水稻免疫负调控蛋白OsPHD1及其突变体与应用的制作方法

水稻免疫负调控蛋白osphd1及其突变体与应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及水稻免疫负调控蛋白osphd1及其突变体与应用。


背景技术：

2.为应对各种生物胁迫，植物在漫长的进化过程中形成了一整套被精密调控的免疫应激反应机制。当感知到病原菌攻击时，植物通过在侵染位点迅速启动过敏反应(hypersensitive response,hr)而快速阻断病原菌的进一步侵染。同时，将信号传递至临近组织，通过启动系统获得抗性而进一步阻止病原菌的继续扩张。植物的先天免疫反应包括两个层级：病原菌相关分子模式诱导的免疫(pathogen associated molecular pattern trigged immunity,pti)和效应因子诱导的免疫(effector trigged immunity,eti)。pti依赖于细胞膜表面的模式识别受体(pattern recognition receptors,prrs)，具有温和但广谱的特点；eti则由抗病蛋白(r蛋白)识别病原菌分泌的效应蛋白(effector)所激发，类似于定点打击，但抗谱较窄。
3.植物抗病性激发过程包含一系列应答反应，包括活性氧(reaction oxygens,ros)爆发，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,mapks)级联反应的激活，防卫相关基因的表达等。其中，在侵染初期，通过快速启动细胞程序性死亡(programmed cell death,pcd)程序，以一种自杀的形式迅速将病原菌的侵染控制在有限的范围内，对于防卫成功与否至关重要。因为关系到细胞的命运，生物体内的pcd被一系列精密元件调控着，从而确保其在准确的位点适时适当启动。当此类调控因子发生功能性缺失突变后，由于pcd的持续激活，植株会表现出自发性细胞死亡表型，即类似细胞感染后产生坏死病斑的现象。从本质上讲，类病斑表型是由于抗病反应失控后持续激活引起，大量实验亦证实，绝大部分类病斑突变体的抗病性都有显著增强，因而成为研究抗病分子机制的极佳材料。
4.水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球有超过一半的人口以稻米为主食。降低水稻病害的发生，维持水稻稳产，对保障世界粮食安全至关重要。实践证明，培育抗病品种，合理利用水稻自身抗性是控制水稻病害的最安全、有效及环保的举措。深入挖掘以及系统剖析水稻抗病分子机理是培育广谱持久抗病品种的根本，亦是水稻研发的重点。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供水稻免疫负调控蛋白osphd1及其突变体与应用。
6.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供水稻免疫负调控蛋白osphd1活性的降低或丧失在提高水稻抗病性中的应用。
7.所述抗病性为抗白叶枯病。由黄单胞菌水稻致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)所导致的白叶枯病。
8.本发明中，水稻免疫负调控蛋白osphd1为：
9.(a)由seq id no:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
10.(b)seq id no:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
11.水稻免疫负调控蛋白osphd1由基因osphd1编码，基因osphd1为：
12.i)seq id no:1所示的核苷酸序列；
13.ii)seq id no:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
14.iii)在严格条件下与seq id no:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
15.iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
16.基因osphd1的cdna序列为：
17.①
seq id no:2所示的核苷酸序列；
18.②
seq id no:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
19.③
在严格条件下与seq id no:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
20.④
与
①
、
②
或
③
的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
21.第二方面，本发明提供一种提高水稻抗病性的方法，利用基因工程手段，对水稻免疫负调控基因osphd1进行改造，获得该基因功能缺失的转基因水稻。
22.基因改造方法包括但不限于诱变、定点突变或同源重组。
23.例如，seq id no:1所示基因osphd1第3322bp，或者seq id no:2所示基因osphd1的cdna序列第346bp，发生了1个碱基(a)的插入突变，由此产生移码突变并最终造成osphd1蛋白翻译的提前终止。
24.第三方面，本发明提供按照所述方法获得的转基因水稻在植物育种中的应用。
25.育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
26.第四方面，本发明提供一种水稻免疫负调控蛋白osphd1突变体，所述突变体为：
27.(a)由seq id no:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
28.(b)seq id no:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
29.第五方面，本发明提供编码所述突变体的核酸分子。
30.第六方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
31.第七方面，本发明提供所述突变体、编码所述突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：
32.1)用于提高植物抗病性；
33.2)用于植物育种；
34.3)用于制备转基因植物。
35.优选地，所述植物为禾本科稻属植物，更优选水稻。
36.进一步地，所述应用为提高水稻抗病性，所述抗病性为抗白叶枯病。
37.本发明通过ems诱变获得水稻类病斑突变体lm212-1，并应用真菌几丁质以及细菌鞭毛蛋白处理野生型嘉禾212(wt)及突变体osphd1(lm212-1)叶片后检测ros含量水平，人工接种白叶枯病并鉴定抗性水平，应用荧光定量pcr技术比较分析突变体以及野生型中防卫相关基因的表达水平，进而通过图位克隆得到控制水稻类病变的基因，然后通过遗传转化验证基因功能，最终成功分离出水稻免疫负调控基因osphd1。实验结果表明，在通过ems诱变获得的osphd1功能缺失突变体中，相较于野生型，其对水稻细菌病害白叶枯病抗性极显著提高，可有效应用于水稻抗病性分子改良育种中，应用前景广阔。
附图说明
38.图1为本发明较佳实施例中野生型嘉禾212(wt)与突变体osphd1(lm212-1)细胞死亡表型对比图；其中，a、b、c、d为播种后22天的表型差异对比，e、f为播种后60天的表型差异对比。
39.图2为本发明较佳实施例中野生型嘉禾212(wt)与突变体osphd1(lm212-1)细胞死亡及活性氧积累检测对比图；其中，a为dab染色对比图，b为伊文思蓝染色对比图，c为h2o2含量对比图，d为cat酶活对比图。
40.图3为本发明较佳实施例中白叶枯菌人工接种抗性鉴定结果对比图；其中，a为接种白叶枯菌的叶片病斑表型对比图，b为接种白叶枯菌的叶片病斑长度对比图。
41.图4为本发明较佳实施例中7个病原菌相关分子模式激活免疫相关基因(oscebip、oscerk1、osrlck185、osbsk1、oslysm-rlk10、ospub44、osserk2)及8个防卫相关基因(ospr1a、ospr1b、ospr5、ospr10、ospal1、oswrky45、ospo-c1、osnpr1)相对表达量对比图。
42.图5为本发明较佳实施例中ros积累动态分析图。
43.图6为本发明较佳实施例中野生型嘉禾212(wt)及突变体osphd1(lm212-1)基因序列比对。
44.图7为本发明较佳实施例中转基因互补材料表型对比图；其中，a为整个植株对比图，b为单个叶片对比图。
45.图2-图4中，*和**表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，*表示p《0.05，**表示p《0.01。
具体实施方式
46.一方面，本发明提供一种与水稻抗病性有关的水稻免疫负调控蛋白osphd1、其编码基因及应用。
47.采用如下技术方案：
48.本发明的水稻免疫负调控蛋白osphd1，其为：(a)由seq id no:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)seq id no:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
49.本发明还提供编码上述蛋白的基因osphd1及cdna序列。
50.进一步地，基因osphd1为：
51.i)seq id no:1所示的核苷酸序列；
52.ii)seq id no:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
53.iii)在严格条件下与seq id no:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
54.iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
55.基因osphd1的cdna序列为：
56.①
seq id no:2所示的核苷酸序列；
57.②
seq id no:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
58.③
在严格条件下与seq id no:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
59.④
与
①
、
②
或
③
的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
60.本发明还提供上述蛋白、基因在水稻抗病性分子改良中的应用。
61.另一方面，本发明提供一种提高水稻抗病性的水稻免疫负调控蛋白osphd1的突变蛋白、其编码基因、表达载体、转化体及应用。
62.采用如下技术方案:
63.本发明提供一种水稻免疫负调控蛋白osphd1的突变蛋白，所述突变蛋白为：
64.(a)由seq id no:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
65.(b)seq id no:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
66.本发明还提供编码上述突变蛋白的基因。
67.本发明还提供含有上述基因的表达载体或转化体。
68.本发明还提供上述蛋白、基因或表达载体、转化体在提高水稻抗病性中的应用。
69.进一步地，所述抗病性为抗白叶枯病。
70.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
71.以下实施例中所用引物由擎科生物科技有限公司合成；测序由擎科生物科技有限公司进行；taq dna聚合酶、限制性内切酶、连接酶、荧光定量pcr试剂盒等购自takara公司；反转录试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自promega公司，使用方法参照说明书。
72.实施例1水稻osphd1突变体(lm212-1)的获得及细胞死亡表型鉴定
73.利用ems诱变水稻粳稻品种嘉禾212种子，经过连续多代自交获得遗传稳定的osphd1突变体lm212-1。在大田环境条件下，lm212-1在苗期22天左右，其下部叶片表面和叶
鞘处开始形成密布的褐色点状斑点。随后，斑点随生长发育逐步融合成块状斑并迅速向整个植株叶片表面扩展、蔓延(图1)。
74.实施例2细胞死亡及活性氧积累表型鉴定
75.大田常规种植条件下，播种移栽60天后，分别取突变体osphd1(lm212-1)带类病斑表型的叶片及野生型嘉禾212(wt)相应位置的正常叶片，利用伊文思蓝染色和dab染色分别对所取叶片中的细胞死亡及活性氧积累情况进行检测，同时对所取叶片中的h2o2含量及cat酶活进行测定。结果显示，突变体osphd1(lm212-1)叶片中活性氧高量积累，细胞死亡程度异常增高，h2o2含量极显著高于野生型嘉禾212(wt)，cat酶活相较于野生型则极显著下降(图2)。
76.实施例3白叶枯病抗性鉴定
77.以剪叶法进行白叶枯病接种。嘉禾212(wt)和突变体osphd1(lm212-1)种子浸种催芽后播种移栽于中国水稻研究所试验田。待孕穗期用沾有黄单胞菌水稻致病变种cr4、pxo86及pxo96(xifeng chen et al.,xa7,a new executor r gene that confers durable and broad-spectrum resistance to bacteria-blight disease in rice,plant communications；yongrun cao et al.,ospg1 encodes a polygalacturonase that determines cell wall architecture and affects resistance to bacterial blight pathogen in rice,rice.菌株cr4、pxo86及pxo96由中国水稻研究所吴建利研究员惠赠)菌液的剪刀剪去全展剑叶叶尖处约3cm，每个菌株接种3个单株，每单株至少接种3个分蘖。15天后调查发病情况，以病斑长度代表感病级别。结果表明，突变体osphd1(lm212-1)对3个白叶枯菌菌株的抗性极显著高于野生型嘉禾212(wt)，病斑长度均显著低于野生型嘉禾212(wt)(图3)。
78.实施例4水稻野生型及突变体防卫相关基因表达量分析
79.嘉禾212(wt)和osphd1(lm212-1)种植于中国水稻研究所试验田，正常大田管理。播种移栽60天后挑选长势一致的3个单株分别取倒三叶的叶尖部分(约1/3叶片总长部分)，用北京天根生化科技有限公司的rnaprep pure试剂盒提取总rna，东洋纺first strand cdna synthesis kit rever tra ace反转录试剂盒合成cdna第一链，荧光定量pcr选用诺唯赞公司的chamq sybr qpcr master mix试剂盒，操作步骤均参照说明书。所用引物序列信息如下(5
′‑3′
)：oscebip-f：ttcatcaatcagcgatacctca，oscebip-r：ctggtttgtatgatgagcgatg；oscerk1-f：tgaacaacctgtatgagaacca，oscerk1-r：atgtacaattttcccagtgtgc；osrlck185-f：actgggtcgaattaggtacatg，osrlck185-r：atttgcatgatcaatcacgagg；osbsk1-f：acctggcatatacacctcca，osbsk1-r：tgtcaagtgcaagggtagga；oslysm-rlk10-f：gttagcgaatcaaaaggactgg，oslysm-rlk10-r：gatcaatcagttcgtcaagagc；ospub44-f：atgccttactgaaaccaaaacc，ospub44-r：attcatagcaaaccccgagtag；osserk2-f：ggctatggaatcatgcttcttg，osserk2-r：caatcgagcaacatcacatcat；ospr1a-f：cgtgtcggcgtgggtgt，ospr1a-r：ggcgagtagttgcaggtgatg；ospr1b-f：tacgccagccagaggagc，ospr1b-r：gccgaaccccagaagagg；ospr5-f：ggcggagttcaccatcgg，ospr5-r：gcgtgtgtcttcctgtcgttg；ospr10-f：cgggcaccatctacacca，ospr10-r：cgggcaccatctacacca；ospal1-f：ttcaacgccgacacct，ospal1-r：gtagagcggatacgacctg；oswrky45-f：
gccgacgaccagcacgatcacc，oswrky45-r：acgagccgacgccgccctc；ospo-c1-f：atagcaatgtgtacgtggagat，ospo-c1-r：attccatgcacatacagatgga；osnpr1-f：cactgcactacgccgtcgaac，osnpr1-r：tctcttcgcctcgcagcaa。
80.结果表明，8个防卫相关基因(ospr1a、ospr1b、ospr5、ospr10、ospal1、oswrky45、ospo-c1、osnpr1)在突变体中均上调表达，上调倍数在3-45倍不等。由此进一步说明该突变基因在免疫应激反应过程中起负调控作用(图4)。
81.7个病原菌相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,pamp)激活免疫相关基因(oscebip、oscerk1、osrlck185、osbsk1、oslysm-rlk10、ospub44、osserk2)相对表达量检测结果显示，oscebip、osrlck185及oslysm-rlk10在突变体中显著上调表达，其它四个基因的表达无明显差异，表明突变体中pamp激活免疫信号通路存在一定程度的被激活。
82.实施例5pamp处理后ros积累动态分析
83.材料种植方法参照实施例3中白叶枯病接种部分，播种60天后，以3mm直径打孔器对倒三叶进行打孔取样，期间注意尽量避开主叶脉。样品先于黑暗条件下ddh2o中浸泡处理6小时去除因物理伤害造成的背景。然后随机挑选3片叶片置于1.5ml离心管底部，依次加入100ul immunstar-hrp substrate(jackson immunoresearch，016-030-084)，1ul peroxidase-streptavidin(hrp)，最后分别加入chitin(几丁质，santa cruz，sc222018)或flg22(鞭毛蛋白，anaspec，as-62633)至终浓度8nm或100nm。迅速用glomax 20/20luminometer仪器每10秒钟测定一次荧光值，持续测定120个循环。结果如图5所示，突变体对chitin和flg22都反应更为敏感，ros积累速率和峰值明显高于野生型嘉禾212(wt)。
84.实施例6osphd1基因的图位克隆
85.以突变体osphd1(lm212-1)为母本，水稻籼稻品种中恢8015为父本杂交获得f1，f1套袋自交获得f2分离定位群体。f2种植于中国水稻研究所试验田，于分蘖盛期分别取10株野生型表型单株和10株突变体表型单株的叶片并利用ctab法抽提基因组dna。按表型等量混合10份dna构建野生型和突变体基因池，用142对均匀分布于水稻12条染色体且在嘉禾212(wt)和中恢8015间呈多态的ssr标记引物分别扩增双亲以及两个基因池，通过连锁分析将osphd1初步定位在1号染色体。由于该位置靠近着丝点，而后进一步将用于基因型分析的单株数扩大至1302株并开发新的indel标记，最终仅将osphd1精细定位于标记ld1和rm7075之间的420kb物理区间内。该区间共包含57个开放阅读框。所用引物：26920-f：5
′‑
cctcacatccccagggtaatc-3
′
和26920-r：5
′‑
gagtgcttggtcgactggta-3
′
分别扩增野生型以及突变体中osphd1 dna序列，通过测序后发现：突变体中osphd1基因第三外显子上发生了1个碱基(a)的插入突变，由此产生移码突变并最终造成突变体蛋白翻译的提前终止(图6)。
86.实施例7转基因互补验证osphd1基因功能
87.为验证osphd1能否恢复突变体类病斑表型，以野生型嘉禾212(wt)基因组dna为模板，com-f：5
′‑
tctafaftcfacctgcagcaggacagtccagcaacgag-3
′
，com-r：5
′‑
aagcttgcatgcctgcaggagtgtacggcgtcttgctt-3
′
为引物，通过pcr扩增成功获得包含启动子、表达框以及终止子在内的osphd1 dna全长序列。随后应用clontech公司in-fusion hd cloning试剂盒(货号:pt5162-1)通过重组将osphd1pcr产物片段连接上经ecorⅰ酶切线性化后的载体pcambia1300。将此重组产物热激转化大肠杆菌dh5a后涂布于含50mg/l卡那霉素的lb平板
上生长16小时，挑选阳性克隆小提质粒送杭州擎科生物科技有限公司测序，将测序正确的质粒命名为1300-osphd1。
88.水稻转化采用农杆菌侵染法，首先电击转化将重组质粒1300-osphd1导入农杆菌菌株eha105。以此重组农杆菌菌株侵染突变体osphd1(lm212-1)愈伤组织，经潮霉素筛选后，阳性愈伤再依次通过分化、生根获得转基因t0代植株com-osphd1(阳性转基因植株com-osphd1-1、com-osphd1-2)。将此转基因植株种植于中国水稻研究所富阳实验基地，正常水肥管理。表型鉴定结果显示，所有的阳性转基因植株在整个生育期内无类病斑产生，表型均得以恢复正常。由此表明osphd1为水稻细胞死亡的一个负调控因子，突变体类病斑表型确系由osphd1功能性缺失引起(图7)。
89.随着crispr基因组定点编辑技术的发展以及其它分子生物学技术手段的日趋成熟，该基因可有效应用于水稻抗性分子改良中，具有极大开发利用价值和意义。
90.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。