假病毒、新冠病毒beta突变株(501y.v2)假病毒、新冠病毒gamma突变株(501y.v3)假病毒进行中和实验，考察疫苗对不同新冠病毒变异株的中和效果，检测结果如表27所示。结果显示，以ntd-rbd-foldon(gamma突变株)为抗原结合as03佐剂免疫小鼠诱导产生中和beta突变株(501y.v2)假病毒的抗体水平最高，诱导产生中和gamma突变株(501y.v3)假病毒的抗体水平其次，而诱导产生中和主要流行株(d614g)假病毒和alpha突变株(b.1.1.7)假病毒的抗体水平较低。可见，以ntd-rbd-foldon(gamma突变株)为免疫原的单价疫苗对4种新冠病毒突变株均有效，其可作为一种新的应对sars-cov-2突变株(尤其是南非和gamma突变株)的covid-19候选疫苗，更高效地诱导产生保护性中和抗体对抗新冠突变株的免疫逃逸。[0725]表27小鼠免疫28天后检测结果[0726][0727]由以上结果可确定，若是按照上述方法制备ntd-rbd-foldon(gamma突变株)联合ntd-rbd-foldon(beta突变株)的二价疫苗，或ntd-rbd-foldon(gamma突变株)联合ntd-rbd-foldon(wuhan-1)的二价疫苗，或ntd-rbd-foldon(gamma突变株)联合ntd-rbd-foldon(beta突变株)和ntd-rbd-foldon(wuhan-1)的三价疫苗，或ntd-rbd-foldon(gamma突变株)联合ntd-rbd-foldon(beta突变株)、ntd-rbd-foldon(wuhan-1)和流感血凝素ha的多价疫苗等多价联合疫苗可能会产生更高的中和抗体滴度。当前第1页12当前第1页12
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：：2.目前，控制新冠疫情的方式是实施检疫、隔离和保持物理距离。因此迫切需要针对covid-19的有效疫苗，以减轻与sars-cov-2感染相关的死亡率和发病率的巨大负担。3.sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。rbd作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。4.sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)为病毒s蛋白n端的一段序列，其可与宿主细胞的蛋白或糖蛋白结合，介导病毒入侵宿主细胞，故该段区域可能包含诱导中和抗体产生的表位。技术实现要素：5.本技术提供了一种包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段和/或sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段的融合蛋白、组合物及其应用，其具有下列性质的一种或多种：1)融合蛋白具有免疫原性；2)包含融合蛋白的covid-19亚单位疫苗免疫原性更强，能诱导产生更多的中和抗体。6.一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。7.在某些实施方式中，所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。8.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。9.在某些实施方式中，所述rbd与野生型sar-cov-2的rbd相比，在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。10.在某些实施方式中，所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。11.在某些实施方式中，所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。12.在某些实施方式中，所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。13.在某些实施方式中，所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。14.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。15.在某些实施方式中，所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。16.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。17.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述p2或其功能活性片段在框内融合。18.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。19.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。20.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。21.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。22.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。23.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。24.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。25.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。26.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。27.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72中任一项所示的氨基酸序列。28.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。29.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。30.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。31.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。32.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述乙肝表面抗原或其功能活性片段在框内融合。33.在某些实施方式中，所述的融合蛋白包含seqidno:1-17、80和86中任一项所示的氨基酸序列。34.另一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。35.在某些实施方式中，所述ntd源自sars-cov-2野生型或其突变体。36.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。37.在某些实施方式中，所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。38.在某些实施方式中，所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。39.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。40.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。41.在某些实施方式中，所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。42.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。43.在某些实施方式中，所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。44.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。45.在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段与所述p2或其功能活性片段在框内融合。46.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。47.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。48.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。49.在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。50.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。51.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。52.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。53.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。54.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。55.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72任一项所示的氨基酸序列。56.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。57.在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。58.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。59.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。60.在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段与所述乙肝表面抗原或其功能活性片段在框内融合。61.在某些实施方式中，所述的融合蛋白包含seqidno:20-36、81和87中任一项所示的氨基酸序列。62.另一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。63.在某些实施方式中，所述的融合蛋白还包括一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。64.在某些实施方式中，所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。65.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。66.在某些实施方式中，所述rbd与野生型sar-cov-2的rbd相比，在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。67.在某些实施方式中，所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。68.在某些实施方式中，所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。69.在某些实施方式中，所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。70.在某些实施方式中，所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。71.在某些实施方式中，所述ntd源自sars-cov-2野生型或其突变体。72.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。73.在某些实施方式中，所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。74.在某些实施方式中，所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。75.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。76.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。77.在某些实施方式中，所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。78.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。79.在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段在框内融合。80.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。81.在某些实施方式中，所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。82.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。83.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。84.在某些实施方式中，所述p2或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性片段的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。85.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。86.在某些实施方式中，所述噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基包含seqidno:78所示的氨基酸序列。87.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。88.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。89.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。90.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。91.在某些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段的n端与所述p2或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述p2或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性的c端直接或间接地相连。92.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。93.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。94.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。95.在某些实施方式中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。96.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。97.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72任一项所示的氨基酸序列。98.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。99.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。100.在某些实施方式中，所述铁蛋白或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。101.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。102.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。103.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。104.在某些实施方式中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。105.在某些实施方式中，所述的融合蛋白包含seqidno:39-44、79、85和96中任一项所示的氨基酸序列。106.另一方面，本技术提供了一种免疫原性组合物，其包含所述的融合蛋白。107.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含第一组分，所述第一组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含融合蛋白。108.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含第一组分，所述第一组分包含融合蛋白；以及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。109.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含第一组分，所述第一组分包含所述的融合蛋白；以及第二组分，所述第二组分包含所述的融合蛋白。110.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物，其按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。111.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物，其包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。112.另一方面，本技术提供了一种免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。113.在某些实施方式中，所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。114.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。115.在某些实施方式中，所述rbd与野生型sar-cov-2的rbd相比，在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。116.在某些实施方式中，所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。117.在某些实施方式中，所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。118.在某些实施方式中，所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。119.在某些实施方式中，所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。120.在某些实施方式中，所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。121.在某些实施方式中，所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。122.在某些实施方式中，所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。123.在某些实施方式中，所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。124.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。125.在某些实施方式中，所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。126.在某些实施方式中，所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。127.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物，其按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。128.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物，其包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。129.在某些实施方式中，所述rbd包含seqidno:18-19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。130.在某些实施方式中，所述ntd包含seqidno:37-38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。131.另一方面，本技术提供了一种药物组合物，其包含所述的融合蛋白，或所述的免疫原性组合物，及任选地药学上可接受的赋形剂。132.另一方面，本技术提供了一种所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。133.在某些实施方式中，所述疫苗用于预防和/或治疗covid-19。134.另一方面，本技术提供了一种所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物，用于治疗和/或预防covid-19。135.另一方面，本技术提供了一种制备covid-19亚单位疫苗的方法，其包括：136.1)提供所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物；以及137.2)使1)中所述融合蛋白或免疫原性组合物与药学上可接受的佐剂混合。138.另一方面，本技术提供了一种检测sars-cov-2中和抗体的方法，其包括：139.1)向受试者施用所述的covid-19亚单位疫苗；以及140.2)检测1)中所述受试者在接受所述covid-19亚单位疫苗后体内产生的中和抗体。141.另一方面，本技术提供了一种治疗和/或预防covid-19的方法，其包括向受试者施用所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物或所述的covid-19亚单位疫苗。142.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。附图说明143.本技术所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本技术所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：144.图1显示的是用sds-page电泳与wb验证rbd-p2-6*his蛋白的结果图。145.图2显示的是用sds-page电泳与wb验证ntd-p2-6*his(gp101150-8)蛋白的结果图。146.图3显示的是用sds-page电泳与wb验证ntd-rbd-foldon-8*his蛋白的结果图。147.图4显示的是ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株)测序结果氨基酸序列比对。148.图5显示的是ntd-rbd-foldon(gamma突变株)蛋白的尺寸排阻层析图谱。149.图6显示的是sds-page电泳与westernblot验证ntd-rbd-foldon(gamma突变株)蛋白结果图。150.图7显示的是ntd-rbd-foldon-6×his(beta突变株)测序结果氨基酸序列比对。151.图8显示的是ntd-rbd-foldon(beta突变株)蛋白的尺寸排阻层析图谱。152.图9显示的是sds-page电泳与westernblot验证ntd-rbd-foldon(beta突变株)蛋白结果图。具体实施方式153.以下由特定的具体实施例说明本技术发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本技术发明的其他优点及效果。154.术语定义155.在本技术中，术语“融合蛋白”通常是指通过基因工程技术得到的具有生物学功能活性的蛋白分子。在本技术中，所述融合蛋白可以是rbd或其功能活性片段与下列任一序列组成的融合蛋白：p2或其功能活性片段、foldon结构域或其功能活性片段、铁蛋白或其功能活性片段、乙肝表面抗原hbsag或其功能活性片段。在本技术中，融合蛋白可以是ntd或其功能活性片段与下列任一序列组成的融合蛋白：p2或其功能活性片段、foldon结构域或其功能活性片段、铁蛋白或其功能活性片段、乙肝表面抗原hbsag或其功能活性片段。在本技术中，融合蛋白可以是ntd或其功能活性片段和rbd或其功能活性片段组成的融合蛋白。在本技术中，融合蛋白可以是ntd或其功能活性片段、rbd或其功能活性片段与下列任一片段组成的融合蛋白：p2或其功能活性片段、foldon结构域或其功能活性片段、铁蛋白或其功能活性片段、乙肝表面抗原hbsag或其功能活性片段。156.gisaid将毒株hcov-19/wuhan/wiv04/2019(wiv04)的全基因组序列(epi_isl_402124)做为正式的参考序列。一般将wiv04毒株定义为野生株或原始株。在本技术中，术语“sars-cov-2野生型”通常指wiv04毒株。157.在本技术中，术语“p2”通常是指破伤风毒素的表位肽。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。158.在本技术中，术语“foldon结构域”通常是指在噬菌体t4纤维蛋白的c末端的残基。在本技术中，foldon结构域可以是噬菌体t4纤维蛋白的c末端的27个残基或突变体。在本技术中，foldon结构域可以是噬菌体t4纤维蛋白的c末端的27个残基截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。159.在本技术中，术语“铁蛋白”、“ferritin”通常是指粉纹夜蛾铁蛋白或幽门螺旋杆菌铁蛋白。在本技术中，粉纹夜蛾铁蛋白具有重链和轻链(ferritinlc和ferritinhc)。在本技术中，幽门螺旋杆菌铁蛋白具有单链结构。在本技术中，铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的轻链”、“lc”可以与“ferritinlc”互换使用。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的重链”、“hc”可以与“ferritinhc”互换使用。160.在本技术中，术语“乙肝表面抗原(hbsag)”通常是指乙肝病毒最外层包膜中的一种外壳蛋白。例如，乙肝表面抗原的氨基酸序列可以为ncbi中的蛋白序列检索号aaa45524、anj76941、caa24234或aac34729对应的序列，也可以适宜地截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸，或有蛋白的突变，例如缺失、置换或插入一个或多个氨基酸。161.在本技术中，术语“功能活性片段”通常是指与rbd、ntd、p2、foldon结构域、铁蛋白、乙肝表面抗原hbsag具有相似生物学活性的片段。162.在本技术中，术语“免疫原性组合物”通常是指一种亚单位组合物。在本技术中，亚单位组合物是在将组分混合形成抗原性组合物之前，其中组分已经被分离并纯化到至少50％、至少60％、70％、80％、90％纯度的组合物。例如，亚单位组合物可以是水溶性蛋白的水溶液。例如，所述亚单位组合物可包含洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含非-离子、两性离子或离子洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含脂类。在一些情形中，免疫原性组合物可包括rbd或其功能活性片段和ntd或其功能活性片段。在一些情形中，免疫原性组合物可包括rbd或其功能活性片段和包含ntd或其功能活性片段的融合蛋白。在一些情形中，免疫原性组合物可包括包含rbd或其功能活性片段的融合蛋白和ntd或其功能活性片段。在一些情形中，免疫原性组合物可包括包含rbd或其功能活性片段的融合蛋白和包含ntd或其功能活性片段的融合蛋白。在本技术中，所述免疫原性组合物还可包括佐剂。例如，所述的佐剂可以包括铝盐(例如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝)，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。例如，所述的免疫原性组合物还可以选择为th1型应答优先诱导物。例如，th1型应答优先诱导物可以包括单磷酰脂质a或其衍生物。例如，所述佐剂可以是单磷酰脂质a(例如，3-脱-o-酰化单磷酰脂质a(3d-mpl))和铝盐的组合。一种佐剂增强系统可以包括单磷酰脂质a和皂苷衍生物的组合，特别是wo94/00153公开的qs21和3d-mpl的组合，或者如wo96/33739公开的用胆固醇将qs21猝灭从而使反应原性较弱的一种组合物。例如，所述佐剂还可以是wo95/17210中所述的佐剂，其在水包油乳剂中含有qs21、3d-mpl和生育酚。例如，所述佐剂可以是吐温80、山梨糖醇三油酸酯和角鲨烯混合后于高压条件下进行微流化形成的均一小滴状乳液。例如，所述佐剂可包含寡核苷酸的未甲基化cpg(wo96/02555)。163.在本技术中，术语“重量份”通常是指免疫原性组合物的第一组分和第二组分的重量比。在本技术中，免疫原性组合物每剂量可含有如下成份：第一组分5-60μg和第二组分5-60μg。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第一组分。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第二组分。164.在本技术中，术语“rbd”是指sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域。在本技术中，所述rbd可为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)310-560氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以截短n端或c端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本技术中，所述rbd可为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)319-541氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短n端或c端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本技术中，所述rbd可为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)331-524氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短n端或c端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。165.在某些实施方式中，所述rbd可以包含sars-cov-2(gamma突变体)的rbd。166.在某些实施方式中，所述rbd可以包含sars-cov-2(beta突变体)的rbd。167.在某些实施方式中，所述rbd可以包含sars-cov-2(wuhan-1)的rbd。168.在本技术中，术语“ntd”即sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端的结构域。在本技术中，所述ntd可以为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)13-353氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短n端或c端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。例如，所述ntd可以为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)13-303氨基酸之间的肽段或其突变体。在本技术中，所述ntd可以为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)14-304氨基酸之间的肽段或其突变体。在本技术中，所述ntd可以为sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)18-353氨基酸之间的肽段或其突变体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，所述ntd可以包含sars-cov-2(gamma突变体)的ntd。在某些实施方式中，所述ntd可以包含sars-cov-2(beta突变体)的ntd。在某些实施方式中，所述ntd可以包含sars-cov-2(wuhan-1)的ntd。169.在本技术中，术语“s蛋白”，也称为“spike蛋白”或“刺突蛋白”，通常是指冠状病毒的衣壳表面糖蛋白。sars-cov-2通过s蛋白与ace2受体结合并侵入细胞。s蛋白由1213个氨基酸组成，含有一个跨膜区，包含来自冠状病毒的衣壳表面糖蛋白从n端起或从第14位氨基酸起至少到1213氨基酸片段，或者来自其它sars病毒的相应区域。s1蛋白是s蛋白的亚单位1，主要指从n端或第14位氨基酸起到第685氨基酸片段。170.在本技术中，所述突变体可以包含目前已知的任意一种或几种sar-cov-2突变株(突变体)。例如，所述gamma突变株可以参考genbank登录号为qrn46961.1的b.1.1.28谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述gamma突变株可以参考genbank登录号为qlf80256.1的b.1.1.28谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述gamma突变株可以参考genbank登录号为qve55289.1的p.1谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述gamma突变株可以为gamma突变株501y.v3，其表面糖蛋白氨基酸序列可以如seqidno:88所示。171.例如，所述beta突变株可以参考genbank登录号为qua12570.1的b.1.351谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述beta突变株可以参考genbank登录号为qiz15537.1的b.1谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述beta突变株可以参考genbank登录号为qvi03430.1的b.1.351谱系的sars-cov-2表面糖蛋白氨基酸序列。例如，所述beta突变株可以为501y.v2beta突变株，其表面糖蛋白氨基酸序列如seqidno:82所示。172.在本文中所使用的术语“血凝素/血凝素蛋白/ha”通常是指可使红血球凝集的抗体或其他物质，在流感病毒、麻疹病毒(以及许多其他细菌和病毒)表面等均能找到，可附着于不同动物的红血球，而使红血球凝集，严重时可致死。在本文中是指流感病毒的表面糖蛋白hemagglutinin(ha)。每年who官网均会公布当年流感序列的预测，本文参考的是2021-2022年度的北半球的流感序列，即gisaid官网可查询的流感病毒a型(h1n1)epi1661231|ha|a/wisconsin/588/2019|epi_isl_404460，a型(h3n2)epi1843589|ha|a/cambodia/e0826360/2020|epi_isl_944639，b型epi1394970|ha|b/washington/02/2019|epi_isl_347829和b型epi529345|ha|b/phuket/3073/2013|epi_isl_161843。173.在本技术中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。174.在本技术中，术语“左右”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。175.在本技术中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将dna或rna插入细胞中的载体、主要用于复制dna或rna的载体，以及主要用于dna或rna的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。176.在本技术中，术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本技术所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本技术所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本技术所述的融合蛋白即可。所述宿主细胞可以通过使用本技术所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如cos细胞，中国仓鼠卵巢(cho)细胞，hela细胞，hek293细胞，cos-1细胞，ns0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是cho细胞。177.发明详述178.融合蛋白179.一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。180.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的rbd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以在k417、l452、t478、e484和n501中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。181.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417t、l452r、t478k、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。例如，所述rbd可以包含seqidno:83所示的氨基酸序列。在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含beta突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417n、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。例如，所述rbd可以包含seqidno:76所示的氨基酸序列。182.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以包含破伤风毒素的表位肽。183.例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。例如，所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。184.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。185.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可与所述rbd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。186.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。187.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可与所述p2或其功能活性片段在框内融合。188.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。189.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个氨基酸残基或突变体。在本技术中，foldon结构域可以是噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个残基截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。190.例如，所述foldon结构域或其功能活性片段可以包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。191.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。192.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端直接或间接相连。193.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。194.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。195.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。196.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段可包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。197.在本技术中，铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的轻链”、“lc”可以与“ferritinlc”互换使用。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的重链”、“hc”可以与“ferritinhc”互换使用。在本技术中，“幽门螺杆菌铁蛋白”可以与“hpferritin”互换使用。198.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链可包含seqidno:70所示的氨基酸序列。199.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链可包含seqidno:71所示的氨基酸序列。200.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。201.在本技术中，所述幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段可包含seqidno:72所示的氨基酸序列。202.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含seqidno:70-72中任一项所示的氨基酸序列。203.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。204.例如，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。205.例如，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。206.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。207.在本技术中，术语“乙肝表面抗原(hbsag)”通常是指乙肝病毒最外层包膜中的一种外壳蛋白。例如，乙肝表面抗原的氨基酸序列可以为ncbi中的蛋白序列检索号aaa45524、anj76941、caa24234或aac34729对应的序列，也可以适宜地截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸，或有蛋白的突变，例如缺失、置换或插入一个或多个氨基酸。208.例如，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可包含seqidno:73所示的氨基酸序列。209.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。210.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。211.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。212.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以与所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段在框内融合。213.在本技术中，所述“直接或间接相连”通常是指两段序列直接相连和间接相连这两种不同的连接方式，其中的直接相连是指两段序列之间的连接没有任何人为添加的其余序列，如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等的参与。间接相连则是指两段序列是通过人为添加连接序列，例如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等手段实现的两段序列的连接方式。在某些实施方式中，所述柔性linker可以包含gsgsg(seqidno:89)的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述连接序列可以包含sftvekgiyqtsnf(seqidno:90)的氨基酸序列。214.在本技术中，所述融合蛋白还可以包含信号肽。在某些实施方式中，可以在所述融合蛋白的n段添加mgwsciilflvatatgvhs(seqidno:91)的信号肽序列。215.在本技术中，所述的融合蛋白可包含seqidno:1-17、80和86中任一项所示的氨基酸序列。216.另一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。217.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的ntd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以在l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i中的一个或多个氨基酸突变。218.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd可以包含l18f、t20n、p26s、d138y和r190s氨基酸突变。例如，所述ntd可以包含seqidno：84所示的氨基酸序列。219.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含例如beta突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。在某些实施方式中，所述ntd可以包含seqidno：77所示的氨基酸序列。220.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以包含破伤风毒素的表位肽。221.例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。例如，所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。222.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。223.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。224.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。225.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以与所述p2或其功能活性片段在框内融合。226.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。在某些实施方式中，所述噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基可以包含seqidno:78所示的氨基酸序列。227.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个氨基酸残基或突变体。在本技术中，foldon结构域可以是噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个残基截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。228.例如，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。229.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。230.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端直接或间接相连。231.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。232.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。233.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。234.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段可包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。235.在本技术中，铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的轻链”、“lc”可以与“ferritinlc”互换使用。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的重链”、“hc”可以与“ferritinhc”互换使用。在本技术中，“幽门螺杆菌铁蛋白”可以与“hpferritin”互换使用。236.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链可包含seqidno:70所示的氨基酸序列。237.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链可包含seqidno:71所示的氨基酸序列。238.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。239.在本技术中，所述幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段可包含seqidno:72所示的氨基酸序列。240.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含seqidno:70-72中任一项所示的氨基酸序列。241.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。242.例如，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。243.例如，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。244.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。245.在本技术中，术语“乙肝表面抗原(hbsag)”通常是指乙肝病毒最外层包膜中的一种外壳蛋白。例如，乙肝表面抗原的氨基酸序列可以为ncbi中的蛋白序列检索号aaa45524、anj76941、caa24234或aac34729对应的序列，也可以适宜地截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸，或有蛋白的突变，例如缺失、置换或插入一个或多个氨基酸。246.例如，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可包含seqidno:73所示的氨基酸序列。247.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。248.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的n端直接或间接地相连。249.在本技术中，所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。250.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以与所述乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段在框内融合。251.在本技术中，所述“直接或间接相连”通常是指两段序列直接相连和间接相连这两种不同的连接方式，其中的直接相连是指两段序列之间的连接没有任何人为添加的其余序列，如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等的参与。间接相连则是指两段序列是通过人为添加连接序列，例如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等手段实现的两段序列的连接方式。在某些实施方式中，所述柔性linker可以包含gsgsg(seqidno:89)的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述连接序列可以包含sftvekgiyqtsnf(seqidno:90)的氨基酸序列。252.在本技术中，所述融合蛋白还可以包含信号肽。在某些实施方式中，可以在所述融合蛋白的n段添加mgwsciilflvatatgvhs(seqidno:91)的信号肽序列。253.在本技术中，所述的融合蛋白可包含seqidno:20-36、81和87中任一项所示的氨基酸序列。254.另一方面，本技术提供了一种融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。255.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的rbd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以在k417、l452、t478、e484、和n501中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。256.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417t、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。例如，所述rbd可以包含seqidno：83所示的氨基酸序列。在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含beta突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417n、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。例如，所述rbd可以包含seqidno：76所示的氨基酸序列。257.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的ntd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以在l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i中的一个或多个氨基酸突变。258.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd可以包含l18f、t20n、p26s、d138y和r190s氨基酸突变。例如，所述ntd可以包含seqidno：84所示的氨基酸序列。259.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含beta突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。例如，所述ntd可以包含seqidno：77所示的氨基酸序列。260.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。261.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地连接。262.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段的c端与所述ntd或其功能活性片段的n端直接或间接地连接。263.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段在框内融合。264.在本技术中，所述的融合蛋白还可以包括一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。265.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可包含破伤风毒素的表位肽。266.例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段或其突变体。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，p2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。267.例如，所述破伤风毒素的表位肽可包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。268.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。269.例如，所述rbd或其功能活性片段的n端可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地连接，且所述p2或其功能活性片段的n端可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地连接。270.在本技术中，所述p2或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段和所述ntd或其功能活性片段在框内融合。271.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。在某些实施方式中，所述噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基包含seqidno:78所示的氨基酸序列。272.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个氨基酸残基或突变体。在本技术中，foldon结构域可以是噬菌体t4纤维蛋白c末端的27个残基截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。273.例如，所述foldon结构域或其功能活性片段可包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。274.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。275.例如，所述foldon结构域或其功能活性片段的n端可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。276.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和所述ntd或其功能活性片段在框内融合。277.在本技术中，所述foldon结构域或其功能活性片段的n端与所述p2或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述p2或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性的c端直接或间接地相连。278.在本技术中，所述p2或其功能活性片段、foldon结构域或其功能活性片段、所述rbd或其功能活性片段和所述ntd或其功能活性片段在框内融合。279.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。280.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。281.在本技术中，铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的轻链”、“lc”可以与“ferritinlc”互换使用。在本技术中，“粉纹夜蛾铁蛋白的重链”、“hc”可以与“ferritinhc”互换使用。在本技术中，“幽门螺杆菌铁蛋白”可以与“hpferritin”互换使用。282.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链可包含seqidno:70所示的氨基酸序列。283.在本技术中，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链可包含seqidno:71所示的氨基酸序列。284.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。285.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可包含seqidno:70-72任一项所示的氨基酸序列。286.在本技术中，所述铁蛋白或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。287.例如，所述铁蛋白或其功能活性片段的n端可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。288.例如，所述幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段的n端可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。289.在本技术中，所述幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段和所述ntd或其功能活性片段在框内融合。290.在本技术中，术语“乙肝表面抗原(hbsag)”通常是指乙肝病毒最外层包膜中的一种外壳蛋白。例如，乙肝表面抗原的氨基酸序列可以为ncbi中的蛋白序列检索号aaa45524、anj76941、caa24234或aac34729对应的序列，也可以适宜地截短或增加n端或c端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸，或有蛋白的突变，例如缺失、置换或插入一个或多个氨基酸。291.在本技术中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段可包含seqidno:73所示的氨基酸序列。292.在本技术中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段可以与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。293.在本技术中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段的n端可以与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端可以与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。294.在本技术中，所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和所述ntd或其功能活性片段在框内融合。295.在本技术中，所述“直接或间接相连”通常是指两段序列直接相连和间接相连这两种不同的连接方式，其中的直接相连是指两段序列之间的连接没有任何人为添加的其余序列，如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等的参与。间接相连则是指两段序列是通过人为添加连接序列，例如柔性linker、刚性linker或可剪切linker等手段实现的两段序列的连接方式。在某些实施方式中，所述柔性linker可以包含gsgsg(seqidno:89)的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述连接序列可以包含sftvekgiyqtsnf(seqidno:90)的氨基酸序列。296.在本技术中，所述融合蛋白还可以包含信号肽。在某些实施方式中，可以在所述融合蛋白的n段添加mgwsciilflvatatgvhs(seqidno:91)的信号肽序列。297.在本技术中，所述的融合蛋白包含seqidno:39-44、79、85和96中任一项所示的氨基酸序列。298.免疫原性组合物299.另一方面，本技术提供了一种免疫原性组合物，其包含所述的融合蛋白。300.在本技术中，术语“免疫原性组合物”通常是指一种亚单位组合物。在本技术中，亚单位组合物是在将组分混合形成抗原性组合物之前，其中组分已经被分离并纯化到至少50％、至少60％、70％、80％、90％纯度的组合物。例如，亚单位组合物可以是水溶性蛋白的水溶液。例如，所述亚单位组合物可包含洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含非-离子、两性离子或离子洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含脂类。在一些情形中，免疫原性组合物可包括rbd或其功能活性片段和ntd或其功能活性片段。在一些情形中，免疫原性组合物可包括rbd或其功能活性片段和包含ntd或其功能活性片段的融合蛋白。在一些情形中，免疫原性组合物可包括包含rbd或其功能活性片段的融合蛋白和ntd或其功能活性片段。在一些情形中，免疫原性组合物可包括包含rbd或其功能活性片段的融合蛋白和包含ntd或其功能活性片段的融合蛋白。在一些情形中，所述免疫原性组合物还可以包含一种或几种人流感病毒血凝素蛋白ha。在本技术中，所述ha可以包含seqidno:92-95中任一项所述的氨基酸序列。301.在某些实施方式中，所述的流感血凝素选自的流感毒株为每一年在who官网上公布的流行毒株，例如2021年who官网公布的流行毒株指的是a型(h1n1)epi1661231|ha|a/wisconsin/588/2019|epi_isl_404460，a型(h3n2)epi1843589|ha|a/cambodia/e0826360/2020|epi_isl_944639，b型epi1394970|ha|b/washington/02/2019|epi_isl_347829和b型epi529345|ha|b/phuket/3073/2013|epi_isl_161843。在一个实施方式中制备预防流感和新冠病毒疫苗组合物包括上述各型别ha蛋白50ug及突变的ntd-rbd-foldon蛋白50μg及疫苗组合中常用的佐剂，例如as03佐剂。302.例如，所述免疫原性组合物可以包含第一组分和第二组分，所述第一组分可以包含本技术所述的rbd或其功能活性片段及ntd或其功能活性片段的融合蛋白，所述融合蛋白还可以包含一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段；所述第二组分可以包含所述rbd或其功能活性片段，所述ntd或其功能活性片段，或任选地一种或几种人流感病毒血凝素蛋白ha。303.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的rbd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以在k417、l452、t478、e484和n501中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。304.在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417t、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。例如，所述rbd可以包含seqidno:83所示的氨基酸序列。在本技术中，所述rbd或其功能活性片段可以包含beta突变株s蛋白的rbd。在某些实施方式中，所述rbd或其功能活性片段可以包含k417n、e484k和n501y中的一个或多个氨基酸突变。在某些实施方式中，所述rbd可以包含seqidno:76所示的氨基酸序列。305.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以来源于sars-cov-2野生型s蛋白的ntd，也可以来源于sars-cov-2突变体s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以在l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246中的一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸突变。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i中的一个或多个氨基酸突变。306.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含gamma突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd可以包含l18f、t20n、p26s、d138y和r190s氨基酸突变。例如，所述ntd可以包含seqidno:84所示的氨基酸序列。307.在本技术中，所述ntd或其功能活性片段可以包含beta突变株s蛋白的ntd。在某些实施方式中，所述ntd或其功能活性片段可以包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。例如，所述ntd可以包含seqidno:77所示的氨基酸序列。308.在本技术中，所述免疫原性组合物还可包括佐剂。例如，所述的佐剂可以包括铝盐(例如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝)，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。例如，所述的免疫原性组合物还可以选择为th1型应答优先诱导物。例如，th1型应答优先诱导物可以包括单磷酰脂质a或其衍生物。例如，所述佐剂可以是单磷酰脂质a(例如，3-脱-o-酰化单磷酰脂质a(3d-mpl))和铝盐的组合。一种佐剂增强系统可以包括单磷酰脂质a和皂苷衍生物的组合，特别是wo94/00153公开的qs21和3d-mpl的组合，或者如wo96/33739公开的用胆固醇将qs21猝灭从而使反应原性较弱的一种组合物。例如，所述佐剂还可以是wo95/17210中所述的佐剂，其在水包油乳剂中含有qs21、3d-mpl和生育酚。例如，所述佐剂可以是吐温80、山梨糖醇三油酸酯和角鲨烯混合后于高压条件下进行微流化形成的均一小滴状乳液。例如，所述佐剂可包含寡核苷酸的未甲基化cpg(wo96/02555)。309.在本技术中，所述的免疫原性组合物包含第一组分，所述第一组分包含所述的融合蛋白；以及第二组分，所述第二组分包含所述的融合蛋白。310.在本技术中，所述的免疫原性组合物，其可按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。311.在本技术中，所述的免疫原性组合物，其可包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。312.在本技术中，术语“重量份”通常是指免疫原性组合物的第一组分和第二组分的重量比。在本技术中，免疫原性组合物每剂量可含有如下成份：第一组分5-60μg和第二组分5-60μg。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第一组分。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第二组分。313.另一方面，本技术提供了一种免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。314.在本技术中，所述的免疫原性组合物，其可按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。315.在本技术中，所述的免疫原性组合物，其可包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。316.在本技术中，所述rbd可包含seqidno:18-19中任一项所示的氨基酸序列。317.在本技术中，所述ntd包含seqidno:37-38中任一项所示的氨基酸序列。318.在本技术中，术语“重量份”通常是指免疫原性组合物的第一组分和第二组分的重量比。在本技术中，免疫原性组合物每剂量可含有如下成份：第一组分5-60μg和第二组分5-60μg。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第一组分。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第二组分。319.在一些情形中，所述免疫原性组合物可以包含第一组分ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg；以及第二组分ntd-foldon蛋白20～100μg，或rbd-foldon蛋白20～100μg，或流感病毒血凝素蛋白15～80μg。320.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含ntd-rbd-foldon(gamma突变株)蛋白20～100μg，ntd-foldon(gamma突变株)蛋白20～100μg，以及冻干保护剂，所述的冻干保护剂按照1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)的配方配制。321.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含ntd-rbd-foldon(gamma突变株)蛋白20～100μg，rbd-foldon(gamma突变株)蛋白20～100μg，以及冻干保护剂，所述的冻干保护剂按照1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)的配方配制。322.在某些实施方式中，所述的免疫原性组合物包含ntd-rbd-foldon(gamma突变株)蛋白20～100μg，流感病毒血凝素蛋白15～180μg，以及冻干保护剂，所述的冻干保护剂按照1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)的配方配制。323.另一方面，本发明提供了一种疫苗，其包含所述的融合蛋白，或所述的免疫原性组合物，及任选地药学上可接受的佐剂。324.在某些实施方式中，所述疫苗包含0.5ml的融合蛋白或免疫原性组合物，及0.5ml任选地药学上可接受的佐剂。325.本发明所述的佐剂选自角鲨烯、mf59、as03、单磷脂酰脂质a、鞭毛蛋白、cpg-odn、胞壁酰二肽、以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。这些佐剂均是本领域所熟知并可通过若干商业渠道获得的。326.在某些实施方式中，所述佐剂是氢氧化铝佐剂。327.在某些实施方式中，所述佐剂是mf59佐剂。328.在某些实施方式中，所述佐剂优选地是as03佐剂。329.所述as03佐剂的成分包括10.69mg的角鲨烯、11.86mg的α-生育酚、4.86mg的聚山梨酯80、3.53mg的氯化钠、0.09mg的氯化钾、0.51mg的磷酸氢二钠、0.09mg的磷酸二氢钾。330.所述mf59佐剂的成分包括4.5％的角鲨烯，0.5％tween80，0.5％span85。331.在某些实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及as03佐剂。332.在某些实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg，h1n1毒株的ha15～45μg，h3n2毒株的ha15～45μg，和b/washington/02/2019毒株的ha15～45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及as03佐剂。333.在某些实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg，h1n1毒株的ha15～45μg，h3n2毒株的ha15～45μg，b/washington/02/2019毒株的ha15～45μg，和b/phuket/3073/2013毒株的ha15～45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及as03佐剂。334.在某些实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg，h1n1毒株的ha15～45μg，h3n2毒株的ha15～45μg，和b/washington/02/2019毒株的ha15～45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及mf59佐剂。335.在某些实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白20～100μg，h1n1毒株的ha15～45μg，h3n2毒株的ha15～45μg，b/washington/02/2019毒株的ha15～45μg，和b/phuket/3073/2013毒株的ha15～45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及mf59佐剂。336.在某些优选的实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白50μg，h1n1毒株的ha45μg，h3n2毒株的ha45μg，b/washington/02/2019毒株的ha45μg，和b/phuket/3073/2013毒株的ha45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及as03佐剂。337.在某些优选的实施方式中，所述疫苗包含ntd-rbd-foldon蛋白50μg，h1n1毒株的ha45μg，h3n2毒株的ha45μg，b/washington/02/2019毒株的ha45μg，和b/phuket/3073/2013毒株的ha45μg，1％(w/v)蔗糖，2％(w/v)甘氨酸，0.02％(w/v)吐温80和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，以及mf59佐剂。338.在本技术中，所述rbd-ntd-foldon(beta突变株)可以包含seqidno:79所示的氨基酸序列。在本技术中，所述rbd-ntd-foldon(gamma突变株)可以包含seqidno:85所示的氨基酸序列。在本技术中，所述rbd-ntd-foldon(wuhan-1)可以包含seqidno:96所示的氨基酸序列。339.在本技术中，所述免疫原性组合物还可以包含一种或几种人流感病毒血凝素蛋白ha。在本技术中，所述ha可以包含seqidno:92-95中任一项所述的氨基酸序列。340.在本技术中，所述rbd还可以包含seqidno:97-108中任一项所示的氨基酸序列。341.在本技术中，所述ntd还可以包含seqidno:109-111中任一项所示的氨基酸序列。342.核酸分子、药物组合物、应用343.另一方面，本技术还提供了一种或多种分离的核酸分子，其可以编码本技术所述的融合蛋白。在某些实施方式中，所述核酸分子可以包含mrna。344.另一方面，本技术提供了一种药物组合物，其包含所述的融合蛋白，或所述的免疫原性组合物，及任选地药学上可接受的赋形剂。345.所述药学上可接受的载体可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。346.在本技术中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。347.所述药物组合物可以用于抑制或延缓疾病或病症的发展或进展，和/或可以减轻和/或稳定疾病或病症的状态。348.本技术所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述融合蛋白、或所述的免疫原性组合物。349.所述预防和/或治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的疾病或病症和/或其任何并发症而所需的剂量。350.在本技术中，术语“有效量”通常是指可以缓解或者消除受试者的疾病或症状，或者可以预防性地抑制或防止疾病或症状发生的药物的量。通常，可根据受试者的体重、年龄、性别、饮食、排泄速率、过往病史、现用治疗、给药时间、剂型、给药方法、给药途径、药物组合、所述受试者的健康状况和交叉感染的潜力、过敏、超敏和副作用、和/或上皮(或内皮)组织疾病发展的程度等来确定具体的有效量。本领域技术人员(例如，医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求按比例降低或升高剂量。351.在本技术中，所述受试者可以包括人或非人动物。例如，所述非人动物可以选自下组：猴、鸡、鹅、猫、狗、小鼠和大鼠。此外，非人动物也可以包括任何除人以外的动物物种，例如家畜动物，或啮齿类动物，或灵长类动物，或家养动物，或家禽动物。所述人可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族，或各种种族的杂合体。又例如，所述人可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。352.可以根据在实验动物中的有效量推测在人类中的有效量。例如，freireich等人描述了动物和人的剂量的相互关系(基于每平方米身体表面的毫克数)(freireichetal.，cancerchemother.rep.50，219(1966))。身体表面积可以从患者的身高和体重近似确定。参见例如scientifictables，geigypharmaceuticals，ardsley，n.y.，537(1970)。353.另一方面，本技术提供了一种所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。354.在本技术中，所述疫苗可用于预防和/或治疗covid-19。355.另一方面，本技术提供了一种所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物，用于治疗和/或预防covid-19。356.另一方面，本技术提供了一种制备covid-19亚单位疫苗的方法，其包括：357.1)提供所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物；以及358.2)使1)中所述融合蛋白或免疫原性组合物与药学上可接受的佐剂混合。359.另一方面，本技术提供了一种检测sars-cov-2中和抗体的方法，其包括：360.1)向受试者施用所述的covid-19亚单位疫苗；以及361.2)检测1)中所述受试者在接受所述covid-19亚单位疫苗后体内产生的中和抗体。362.另一方面，本技术提供了一种治疗和/或预防covid-19的方法，其包括向受试者施用所述的融合蛋白或所述的免疫原性组合物或所述的covid-19亚单位疫苗。363.本技术还涉及以下的具体实施方式：364.1.融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。365.2.根据实施方式1所述的融合蛋白，其中所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。366.3.根据实施方式2所述的融合蛋白，其中所述sar-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。367.4.根据实施方式1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd与野生型sars-cov-2的rbd相比，在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。368.5.根据实施方式1-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。369.6.根据实施方式1-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。370.7.根据实施方式1-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。371.8.根据实施方式1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。372.9.根据实施方式1-8任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。373.10.根据实施方式9所述的融合蛋白，其中所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。374.11.根据实施方式1-10任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。375.12.根据实施方式1-11任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述p2或其功能活性片段在框内融合。376.13.根据实施方式1-12任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。377.14.根据实施方式1-13任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。378.15.根据实施方式1-14任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。379.16.根据实施方式1-15任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。380.17.根据实施方式1-16任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。381.18.根据实施方式17所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。382.19.根据实施方式18所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。383.20.根据实施方式18-19任一项所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。384.21.根据实施方式1-20任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。385.22.根据实施方式1-21任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72中任一项所示的氨基酸序列。386.23.根据实施方式1-22任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。387.24.根据实施方式1-23任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。388.25.根据实施方式1-24任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。389.26.根据实施方式1-25任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。390.27.根据实施方式1-26任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述乙肝表面抗原或其功能活性片段在框内融合。391.28.根据实施方式11-27任一项所述的融合蛋白，其中所述直接或间接相连可以包含通过连接子相连。392.29.根据实施方式28所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含刚性接头，柔性接头或其他序列。393.30.根据实施方式28-29任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含seqidno:89-90中任一项所示的氨基酸序列。394.31.根据实施方式1-30任一项所述的融合蛋白，其包含seqidno:1-17、80和86中任一项所示的氨基酸序列。395.32.融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。396.33.根据实施方式32所述的融合蛋白，其中所述ntd源自sars-cov-2野生型或其突变体s蛋白的ntd。397.34.根据实施方式33所述的融合蛋白，其中所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。398.35.根据实施方式32-34中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。399.36.根据实施方式32-35中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。400.37.根据实施方式32-36中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。401.38.根据实施方式32-37中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r190s氨基酸突变。402.39.根据实施方式32-38中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。403.40.根据实施方式32-39中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。404.41.根据实施方式32-40任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。405.42.根据实施方式41所述的融合蛋白，其中所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。406.43.根据实施方式32-42任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。407.44.根据实施方式32-43任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd或其功能活性片段与所述p2或其功能活性片段在框内融合。408.45.根据实施方式32-44任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。409.46.根据实施方式32-45任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。410.47.根据实施方式32-46任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。411.48.根据实施方式32-47任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd或其功能活性片段与所述foldon结构域或其功能活性片段在框内融合。412.49.根据实施方式32-48任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。413.50.根据实施方式49所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。414.51.根据实施方式50所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。415.52.根据实施方式50-51任一项所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。416.53.根据实施方式32-52任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。417.54.根据实施方式32-53任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72任一项所示的氨基酸序列。418.55.根据实施方式32-54任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。419.56.根据实施方式32-55任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd或其功能活性片段与所述铁蛋白或其功能活性片段在框内融合。420.57.根据实施方式32-56任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。421.58.根据实施方式32-57任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。422.59.根据实施方式32-58任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd或其功能活性片段与所述乙肝表面抗原或其功能活性片段在框内融合。423.60.根据实施方式43-59任一项所述的融合蛋白，其中所述直接或间接相连可以包含通过连接子相连。424.61.根据实施方式60所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含刚性接头，柔性接头或其他序列。425.62.根据实施方式60-61任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含seqidno:89-90中任一项所示的氨基酸序列。426.63.根据实施方式32-62中任一项所述的融合蛋白，其包含seqidno:20-36、81和87中任一项所示的氨基酸序列。427.64.融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。428.65.根据实施方式64所述的融合蛋白，其中所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。429.66.根据实施方式65所述的融合蛋白，其中所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。430.67.根据实施方式64-66中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。431.68.根据实施方式64-67中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。432.69.根据实施方式64-68中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。433.70.根据实施方式64-69中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。434.71.根据实施方式64-70中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。435.72.根据实施方式64-71任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd源自sars-cov-2野生型或其突变体。436.73.根据实施方式72所述的融合蛋白，其中所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。437.74.根据实施方式64-73中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t19、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。438.75.根据实施方式64-74中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t19r、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。439.76.根据实施方式64-75中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。440.77.根据实施方式64-76中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r190s氨基酸突变。441.78.根据实施方式64-77中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。442.79.根据实施方式64-78中任一项所述的融合蛋白，其中所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。443.80.根据实施方式64-79任一项所述的融合蛋白，其还包括一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。444.81.根据实施方式64-80任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。445.82.根据实施方式64-81任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述ntd或其功能活性片段在框内融合。446.83.根据实施方式64-82任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。447.84.根据实施方式83所述的融合蛋白，其中所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。448.85.根据实施方式64-84任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。449.86.根据实施方式64-85任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。450.87.根据实施方式64-86任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性片段的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。451.88.根据实施方式64-87任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。452.89.根据实施方式64-88任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。453.90.根据实施方式64-89任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。454.91.根据实施方式64-90任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。455.92.根据实施方式64-91任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。456.93.根据实施方式64-92任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段的n端与所述p2或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述p2或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性的c端直接或间接地相连。457.94.根据实施方式64-93任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段。458.95.根据实施方式94所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。459.96.根据实施方式95所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列。460.97.根据实施方式95-96任一项所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。461.98.根据实施方式64-97任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。462.99.根据实施方式64-98任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72任一项所示的氨基酸序列。463.100.根据实施方式64-99任一项所述地融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。464.101.根据实施方式64-100任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。465.102.根据实施方式64-101任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段的n端与所述rbd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连，所述rbd或其功能活性的n端与所述ntd或其功能活性片段的c端直接或间接地相连。466.103.根据实施方式64-102任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。467.104.根据实施方式64-103任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段直接或间接地相连。468.105.根据实施方式64-104任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段与所述rbd或其功能活性片段和/或所述ntd或其功能活性片段在框内融合。469.106.根据实施方式81-105任一项所述的融合蛋白，其中所述直接或间接相连可以包含通过连接子相连。470.107.根据实施方式106所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含刚性接头，柔性接头或其他序列。471.108.根据实施方式81-107所述的融合蛋白，其中所述连接子可以包含seqidno:89-90中任一项所示的氨基酸序列。472.109.根据实施方式64-108中任一项所述的融合蛋白，其包含seqidno:39-44、79、85和96中任一项所示的氨基酸序列。473.110.免疫原性组合物，其包含实施方式1-109中任一项所述的融合蛋白。474.111.根据实施方式110所述的免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含实施方式1-109中任一项所述的融合蛋白。475.112.根据实施方式110所述的免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含实施方式1-109中任一项所述的融合蛋白；以及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。476.113.根据实施方式110所述的免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含实施方式1-109中任一项所述的融合蛋白；以及第二组分，所述第二组分包含实施方式1-109中任一项所述的融合蛋白。477.114.根据实施方式110-113任一项所述的免疫原性组合物，其按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。478.115.根据实施方式110-114任一项所述的免疫原性组合物，其包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。479.116.免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。480.117.根据实施方式116所述的免疫原性组合物，其中所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。481.118.根据实施方式117所述的免疫原性组合物，其中所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。482.119.根据实施方式116-118中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。483.120.根据实施方式116-119中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。484.121.根据实施方式116-120中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。485.122.根据实施方式116-121中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。486.123.根据实施方式116-122中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。487.124.根据实施方式116-123任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd源自sars-cov-2野生型或其突变体。488.125.根据实施方式124所述的免疫原性组合物，其中所述sars-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。489.126.根据实施方式116-125中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含在选自下组的一个或多个氨基酸位点的突变：l18、t20、p26、d80、d138、r190、d215、l242-244和r246。490.127.根据实施方式116-126中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：l18f、t20n、p26s、d80a、d138y、r190s、d215g、l242-244del和r246i。491.128.根据实施方式116-127中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r246i突变。492.129.根据实施方式116-128中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含l18f、d80a、d215g、l242-244del和r190s氨基酸突变。493.130.根据实施方式116-129中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含l18f、t20n、p26s、d138y和r246i氨基酸突变。494.131.根据实施方式116-130中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含seqidno:37、38、77、84和109-111中任一项所示的氨基酸序列。495.132.根据实施方式116-131任一项所述的免疫原性组合物，其按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。496.133.根据实施方式111-132任一项所述的免疫原性组合物，其包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。497.134.根据实施方式116-133任一项所述的免疫原性组合物，其中所述rbd包含seqidno:18-19中任一项所示的氨基酸序列。498.135.根据实施方式116-134任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ntd包含seqidno:37-38中任一项所示的氨基酸序列。499.136.一种或多种分离的核酸分子，其编码权利要求1-109中任一项所述的融合蛋白。500.137.根据权利要求136所述的核酸分子，其包含mrna。501.138.药物组合物，其包含实施方式1-109任一项所述的融合蛋白，或实施方式110-135中任一项所述的免疫原性组合物，或实施方式136-137中任一项所述的核酸分子，及任选地药学上可接受的赋形剂。502.139.实施方式1-109任一项所述的融合蛋白或实施方式110-135任一项所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。503.140.根据实施方式139所述的用途，其中所述疫苗用于预防和/或治疗covid-19。504.141.实施方式1-109任一项所述的融合蛋白，或实施方式110-135任一项所述的免疫原性组合物，或实施方式136-137中任一项所述的核酸分子，用于治疗和/或预防covid-19。505.142.一种制备covid-19亚单位疫苗的方法，其包括：506.1)提供实施方式1-109任一项所述的融合蛋白或实施方式110-135任一项所述的免疫原性组合物；以及507.2)使1)中所述融合蛋白或免疫原性组合物与药学上可接受的佐剂混合。508.143.一种检测sars-cov-2中和抗体的方法，其包括：509.1)向受试者施用实施方式142所述的covid-19亚单位疫苗；以及510.2)检测1)中所述受试者在接受所述covid-19亚单位疫苗后体内产生的中和抗体。511.144.一种治疗和/或预防covid-19的方法，其包括向受试者施用实施方式1-109任一项所述的融合蛋白，或实施方式110-135任一项所述的免疫原性组合物，或实施方式136-137中任一项所述的核酸分子，或实施方式142所述的covid-19亚单位疫苗。512.本技术还提供了以下实施方案：513.1.融合蛋白，其包含：1)sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段；以及2)一种或多种选自下组的多肽：p2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(hbsag)或其功能活性片段。514.2.根据实施方案1所述的融合蛋白，其中所述rbd源自sars-cov-2野生型或其突变体。515.3.根据实施方案2所述的融合蛋白，其中所述sar-cov-2突变体选自下组中的任一种：gamma突变体、beta突变体、delta突变体和alpha突变体。516.4.根据实施方案1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd与野生型sars-cov-2的rbd相比，在选自下组的一个或多个氨基酸位点有突变：k417、l452、t478、e484和n501。517.5.根据实施方案1-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含氨基酸突变k417t/n、l452r、t478k、e484k和n501y的一种或多种。518.6.根据实施方案1-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417t、e484k和n501y氨基酸突变。519.7.根据实施方案1-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含k417n、e484k和n501y氨基酸突变。520.8.根据实施方案1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd包含seqidno:18、19、76、83、97-108中任一项所示的氨基酸序列。521.9.根据实施方案1-8中任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽与所述rbd或其功能活性片段的n端或c端直接或间接地相连。522.10.根据实施方案1-9中任一项所述的融合蛋白，其中所述rbd或其功能活性片段与所述多肽在框内融合。523.11.根据实施方案1-10中任一项所述的融合蛋白，其中所述p2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。524.12.根据实施方案11所述的融合蛋白，其中所述破伤风毒素的表位肽包含seqidno:64-66中任一项所示的氨基酸序列。525.13.根据实施方案1-12中任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体t4纤维蛋白c末端的氨基酸残基。526.14.根据实施方案1-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述foldon结构域或其功能活性片段包含seqidno:67-69和78中任一项所示的氨基酸序列。527.15.根据实施方案1-14中任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含粉纹夜蛾铁蛋白、幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段。528.16.根据实施方案15所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白或其功能活性片段包括粉纹夜蛾铁蛋白的重链或轻链。529.17.根据实施方案16所述的融合蛋白，其中所述粉纹夜蛾铁蛋白的重链包含seqidno:70所示的氨基酸序列，所述粉纹夜蛾铁蛋白的轻链包含seqidno:71所示的氨基酸序列。530.18.根据实施方案1-17中任一项所述的融合蛋白，其中所述铁蛋白或其功能活性片段包含seqidno:70-72中任一项所示的氨基酸序列。531.19.根据实施方案1-18中任一项所述的融合蛋白，其中所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含seqidno:73所示的氨基酸序列。532.20.根据实施方案9-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述直接或间接相连包含通过连接子相连。533.21.根据实施方案20所述的融合蛋白，其中所述连接子包含刚性接头，柔性接头或其他序列。534.22.根据实施方案20-21中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子包含seqidno:89-90中任一项所示的氨基酸序列。535.23.根据实施方案1-22中任一项所述的融合蛋白，其包含seqidno:1-17、80和86中任一项所示的氨基酸序列。536.24.免疫原性组合物，其包含实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白。537.25.根据实施方案24所述的免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含权利1-23中任一项所述的融合蛋白，及第二组分，所述第二组分包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段。538.26.根据实施方案25所述的免疫原性组合物，其按下述重量比配制而成：1)第一组分(1-15重量份)；和/或2)第二组分(1-15重量份)。539.27.根据实施方案25-26中任一项所述的免疫原性组合物，其包含：1)5-60μg第一组分；和/或2)5-60μg第二组分。540.28.根据实施方案24-27中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含至少一种人流感病毒血凝素蛋白ha。541.29.根据实施方案28所述的免疫原性组合物，其中所述ha包含seqidno:92-95中任一项所述的氨基酸序列。542.30.一种或多种分离的核酸分子，其编码实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白。543.31.根据实施方案30所述的核酸分子，其包含mrna。544.32.药物组合物，其包含实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白，实施方案24-29中任一项所述的免疫原性组合物，或实施方案30-31中任一项所述的核酸分子，及任选地药学上可接受的赋形剂。545.33.实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白、实施方案24-29中任一项所述的免疫原性组合物、实施方案30-31中任一项所述的核酸分子、或实施方案30所述的药物组合物在制备疫苗中的用途。546.34.根据实施方案33所述的用途，其中所述疫苗用于预防和/或治疗covid-19。547.35.一种制备covid-19亚单位疫苗的方法，其包括：548.36.提供实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白、实施方案24-29中任一项所述的免疫原性组合物或实施方案30-31中任一项所述的核酸分子；以及549.37.使1)中所述的免疫原性组合物与药学上可接受的佐剂混合。550.38.一种检测sars-cov-2中和抗体的方法，其包括：551.1)向受试者施用实施方案35所述的covid-19亚单位疫苗；以及552.2)检测1)中所述受试者在接受所述covid-19亚单位疫苗后体内产生的中和抗体。553.不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本技术的融合蛋白、免疫原性组合物、制备方法和用途等，而不用于限制本技术发明的范围。此外，实施例中无论是否有6个或8个his标签或n端的信号肽，不影响保护范围，熟悉本领域的技术人员根据本技术发明的内容对实施例进行非本质的改进和调整，仍属于本技术发明的保护范围。554.实施例555.实施例1构建rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒556.信号肽添加：mgvpavpeassprwgtlllaiflaasrglvaa(seqidno：74)。载体选择:pcdna3.1( )，按照宿主cho细胞进行密码子优化。557.片段的克隆。rbd-p2-6*his的引物通过pcr的方法扩增得到片段pcr产物,通过多段重组的方法重组到目的载体pcdna3.1( )(bamhi-xhoi酶切载体)中，得到rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒。反应体系如表1所示。558.表1处理好的目的片段与载体连接反应体系559.名称体积酶切后载体5μl纯化的pcr产物5μl无缝组装mix10μl总体积20μl560.以上连接液在52℃恒温环境下连接30min，得到rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒。561.转化的方法：(1)将浓度在100ng/μl的rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒吸取1-3μl加入到100μl的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。(2)42℃水浴90s不要摇动。(3)冰浴中放置3分钟左右。(4)每管中加入500-800μl37℃预温lb培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。562.rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒的验证：(1)制备含相应抗性的琼脂平板。(2)取100μl菌液，然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。(4)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行pcr鉴定，将阳性克隆菌液送测序。563.克隆质粒的鉴定方法：pcr扩增rbd-p2-6*his片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成预期扩增的片段长度为861bp，pcr反应采用20μl体系：引物0.5μl，模板菌液2μl，聚合酶缓冲液0.5μl，buffer3μl，ddh2o14μl。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液pcr方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得861bp、5372bp两个片段。564.rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒抽提：接1％含rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒的大肠杆菌细胞(stbl3)于2mllb培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100ug质粒。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得861bp、5372bp两个片段。565.实施例2细胞转染及rbd-p2-6*his蛋白纯化566.在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞，避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增cho细胞(来自thermo公司的expicho)直到细胞密度达到4×106–6×106个/ml。第-1天：细胞扩增，扩增培养细胞到3×106–4×106个/ml，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106–10×106个/ml,存活率到95–99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/ml，50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。使用opti-prosfm培养基制备转染试剂和rbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒复合物(4℃)，例：1mlcho细胞准备40μlopti-prosfm添加0.8ugrbd-p2-6*his(gp101150-7)重组表达质粒混匀放置5min；准备40μlopti-prosfm添加3μlexpifectaminecho试剂混匀放置5min，室温下1–5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后18-22小时，添加enhancer和expichofeed，执行标准实验方案。例：1ml细胞添加6μlenhancer和0.24mlexpichofeed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后8天收集，进行后续纯化。567.蛋白纯化。培养基离心，上清添加ni柱，振荡孵育2h，经过重力空柱管柱进行亲和层析纯化。平衡缓冲液：“pbs”,ph7.4，清洗10cv；清洗缓冲液：“pbs”,ph7.4with20mmimidazole，清洗10cv；洗脱缓冲液：“pbs”,ph7.4with500mmimidazole，洗脱1cv，重复5次，得到rbd-p2-6*his纯化蛋白，如表2所示。568.表2蛋白纯化后的浓度和体积569.p101150-7concentration(mg/ml)volume(ml)rbd-p2-6*his0.051570.sds-page电泳与wb验证。a.1.0mmpage胶，上样量8μl，跑胶顺序：m.molecularweightmarker.me.culturemedium.ft.flowthrough.w.wash.e.elutedfractions。b.电泳:将rbd-p2-6*his纯化蛋白与上样缓冲液混合(rbd-p2-6*his纯化蛋白:5x上样缓冲液＝4:1)，煮沸5min，进行点样。首先100v恒压电泳，可以看到marker逐渐变成一条细线。待marker进入分离胶后，将电压调到300v继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25min)。c.转膜，撬开玻璃板，小心取出凝胶。pvdf膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20v恒压转移，50kda蛋白需20min。分子量越大需时间越长。d.抗体孵育，转膜后取出pvdf膜，可以看到marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100mlpbst)封闭1小时，用pbst漂洗2x5min。一抗(anti-hismab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100mltbs)稀释，放在小盒中孵育，4℃脱色摇床中反应2h。取出pvdf膜,pbst漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。pbst漂洗4x10min。均使用摇床震动。e.显色，ecl显色:每一块pbst膜，用a液1ml和b液10μl混合后滴在膜上，5min后在化学发光成像系统中拍照记录，如图1所示。571.实施例3构建ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒572.信号肽添加：mfvflvllplvs(seqidno：75)，载体选择:pcdna3.1( )。按照宿主cho细胞进行密码子优化。ntd-p2-6*his的引物通过pcr的方法扩增得到片段pcr产物,通过多段重组的方法重组到目的载体pcdna3.1( )(bamhi-xhoi酶切载体)中，得到ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒。反应体系如表3所示。573.表3处理好的目的片段与载体连接反应体系574.名称体积酶切后载体5μl纯化的pcr产物5μl无缝组装mix10μl总体积20μl575.转化的方法：将浓度在100ng/μl左右的ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒吸取1-3μl加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。42℃水浴90s不要摇动；冰浴中放置3分钟左右；每管中加入500-800μl37℃预温lb培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。576.ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒的验证：(1)制备含相应抗性的琼脂平板。(2)取100μl菌液，然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。(4)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行pcr鉴定，将阳性克隆菌液送测序。577.克隆质粒的鉴定方法：pcr扩增ntd-p2-6*his片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成预期扩增的片段长度为1005bp，pcr反应采用20μl体系：引物0.5μl，模板菌液2μl，聚合酶缓冲液0.5μl，buffer3μl，ddh2o14μl。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液pcr方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得1005bp、5372bp两个片段。578.ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒抽提。接1％含ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒的大肠杆菌细胞(stbl3)于2mllb培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100ug质粒。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得1005bp、5372bp两个片段。579.实施例4细胞转染及ntd-p2-6*his(gp101150-8)蛋白纯化580.在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞；避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增cho细胞直到细胞密度达到4×106–6×106个/ml。第-1天：cho细胞扩增，扩增培养细胞到3×106–4×106个/ml，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106–10×106个/ml,存活率到95–99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/ml，50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。使用opti-prosfm培养基制备转染试剂和ntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒复合物(4℃)，例：1ml细胞准备40μlopti-prosfm添加0.8ugntd-p2-6*his(gp101150-8)重组表达质粒混匀放置5min；准备40μlopti-prosfm添加3μlexpifectaminecho试剂混匀放置5min，室温下1–5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后18-22小时，添加enhancer和expichofeed，执行标准实验方案。例：1ml细胞添加6μlenhancer和0.24mlexpichofeed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后8天收集，进行后续纯化。581.蛋白纯化，培养基离心，上清添加ni柱，振荡孵育2h，经过重力空柱管柱进行亲和层析纯化。平衡缓冲液：“pbs”,ph7.4，清洗10cv；清洗缓冲液：“pbs”,ph7.4with20mmimidazole，清洗10cv；洗脱缓冲液：“pbs”,ph7.4with500mmimidazole，洗脱1cv，重复5次，得到ntd-p2-6*his(gp101150-8)纯化蛋白，结果如表4所示。582.表4ntd-p2-6*his(gp101150-8)纯化蛋白的浓度和体积583.p101150-8浓度(mg/ml)体积(ml)ntd-p2-6*his0.031584.sds-page电泳与wb验证。a.1.0mmpage胶，上样量8μl，跑胶顺序：m.molecμlarweightmarker.me.cμlturemedium.ft.flowthrough.w.wash.e.elutedfractions。b.电泳:将ntd-p2-6*his(gp101150-8)纯化蛋白与上样缓冲液混合(ntd-p2-6*his(gp101150-8)纯化蛋白:5x上样缓冲液＝4:1)，煮沸5min，进行点样。首先100v恒压电泳，可以看到marker逐渐变成一条细线。待marker进入分离胶后，将电压调到300v继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25min)。c.转膜。撬开玻璃板，小心取出凝胶。pvdf膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20v恒压转移，50kda蛋白需20min。分子量越大需时间越长。d.抗体孵育。转膜后取出pvdf膜，可以看到marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100mlpbst)封闭1小时，用pbst漂洗2x5min。一抗(anti-hismab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100mltbs)稀释，放在小盒中孵育，4'c脱色摇床中反应2h。取出pvdf膜,pbst漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。pbst漂洗4x10min。均使用摇床震动。e.显色。ecl显色:每一块pbst膜，用a液1ml和b液10μl混合后滴在膜上，5min后在化学发光成像系统中拍照记录，如图2所示。585.实施例5构建ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒586.信号肽添加：mfvflvllplvs(seqidno：75)，载体选择:pcdna3.1( )。按照宿主cho细胞进行密码子优化。ntd-rbd-foldon-8*his的引物通过pcr的方法扩增得到片段pcr产物，通过多段重组的方法重组到目的载体pcdna3.1( )(bamhi-xhoi酶切载体)中，得到ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒。反应体系如表5所示。587.表5处理好的目的片段与载体连接反应体系588.名称体积酶切后载体5μl纯化的pcr产物5μl无缝组装mix10μl总体积20μl589.转化的方法：将浓度在100ng/μl左右的ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒吸取1-3μl加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。42℃水浴90s不要摇动；冰浴中放置3分钟左右；每管中加入500-800μl37℃预温lb培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。590.ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒的验证：(1)制备含相应抗性的琼脂平板。(2)取100μl菌液,然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。(4)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行pcr鉴定，将阳性克隆菌液送测序。591.克隆质粒的鉴定方法：pcr扩增ntd-rbd-foldon-8*his片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成预期扩增的片段长度为1761bp，pcr反应采用20μl体系：引物0.5μl，模板菌液2μl，聚合酶缓冲液0.5μl，buffer3μl，ddh2o14μl。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液pcr方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得1761bp、5372bp两个片段。592.ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒抽提。接1％含ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒的大肠杆菌细胞(stbl3)于2mllb培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100ug质粒。测序比对正确的质粒，用bamhi‑‑xhoi进行双酶切，获得1761bp、5372bp两个片段。593.实施例6细胞转染及蛋白纯化594.在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞；避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增cho细胞直到细胞密度达到4×106–6×106个/ml。第-1天：细胞扩增，扩增培养细胞到3×106–4×106个/ml，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106–10×106个/ml，存活率到95–99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/ml，50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。595.使用opti-prosfm培养基制备转染试剂和ntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒复合物(4℃)，例：1ml细胞准备40ulopti-prosfm添加0.8ugntd-rbd-foldon-8*his重组表达质粒混匀放置5min；准备40ulopti-prosfm添加3ulexpifectaminecho试剂混匀放置5min，室温下1–5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后18-22小时，添加enhancer和expichofeed，执行标准实验方案，例：1ml细胞添加6ulenhancer和0.24mlexpichofeed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后8天收集，进行后续纯化。596.蛋白纯化：培养基离心，上清添加ni柱，振荡孵育2h，经过重力空柱管柱进行亲和层析纯化。平衡缓冲液：“pbs”,ph7.4，清洗10cv；清洗缓冲液：“pbs”,ph7.4with20mmimidazole，清洗10cv；洗脱缓冲液：“pbs”,ph7.4with500mmimidazole，洗脱1cv，重复5次，得到ntd-rbd-foldon-8*his纯化蛋白，结果如表6所示。597.表6ntd-rbd-foldon-8*his纯化蛋白的浓度和体积598.p101150-5concentration(mg/ml)volume(ml)nr-foldon-8*his0.050.5599.sds-page电泳与wb验证。a.1.0mmpage胶，上样量8ul，跑胶顺序：m.molecularweightmarker.me.culturemedium.ft.flowthrough.w.wash.e.elutedfractions。b.电泳:将ntd-rbd-foldon-8*his纯化蛋白与上样缓冲液混合(nr-foldon-8*his纯化蛋白:5x上样缓冲液＝4:1)，煮沸5min，进行点样。首先100v恒压电泳，可以看到marker逐渐变成一条细线。待marker进入分离胶后，将电压调到300v继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25min)。c.转膜，撬开玻璃板，小心取出凝胶。pvdf膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20v恒压转移，50kda蛋白需20min。分子量越大需时间越长。d.抗体孵育转膜后取出pvdf膜，可以看到marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100mlpbst)封闭1小时，用pbst漂洗2x5min。一抗(anti-hismab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100mltbs)稀释，放在小盒中孵育，4'c脱色摇床中反应2h。取出pvdf膜,pbst漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。pbst漂洗4x10min.均使用摇床震动。e.显色，ecl显色:每一块pbst膜，用a液1ml和b液10μl混合后滴在膜上，5min后在化学发光成像系统中拍照记录，如图3所示。600.实施例7构建载体和蛋白表达601.参照上述实施例，构建如下需要表达的目的片段，并表达纯化蛋白，如表7所示。602.表7不同的目的片段603.基因名称构建方式seqidnorbd-hbsag-6*his全基因合成45ntd-hbsag-6*his全基因合成46rbd-foldon-6*his全基因合成47ntd-foldon-6*his全基因合成48ntd-rbd-foldon-8*his全基因合成49s-foldon-8*his全基因合成50rbd-p2-6*his全基因合成51ntd-p2-6*his全基因合成52s1-p2-8*his全基因合成53rbd-p2-foldon-6*his全基因合成54ntd-p2-foldon-6*his全基因合成55s1-p2-foldon-6*his全基因合成56rbd-ferritinlc-6*his全基因合成57rbd-ferritinhc-flag全基因合成58rbd194-hbsagpcr克隆59ntd-ferritinhc核酸序列pcr克隆60ntd-ferritinlc核酸序列pcr克隆61ntdferritin核酸序列全基因合成62rbdferritin核酸序列全基因合成63604.实施例8疫苗组合物的制备605.0.04mg/ml的rbd蛋白，0.04mg/ml的ntd蛋白；2％至15％(w/v)蔗糖；0.01％至0.05％(w/v)吐温80；和ph为5.0至7.0的5mm至25mm组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。606.实施例9疫苗组合物的制备607.0.04mg/ml的rbd-p2蛋白，0.04mg/ml的ntd-p2蛋白；2％至15％(w/v)山梨糖醇；0.01％至0.05％(w/v)聚山梨酯20；和ph为5.5至7.0的5mm至20mm组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。608.实施例10疫苗组合物的制备609.0.04mg/ml的rbd蛋白，0.04mg/ml的ntd-p2蛋白；2％至15％(w/v)蔗糖；0.01％至0.05％(w/v)吐温80；和ph为4.5至5.5的5mm至25m琥珀酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。610.实施例11疫苗组合物的制备611.0.04mg/ml的rbd-p2蛋白，0.04mg/ml的ntd蛋白；2％至15％(w/v)山梨糖醇；0.01％至0.05％(w/v)聚山梨酯20；和ph为5.5至7.0的5mm至20mm组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。612.实施例12疫苗组合物的制备613.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含氢氧化铝佐剂，浓度为1mg/ml。614.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物中加入cpg1018佐剂，浓度为6mg/ml，cpg佐剂(cpg由上海生工生物公司按cpg1018序列合成)。615.实施例13疫苗组合物的制备616.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.5ml，50μg的mpl，500μg氢氧化铝，150mm的nacl，8mm的二水磷酸氢二钠，加注射用水至0.5ml。617.实施例14疫苗组合物的制备618.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.25ml，成份包括10.69mg的角鲨烯，11.86mg的α-生育酚，4.86mg的吐温80，3.53mg的nacl，0.09mg的kcl，0.51mg的na2hpo4，0.09mg的kh2po4和注射用水。619.实施例15疫苗组合物的制备620.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.5ml，成份包括50μg的mpl，50μg的qs-21，1mg的dopc二油酰磷脂酰胆碱，0.25mg的胆固醇，0.15mg的无水磷酸二钠，0.54mg的磷酸二氢钾，4.385mg的氯化钠，和注射用水。621.实施例16疫苗组合物的制备622.实施例8-11中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.5ml，成份包括9.75mg角鲨烯、1.175mg司盘85、1.175mg吐温80、0.66mg二水合柠檬酸三钠和0.04mg一水合柠檬酸，和注射用水。623.实施例17不同抗原与佐剂的小鼠免疫实验624.抗原蛋白结合不同佐剂用于免疫小鼠，蛋白诱导的中和抗体水平通过elisa测定确定。小鼠分组及免疫方案如表8所示。625.表8小鼠分组表[0626][0627]其中的ntd蛋白序列为seqidno：20中1-291氨基酸，rbd的序列为seqidno：1中1-223氨基酸，al(oh)3佐剂、cpg佐剂、cpg al(oh)3佐剂参照实施例12的浓度，as01的组成参照实施例15，as04的组成参照实施例13，小鼠免疫后28天后检测结果如表9所示。结果显示，rbd ntd诱导产生中和抗体的水平更强。[0628]表9小鼠免疫后28天后检测结果[0629][0630]实施例18不同抗原与佐剂的免疫原性评价实验[0631]抗原蛋白与mf59佐剂共同用于免疫日本大耳朵白兔，蛋白诱导的中和抗体水平通过elisa测定确定。日本大耳朵白兔分组及免疫方案如表10所示。[0632]表10日本大耳白兔免疫分组表[0633][0634]ntd-p2的序列见seqidno：20，rbd-p2的序列参照seqidno：1，ntd-foldon的序列见seqidno：22，rbd-foldon的序列见seqidno：3，ntd-ferritinlc的序列见seqidno：23，rbd-ferritin的序列参照seqidno：5，ntd-hbsag的序列参照seqidno：25，rbd-hbsag的序列参照seqidno：6，佐剂mf59参照实施例16。[0635]ntd-rbd-p2的序列参照seqidno：40序列，但c端无his标签，ntd-rbd-foldon的序列参照seqidno：41序列，但c端无his标签，ntd-rbd-p2-foldon的序列参照seqidno：42序列，但c端无his标签，ntd-rbd-ferritin的序列参照seqidno：43序列，ntd-rbd-hbsag的序列参照seqidno：44序列。日本大耳朵白兔免疫28天后的检测结果如表11所示，说明融合蛋白具有免疫原性。[0636]表11日本大耳白兔免疫28天后的检测结果[0637][0638][0639]实施例19不同抗原与佐剂的免疫原性评价实验[0640]抗原蛋白与不同佐剂共同用于免疫恒河猴，蛋白诱导的中和抗体水平通过elisa测定确定。恒河猴分组及免疫方案如下，阳性对照为新冠的灭活苗。恒河猴免疫28天后的检测结果如表12所示。[0641]表12恒河猴免疫结果[0642][0643]实施例20小鼠中重组新冠疫苗候选抗原诱导中和抗体产生的效果检测[0644]以wuhan-1序列为基础，选择ntd和rbd作为候选抗原。检测单独ntd、单独rbd、ntd和rbd共免疫、ntd-rbd融合蛋白(以下简称nr)，以及ntd-rbd-foldon融合蛋白(以下简称nr-foldon)的免疫原性，结果如表14所示。结果显示，nr-foldon抗原和bfa03佐剂联合免疫balb/c小鼠后，能够显著有效诱导机体产生高滴度的中和抗体(基于sars-cov-2病毒株及vsv假病毒检测系统)和抗原特异性igg抗体，其中，对武汉原型株以及d614g、gamma突变株的中和效果显著优于其他抗原。[0645]表13balb/c小鼠中重组新冠疫苗候选抗原实验设计概况[0646][0647][0648]表14balb/c小鼠中重组新冠疫苗候选抗原的筛选结果[0649][0650]备注：1.基于sars-cov-2毒株的新冠病毒中和抗体检测，下同。[0651]2.假病毒类型：原型株(wuhan-1)、主要流行毒株(d614g)；voc变异毒株：英国突变株(alpha，b.1.1.7)、南非突变株(beta，b.1.351)、巴西突变株(gamma，p.1)、印度突变株(delta，b.1.617.2)；voi变异毒株：秘鲁突变株(lambda，c.37)，下同。[0652]实施例21不同佐剂的免疫效果检测[0653]选择al(oh)3、bfa01、bfa02、bfa03、bfa04、cpg/al(oh)3与nr-foldon抗原配伍免疫balb/c小鼠，检测血清中中和抗体及抗原特异性igg抗体。研究结果表明，在候选佐剂中，bfa03佐剂的免疫效果最佳且显著优于传统铝佐剂(氢氧化铝佐剂)，也优于以铝盐佐剂为基础的复合佐剂系统。[0654]表15balb/c小鼠中重组新冠疫苗候选佐剂实验设计概况[0655][0656][0657]备注：1.人用剂量(0.5ml)佐剂中主要成分的含量，balb/c小鼠中的免疫剂量为1/5hd。[0658]表16balb/c小鼠中重组新冠疫苗候选佐剂的实验结果[0659][0660]实施例22小鼠实验中不同剂量的免疫效果检测[0661]将1/10及1/5人用剂量(即4μg和8μg)nr-foldon抗原，分别与1/5或1/10人用剂量bfa03佐剂联合免疫balb/c小鼠。结果显示，在抗原剂量固定的前提下，1/10hd佐剂免疫产生中和抗体滴度低于1/5hd佐剂，各组不具有统计学差异，在一定程度上认为抗原和佐剂需要配比合适时可以诱导更强的免疫反应。[0662]表17balb/c小鼠中重组新冠疫苗剂量考察结果[0663][0664][0665]实施例23兔子实验中不同剂量的免疫效果检测[0666]以1人用剂量bfa03佐剂(0.5ml)分别与20μg和40μg两个不同剂量的nr-foldon抗原联合免疫日本大耳白兔，结果如表18所示，40μg抗原免疫产生的抗体滴度较高。[0667]表18不同剂量佐剂免疫日本大耳白兔结果[0668][0669]选择1hd(0.5ml)、1/2hd、1/4hdbfa03佐剂，分别与1hdnr-foldon抗原联合免疫日本大耳白兔，结果如表19所示，1hd的佐剂与1hd抗原免疫诱导机体产生的中和抗体及结合抗体水平最高，降低佐剂剂量则会降低免疫效果。[0670]表19不同剂量佐剂免疫日本大耳白兔结果[0671][0672]实施例24抗原佐剂组合对新冠病毒不同变异株的中和作用检测[0673]recov疫苗(nr-foldon抗原/bfa03佐剂)免疫不同种属动物产生的中和抗体滴度gmt结果如下，由表可知，所确定的抗原佐剂组合对sars-cov-2病毒和不同的变异株均具有较好的中和作用。[0674]表20不同种属动物产生的中和抗体滴度结果[0675][0676][0677]使用gamma突变株s蛋白ntd及rbd和beta突变株s蛋白ntd及rbd的效果检测[0678]实施例25构建ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株)和ntd-rbd-foldon-6×his(beta突变株)重组表达质粒[0679]如seqidno：85所示的ntd-rbd-foldon(gamma突变株)添加信号肽mgwsciilflvatatgvhs(seqidno:91)和6×his；如seqidno:79所示的ntd-rbd-foldon(beta突变株)添加信号肽mgwsciilflvatatgvhs(seqidno:91)和6×his，全长氨基酸序列由无锡药明生物技术股份有限公司进行密码子优化，并通过pcr进行全基因合成得到ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株)和ntd-rbd-foldon-6×his(beta突变株)的dna片段。经凝胶纯化后，将纯化后的dna片段重组到目的载体pcdna3.1( )中，得到ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株)和ntd-rbd-foldon-6×his(beta突变株)重组表达质粒。并通过sanger测序验证，序列100％正确，测序结果见图1和图7。[0680]转化宿主菌：(1)将浓度在100ng/μl的ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株)或ntd-rbd-foldon-6×his(beta突变株)重组表达质粒吸取1～3μl加入到100μl的大肠杆菌e.colitop10感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。(2)42℃水浴90s不要摇动。(3)冰浴中放置3分钟左右。(4)每管中加入500～800μl37℃预温lb培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。[0681]重组表达质粒抽提并测序：(1)制备含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板。(2)取100μl菌液培养后用无菌玻璃涂布器轻轻划lb琼脂平板(含100μg/ml氨苄青霉素)，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12～16小时可出现菌落。(4)从平板上挑取一个单克隆接种至300mllb培养基中扩大培养，采用nucleobondxtramaxief试剂盒按照说明书进行质粒大量制备。并测序验证目的基因，测序结果与设计的基因组序列一致。[0682]实施例26细胞转染及蛋白纯化[0683]细胞转染：[0684]在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞，避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增cho细胞(来自thermo公司的expicho)直到细胞密度达到4×106～6×106个/ml。转染的第-1天：调整细胞密度到3×106～4×106个/ml，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106～10×106个/ml，存活率达95～99％进行转染。新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/ml，在50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。使用optiprotmsfm培养基制备转染试剂和ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株/beta突变株)重组表达质粒复合物(4℃)，例：1mlcho细胞准备40μloptiprotmsfm添加0.8μgntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株/beta突变株)重组表达质粒，混匀放置5分钟；准备40μloptiprotmsfm添加3μlexpifectaminetmcho试剂混匀放置5分钟，室温下1～5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后18-22小时，添加enhancer和expichofeed，执行标准实验方案。例：1ml细胞添加6μlenhancer和0.24mlexpichofeed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％co2。转染后6天收集，进行后续纯化。[0685]蛋白纯化：[0686]采用固定化金属离子亲和层析(imac)和尺寸排阻层析(sec)相结合的方法进行纯化。采用装载niso4的hitrap5mlchelatinghp层析柱(美国ge公司)。鳌合层析介质预处理后装柱，分别用50mmol/ledta、0.2mol/lnaoh、超纯水洗柱。5倍以上的裂解缓冲液平衡后，细胞裂解上清直接上柱，以溶液a(20mmol/lpb，ph7.4，0.15mol/lnacl)与溶液b(20mmol/lpb，ph7.4，0.15mol/lnacl，0.5mol/l咪唑)为流动相进行梯度洗脱(溶液b的浓度从4％(体积)增大至100％(体积))。收集目标组分，继续进行sec分离。采用hiload26/60superdex-200pre-grade凝胶柱(美国ge公司)。以溶液c(20mmol/lpb，ph7.4，0.15mol/lnacl)为流动相洗脱1个柱体积，洗脱速率为2.5ml/min。sec纯化后的层析图谱见图5和图8。[0687]得到ntd-rbd-foldon-6×his(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白，蛋白纯化结果如表21所示，经纯化后的目的蛋白纯度可达93.6％(gamma突变株)95％(beta突变株)。[0688]表21蛋白纯化结果[0689][0690]sds-page电泳和westernblot验证：[0691]a.1.0mmpage胶，上样量8μl，跑胶顺序：m.molecularweightmarker.me.culturemedium.ft.flowthrough.w.wash.e.elutedfractions。b.电泳：将ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白与上样缓冲液混合(ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白:5×上样缓冲液＝4:1)，煮沸5分钟，进行点样。首先100v恒压电泳，可以看到marker逐渐变成一条细线。待marker进入分离胶后，将电压调到300v继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25分钟)。c.转膜，撬开玻璃板，小心取出凝胶。pvdf膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20v恒压转移，50kda蛋白需20分钟。分子量越大需时间越长。d.抗体孵育，转膜后取出pvdf膜，可以看到marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100mlpbst)封闭1小时，用pbst漂洗2×5min。一抗(anti-hismab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100mltbs)稀释，放在小盒中孵育，4℃脱色摇床中反应2h。取出pvdf膜，pbst漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。pbst漂洗4×10min。均使用摇床震动。e.显色，ecl显色：每一块pbst膜，用a液1ml和b液10μl混合后滴在膜上，5分钟后在化学发光成像系统中拍照记录，如图6和图9所示。从sds-page电泳图和westernblot的结果图可知，经sec分离后ntd-rbd-foldon(beta突变株)溶液的电泳泳道上最大的条带是ntd-rbd-foldon(beta突变株)，ntd-rbd-foldon(gamma突变株)溶液的电泳泳道上最大的条带是ntd-rbd-foldon(gamma突变株)，且其主要以三聚体的形式存在，westernblot结果可见对应的目的条带。[0692]实施例27构建载体和蛋白表达[0693]参照上述实施例，构建如表22所示需要表达的目的片段，并表达纯化蛋白。[0694]表22不同的目的片段[0695][0696][0697]实施例28免疫原性组合物的制备[0698]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白，1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。[0699]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白，50μg的rbd-foldon(beta突变株/gamma突变株)纯化蛋白；1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。[0700]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白，50μg的ntd-foldon(beta突变株/gamma突变株)纯化蛋白；1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。[0701]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白，50μg的ntd-rbd-foldon(wuhan-1)纯化蛋白；1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。[0702]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白；135μg的ha蛋白(45μg的h1n1的ha蛋白，45μg的h3n2的ha蛋白，45μg的b/washington/02/2019的ha蛋白)；1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。选用的ha蛋白如表23所示。[0703]50μg的ntd-rbd-foldon(gamma突变株/beta突变株)纯化蛋白；180μg的ha蛋白(45μg的h1n1的ha蛋白，45μg的h3n2的ha蛋白，45μg的b/washington/02/2019的ha蛋白，45μg的b/phuket/3073/2013的ha蛋白)；1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和ph7.5的10mm的pb缓冲液(na2hpo4，nah2po4)，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。选用的ha蛋白如表23所示。[0704]表23联用的流感毒株[0705][0706]实施例29疫苗的制备[0707]前述任一项实施例所述的免疫原性组合物，该组合物进一步包含氢氧化铝佐剂，浓度为1mg/ml。[0708]前述任一项实施例所述的免疫原性组合物，进一步包含佐剂as03，佐剂瓶为0.5ml，成分包括10.69mg的角鲨烯、11.86mg的α-生育酚、4.86mg的聚山梨酯80、3.53mg的氯化钠、0.09mg的氯化钾、0.51mg的磷酸氢二钠、0.09mg的磷酸二氢钾和注射用水。[0709]前述任一项实施例所述的免疫原性组合物，进一步包含佐剂mf59，佐剂瓶为0.5ml，成分包括4.5％的角鲨烯，0.5％tween80，0.5％span85和注射用水。[0710]实施例30疫苗的小鼠免疫实验(beta突变株)[0711]分别选用实施例28所述的免疫原性组合物结合as03佐剂，按照2/25人用剂量进行小鼠免疫，以ntd-rbd-foldon(wuhan-1)蛋白制备的免疫原性组合物结合as03佐剂作为对照，诱导的中和抗体水平通过基于vsv(水疱性口炎病毒)系统的新冠假病毒中和抗体检测方法测定。小鼠分组及免疫方案如表24所示。[0712]表24小鼠免疫分组表[0713][0714][0715]as03佐剂的配制参考实施例29，小鼠免疫第28天后，通过眼眶静脉采血的方式获得血清，利用基于vsv的假病毒检测系统检测中和抗体滴度，分别采用新冠病毒主要流行株(d614g)假病毒、新冠病毒alpha突变株(b.1.1.7)假病毒、新冠病毒beta突变株(501y.v2)假病毒、新冠病毒gamma突变株(501y.v3)假病毒进行中和实验，考察疫苗对不同新冠病毒变异株的中和效果，检测结果如表25所示。结果显示，以ntd-rbd-foldon(wuhan-1)为抗原结合as03佐剂诱导产生的中和抗体对主要流行株假病毒和gamma突变株假病毒的中和效果较好(gmt远高于10000)，而对于alpha突变株假病毒和beta突变株假病毒的中和效果较差(gmt远低于10000)；以ntd-rbd-foldon(beta突变株)为抗原结合as03佐剂诱导产生的中和抗体对beta突变株假病毒和gamma突变株假病毒均有较好的中和效果(gmt远高于10000)，更加令人意外的是，尤其是对于gamma突变株假病毒的中和抗体gmt高达20944，但其对主要流行株假病毒和alpha突变株假病毒的中和效果稍弱。可见，以ntd-rbd-foldon(beta突变株)为免疫原的单价疫苗对4种新冠病毒突变株均有良好的免疫效果，其尤其可作为一种新的应对sars-cov-2突变株(尤其是南非和gamma突变株)的covid-19候选疫苗，更高效地诱导产生保护性中和抗体对抗新冠突变株的免疫逃逸。[0716]而以ntd-rbd-foldon(beta突变株)联合ntd-rbd-foldon(wuhan-1)为免疫原的二价疫苗相比于ntd-rbd-foldon(beta突变株)单价疫苗和ntd-rbd-foldon(wuhan-1)单价疫苗，诱导产生的中和抗体水平整体提升，既增强了ntd-rbd-foldon(wuhan-1)单价疫苗对beta突变株假病毒的作用效果，又增强了ntd-rbd-foldon(beta突变株)单价疫苗对主要流行株假病毒和英国流行株假病毒的作用效果。此二价疫苗具有作用范围更广，作用效果更强的特点，更适合作为一种应对covid-19的候选疫苗发挥作用。[0717]表25小鼠免疫28天后检测结果[0718][0719][0720]实施例31疫苗的小鼠免疫实验(gamma突变株)[0721]选用实施例28所述的免疫原性组合物结合as03佐剂，按照2/25人用剂量进行小鼠免疫，诱导的中和抗体水平通过基于vsv(水疱性口炎病毒)系统的新冠假病毒中和抗体检测方法测定。小鼠分组及免疫方案如表26所示。[0722]表26小鼠免疫分组表[0723][0724]as03佐剂的配制参考实施例29，小鼠免疫第28天后，通过眼眶静脉采血的方式获得血清，利用基于vsv的假病毒检测系统检测中和抗体滴度，分别采用新冠病毒主要流行株(d614g)假病毒、新冠病毒alpha突变株(b.1.1.7)假病毒、新冠病毒beta突变株(501y.v2)假病毒、新冠病毒gamma突变株(501y.v3)假病毒进行中和实验，考察疫苗对不同新冠病毒变异株的中和效果，检测结果如表27所示。结果显示，以ntd-rbd-foldon(gamma突变株)为抗原结合as03佐剂免疫小鼠诱导产生中和beta突变株(501y.v2)假病毒的抗体水平最高，诱导产生中和gamma突变株(501y.v3)假病毒的抗体水平其次，而诱导产生中和主要流行株(d614g)假病毒和alpha突变株(b.1.1.7)假病毒的抗体水平较低。可见，以ntd-rbd-foldon(gamma突变株)为免疫原的单价疫苗对4种新冠病毒突变株均有效，其可作为一种新的应对sars-cov-2突变株(尤其是南非和gamma突变株)的covid-19候选疫苗，更高效地诱导产生保护性中和抗体对抗新冠突变株的免疫逃逸。[0725]表27小鼠免疫28天后检测结果[0726][0727]由以上结果可确定，若是按照上述方法制备ntd-rbd-foldon(gamma突变株)联合ntd-rbd-foldon(beta突变株)的二价疫苗，或ntd-rbd-foldon(gamma突变株)联合ntd-rbd-foldon(wuhan-1)的二价疫苗，或ntd-rbd-foldon(gamma突变株)联合ntd-rbd-foldon(beta突变株)和ntd-rbd-foldon(wuhan-1)的三价疫苗，或ntd-rbd-foldon(gamma突变株)联合ntd-rbd-foldon(beta突变株)、ntd-rbd-foldon(wuhan-1)和流感血凝素ha的多价疫苗等多价联合疫苗可能会产生更高的中和抗体滴度。当前第1页12当前第1页12
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