用于非酒精性肝硬化诊断的circRNA标志物及其应用的制作方法

用于非酒精性肝硬化诊断的circrna标志物及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于非酒精性肝硬化诊断的circrna标志物及其应用。


背景技术：

2.肝硬化(liver cirrhosis)是一种常见的慢性肝病，可由一种或多种原因引起肝脏损害，肝脏呈进行性、弥漫性、纤维性病变。具体表现为肝细胞弥漫性变性坏死，继而出现纤维组织增生和肝细胞结节状再生，这三种改变反复交错进行，结果肝小叶结构和血液循环途径逐渐被改建，使肝变形、变硬而导致肝硬化。该病早期无明显症状，后期则出现一系列不同程度的门静脉高压和肝功能障碍，直至出现上消化道出血、肝性脑病等并发症死亡。引起肝硬化的病因很多，不同地区的主要病因也不相同。欧美以酒精性肝硬化为主，我国以非酒精性肝硬化为主，例如病毒性肝炎性肝硬化多见，其次为血吸虫病肝纤维化。
3.当人们患有非酒精性肝硬化的病症时，会出现乏力，消化不良，肝区隐痛的症状及体征，也可能会出现体重超重，空腹血糖升高，血脂紊乱，在早期的时候，还会出现体重减轻，食欲不振，身上没有力气的症状，所以在日常的生活中，患者应当减少活动，注意劳逸结合。随着肥胖及其相关代谢综合症在全球的流行趋势，非酒精性肝硬化已经逐渐成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，对人们的健康产生重大危害。非酒精性脂肪肝至今尚无完全有效的药物治疗,基础治疗主要是控制饮食和减轻体重。目前，对于非酒精性脂肪肝的诊断有一系列的方法，包括出现乏力、消化不良、肝脾肿大等体征表现，丙氨酸氨基转移酶增高，肝脏影像学检测中符合弥散性脂肪肝以及肝活体检测等。
4.环状rna(circrnas)是一类新型rna，广泛存在于从秀丽隐杆线虫到人类的真核生物中，具有进化守恒的特征。circrnas是在共价闭环结构中产生的，它不具有5'帽或3'聚腺苷酸尾巴。circrnas可以通过一种称为“反向剪接”的特殊剪接事件从备选基因位点形成，包括编码和非编码外显子(ecircrnas)、内含子(cirnas)、外显子和内含子(eicirnas)或转录反义到5’和3’utrs。circrnas在生物体中高度丰富，以细胞型、组织型和阶段特异性模式表达。虽然circrnas已经在各种组织中被检测到，但它们在大脑中被证明更丰富。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了用于非酒精性肝硬化诊断的circrna标志物及其应用，通过检测外周血circrna，可辅助非酒精性肝硬化诊断，揭示其筛查和诊断价值，对预防和控制非酒精性肝硬化的发生发展具有重要意义。
6.本发明的技术方案如下。
7.本发明提供了用于肝硬化诊断的circrna标志物，所述circrna标志物包括：seq id no:1所示的hsa_circ_0001496、seq id no:2所示的hsa_circ_0001927、seq id no:3所示的hsa_circ_0000355、seq id no:4所示的hsa_circ_0001807中的一种或多种。
8.进一步地，当患有肝硬化时，所述hsa_circ_0001496、hsa_circ_0001927表达上调。
9.进一步地，当患有肝硬化时，所述hsa_circ_0000355、hsa_circ_0001807表达上调。
10.进一步地，所述肝硬化为非酒精性肝硬化。
11.本发明还提供了上述circrna标志物的特异性引物组合，所述特异性引物组合包括：针对hsa_circ_0001496的特异性引物、针对hsa_circ_0001927的特异性引物、针对hsa_circ_0000355的特异性引物、针对hsa_circ_0001807的特异性引物。
12.进一步地，所述针对hsa_circ_0001496的特异性引物包括如seq id no：9所示的上游引物，如seq id no：10所示的下游引物。
13.进一步地，所述针对hsa_circ_0001927的特异性引物包括如seq id no：11所示的上游引物，如seq id no：12所示的下游引物。
14.进一步地，所述针对hsa_circ_0000355的特异性引物包括如seq id no：13所示的上游引物，如seq id no：14所示的下游引物。
15.进一步地，所述针对hsa_circ_0001807的特异性引物包括如seq id no：15所示的上游引物，如seq id no：16所示的下游引物。
16.本发明还提供了上述circrna标志物，或上述特异性引物组合在制备或筛选人非酒精性肝硬化诊断药物中的应用。
17.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
18.图1为本发明实施例1中筛选的8个circrna。
19.图2为本发明实施例2中qpcr检测细胞模型中候选circrna表达。
20.图3为本发明实施例2中circrna环化位点测序图。
21.图4为本发明实施例3中qpcr检测临床样本中候选circrna表达。
具体实施方式
22.为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
23.实施例1与非酒精性肝硬化相关的circrna获取与筛选
24.1.1为了获取与非酒精性肝硬化相关的circrna，我们从geo数据库中(gse134146)，分析了正常人和非酒精性肝硬化患者组织分离的肝纤维化细胞中circrna的表达测序。
25.1.2结合序列本身是否具有创新性，以及是否已知，筛选出8个候选circrna进行后续实验验证，如图1所示。
26.表达上调的：hsa_circ_0001496，hsa_circ_0001927，hsa_circ_0000548，hsa_circ_0000743；
27.表达下调的：hsa_circ_0001807，hsa_circ_0000318，hsa_circ_0000355，hsa_circ_0000313。
28.实施例2候选circrna在细胞模型中的表达检测
29.2.1候选circrna引物设计
30.2.1.1通过circbase网址获取8个候选circrna全序列，序列结果分别如seq id no:1-8所示(seq id no:1所示的hsa_circ_0001496、seq id no:2所示的hsa_circ_0001927、seq id no:3所示的hsa_circ_0000355、seq id no:4所示的hsa_circ_0001807、seq id no:5所示的hsa_circ_0000548、seq id no:6所示的hsa_circ_0000743、seq id no:7所示的hsa_circ_0000318、seq id no:8所示的hsa_circ_0000313)。
31.2.1.2针对获取的8个候选circrna，依据circrna引物设计原则，跨结合位点设计上下游引物，序列结果分别如seq id no:9-24所示。(hsa_circ_0001496的特异性引物包括如seq id no：9所示的上游引物，如seq id no：10所示的下游引物；所述针对hsa_circ_0001927的特异性引物包括如seq id no：11所示的上游引物，如seq id no：12所示的下游引物；所述针对hsa_circ_0000355的特异性引物包括如seq id no：13所示的上游引物，如seq id no：14所示的下游引物；所述针对hsa_circ_0001807的特异性引物包括如seq id no：15所示的上游引物，如seq id no：16所示的下游引物。hsa_circ_0000548的特异性引物包括如seq id no：17所示的上游引物，如seq id no：18所示的下游引物；所述针对hsa_circ_0000743的特异性引物包括如seq id no：19所示的上游引物，如seq id no：20所示的下游引物；所述针对hsa_circ_0000318的特异性引物包括如seq id no：21所示的上游引物，如seq id no：22所示的下游引物；所述针对hsa_circ_0000313的特异性引物包括如seq id no：23所示的上游引物，如seq id no：24所示的下游引物)。
32.2.2人肝星状细胞系lx-2培养与造模
33.2.2.1培养lx-2细胞
34.复苏并培养lx-2细胞。细胞培养基的配方如下表1所示。
35.表1.lx-2细胞完全培养基成分表
[0036][0037]
2.2.2人肝星状细胞系lx-2造模
[0038]
2.2.2.1取处于对数生长期，生长状态良好的人肝星状细胞系lx-2用0.25％胰酶消化后，细胞计数；
[0039]
2.2.2.2将细胞种到6孔细胞培养板中，密度为1.5
×
105个/孔；
[0040]
2.2.2.3待细胞贴壁、稳定生长后，分别加入或者不加入终浓度为5μg/ml的人重组蛋白tgf-β1(peprotech，货号100-21)，处理48小时后收样，用于候选circrna的检测。
[0041]
2.3人肝星状细胞lx-2中候选circrna的表达检测
[0042]
2.3.1样品前期处理
[0043]
向细胞样本中加入500μl trizol。
[0044]
2.3.2 rna提取
[0045]
向加有trizol的1.5ml ep管中加入100μl氯仿，震荡混匀后，静置5min，在12000rpm，4度离心10min。从离心机中取出1.5ml ep管，将上层无色透明的水相层吸入到另一干净的1.5mlep管中。加入等体积的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀，静置10min，再12000rpm，4度离心10min。小心弃去上清，用1ml 75
℅
乙醇对rna沉淀进行洗涤。4℃7000rpm离心5分钟，将上清去除干净。室温静置干燥。所有ep管中加入25μl的depc h2o，用枪头吹打几次，使rna充分溶解，-80℃保存。
[0046]
2.3.3 rna浓度检测
[0047]
使用核酸蛋白检测仪检测rna浓度。
[0048]
2.3.4逆转录pcr
[0049]
按以下组份分别配制逆转录反应液：
[0050][0051]
cdna立刻进行实验或者置于4℃保存。
[0052]
2.3.5实时荧光定量pcr反应
[0053]
反应体系的配置
[0054]
成分体积sybr green i mix(2
×
)5μlprimer-f(10μm)0.3μlprimer-r(10μm)0.3μlcdna0.2μl灭菌蒸馏水up to 10μl
[0055]
反应条件设置：
[0056][0057]
熔解程序：
[0058][0059][0060]
qpcr检测结果如图2所示。相对于未处理组，经tgf-β1造模后，hsa_circ_0001496，hsa_circ_0001927，hsa_circ_0000548，hsa_circ_0000743表达都有升高，其中hsa_circ_0001496，hsa_circ_0001927具有显著性差异；而hsa_circ_0001807，hsa_circ_0000318，hsa_circ_0000355，hsa_circ_0000313表达都有下调，其中hsa_circ_0001807和hsa_circ_0000355具有显著性差异。因此，将候选的circrna缩小范围到hsa_circ_0001496、hsa_circ_0001927和hsa_circ_0001807以及hsa_circ_0000355。
[0061]
2.4候选circrna测序验证
[0062]
取四个候选的circrna的qpcr产物进行测序，检测环化位点。环化位点测序结果如图3所示(3a为hsa_circ_0001496的环化位点测序结果，3b为hsa_circ_0001927的环化位点测序结果，3c为hsa_circ_0001807的环化位点测序结果，3d为hsa_circ_0000355的环化位点测序结果)。
[0063]
实施例3候选circrna在非酒精性肝硬化患者样本中的表达验证
[0064]
3.1外周血样本收集
[0065]
所有标本收集于湖南长沙湘雅医院2021年3月至2021年10月期间。非酒精性肝硬化阳性患者共计46名，其中男性患者25名，女性患者21名，平均年龄为54.78岁；非酒精性肝硬化阴性个体30名，其中男性16名，女性14名，平均年龄55.6岁。所有个体均获得知情同意书，并进行组织病理学分析以确认受试者患有或者不患有非酒精性肝硬化。
[0066]
3.2外周血样本检测
[0067]
3.2.1外周血样本rna提取
[0068]
使用血液rna提取试剂盒(blood rna kit，全世金，er401-01)进行rna提取，并使用核酸蛋白检测仪检测rna浓度。
[0069]
3.2.3 rna逆转录与qpcr检测。
[0070]
参照实施例2中实验程序与相关步骤进行。
[0071]
qpcr检测结果如图4所示。相对于非酒精性肝硬化阴性组，患者组中hsa_circ_0001496，hsa_circ_0001927具有显著性表达升高；而hsa_circ_0001807和hsa_circ_
0000355具有显著性表达降低。因此，候选的hsa_circ_0001496、hsa_circ_0001927和hsa_circ_0001807、hsa_circ_0000355能作为辅助检测非酒精性肝硬化的检测指标。
[0072]
非编码rna广泛存在于外周血中，具有含量丰富、性质稳定、易于实时精确定量检测等特质，更重要的是基于外周血的检测具有侵入性更小、更易获得的优势，因此十分具有临床标志物应用价值。环状rna(circular rna，circrna)是一类重要的非编码rna，同时由于circrna具有闭合环状结构，核酸酶对circrna并不起作用，这使得circrna具有很好的稳定性，被认为是比传统的微小rna(microrna，mirna)等线性rna更好的生物标记。进一步的实验证据表明，circrna广泛参与多种纤维化疾病发生发展的调控，包括肾纤维化、心肌纤维化等。综上，结合上述实施例，本发明所提供的circrna组合可被用于辅助检测非酒精性肝硬化疾病诊断和预后的新型理想生物标志物。
[0073]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。