一种捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片及其制作方法与流程

1.本发明涉及微流控技术领域，尤其涉及一种捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片及其制作方法。


背景技术：

2.循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,ctc)的捕获在癌症的诊断、预后及个性化治疗等方面具有重要意义，然而循环肿瘤细胞的稀缺性、异质性等给它们的捕获及分离带来了严峻的技术挑战。目前常见的捕获ctc的方法是利用上皮细胞粘附分子抗体(epithelial cell adhesion molecule，epcam，35kda)进行特异性捕获，用特定的生物分子修饰纳米结构基底可以高效、特异性识别和捕获循环肿瘤细胞，但这些纳米结构基底的制作过程复杂且成本高昂。
3.微流控是一种利用微管道精确控制和操纵微尺度流体的系统，具有样品消耗少、检测速度快、多功能集成化、体积小方便操作和携带等特点，微流控技术具有精确控制流体、自动化、集成化等特点被广泛用于ctc的捕获与分离。
4.现有将微流控技术应用于ctc的捕获设计中，大多是将epcam抗体设置在微流控的基底上，在ctc通过通道后，待epcam抗体将其捕获。但基底的结构和epcam抗体(35kda)的分子大小限制了其在基底表面的高通量修饰，造成了在同等基底材料上，同等比表面积的空间内所容积的epcam抗体数量受到了限制，导致epcam抗体捕获ctc的效率降低。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片及其制作方法，通过制作出具有更大比表面积的微流控芯片，使得微流控芯片可以修饰更多的纳米抗体，以提高纳米抗体捕获循环肿瘤细胞的效率。
6.为实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片，包括第一基板和第二基板，所述第一基板覆盖在所述第二基板上，所述第一基板和所述第二基板之间开设有微流道，所述微流道两端开设有进液口和出液口，含有所述循环肿瘤细胞的溶液自所述进液口流入所述微流道后从所述出液口流出；在所述微流道内，所述第二基板上形成有纳米森林结构，所述纳米森林结构由多个表面带有凹槽的立柱组成，所述立柱表面修饰有纳米抗体，且所述凹槽用于容置所述纳米抗体，所述纳米抗体用于与所述循环肿瘤细胞结合。
8.一种实施方式中，所述立柱表面形成有至少两个所述凹槽。
9.一种实施方式中，两个所述凹槽相连通。
10.一种实施方式中，至少两个所述凹槽的形状和/或尺寸不全相同。
11.一种实施方式中，所述凹槽的深度为5-50nm。
12.一种实施方式中，所述纳米抗体的分子量为15kda。
13.一种实施方式中，多个所述立柱的形状和/或尺寸不全相同。
14.一种实施方式中，多个所述立柱的高度为0.5-1.5μm。
15.一种实施方式中，在所述微流道内，所述第一基板上设有扰流结构，所述扰流结构用于将所述循环肿瘤细胞自所述微流道导流至所述立柱上与所述纳米抗体结合。
16.通过在微流道内的第二基板上形成纳米森林结构，可以增大第二基板的比表面积，以此使得第二基板可以修饰更多的纳米抗体；并且，本发明中还在纳米森林结构的立柱表面形成有凹槽，以此进一步增大了第二基板上的比表面积，且凹槽的设计也有助于容置更多的纳米抗体，以提高纳米抗体捕获循环肿瘤细胞的效率。
17.第二方面，本发明还提供一种捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片的制作方法，包括：提供第一模具和第二模具，在所述第一模具上形成第一微流道，在所述第二模具上形成第二微流道，在所述第一微流道内，所述第一模具上形成有扰流结构，在所述第二微流道内，所述第二模具形成有纳米森林结构，所述纳米森林结构由多个立柱组成；在所述第二模具上覆盖第一材料；将所述第二模具上的第一材料固化后分离，得到具有与所述第二模具互补的第二倒模；在所述第二倒模表面设置纳米微球；在所述第一模具和所述第二倒模上分别覆盖第二材料；将所述第一模具和所述第二倒模上的第二材料固化后分离，分别得到具有所述扰流结构的第一基板和具有所述纳米森林结构的第二基板，且通过所述纳米微球在所述立柱表面形成凹槽；在所述立柱的表面修饰纳米抗体，并将所述第一基板和所述第二基板组合形成所述微流控芯片，所述第一微流道和所述第二微流道组合形成微流道。
18.通过在第二模具上制作纳米森林结构，可以使得与第二模具互补的第二倒模上形成与纳米森林结构互补的结构，在通过第二倒模制作出的第二基板上也形成纳米森林结构，增大了第二基板的比表面积，以此使得第二基板可以修饰更多的纳米抗体；并且，在第二倒模上设置纳米微球，使得通过第二倒模制作出的立柱表面可以形成凹槽，以此进一步增大了第二基板上的比表面积，且凹槽的设计也有助于容置更多的纳米抗体，以提高纳米抗体捕获循环肿瘤细胞的效率。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1是一种实施例的微流控芯片的俯视结构示意图；
21.图2是一种实施例的微流控芯片的剖视面结构示意图；
22.图3是一种实施例的扰流结构的俯视结构示意图；
23.图4是一种实施例的纳米森林结构的扫描电镜俯视图；
24.图5是一种实施例的纳米森林结构的扫描电镜侧视图；
25.图6是一种实施例的立柱的剖视面结构示意图；
26.图7是一种实施例的微流控芯片的制作方法流程图；
27.图8是一种实施例的微流控芯片的制作方法流程图。
28.附图标记说明：10-微流控芯片，1-第一基板，111-第一模具，2-第二基板，22-第二倒模，222-第二模具，3-进液口，4-微流道，41-第一微流道，42-第二微流道，5-出液口，6-纳
米森林结构，61-立柱，62-凹槽，7-扰流结构；
29.20-纳米抗体，30-循环肿瘤细胞，40-纳米微球。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
31.请参考图1和图2，本发明实施例提供一种捕获循环肿瘤细胞30的微流控芯片10，包括第一基板1和第二基板2，第一基板1覆盖在第二基板2上，第一基板1和第二基板2之间开设有微流道4，微流道4两端开设有进液口3和出液口5，含有循环肿瘤细胞30的溶液自进液口3流入微流道4后从出液口5流出；在微流道4内，第二基板2上形成有纳米森林结构6，纳米森林结构6由多个表面带有凹槽62的立柱61组成，立柱61表面修饰有纳米抗体20，且凹槽62用于容置纳米抗体20，纳米抗体20用于与循环肿瘤细胞30结合。
32.具体地，本发明实施例中，第一基板1和第二基板2均为热塑性材料，包括但不限于环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)、聚苯乙烯(ps)、聚碳酸酯(pc)或聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)等。在现有的微流控芯片10的设计中，聚二甲基硅氧烷(pdms)是制作微流控芯片10最广泛使用的材料，但pdms容易吸附疏水性小分子、加工工艺复杂、加工时间长、与玻璃等材质的结合需要通过等离子表面处理进行键合，其成本及批量生产所需的设备限制了其大规模使用，不适合工业化生产。很多热塑性材料的物理性质与pdms相似具有良好的生物相容性和光学透性等，但抛弃了pdms加工工艺复杂、加工时间长等缺点。
33.进一步地，微流控芯片10中，第一基板1可以为上述材料中任一种，第二基板2也可以为上述材料中的任一种，且第一基板1和第二基板2的材料可以为不相同的两种材料相组合。本发明中，利用热塑性材料代替pdms，其物理性质与pdms相似具有良好的生物相容性和光学透性等，但抛弃了pdms加工工艺复杂、加工时间长等缺点，可以在几分钟内以高分辨率快速热压成型，适合大规模工业生产，是制作微流控芯片10的新选择。
34.第一基板1的厚度和第二基板2的厚度可以为1.5-3mm。
35.在第一基板1覆盖在第二基板2上后，第一基板1和第二基板2之间可以形成有微流道4，微流道4的延伸形状可以为直线或曲线；微流道4的宽度可以为4-10mm，高度为100-200μm，且微流道4的流经长度具体不做限制，可以根据所需检测的循环肿瘤细胞30溶液浓度而决定流经长度。
36.进一步地，进液口3和出液口5的形状可以为圆形，且直径可以为0.5-1mm。微流道4与进液口3和出液口5之间可以为缩口形状，以便于用户使用针尖或其他细小输液管从进液口3伸入并注液，这样含有循环肿瘤细胞30的溶液可以快速扩散至微通道内。
37.在其他实施例中，微流控芯片10上可以开设有多条微流道4(图中未展示)，多条微流道4可以呈阵列排布。进一步地，多条微流道4均可开设有进液口3和出液口5；当然，多条微流道4还可以共用一个出液口5。
38.通过在微流道4内的第二基板2上形成纳米森林结构6，可以增大第二基板2的比表面积，以此使得第二基板2可以修饰更多的纳米抗体20；并且，本发明中还在纳米森林结构6
的立柱61表面形成有凹槽62，以此进一步增大了第二基板2上的比表面积，且凹槽62的设计也有助于容置更多的纳米抗体20，以提高纳米抗体20捕获循环肿瘤细胞30的效率。
39.一种实施例中，请参考图2，立柱61表面形成有至少两个凹槽62。具体地，凹槽62的形状可以是圆形或椭圆形，凹槽62可以使用纳米微球通过倒模的方式形成，具体步骤可参考本发明中微流控芯片10的制作方法。任一根立柱61表面所形成的凹槽62数量越多，可以使得立柱61对纳米抗体20的负载能力越强，以此提高纳米抗体20对循环肿瘤细胞30的捕获效率。
40.一种实施例中，请参考图6，两个凹槽62相连通。具体地，两个相连通的凹槽62的深度可以不一致，以使得相连通的凹槽62之间可以形成更大的比表面积。进一步地，在其他实施例中，还可以是多个凹槽62相连通，且相连通的凹槽62可以在立柱61表明形成沟壑，以此增大立柱61的比表面积。
41.一种实施例中，至少两个凹槽62的形状和/或尺寸不全相同。具体地，在利用纳米微球分散液制作凹槽62时，可以使用至少两种尺寸不一致的纳米微球，且可以通过调控纳米微球的比例以此控制凹槽62的尺寸比例。通过控制形成不全相同形状和/或尺寸的凹槽62，可以增加凹槽62之间的连通概率，形状不全相同也有助于进一步增大立柱61的比表面积。
42.一种实施例中，凹槽62的深度为5-50nm。当凹槽62的深度小于5nm时，制作倒模所需要的纳米微球的尺寸也更小，在制作纳米微球分散液时，纳米微球不易分散且易于团聚，使得所述制作的凹槽62的分布不均匀，且也可能造成立柱61的破损。当凹槽62的深度大于50nm时，单个立柱61上所形成的凹槽62数量受到了限制，使得其比表面积减小，立柱61对纳米抗体20的负载能力降低。因此，满足上述范围，可以在使得凹槽62数量最大化的情况下，凹槽62还可以均匀分布。
43.一种实施例中，纳米抗体20的分子量为15kda。具体地，本发明使用的纳米抗体20是仅由重链可变区组成的目前最小的天然抗体片段，是传统epcam抗体的1/10，并且成本低廉，可在大肠杆菌和酵母菌中大量生产。纳米抗体20体积小，可在基底表面实现高通量修饰，进一步提高了纳米抗体20捕获循环肿瘤细胞30的效率。
44.一种实施例中，请参考图4和图5，多个立柱61的形状和/或尺寸不全相同。具体地，多个立柱61的截面形状可以为圆形、椭圆形或多边形，具体不做限制。在制作第二基板2的过程中，可以通过控制工艺参数而形成形状和/或尺寸不全相同的立柱61，以此有利于纳米抗体20覆盖在立柱61表面，增加纳米抗体20捕获循环肿瘤细胞30的概率。
45.一种实施例中，多个立柱61的高度为0.5-1.5μm，直径为50-200nm。当立柱61的高度小于0.5μm或直径小于50nm时，立柱61的整体尺寸较小，其表面所能形成的凹槽62数量和尺寸也受到了限制，当较小尺寸的立柱61上形成较大尺寸的凹槽62后，立柱61的稳定性也因此受到影响，导致立柱61的机械强度较小。当立柱61的高度大于1.5μm或直径大于200nm时，立柱61的整体尺寸较大，相邻立柱61之间的间距也因此变小，不利于立柱61表面的纳米抗体20捕获循环肿瘤细胞30。因此，满足上述范围，可以在使得立柱61保持较好的机械强度的同时，还有利于纳米抗体20捕获循环肿瘤细胞30。
46.一种实施例中，请参考图2和图3，在微流道4内，第一基板1上设有扰流结构7，扰流结构7用于将循环肿瘤细胞30自微流道4导流至立柱61上与纳米抗体结20合。具体地，扰流
结构7可以为一种间隔排布的鱼骨结构，单根鱼骨的截面形状可以为方形，鱼骨的宽度为20-50μm，高度为20-50μm，相邻两个鱼骨之间的间距为40-100微米。通过设置扰流结构7可以诱导含有循环肿瘤细胞30的溶液垂直流动，从而增强循环肿瘤细胞30与第二基板2的接触频率，进一步提高纳米抗体20对循环肿瘤细胞30的捕获效率。
47.请参考图7和图8，本发明还提供一种捕获循环肿瘤细胞30的微流控芯片10的制作方法。具体地制作方法包括：
48.s10:提供第一模具111和第二模具222，在第一模具111上形成第一微流道41，在第二模具222上形成第二微流道42，在第一微流道41内，第一模具111上形成有扰流结构7，在第二微流道42内，第二模具222形成有纳米森林结构6，纳米森林结构6由多个立柱61组成。具体地，准备两张硅片，并通过紫外光刻技术处理其中的一张硅片，可以得到具有第一微流道41和扰流结构7的第一模具111；再通过纳米粒子沉积技术和深度反应离子刻蚀技术(drie)处理另一张硅片，可以得到具有第二微流道42和纳米森林结构6的第二模具222。
49.s20:在第二模具222上覆盖第一材料。具体地，第一材料可以为uv胶或ab胶等；将第一材料再覆盖在第二模具222上具有第二微流道42和纳米森林结构6的一面。
50.s30:将第二模具222上的第一材料固化后分离，得到具有与第二模具222互补的第二倒模22。当选用第一材料为uv胶时，可通过紫外光照射2-5min后，待第一材料固化后，可将第一材料自第二模具222上分离。利用第一材料制作的第二倒模22相对硅片制作的第二模具222具备更加柔软的性能，并且可以反复利用以制作第二基板2，避免了利用硅片作为模具后仅能使用一次的弊端，以此，极大的节约了微流控芯片10制作过程中的成本。
51.s40:在第二倒模22表面设置纳米微球40。准备一份具有纳米微球40的分散液，可以通过喷涂或浸泡的方式在第二倒模22的表面设置纳米微球40，并且纳米微球40的尺寸可以为5-50nm。纳米微球40的材质可以但不限于为聚苯乙烯(ps)、二氧化硅(sio2)或四氧化三铁(fe3o4)等。通过在第二倒模22的表面设置纳米微球40，可以使得在利用第二倒模22制作第二基板2时，在第二基板2相应的位置可以出现凹槽62结构。
52.在其他实施例中，所选择的纳米微球40还可以为多尺寸相互组合，以此，也可以制作出尺寸形状不一的凹槽62。还可以通过调配不同浓度的纳米微球40分散液，以调控纳米微球40的数量，并制作出具有不同凹槽62密度的第二基板2。
53.s50:在第一模具111和第二倒模22上分别覆盖第二材料。具体地，第二材料可以为环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)、聚苯乙烯(ps)、聚碳酸酯(pc)或聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)等。所使用的第二材料可以为热塑性材料，材料成本低，且通过工业注塑成型和热压成型的方式即可处理，极大的节约了制作成本，还节约了制作时间。
54.s60:将第一模具111和第二倒模22上的第二材料固化后分离，分别得到具有扰流结构7的第一基板1和具有纳米森林结构6的第二基板2，且通过纳米微球40在立柱61表面形成凹槽62。通过纳米压印技术反复按压覆盖了第二材料的第一模具111和第二倒模22，将纳米森林结构6和扰流结构7直接压印到第二材料上。其中，压印的温度为100-120℃，压印时间为10-15分钟。利用纳米压印技术制作第一基板1和第二基板2的工艺操作简单、制作时间短、成本低，适合大规模生产。
55.s70:在立柱61的表面形成纳米抗体20，并将第一基板1和第二基板2组合形成微流控芯片10，第一微流道41和第二微流道42组合形成微流道4。具体地，通过uv/o3表面处理和
热压机结合的方式使得第一基板1和第二基板2组合形成微流控芯片10。其中，使用uv/o3对第一基板1和第二基板2表面处理的时长10-30min；再将第一基板1和第二基板2放入热压机，预热到粘接温度并给定一定压力，持续10-15min。uv/o3表面处理可以实现室温下的中等强度键合，具有设备成本低、制造成本低和高通量等特点。
56.通过在第二模具222上制作纳米森林结构6，可以使得与第二模具222互补的第二倒模22上形成与纳米森林结构6互补的结构，再通过第二倒模22制作出的第二基板2上也形成纳米森林结构6，增大了第二基板2的比表面积，以此使得第二基板2可以修饰更多的纳米抗体20；并且，在第二倒模22上设置纳米微球40，使得通过第二倒模22制作出的立柱61表面可以形成凹槽62，以此进一步增大了第二基板2上的比表面积，且凹槽62的设计也有助于容置更多的纳米抗体20，以提高纳米抗体20捕获循环肿瘤细胞30的效率；进一步地，使用uv胶或者ab胶等材料制作出的第二倒模22具备良好的力学性能和耐腐蚀性能，一次制作成型后可反复多次使用，极大节约成本的同时，还利于工业化生产。
57.以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。