一种提高菌株产精氨酸能力稳定性的方法

1.本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种提高菌株产精氨酸能力稳定性的方法，尤其涉及一种通过基因工程提高精氨酸生产菌遗传稳定性的方法。


背景技术：

2.l-精氨酸(l-argnine，简称l-arg)是人体内所需半必需碱性氨基酸之一，作为一种含有胍基的碱性氨基酸，是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物，具有多种独特的生理和药理作用，对于治疗生理功能、心血管疾病、激励免疫系统、维持婴儿的营养平衡、促进人体解毒等都具有良好的疗效，被专家称为是机体内运输和贮存氨基酸的重要载体，在肌内代谢中极为重要。它是合成胞浆蛋白和核蛋白的必需氨基酸；作为唯一的氨来源参与肌酸的合成；作为尿素循环的重要中间体，在肝脏中扮演着排除多余氨的角色，防止氨过量积累而引起中毒；它还具有调节人体免疫力的功能，可抑制肿瘤生长、促进受伤组织愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。因此，l-精氨酸在医药、食品及化工领域方面具有重要而广泛的应用。比如，在临床上，除作为复方氨基酸输液的主要组分之一外，l-精氨酸及其盐类还广泛用于治疗各类肝昏迷忌用谷氨酸钠者和病毒性肝类谷丙转氨酶异常者，对病毒性肝炎疗效显著。对肠道溃疡、血栓形成和神经衰弱等症都有治疗效果。另外，l-精氨酸是运动营养饮料配方的重要组成部分，也是一种重要的饲料添加剂，还广泛地应用于高端养殖业。据统计，目前全世界l-精氨酸需求量在15000吨以上，并且需求量以每年12％-15％的速度增长。
3.l-精氨酸的生产方法有两种：一是蛋白质水解提取法，二是微生物发酵法。水解法存在操作费时，收率和产量低，成本高等问题，并且存在严重的污染，因而不适合大规模生产。发酵法生产l-精氨酸工艺相对简单，且对环境友好，因此具有很大的发展潜力，成为国内外氨基酸工业的一个重要发展趋势。国际上著名的氨基酸公司比如日本味之素、协和发酵和德国迪高沙主要采用生物发酵和基因工程技术进行l-精氨酸生产。但是，国内的微生物发酵生产l-精氨酸的产酸水平普遍较低，成本较高，生产水平和产量远远不能满足国内需求，因此提高l-精氨酸发酵水平的研究具有重要的意义。
4.l-精氨酸的发酵菌种研究得较多的主要有谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、钝齿棒杆菌(corynebacterium crenatum)、大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)等，但目前用来生产l-精氨酸的微生物菌株主要是谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌。基因工程技术对于精氨酸高产菌选育具有重要的推动作用，利用基因工程构建l-精氨酸高产菌株是一种高效率、理性化的育种手段。
5.然而，许多基因工程菌的遗传性状不稳定，分泌产生精氨酸的能力不稳定，导致发酵批次差异大，传代后会发生退化变异现象，甚至经数次传代后就失去产精氨酸能力，造成工业规模生产应用的困难。例如，发明人以野生型谷氨酸棒杆菌atcc13032为出发菌株，敲
除argr，解除argb反馈抑制引入argb的(a26v m31v)突变获得基因工程菌株编号1441(基因型atcc13032δargrargb
a26v m31v
)，大大提高了谷氨酸棒杆菌生产精氨酸的能力，精氨酸产量为6.231
±
0.023g/l，但是后续实验发现，该基因工程菌株十分不稳定，发酵批次差异大，传代后即失去产精氨酸的能力(编号1442即从编号1441菌株传一代后获得的菌株)。因此提高精氨酸工程菌株的遗传稳定性始终是一种迫切的需求。


技术实现要素：

6.为了克服现有l-精氨酸生产菌株遗传性状不稳定、发酵水平低的缺陷，本发明利用基因工程技术来改造谷氨酸棒杆菌包括谷氨酸棒杆菌工程菌的基因组，并且通过增强与l-精氨酸产生相关的基因、弱化分支代谢途径，能够大幅度提高菌株的遗传稳定性和l-精氨酸生产能力。
7.为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种提高菌株产精氨酸能力稳定性的方法，包括以下步骤：以产l-精氨酸的谷氨酸棒杆菌为基础菌株，对基因组中基因ncgl2644/cg3035进行失活或减弱。
9.上述基因ncgl2644/cg3035的失活或减弱可以选自下述方式：敲除基因ncgl2644/cg3035开放阅读框；使基因ncgl2644/cg3035开放阅读框中的任何氨基酸突变为终止密码子；使基因ncgl2644/cg3035开放阅读框中第251位氨基酸a发生突变。
10.上述基因ncgl2644/cg3035的第251位氨基酸a的突变可以选自下组：突变为终止密码子tga或者taa；突变为氨基酸v、d、e、f、g、k、l、m、n、p、r、s、t、w或者y。
11.上述基础菌株可以选自atcc13032、atcc13870、atcc21831等，优选选自上述菌株的基因组(δargr,argbmut(a26v m31v))工程菌即atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v))、atcc13870(δargr,argbmut(a26v m31v))、atcc21831(δargr,argbmut(a26v m31v))等，更优选是谷氨酸棒杆菌atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v))或者其衍生突变菌株，其中
12.所述谷氨酸棒杆菌atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v))是通过敲除谷氨酸棒杆菌atcc13032的argr基因并引入argb的(a26v m31v)突变而得到，
13.所述衍生突变菌株选自专利申请cn201711430988.5中报道的菌株cctcc no:m2017760、专利申请cn201810493046.x中报道的菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v),ncgl0083mut2)、专利申请cn201810492999.4中报道的菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v),ncgl0742mut3)、专利申请cn201810492998.x中报道的菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v),ncgl2374mut4)、专利申请cn201810569947.2中报道的菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v),ncgl2620mut6)、专利申请cn201810569343.8中报道的菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v),ncgl2585mut51)、专利申请cn201810569948.7中报道的菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v),ncgl2585mut52)。
14.在一种优选的实施方式中，上述基础菌株是谷氨酸棒杆菌atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v))，包括以下步骤：
15.a.将基因组中基因ncgl2644/cg3035进行失活或减弱，获得基因ncgl2644/cg3035突变菌株atcc13032(cg3035mut)；
16.b.敲除步骤a中所述基因ncgl2644/cg3035突变菌株atcc13032(cg3035mut)基因组中的argr基因，获得基因敲除菌株atcc13032((cg3035mut,δargr)；
17.c.对步骤b中所述基因敲除菌株atcc13032(cg3035mut,δargr)的基因组中argb基因进行a26v和m31v突变，获得基因工程菌株atcc13032((cg3035mut,δargr,argbmut(a26v m31v))。
18.上述步骤a可通过基因编辑技术实施，所述基因编辑可以采用crispr-cas9系统、crispr-cpf1系统、crispr-cas相关的转座系统integrate系统或者cast系统。
19.上述integrate系统是指sam sternberg研究组开发的基因编辑工具(insertion of transposable elements by guide rna-assisted targeting，引导rna辅助靶向的转座元件插入)；cast系统是指张锋研究组开发的基因编辑工具(crispr-associated transposase，crispr相关转座酶)。
20.在一种实施方式中，上述步骤b中所述基因敲除菌株atcc13032(cg3035mut,δargr)可以通过下述方法制备：
21.b1.以atcc13032基因组为模板，使用序列为seq id no:15的引物argr-al-f和序列为seq id no:16的引物argr-al-r进行pcr扩增，得到约1kb的argr-al片段；
22.b2.以atcc13032基因组为模板，使用序列为seq id no:17的引物argr-ar-f和序列为seq id no:18的引物argr-ar-r进行pcr扩增，得到约1kb的argr-ar片段；
23.b3.使用hindiii和ecori酶切genbank登录号为fj437239.1的质粒pk18mobsacb，胶回收得到5.7kb载体片段；
24.b4.gibson连接上述argr-al片段、argr-ar片段和载体片段，转化dh5α感受态细胞，涂布卡那霉素lb平板，过夜培养；
25.b5.使用引物argr-al-f和argr-ar-r进行pcr扩增验证转化子，得到质粒pk18mobsacb-argr；
26.b6.制备谷氨酸棒状杆菌atcc13032(cg3035mut)感受态细胞；
27.b7.将质粒pk18mobsacb-argr转化入atcc13032(cg3035mut)感受态细胞；
28.b8.进行sacb蔗糖反筛，使用引物argr-al-f和argr-ar-r进行pcr扩增，验证在bhis平板生长而在含卡那霉素的bhis平板不能生长的转化子，得到菌株atcc13032(cg3035mut,δargr)。
29.上述步骤c中所述基因工程菌株可以通过下述方法制备：
30.c1.以atcc13032基因组为模板，使用序列为seq id no:19的引物argb-al-f和序列为seq id no:20的引物argb-al-r进行pcr扩增，得到约1kb的argb-al片段；
31.c2.以atcc13032基因组为模板，使用序列为seq id no:21的引物argb-ar-f和序列为seq id no:22的引物argb-ar-r进行pcr扩增，得到约1kb的argb-ar片段；
32.c3.使用hindiii和ecori酶切genbank登录号为fj437239.1的质粒pk18mobsacb，胶回收得到5.7kb载体片段；
33.c4.gibson连接上述argb-al片段、argb-ar片段和载体片段，转化dh5α感受态细胞，涂布卡那霉素lb平板，过夜培养；
34.c5.使用引物argb-al-f和argb-ar-r进行pcr扩增验证转化子，得到质粒pk18mobsacb-argbmut；
35.c6.制备谷氨酸棒状杆菌atcc13032(cg3035mut,δargr)感受态细胞；
36.c7.将质粒pk18mobsacb-argbmut转化入atcc13032(cg3035mut,δargr)感受态细胞；
37.c8.进行sacb蔗糖反筛，使用引物argb-al-f和argb-ar-r进行pcr扩增，验证在bhis平板生长而在含卡那霉素的bhis平板不能生长的转化子，得到菌株atcc13032(cg3035mut,δargr,argbmut(a26v m31v))。
38.上述步骤b7和c7中所述转化可以是氯化钙转化法或电转化，优选电转化。
39.上述步骤a、步骤b和步骤c可以任意交叉、颠倒地操作，只要每个步骤能实现各自的功能即可。
40.根据本发明的第二个方面，提供了一种基因工程菌，其按照上述的方法构建。
41.根据本发明的第三个方面，提供了上述基因工程菌在l-精氨酸的生产中的应用。
42.该基因工程菌既可以直接作为发酵菌株通过发酵来生产l-精氨酸，也可以作为出发菌株做进一步改良以便筛选出l-精氨酸生产能力进一步提高的新的生产菌。
43.当通过对上述基因工程菌进行发酵来生产l-精氨酸时，发酵时所用的培养基可以是任何适用于谷氨酸棒杆菌生长发酵的培养基。
44.根据本发明的优选实施例，发酵培养基组成如下：60g/l葡萄糖，5g/l玉米浆，30g/l(nh4)2so4，8g/l kcl，2g/l尿素，0.5g/l kh2po4，0.5g/l k2hpo4，1g/l mgso4·
7h2o，1g/l nacl，20mg/l feso4·
7h2o，10mg/l mnso4·
5h2o，20mg/l尼克酸，20mg/lβ-丙氨酸，10mg/l vb1，0.2mg/l生物素，30g/l caco3，koh调至ph7.7。
45.在一种优选的实施方式中，上述l-精氨酸生产菌进行发酵时包括种子培养阶段和菌体发酵阶段。这两个阶段分别使用种子培养基和发酵培养基，发酵培养基可以与种子培养基相同，也可以不相同。
46.优选地，当发酵培养基与种子培养基不相同时，种子培养基组成如下：3g/l nacl，5g/l酵母提取物，7g/l牛肉浸膏，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖。
47.本发明通过将谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组中基因ncgl2644/cg3035进行失活或减弱，能够使产l-精氨酸的基因工程菌株corynebacterium glutamicum atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v))及其衍生突变菌株的遗传稳定性即传代稳定性大大提高，具有普及推广价值。
附图说明
48.图1为质粒pk18mobsacb的示意图，该质粒由中国科学院微生物研究所刘双江馈赠。genbank：fj437239.1。具体信息参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/215434894。
49.图2为本发明构建的重组质粒pk18mobsacb-argr的示意图。
50.图3为本发明构建的重组质粒pk18mobsacb-argbmut的示意图。
51.图4为本发明构建的重组质粒pjys3_δcg3035的示意图。
52.图5为本发明构建的重组质粒pcgsgrna_cg3035的示意图。
具体实施方式
53.以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
54.本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
55.目前能够用于生产、或者有潜力用于生产l-精氨酸的原始谷氨酸棒杆菌包括atcc13032、atcc13870、atcc21831等。这些原始菌株在经过对其基因组进行(δargr,argbmut(a26v m31v))基因工程改造后，形成工程菌即atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v))、atcc13870(δargr,argbmut(a26v m31v))、atcc21831(δargr,argbmut(a26v m31v))等后，可以由不能生产l-精氨酸变为能够生产l-精氨酸、或者由生产l-精氨酸能力弱变为生产l-精氨酸能力强。许多基因工程菌都会存在传代稳定性低下的缺陷，因此如何提高它们的传代稳定性一直是急需解决的问题。
56.在本文中，术语“谷氨酸棒杆菌atcc13032/atcc13870/atcc21831”、“菌株atcc13032/atcc13870/atcc21831”、“atcc13032/atcc13870/atcc21831”表示相同的意义，都是指作为基因改造对象的原始菌株atcc13032/atcc13870/atcc21831，是l-精氨酸产生菌出发菌即野生菌株，购买自上海工业微生物研究所。
57.本发明提高谷氨酸棒杆菌包括菌株corynebacterium glutamicum atcc13032/13870/21831(δargr,argbmut(a26v m31v))及其衍生突变菌株的遗传稳定性(传代稳定性)主要是通过将谷氨酸棒杆菌atcc13032/atcc13870/atcc21831基因组中基因ncgl2644/cg3035以任何改造方式进行失活或减弱而实现的，其中失活或减弱包括敲除ncgl2644/cg3035基因开放阅读框；或者将开放阅读框第251位氨基酸a突变为终止密码子tga或taa，或者突变为其他氨基酸v、d、e、f、g、k、l、m、n、p、r、s、t、w或y。随后在获得的突变菌株基础上敲除argr，并将argb突变为抗l-精氨酸反馈抑制基因型。
58.基因ncgl2644/cg3035编码n-乙酰谷氨酸合酶，可以催化谷氨酸合成n-乙酰谷氨酸，是从谷氨酸到精氨酸生物合成途径的第一步反应，发明人的研究证明该基因的失活或减弱可以提高产l-精氨酸的谷氨酸棒杆菌atcc13032/13870/21831(δargr,argbmut(a26v m31v))及其衍生突变菌株的遗传稳定性。
59.基因argr是一个在细菌中普遍存在的精氨酸操纵子调节基因，在不同的细菌中有不同的功能，发明人研究发现，通过敲除谷氨酸棒杆菌基因组中的这一负调控基因，可一定程度上解除其对精氨酸合成的抑制。
60.n-乙酰谷氨酸激酶(n-acetylglutamatekinase)催化n-乙酰谷氨酸合成n-乙酰谷氨酰磷酸，并受到终产物l-精氨酸的反馈抑制。发明人研究发现，通过对n-乙酰谷氨酸激酶进行突变，将第26位的丙氨酸(a)突变为缬氨酸(v)、第31位的蛋氨酸(m)突变为缬氨酸(v)，可以有效地提高谷氨酸棒杆菌atcc13032/atcc13870/atcc21831中l-精氨酸的合成能力。在本文中，将该n-乙酰谷氨酸激酶基因argb的突变基因简写为argbmut或argbmut(a26v m31v)，其为抗l-精氨酸反馈抑制基因型。
61.实施例中通过上述基因工程操作，获得了一系列遗传稳定性明显提高的产l-精氨酸的谷氨酸棒杆菌，例如基因工程菌株atcc13032 cg3035mutδargrargb
a26v m31v
包括atcc13032δcg3035δargrargb
a26v m31v
和atcc13032 cg3035
a251x
δargrargb
a26v m31v
(其中x
为终止密码子tga、taa、氨基酸v、d、e、f、g、k、l、m、n、p、r、s、t、w或y)等。
62.为描述方便起见，本文中将基因ncgl2644/cg3035的突变δcg3035(敲除)和cg3035
a251x
(第251位氨基酸a突变)统一标示为cg3035mut。
63.进一步地，在上述遗传稳定性提高的谷氨酸棒杆菌包括基因工程菌株atcc13032δcg3035δargrargb
a26v m31v
和atcc13032 cg3035
a251x
δargrargb
a26v m31v
的基础上，为了提高菌株的l-精氨酸产量，还可以分别叠加ncgl2585 e484k突变(参见专利文献cn110564790a即cn201810569948.7)、或ncgl2585 e645k突变(参见专利文献cn110564758a即cn201810569343.8)、或同时叠加ncgl2585 e484k e645k突变，可以将精氨酸产量提高0.5倍以上。换句话说，本发明提高l-精氨酸生产菌的遗传稳定性的技术方案同样适用于工程菌atcc13032(δargr,argbmut(a26v m31v))的衍生菌株，从而同时提高l-精氨酸生产菌的遗传稳定性和生产能力。
64.应理解，在构建本发明的基因工程菌atcc13032δcg3035δargrargb
a26v m31v
和atcc13032 cg3035
a251x
δargrargb
a26v m31v
(其中x为终止密码子tga、taa、氨基酸v、d、e、f、g、k、l、m、n、p、r、s、t、w或y)的具体操作中，步骤a、步骤b和步骤c的排序并非完全根据英文字母顺序由前到后地固定不变，它们可以交叉、颠倒地操作，只要每个步骤能实现各自的功能、完成宿主细胞基因型的定向改变即可。
65.下面以提高产l-精氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌包括atcc13032/13870/21831(δargr,argbmut(a26v m31v))的传代稳定性为例，对本发明的技术方案做具体说明。
66.实施例
67.材料和方法
68.本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
69.本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
70.主要培养基及缓冲液：
71.lb液体培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠。
72.lb固体培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠，20g/l琼脂粉。
73.bhis液体培养基：37g/l bhi，91g/l山梨醇。
74.bhis固体培养基：37g/l bhi，91g/l山梨醇，20g/l琼脂粉。
75.bhis-suc固体培养基：37g/lbhi，91g/l山梨醇，200g/l蔗糖，10g/l葡萄糖。
76.byg培养基：3g/l nacl，5g/l酵母提取物，7g/l牛肉浸膏，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖。
77.rg2培养基：60g/l葡萄糖，5g/l玉米浆，30g/l(nh4)2so4，8g/l kcl，2g/l尿素，0.5g/l kh2po4，0.5g/l k2hpo4，1g/l mgso4·
7h2o，1g/l nacl，20mg/l feso4·
7h2o，10mg/l mnso4·
5h2o，20mg/l尼克酸，20mg/lβ-丙氨酸，10mg/l vb1，0.2mg/l生物素，30g/l caco3，koh调至ph7.7。
78.20x电转母液：80g/l甘氨酸，2％吐温80。
79.以下实施例中，当使用含卡那霉素的培养基时，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml。
80.以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示。
81.表1、实施例中使用的引物列表
82.[0083][0084]
表1中，名称中的
“-
f”代表正向；
“-
r”代表反向。
[0085]
实施例1：利用crispr-cpf1单质粒系统敲除ncgl2644/cg3035基因开放阅读框
[0086]
1.1atcc13032基因组抽提：
[0087]
接少量atcc13032甘油菌(购买自上海工业微生物研究所)到bhis试管，恒温摇床上30℃，220rpm培养18小时，12000rpm离心收集菌体，使用axygen细菌基因组小量抽提试剂盒抽提atcc13032基因组。
[0088]
1.2敲除质粒构建
[0089]
以pjys3_crtyf质粒(nat commun.2017may 4；8:15179.)为模板，用f1/r1为引物获得的4268bp的片段1，用引物f2/r2为引物获得5584bp片段2，以步骤1.1中抽提的atcc13032基因组为模板，用f3/r3为引物获得1026bp片段3，用f4/r4为引物获得965bp片段4，将上述4个片段进行gibson连接，转化dh5α感受态细胞(购买自南京诺唯赞生物科技有限公司的商品化感受态细胞)，涂布卡那霉素lb平板，过夜培养。
[0090]
阳性转化子接lb液体试管，使用axygen的质粒抽提试剂盒抽提质粒测序，得到正确敲除质粒pjys3_δcg3035，其结构如图4所示。
[0091]
pcr体系如下(以下pcr试剂购买自东洋纺toyobo的kod系列)：kod buffer 5μl，dntp 5μl，mgso
4 4μl，引物argr-al-f 0.5μl，引物argr-al-r 0.5μl，kod plus neo 1μl，模板0.4μl，ddh2o补足50μl。pcr程序为99℃热盖，95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸60s；35个循环，最后68℃延伸10min；16℃降温10min扩增目的条带，胶回收目的片段。
[0092]
1.3制备谷氨酸棒状杆菌atcc13032感受态细胞：
[0093]
挑取谷氨酸棒状杆菌attc13032在bhis平板上划线，30℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单菌落到bhis试管培养基中，在30℃，220rpm的过夜培养。接种1ml菌液到100ml的bhis液体培养基摇瓶中，恒温摇床上30℃，220rpm培养4-6h至od600值达到1.0左右。在超净工作台上，将菌液全部转移至50ml离心管中，4℃，4500
×
g离心，弃上清，用10％甘油洗涤菌体，使菌体重悬，4℃，4500
×
g离心，重复洗涤1遍，弃上清。最后加入600μl的10％甘油，使菌体悬浮，分装到1.5ml离心管中，每90μl制备为一支感受态细胞，感受态细胞可放置在-80℃冰箱中保存。
[0094]
1.4pjys3_δcg3035电转化atcc13032感受态细胞：
[0095]
选取测序正确的pjys3_δcg3035质粒，吸取3μl(1μg以上)到谷氨酸棒状杆菌atcc13032感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，在25uf,2.5kv,200ω的条件下进行电击，电击时间为5.6ms，电击后立即转入900μl 46℃预热的bhis液体培养基中，并在46℃水浴锅中水浴6min，然后置于恒温摇床中30℃，220rpm培养1h，使菌体复苏。复苏之后取50μl菌体涂布在含卡那霉素的bhis平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。
[0096]
1.5阳性菌株鉴定
[0097]
pcr扩增验证在含有卡那霉素的bhis平板上生长的单菌落，pcr扩增条件同步骤1.2，使用引物f5/r5进行鉴定，cg3035成功敲除后阳性条带大小为2335bp，未敲除阴性条带大小为3200bp。
[0098]
1.6阳性转化子丢质粒
[0099]
挑取阳性转化子到4ml的bhis试管培养基中，在恒温摇床上37℃，220rpm培养12小时后划线无抗平板，继续培养37℃恒温培养箱培养24小时，将单菌落分别划线含卡那霉素的bhis平板和无抗bhis平板，挑取在无抗bhis平板生长而在含卡那霉素的bhis平板不能生长的转化子，使用20％甘油保菌。得到了敲除ncgl2644/cg3035基因开放阅读框的基因型为atcc13032δcg3035的菌株。
[0100]
实施例2：利用crispr-cas9双质粒系统将ncgl2644/cg3035基因第251位a突变
[0101]
2.1突变质粒构建
[0102]
以pcgsgrna_crtyf质粒(acs synth biol.2020jul 17；9(7):1897-1906.)为模板，以f6/r6为引物扩增4401bp的片段，将该片段转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布壮观霉素lb平板，过夜培养。
[0103]
阳性转化子接lb液体试管，使用axygen的质粒抽提试剂盒抽提质粒测序，得到正确质粒pcgsgrna_cg3035，其结构如图5所示。
[0104]
pcr体系同1.2。
[0105]
2.2单链修复模板的设计
[0106]
为了将ncgl2644/cg3035基因第251位a突变为终止密码子tga、taa、或其他氨基酸v、d、e、f、g、k、l、m、n、p、r、s、t、w、y，设计单链修复模板，见表2。将表2中的序列以引物的形式合成，并溶解到浓度为2μg/μl。
[0107]
表2、单链修复模板列表
[0108]
单链修复模板模板序列(5
’→3’
)tga(stop)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgtgaatcacgcgcgccaccatcacggctgcggtaa(stop)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgtaaatcacgcgcgccaccatcacggctgcgggtg(v)cctgaccacgccggcggggcaaacagtggtgatcacgcgcgccaccatcacggctgcgggat(d)cctgaccacgccggcggggcaaacagtggatatcacgcgcgccaccatcacggctgcgggaa(e)cctgaccacgccggcggggcaaacagtggaaatcacgcgcgccaccatcacggctgcggttc(f)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgttcatcacgcgcgccaccatcacggctgcggggc(g)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgggcatcacgcgcgccaccatcacggctgcggaag(k)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgaagatcacgcgcgccaccatcacggctgcggctg(l)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgctgatcacgcgcgccaccatcacggctgcggatg(m)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgatgatcacgcgcgccaccatcacggctgcggaac(n)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgaacatcacgcgcgccaccatcacggctgcggcca(p)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgccaatcacgcgcgccaccatcacggctgcggcgc(r)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgcgcatcacgcgcgccaccatcacggctgcggtcc(s)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgtccatcacgcgcgccaccatcacggctgcggacc(t)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgaccatcacgcgcgccaccatcacggctgcggtgg(w)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgtggatcacgcgcgccaccatcacggctgcggtac(y)cctgaccacgccggcggggcaaacagtgtacatcacgcgcgccaccatcacggctgcgg
[0109]
2.3将pcgcas9_rect质粒转入谷氨酸棒杆菌atcc13032感受态细胞
[0110]
首先将pcgcas9_rect质粒(acs synth biol.2020jul 17；9(7):1897-1906.)转入制备好的谷氨酸棒杆菌atcc13032感受态细胞中，感受态制备方法与电转化方法同步骤1.3
与1.4。获得含有pcgcas9_rect质粒的atcc13032菌株。
[0111]
2.4将pcgsgrna_cg3035质粒转入含有pcgcas9_rect质粒的atcc13032菌株的感受态细胞
[0112]
按照步骤1.3感受态制备方法制备含有pcgcas9_rect质粒的atcc13032菌株的感受态细胞，将500ng pcgsgrna_cg3035质粒和1～10ng单链修复模板转入制备好的感受态细胞中，复苏之后将菌体涂布在含卡那霉素和壮观霉素的bhis平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。
[0113]
2.5阳性转化子鉴定
[0114]
使用引物f-cg3035和r-cg3035进行pcr扩增，验证在含卡那霉素和壮观霉素的bhis平板上的转化子，pcr扩增条件同步骤1.2，得到条带约为1kb，对pcr产物进行测序得到成功突变的转化子。挑取阳性转化子到4ml的bhis试管培养基中，按照步骤1.6所述方法丢质粒，随后将阳性转化子在恒温摇床上30℃，220rpm培养24小时，使用20％甘油保菌。得到基因ncgl2644/cg3035发生第251位a突变的基因型为atcc13032 cg3035 a251x
的菌株，包括atcc13032 cg3035
a251tga
、atcc13032 cg3035
a251taa
、atcc13032 cg3035
a251v
、atcc13032 cg3035
a251d
、atcc13032 cg3035
a251e
、atcc13032 cg3035
a251f
、atcc13032 cg3035
a251g
、atcc13032 cg3035
a251k
、atcc13032 cg3035
a251l
、atcc13032 cg3035
a251m
、atcc13032 cg3035
a251n
、atcc13032 cg3035
a251p
、atcc13032 cg3035
a251r
、atcc13032 cg3035
a251s
、atcc13032 cg3035
a251t
、atcc13032 cg3035
a251w
、atcc13032 cg3035
a251y
。
[0115]
实施例3：敲除argr基因的菌株atcc13032 cg3035mutδargr的制备
[0116]
3.1敲除质粒pk18mobsacb-argr的构建
[0117]
3.1.1以步骤1.1中抽提的atcc13032基因组为模板，使用引物argr-al-f和argr-al-r进行pcr扩增argr-al片段，pcr体系如下(以下pcr试剂购买自东洋纺toyobo的kod系列)：kod buffer 5μl，dntp 5μl，mgso
4 4μl，引物argr-al-f 0.5μl，引物argr-al-r 0.5μl，kod plus neo 1μl，模板0.4μl，ddh2o补足50μl。pcr程序为99℃热盖，95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸60s；35个循环，最后68℃延伸10min；16℃降温10min。扩增得到约1kb片段，胶回收目的片段。
[0118]
3.1.2以步骤1.1中抽提的atcc13032基因组为模板，使用引物argr-ar-f和argr-ar-r按照步骤3.1.1相同的pcr条件扩增argr-ar片段，约1kb，胶回收目的片段。
[0119]
3.1.3使用axygen的质粒抽提试剂盒抽提质粒pk18mobsacb(由中国科学院微生物研究所刘双江馈赠，其结构如图1所示)，使用hindiii和ecori酶切质粒，胶回收，得到5.7kb载体片段。
[0120]
3.1.4gibson连接以上片段，转化dh5α感受态细胞，涂布卡那霉素lb平板，过夜培养。
[0121]
3.1.5使用引物argr-al-f和argr-ar-r进行pcr扩增验证转化子，pcr体系如下(以下pcr试剂购买自东洋纺toyobo的kod系列)：kod buffer 2μl，dntp 2μl，mgso
4 1.6μl，引物argr-al-f 0.4μl，引物argr-ar-r 0.4μl，kod plus neo 0.4μl，模板为菌体，ddh2o补足20μl。pcr程序为99℃热盖，95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸120s，35个循环；最后68℃延伸10min；16℃降温10min。阳性条带约为2kb。阳性转化子接lb液体试管，使用axygen的质粒抽提试剂盒抽提质粒测序，得到正确质粒pk18mobsacb-argr，其结构
如图2所示。
[0122]
3.2制备谷氨酸棒状杆菌atcc13032δcg3035或atcc13032 cg3035 a251x
感受态细胞：
[0123]
挑取谷氨酸棒状杆菌atcc13032δcg3035或atcc13032cg3035 a251x
在bhis平板上划线，30℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单菌落到bhis试管培养基中，在30℃，220rpm的过夜培养。接种1ml菌液到100ml的bhis液体培养基摇瓶中，恒温摇床上30℃，220rpm培养4-6h至od
600
值达到1.0左右。在超净工作台上，将菌液全部转移至50ml离心管中，4℃，4500
×
g离心，弃上清，用10％甘油洗涤菌体，使菌体重悬，4℃，4500
×
g离心，重复洗涤1遍，弃上清。最后加入600μl的10％甘油，使菌体悬浮，分装到1.5ml离心管中，每90μl制备为一支感受态细胞，感受态细胞可放置在-80℃冰箱中保存。
[0124]
3.3pk18mobsacb-argr电转化atcc13032δcg3035或atcc13032 cg3035 a251x
感受态细胞：
[0125]
选取测序正确的质粒，吸取3μl(1μg以上)到谷氨酸棒状杆菌atcc13032δcg3035或atcc13032 cg3035 a251x
感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，在25uf,2.5kv,200ω的条件下进行电击，电击时间为5.6ms，电击后立即转入900μl 46℃预热的bhis液体培养基中，并在46℃水浴锅中水浴6min，然后置于恒温摇床中30℃，220rpm培养1h，使菌体复苏。复苏之后取50μl菌体涂布在含卡那霉素的bhis平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。
[0126]
3.4sacb蔗糖反筛：
[0127]
挑取含卡那霉素的bhis平板上的转化子，接种到无抗性的bhis试管培养基中，在恒温摇床中30℃，220rpm培养24h，使其发生双交换。将菌体稀释1000倍后涂布在含20％蔗糖的bhis-suc平板上，倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取bhis-suc平板转化子，分别点板bhis平板和含卡那霉素的bhis平板，倒置在30℃恒温培养箱中培养24小时。使用引物argr-al-f和argr-ar-r进行pcr扩增验证在bhis平板生长而在含卡那霉素的bhis平板不能生长的转化子，pcr扩增条件同步骤1.2.5，argr基因成功敲除的阳性条带约为2kb，阴性条带为2.5k。挑取阳性转化子到4ml的bhis试管培养基中，在恒温摇床上30℃，220rpm培养24小时，使用20％甘油保菌。得到了基因型为atcc13032 cg3035mutδargr包括(atcc13032δcg3035δargr和atcc13032 cg3035 a251x
δargr)的菌株。
[0128]
实施例4：突变argb基因的菌株atcc13032 cg3035mutargb
mut(a26v m31v)
的制备
[0129]
4.1突变质粒pk18mobsacb-argbmut的构建：
[0130]
4.1.1以步骤1.1中抽提的atcc13032基因组为模板，使用引物argb-al-f和argb-al-r扩增argb-al片段，约1kb，胶回收目的片段。
[0131]
4.1.2以步骤1.1中抽提的atcc13032基因组为模板，使用引物argb-ar-f和argb-ar-r扩增argb-ar片段，约1kb，胶回收目的片段。
[0132]
4.1.3使用axygen的质粒抽提试剂盒抽提质粒pk18mobsacb(由中国科学院微生物研究所刘双江馈赠，其结构如图1所示)，使用hindiii和ecori酶切质粒，胶回收，得到5.7kb载体片段。
[0133]
4.1.4gibson连接以上片段，转化dh5α感受态细胞(购买自南京诺唯赞生物科技有限公司的商品化感受态细胞)，涂布卡那霉素lb平板，过夜培养。
[0134]
4.1.5使用引物argb-al-f和argb-ar-r按照步骤1.2.5相同的pcr条件扩增验证转化子，阳性条带约为2kb。阳性转化子接lb液体试管，抽提质粒测序，得到正确质粒pk18mobsacb-argbmut，其结构如图3所示。
[0135]
4.2制备谷氨酸棒状杆菌atcc13032 δcg3035δargr或atcc13032 cg3035
a251x
δargr感受态细胞：
[0136]
挑取谷氨酸棒状杆菌atcc13032δcg3035δargr或atcc13032 cg3035
a251x
δargr在bhis平板上划线，30℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单菌落到bhis试管培养基中，在30℃，220rpm的过夜培养。接种1ml菌液到100ml的bhis液体培养基摇瓶中，恒温摇床上30℃，220rpm培养4-6h至od
600
值达到1.0左右。在超净工作台上，将菌液全部转移至50ml离心管中，4℃，4500
×
g离心，弃上清，用10％甘油洗涤菌体，使菌体重悬，4℃，4500
×
g离心，重复洗涤1遍，弃上清。最后加入600μl的10％甘油，使菌体悬浮，分装到1.5ml离心管中，每90μl制备为一支感受态细胞，感受态细胞可放置在-80℃冰箱中保存。
[0137]
4.3pk18mobsacb-argbmut电转化atcc13032δcg3035δargr或atcc13032cg3035
a251x
δargr感受态细胞：
[0138]
选取测序正确的质粒，吸取3μl(1μg以上)到谷氨酸棒状杆菌atcc13032δcg3035δargr或atcc13032 cg3035
a251x
δargr感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，在25uf,2.5kv,200ω的条件下进行电击，电击时间为5.6ms，电击后立即转入900μl 46℃预热的bhis液体培养基中，并在46℃水浴锅中水浴6min，然后置于恒温摇床中30℃，220rpm培养1h，使菌体复苏。复苏之后取50μl菌体涂布在含卡那霉素的bhis平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。
[0139]
4.4sacb蔗糖反筛：
[0140]
挑取含卡那霉素的bhis平板上的转化子，接种到无抗性的bhis试管培养基中，在恒温摇床中30℃，220rpm培养24h，使其发生双交换。将菌体稀释1000倍后涂布在含20％蔗糖的bhis-suc平板上，倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取bhis-suc平板转化子，分别点板bhis平板和含卡那霉素的bhis平板，倒置在30℃恒温培养箱中培养24小时。使用引物argb-al-f和argb-ar-r进行pcr扩增验证在bhis平板生长而在含卡那霉素的bhis平板不能生长的转化子，pcr扩增条件同步骤3.1.5，得到条带约为2kb，对pcr产物进行测序得到argb成功突变的转化子。挑取阳性转化子到4ml的bhis试管培养基中，在恒温摇床上30℃，220rpm培养24小时，使用20％甘油保菌。得到基因型为atcc13032 cg3035mutargb
mut(a26v m31v)
(包括atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
和atcc13032 cg3035
a251x
δargrargb
mut(a26v m31v)
)的菌株。
[0141]
实施例5：atcc13032 cg3035mutδargr argb
mut(a26v m31v)
衍生菌株的制备
[0142]
为了提高具有较高遗传稳定性的菌株atcc13032 cg3035mutargb
mut(a26v m31v)
(包括atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
或atcc13032 cg3035
a251x
δargrargb
mut(a26v m31v)
)的精氨酸生产能力，构建其衍生菌株。
[0143]
5.1参照专利cn110564790a，突变实施例4中所得菌株atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
或atcc13032 cg3035
a251x
δargrargb
mut(a26v m31v)
的clpc基因为clpc
e484k
，得到菌株atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
clpc
e484k
或atcc13032cg3035
a251x
δargrargb
mut(a26v m31v)
clpc
e484k
。
[0144]
5.2参照专利cn110564758a，突变实施例4中所得菌株atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
或atcc13032 cg3035
a251x
δargrargb
mut(a26v m31v)
的clpc基因为clpc
e645k
，得到菌株atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
clpc
e645k
或atcc13032cg3035
a251x
δargrargb
mut(a26v m31v)
clpc
e645k
。
[0145]
5.3参照专利cn110564790a和cn110564758a，突变实施例4中所得菌株atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
或atcc13032 cg3035
a251x
δargrargb
mut(a26v m31v)
的clpc基因为clpc
e484ke645k
，得到菌株atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
clpc
e484ke645k
或atcc13032 cg3035
a251x
δargrargb
mut(a26v m31v)
clpc
e484ke645k
。
[0146]
这些衍生菌株的精氨酸产量相比基因ncgl2644/cg3035进行失活或减弱改造前的出发菌株而言，普遍提高了0.5倍以上。
[0147]
实施例6：精氨酸生产菌株发酵测试
[0148]
对于原始菌株atcc13032、产精氨酸菌株atcc13032δargrargb
mut(a26v m31v)
(包括编号1441菌株、及其下一代菌株1442)、基因ncgl2644/cg3035进行失活或减弱改造的atcc13032 cg3035mutδargr argb
mut(a26v m31v)
菌株及其衍生菌株，通过发酵来测试精氨酸生产能力。步骤如下：
[0149]
6.1菌株摇瓶发酵
[0150]
6.1.1活化：从菌种甘油管划线至平板bhig，30℃培养2天左右。
[0151]
6.1.2种子培养：byg培养基配制混匀后分装10ml/瓶至250ml摇瓶中，用接种环挖取传代得到的单菌落接种于种瓶中，30℃，220rpm培养24h。
[0152]
6.1.3摇瓶发酵：rg2培养基配制混匀分装45ml/瓶至500ml单挡板摇瓶(预装有1.5g碳酸钙)中，接种5ml以上种子液至rg2摇瓶中，30℃，220rpm培养约48h-72h，直至葡萄糖耗尽。发酵液高速离心，取上清，稀释50倍，hplc检测精氨酸产量。
[0153]
6.2高效液相色谱hplc测定精氨酸含量
[0154]
6.2.1方法：使用opa柱前衍生氨基酸分析法来测定发酵液中l-精氨酸含量。一级氨基酸在巯基试剂存在下与邻苯二醛(opa)反应生成opa-氨基酸，生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分离后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。
[0155]
6.2.2衍生剂和流动相配制
[0156]
硼酸缓冲液：0.4m硼酸缓冲液，准确称取6.183g硼酸，溶于超纯水中，用10n naoh溶液调至ph 10.2，定容至250ml容量瓶中。
[0157]
衍生剂：准确称取500mg邻苯二甲醛(opa)固体，加5ml无水乙醇，加500μl巯基丙酸，用0.4m、ph 10.2的硼酸缓冲液定容至50ml。
[0158]
流动相a：40mm nah2po4溶液，准确称取5.5g nah2po4·
h2o，溶于超纯水，用10n naoh溶液调至ph 7.8，定容至1l，0.22μm滤膜过滤后备用。
[0159]
流动相b：acn:meoh:h2o＝45:45:10，定容1l备用，试剂纯度为hplc级。
[0160]
6.2.3高效液相色谱测定条件：
[0161]
色谱柱：zorbax eclipse-aaa 4.6x 75mm，3.5μm；流速：1.2ml/min；停止时间：14min；柱温：40度；dad设置：uv 338nm，10nm(带宽)，参比390nm，20nm(带宽)。
[0162]
洗脱程序如表3所示。
[0163]
表3、hplc洗脱程序
[0164][0165][0166]
自动进样器分别取0.5μl样品，2.5μl硼酸缓冲液，0.5μl衍生剂，32μl超纯水，混合衍生后进样，精氨酸出峰时间为7.9分钟。根据峰面积对比标样，即可得到样品中l-精氨酸含量。
[0167]
6.3菌株发酵的l-精氨酸产量
[0168]
根据步骤6.1中的发酵方案和步骤6.2中的测定方法，比较各菌株的l-精氨酸发酵产量，每个菌株做3个平行试验，结果如下表：
[0169]
表4、菌株发酵的l-精氨酸水平比较
[0170]
[0171][0172]
由表4中可以看出，菌株atcc13032δargrargb
a26v m31v
传代后即失去产精氨酸的能力，没有遗传稳定性。对产l-精氨酸菌株atcc13032δargrargb
mut(a26v m31v)
进行基因ncgl2644/cg3035失活或减弱改造后，所得的atcc13032 cg3035mutδargr argb
mut(a26v m31v)
菌株及其衍生菌株仍然保持了l-精氨酸生产能力。
[0173]
下面对atcc13032 cg3035mutδargr argb
mut(a26v m31v)
菌株的遗传稳定性进行考察
[0174]
实施例7：通过传代分析菌株产精氨酸能力的稳定性
[0175]
选取基因ncgl2644/cg3035敲除菌株atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
、第251位氨基酸a突变菌株atcc13032 cg3035
a251tga
δargrargb
a26v m31v
和atcc13032 cg3035
a251v
δargrargb
a26v m31v
，通过传代和发酵进行遗传稳定性考察。
[0176]
7.1用于稳定性分析的传代
[0177]
7.1.1将byg培养基配制混匀后分装10ml/瓶至250ml摇瓶中，将待考察菌株的甘油菌分别接种三瓶byg培养基。30℃，220rpm培养24h。
[0178]
7.1.2把上述培养液2％v/v接种于新的byg培养基，30℃，220rpm培养24h。
[0179]
7.1.3重复7.1.2中步骤转接，完成传代三次。
[0180]
7.1.4经以上byg三次传代之后，取2％v/v转接入50ml rg2培养基。30℃，220rpm培养48h。
[0181]
7.1.5取48h终点发酵液，稀释10
5-106倍后取100μl涂布无抗bhis平板，30℃培养48h。待长出单菌落后进行发酵验证菌株经过上述三次传代后能保持产精氨酸能力菌落的占比。
[0182]
7.2菌株摇瓶发酵
[0183]
7.2.1种子培养：byg培养基配制混匀后分装10ml/瓶至250ml摇瓶中，用接种环挖取步骤7.1中传代得到的单菌落接种于种瓶中，30℃，220rpm培养24h。
[0184]
7.2.2摇瓶发酵：rg2培养基配制混匀分装45ml/瓶至500ml单挡板摇瓶(预装有1.5g碳酸钙)中，接种5ml以上的步骤7.2.1中的种子液至rg2摇瓶中，30℃，220rpm培养约
48h-72h，直至葡萄糖耗尽。发酵液高速离心，取上清，稀释50倍，hplc检测精氨酸产量。
[0185]
7.3菌株产精氨酸能力的稳定性分析：
[0186]
根据步骤7.1中传代方案，每个菌分别进行3个平行传代实验，得到6块平板。每个平板上挑取10个单菌落进行发酵，测得菌株的l-精氨酸发酵产量汇总如表5所示。
[0187]
表5、传三代之后菌株发酵的l-精氨酸产量及有产量菌株占比
[0188]
[0189][0190]
由表5可见，菌株atcc13032δargrargb
a26v m31v
传代后即失去产精氨酸的能力，没有遗传稳定性；菌株atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
和atcc13032 cg3035
a251v
δargrargb
mut(a26v m31v)
经三次传代，都能保持70％以上的母菌l-精氨酸生产能力。
[0191]
至于第251位氨基酸a突变为终止密码子taa以及分别突变为氨基酸d、e、f、g、k、l、m、n、p、r、s、t、w和y的菌株，经传代培养考察遗传稳定性的结果与atcc13032δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
、atcc13032 cg3035
a251tga
δargrargb
a26v m31v
和atcc13032 cg3035
a251v
δargrargb
mut(a26v m31v)
类似，即，经三次传代都能保持70％以上的母菌l-精氨酸生产能力。
[0192]
实施例8：菌株atcc13870/atcc21831基因ncgl2644/cg3035改造后发酵测试
[0193]
为了验证基因ncgl2644/cg3035进行失活或减弱的改造方案是否适用于其他生产l-精氨酸菌株，继续以谷氨酸棒杆菌atcc13870和谷氨酸棒杆菌atcc21831为例进行相应改造，并进行发酵测试，具体如下：
[0194]
8.1参照实施例1和实施例2，分别构建atcc13870δcg3035，atcc13870 cg3035
a251v
，atcc21831δcg3035，atcc21831 cg3035
a251v
菌株。
[0195]
8.2参照实施例3，分别构建atcc13870δcg3035δargr，atcc13870 cg3035
a251v
δargr，atcc21831δcg3035δargr，atcc21831 cg3035
a251v
δargr菌株。
[0196]
8.3参照实施例4，分别构建atcc13870δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
，atcc13870 cg3035
a251v
δargr argb
mut(a26v m31v)
，atcc21831δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
，atcc21831 cg3035
a251v
δargr argb
mut(a26v m31v)
菌株。
[0197]
8.4参照实施例6，对于菌株atcc13870，atcc21831，atcc13870δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
，atcc13870 cg3035
a251v
δargr argb
mut(a26v m31v)
，atcc21831δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
，atcc21831 cg3035
a251v
δargr argb
mut(a26v m31v)
通过发酵来测试精氨酸生产能力。
[0198]
比较各菌株的l-精氨酸发酵产量，每个菌株做3个平行试验，结果如下表6所示。
[0199]
表6、菌株发酵的l-精氨酸水平比较
[0200]
菌株编号基因型精氨酸产量(g/l)atcc13870wild type0atcc21831wild type013870δcg3035atcc13870δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
6.486
±
0.11713870cg3035
a251v
atcc13870cg3035
a251v
δargr argb
mut(a26v m31v)
6.794
±
0.14621831δcg3035atcc21831δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
5.986
±
0.21321831cg3035
a251v
atcc21831cg3035
a251v
δargr argb
mut(a26v m31v)
6.725
±
0.124
[0201]
实施例9：通过传代分析菌株atcc13870/atcc21831产精氨酸能力的稳定性
[0202]
选取菌株，atcc13870δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
，atcc13870 cg3035
a251v
δargr argb
mut(a26v m31v)
，atcc21831δcg3035δargr argb
mut(a26v m31v)
，atcc21831 cg3035
a251v
δargr argb
mut(a26v m31v)
通过传代和发酵进行遗传稳定性考察，结果如下表7所示。
[0203]
表7、传三代之后菌株发酵的l-精氨酸产量及有产量菌株占比
[0204]
[0205][0206]
上述实验结果表明，本发明对产精氨酸菌株进行基因ncgl2644/cg3035失活或减弱的改造方案能大大提高菌株产精氨酸能力的稳定性，使基因工程菌株具有产业化应用的可能。