哈茨木霉酸A化合物以及产该化合物的哈茨木霉突变株

哈茨木霉酸a化合物以及产该化合物的哈茨木霉突变株
技术领域
1.本发明属于真菌天然产物领域，涉及一种哈茨木霉酸a化合物以及产该化合物的哈茨木霉突变株。


背景技术：

2.真菌的次级代谢产物是新药和先导化合物的重要来源，然而随着越来越多的化合物被重复发现，真菌来源的天然产物发掘逐渐到了瓶颈期。随着基因组测序技术的成熟和生物信息学分析方法的完善，研究人员发现真菌的生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters，bgcs)十分丰富，然而由于实验室培养条件的限制，超过70％的生物合成基因簇处于沉默或未开发状态，表明真菌天然产物的发掘还有很大的空间。因此，如何激活这些沉默基因簇成为真菌天然产物研究的关键。
3.真菌天然产物发现的研究策略主要有四种：(1)采用极端环境微生物(从来自特殊环境例如温泉、火山、盐碱地等密切相关的真菌中发现新化合物)、优化培养条件。其操作简单，但是工作量大效率低，大量实验中仅获得极少量的新化合物；(2)异源表达。该方法能获得新活性化合物同时能够阐明沉默基因簇的功能，但是需要进行基因簇的组装，由于基因簇往往较大，实验难度系数大；(3)转录调控。真菌的次级代谢涉及复杂的调控网络，对调控基因的编辑有助于新化合物的发现。其中，表观遗传学方法，对组蛋白进行修饰，能够在全局发挥调控作用。常用化学表观修饰，适用小分子表观遗传修饰因子抑制剂。其操作相对简单，但是无法获得具有遗传性的转化子，实验重复性差。因此寻找实验操作简单，重复性好的天然产物挖掘策略具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一是针对现有技术存在的缺陷，提供一种哈茨木霉酸a化合物，该化合物具有低细胞毒性和高抗炎活性。
5.本发明的目的之二在于提供一种产哈茨木霉酸a化合物的哈茨木霉突变菌株，该菌株用于生产哈茨木霉酸a化合物操作简单，产率高。
6.为此，本发明第一方面提供了一种哈茨木霉酸a化合物(trichoharzianin a)，其分子结构如式(ⅰ)所示：
[0007][0008]
根据本发明，所述哈茨木霉酸a化合物具有低细胞毒性；具体地，所述哈茨木霉酸a化合物的抗肿瘤活性为：浓度为10μm的哈茨木霉酸a化合物对肿瘤细胞a549、hct-8、hepg2和mcf-7的抑制率分别为4.84％、11.82％、5.30％和2.47％。
[0009]
根据本发明，所述哈茨木霉酸a化合物具有高抗炎活性；具体地，所述哈茨木霉酸a化合物的抗炎活性为：浓度为10μm的哈茨木霉酸a化合物对脂多糖诱导小胶质细胞bv2产生
的no及炎症因子il-1、il-6和tnf-α的抑制率分别为41.11％、75.00％、16.67％和28.57％。
[0010]
在本发明的一些实施例中，所述哈茨木霉酸a化合物的分子式为c
13h18
o3，分子量为223.13。
[0011]
本发明第二方面提供了一种产哈茨木霉酸a化合物哈茨木霉突变株，其为敲除了组蛋白去乙酰化酶基因hos2(m431draft_478849)的哈茨木霉菌。
[0012]
本发明中，所述组蛋白去乙酰化酶基因hos2的哈茨木霉菌的序列如seq no.3所示。
[0013]
在本发明的一些实施例中，所述哈茨木霉菌的保藏编号为cgmcc 3.9236。
[0014]
本发明第二方面提供了一种如本发明第二方面所述的哈茨木霉突变株在生产分子结构如式(ⅰ)所示的哈茨木霉酸a化合物中的应用。
[0015]
根据本发明的一些实施方式，所述应用包括将所述哈茨木霉突变株接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得分子结构如式(ⅰ)所示的哈茨木霉酸a化合物。
[0016]
本发明中，所述发酵培养基包括pda、pdb和大米培养基中的一种或几种。
[0017]
在本发明的一些实施例中，所述发酵的温度为25-30℃；所述发酵的时间为10-14天。
[0018]
在本发明的一些实施例中，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括用乙酸乙酯萃取粗提物进行uplc检测，经ods柱粗分代谢产物，选择30％-100％的甲醇/水，进行梯度洗脱，浓缩馏分，并利用半制备液相色谱分离。
[0019]
本发明具有以下优点：
[0020]
(1)本发明提供了一种分子结构如式(ⅰ)所示的新颖化合物，该化合物具有低细胞毒性和高抗炎活性。
[0021]
(2)组蛋白去乙酰化酶hos2在以往的研究中被认为是次级代谢的正调控或负调控因子，然而在哈茨木霉(trichoderma harzianum)中是首次被研究，且通过从哈茨木霉菌中敲除组蛋白去乙酰化酶基因hos2，获得了产哈茨木霉酸a化合物的哈茨木霉突变菌株。
[0022]
(3)将上述产哈茨木霉酸a化合物的哈茨木霉突变菌株用于生产哈茨木霉酸a化合物操作简单，产率高。
附图说明
[0023]
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
[0024]
图1为转化子tmy3的验证电泳图，其中，a为pcr体系，所用引物为rt-f和rt-r；b为pcr体系，所用引物为5f-f和3f-r；wt为保藏编号为cgmcc3.9236的哈茨木霉菌，即pcr所用模板为wt的基因组dna；n为阴性对照，pcr模板为超纯水；tmy3为敲除了hos2的转化子；1.1、1.2、1.3：为平行的三株转化子，其pcr所用模板为转化子基因组dna。
[0025]
图2为uplc液相分析谱图(大米培养基)。
[0026]
图3示出哈茨木霉酸a化合物的分子结构。
[0027]
图4为1h nmr(cdcl3)谱图。
[0028]
图5为
13
c nmr(cdcl3)谱图。
[0029]
图6为1h-1
h cosy(cdcl3)谱图。
[0030]
图7为hsqc(cdcl3)谱图。
[0031]
图8为hmbc(cdcl3)谱图。
[0032]
图9为敲除基因hos2构建转化子tmy3的原理图。
具体实施方式
[0033]
为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
[0034]
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
[0035]ⅰ.术语
[0036]
本发明所述用语“转化子”是指转化后的突变株，指敲除了某段基因或导入外源基因后获得的具有新的遗传标志的菌细胞或其他受体细胞。
[0037]ⅱ.实施方案
[0038]
如前所述，现有的真菌天然产物发现的研究策略总是不尽如人意，存在这样或那样的问题，例如，(1)采用极端环境微生物，工作量大效率低，大量实验中仅获得极少量的新化合物；(2)异源表达，需要进行基因簇的组装，由于基因簇往往较大，实验难度系数大；(3)转录调控，常用化学表观修饰，无法获得具有稳定遗传性的转化子，实验重复性差。为寻找操作简单，重复性好，且具有稳定遗传性的高产功能性天然化合物的转化子，本发明人对天然产物挖掘策略进行了大量研究。
[0039]
本发明人研究发现，从哈茨木霉中敲除组蛋白去乙酰化酶基因hos2可以获得一种产新型化合物的具有稳定遗传性的转化子，该化合物具有低细胞毒性和高抗炎活性，且以该转化子生产该化合物操作简单，重复性好，由此获得本发明。
[0040]
因此，本发明第一方面所涉及的哈茨木霉酸a化合物，其分子结构如式(ⅰ)所示(见图3)：
[0041][0042]
该化合物为一种新型天然功能性化合物，其具有低细胞毒性和较高的抗炎活性。
[0043]
所述哈茨木霉酸a化合物的活性分析：
[0044]
通过mtt法检测该化合物对肿瘤细胞a549、hct-8、hepg2和mcf-7的抑制率来评价其抗肿瘤活性；通过griess法和elisa试剂盒检测该化合物对脂多糖诱导小胶质细胞bv2产生的no及炎症因子il-1、il-6和tnf-α的抑制率来评价其抗炎活性，结果表明(见表8)：所述哈茨木霉酸a化合物的抗肿瘤活性为：浓度为10μm的哈茨木霉酸a化合物对肿瘤细胞a549、hct-8、hepg2和mcf-7的抑制率分别为4.84％、11.82％、5.30％和2.47％；所述哈茨木霉酸a化合物的抗炎活性为：浓度为10μm的哈茨木霉酸a化合物对脂多糖诱导小胶质细胞bv2产生的no抑制率为41.11％，明显高于阳性药一氧化氮合酶(nitric oxide synthase)抑制剂l-nmma抑制率31.16％；而其对炎症因子il-1、il-6和tnf-α的抑制率分别为75.00％、16.67％
和28.57％。从上述可以看出，哈茨木霉酸a化合物对肿瘤细胞的抑制效果不佳，说明该化合物具有低细胞毒性。而哈茨木霉酸a化合物对no和炎症因子il-1、il-6和tnf-α的抑制效果较好，说明该化合物具有潜在的抗炎活性。
[0045]
本发明第二方面涉及一种产哈茨木霉酸a化合物哈茨木霉突变株，其为敲除了组蛋白去乙酰化酶基因hos2的哈茨木霉菌。
[0046]
本发明中所用哈茨木霉菌(trichoderma harzianum)(野生型)，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，其保藏编号为cgmcc3.9236，本发明中称为哈茨木霉菌(trichoderma harzianum)wt株(野生型)或野生哈茨木霉菌wt株，其基因组中的含有hos2的dna片段(野生哈茨木霉菌wt株基因组中的hos2及其上游665bp和下游1179bp的dna片段)的序列如seq no.1所示。从该菌中敲除的基因为hos2(蛋白号：m431draft_478849)，其功能为组蛋白去乙酰化酶，本发明中也称为组蛋白去乙酰化酶基因hos2，其序列如seq no.3所示。
[0047]
容易理解，本发明所涉及的产哈茨木霉酸a化合物哈茨木霉突变株是从哈茨木霉菌(trichoderma harzianum)3.9236的基因组中敲除了组蛋白去乙酰化酶基因hos2(m431draft_478849)获得的转化子，本发明中也称为转化子tmy3，其基因组中的敲除了hos2的dna片段(转化子tmy3基因组中的敲除了hos2的上游611bp和下游580bp的dna片段)的序列如seq no.2所示。
[0048]
进一步地，本发明所涉及的哈茨木霉酸a化合物是利用分子生物学基因操作敲除哈茨木霉菌(trichoderma harzianum)3.9236中的表观调控因子hos2而激活新天然产物而产生，且该化合物具有低细胞毒性和较高的抗炎活性。
[0049]
本发明中hos2的敲除：利用peg介导的原生质体转化法，转入基因上下游同源片段和crispr/cas9质粒进行hos2的敲除。通过pcr验证，如图1所示，获得hos2敲除的转化子tmy3。
[0050]
本发明第三方面涉及一种如本发明第二方面所述的哈茨木霉突变株在生产分子结构如式(ⅰ)所示的哈茨木霉酸a化合物中的应用。
[0051]
根据本发明的一些实施方式，所述应用包括将所述哈茨木霉突变株接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得分子结构如式(ⅰ)所示的哈茨木霉酸a化合物。
[0052]
本发明中，所述发酵培养基包括pda、pdb和大米培养基中的一种或几种，优选为大米培养基。
[0053]
在本发明的一些实施例中，所述发酵的温度为25-30℃；所述发酵的时间为10-14天。
[0054]
在本发明的一些实施例中，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括用乙酸乙酯萃取粗提物进行uplc检测，经ods柱粗分代谢产物，选择30％-100％的甲醇/水，进行梯度洗脱，浓缩馏分，并利用半制备液相色谱分离。
[0055]
在一些具体的实施例中，选择营养丰富廉价易得的大米培养基对转化子tmy3进行培养。其次级代谢产物分析如图2所示。具体过程包括：
[0056]
(1)发酵培养：将哈茨木霉突变株于28℃或25℃在大米培养基中发酵培养10-14天后，获得次级代谢产物；
[0057]
(2)次级代谢产物的萃取及分离：乙酸乙酯萃取粗提物进行uplc检测，经ods柱色谱分离代谢产物，选择30％-100％的甲醇/水，进行梯度洗脱。浓缩馏分，利用半制备液相色谱进一步分离，获得新化合物纯品；
[0058]
(3)结构鉴定：
[0059]
样品用氘代氯仿(cdcl3)溶解，利用布鲁克avance iii hd 500mhz核磁共振(nmr)波谱仪(布鲁克bruker)分析获得一维、二维核磁数据[1h-nmr、
13
c-nmr、二维谱图(500mhz)]，如图4-8所示；
[0060]
采用安捷伦6520精确质量qtof lc/ms系统(安捷伦aglient)进行高分辨质谱测试，获得化合物分子式为c
13h18
o3，分子量为223.1331(计算分子量为222.1329)，离子形式为[m h]

，如表7所示；解析获得新产物的结构如图3所示，本发明中命名为哈茨木霉酸a化合物。
[0061]
采用j-810-150s型分光偏振仪(日本分光株式会社jasco)进行旋光度分析，结果表明，该化合物旋光值为[α]
20d
＝28(c＝0.01g/100ml，ch3oh)。
[0062]
本发明中所述试剂均以市售浓度直接或者配制使用。
[0063]ⅲ.实施例
[0064]
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
[0065]
实施例1：
[0066]
1.敲除hos2构建转化子的原理图，如图9
[0067]
2.同源臂片段的构建
[0068]
使用融合pcr技术对目标敲除基因的同源片段进行构建，根据表1所示pcr体系扩增目标敲除基因上下游的5f、3f片段，将其进行琼脂糖凝胶电泳分析并利用试剂盒回收片段，以回收后片段作为融合pcr的模板，如表2配制pcr的体系扩增获得同源片段。当表1中正向引物为5f-f，反向引物为5f-r时，扩增出目标敲除基因hos2的上游5f片段；当表1中正向引物为3f-f，反向引物为3f-r时，扩增出目标敲除基因hos2的下游3f片段。模板dna为trichoderma harzianum 3.9236的基因组dna。
[0069]
表1第一轮pcr体系
[0070][0071]
表2第二轮融合pcr体系
[0072][0073]
3.crispr/cas9敲除质粒的构建
[0074]
利用网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/breakingcas)设计sgrna(small guide rna)，根据所选择的sgrna设计sgrna的正向引物和反向引物。
[0075]
表3引物退火体系
[0076][0077]
表4退火产物磷酸化体系
[0078][0079]
表5酶切体系
[0080][0081]
引物退火：将合成的引物按照表3配制体系，使用pcr仪控温95℃3分钟，后转移至95℃的水浴锅，关闭控温系统，使温度以-1℃/30s的速度从95℃到25℃缓慢冷却，退火之后
生成含有粘性末端的dna双链。按表4进行退火产物磷酸化体系配制，置于37℃水浴30分钟。
[0082]
酶切骨架载体phs-bvc-lw209：37℃过夜酶切，电泳后切胶回收，酶切体系见表5。
[0083]
连接：pcr仪恒温16℃1小时，连接体系见表6。
[0084]
表6连接体系
[0085][0086]
质粒转化至大肠杆菌：
[0087]
将5μl连接产物转入50μl dh5a感受态细胞中，37℃恒温培养箱静置过夜培养。待长出单克隆后挑取菌落提质粒并送测序验证。
[0088]
4.原生质体制备与转化
[0089]
(1)挑取哈茨木霉菌丝于ep管(微量离心管)中，加入3ml pdb培养基均浆，取3ml菌液转接入pdb培养基中，28℃，200rpm，培养24小时。
[0090]
(2)过滤菌液，取滤布上菌球放入3ml tg溶液中，均浆，取2.5ml菌液转接至tg溶液中，28℃，200rpm，培养12小时。
[0091]
(3)过滤菌液，取滤布上菌球放入trichoderma lysing enzyme n-m溶液中酶解，定时镜检，观察细胞形态，产生足量原生质体后过滤。离心，弃上清，stc溶液重悬。充分重悬后分装15ml ep管中，分别加入构建好的crispr/cas9质粒和同源片段，阴性对照不加。混匀后冰浴50分钟。
[0092]
(4)加入适量60％peg溶液，混匀，室温静置20分钟，加入适量stc溶液混匀，接种于spda(潮霉素浓度为100μg/ml)板上。每板加上层spda(潮霉素浓度为100μg/ml)。25℃培养5天。
[0093]
(5)挑取单克隆转化子，潮霉素筛选后保菌，同时将菌丝接到pdb培养基中培养，用于提取基因组验证。
[0094]
5.基因组dna提取
[0095]
采用苯酚氯仿抽提法提取基因组。具体步骤如下：
[0096]
(1)pdb培养菌株2-3天。
[0097]
(2)用枪头或扁牙签挑取菌体，吸水纸去除水分后放入1.5ml ep管。
[0098]
(3)每管放入2-3颗钢珠，加入400μl lest缓冲液，组织研磨仪破碎。
[0099]
(4)破碎均匀后再加入300μl lest缓冲液混合均匀，室温放置5分钟。
[0100]
(5)加入500μl pci溶液(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，混合颠倒10-15次，室温放置5分钟。
[0101]
(6)4℃，13000rpm，离心10分钟。
[0102]
(7)上清液转移至新的ep管，加入1ml纯乙醇，置于4℃离心，13000rpm，10分钟。
[0103]
(8)将上清舍弃，加入500μl 70％乙醇，略微震荡后置于4℃离心，13000rpm，2分钟。
[0104]
(9)将上清舍弃，在室温下干燥。
[0105]
(10)加20μl te缓冲液缓冲液，0.5μl rnase a，37℃水浴30分钟，-20℃保存。
[0106]
6.转化子的验证
[0107]
根据原理图利用5f-f和3f-r，rt-f和rt-r两对引物进行验证，结果如图1所示，从图1可以看出，在野生型中rt-f和rt-r能扩增出条带，而转化子tmy3中无法扩增出条带。同时，5f-f和3f-r在野生型中扩增出的条带大于转化子tmy3中扩增出的。说明本发明成功获得阳性转化子(敲除hos2的转化子tmy3)。
[0108]
7.发酵培养
[0109]
将转化子tmy3菌株于28℃或25℃在大米培养基中发酵培养10-14天后，获得次级代谢产物。其次级代谢产物分析如图2所示。
[0110]
8.次级代谢产物的萃取及分离
[0111]
乙酸乙酯萃取粗提物进行uplc检测，经ods柱分离代谢产物，选择30％-100％的甲醇/水，进行梯度洗脱。浓缩馏分，利用半制备液相色谱进一步分离，获得新化合物(哈茨木霉酸a化合物)纯品。
[0112]
9.结构鉴定
[0113]
样品用氘代氯仿(cdcl3)溶解，利用核磁共振(nmr)波谱仪分析获得一维、二维核磁数据[1h-nmr、
13
c-nmr、二维谱图(500mhz)]，如图4-8所示；高分辨质谱测试获得化合物分子量及分子式(见表7)；解析获得新产物哈茨木霉酸a的结构如图3所示，本发明中命名为哈茨木霉酸a化合物。
[0114]
表7化合物的hrms分析
[0115][0116]
旋光度检测结果显示，该化合物旋光值为[α]
20d
＝28(c＝0.01g/100ml，ch3oh)。
[0117]
10.所述哈茨木霉酸a化合物的活性分析：
[0118]
将该哈茨木霉酸a化合物配置成10mm浓度(溶剂为dmso)，检测生物活性，通过mtt法检测该化合物对肿瘤细胞a549、hct-8、hepg2和mcf-7的抑制率来评价其抗肿瘤活性；通过griess法和elisa试剂盒检测该化合物对脂多糖诱导小胶质细胞bv2产生的no及炎症因子il-1、il-6和tnf-α的抑制率来评价其抗炎活性，结果如表8所示。
[0119]
表8哈茨木霉酸a化合物的活性检测结果
[0120][0121]
从表8可以看出，哈茨木霉酸a化合物对肿瘤细胞的抑制效果不佳，说明该化合物具有低细胞毒性。而哈茨木霉酸a化合物对no及炎症因子il-1、il-6和tnf-α具有较好的的抑制效果，说明该化合物具有较好的抗炎活性。
[0122]
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。