一株铜绿假单胞菌及其应用的制作方法

1.本发明属于生物环境修复领域，具体涉及一种能够利用廉价厨余油生产高稳定性生物表面活性剂的铜绿假单胞菌及其应用。


背景技术：

2.多环芳烃(pahs)是环境中普遍存在且难以去除的有机化合物，其主要来自于有机物热解和化石燃料的燃烧。pahs是有毒、诱变和致癌的有机化合物，其毒性随着其分子量的增加而增加。鉴于多环芳烃的毒性及致癌性，人们对开发了各种从污染的土壤、沉积物和水中去除多环芳烃的方法，如物理、化学和生物修复等处理方法。生物修复方法是利用微生物的新陈代谢作用来降解环境中多环芳烃，是一种环境友好型的修复方法。然而，由于多环芳烃复杂的化学结构使其在环境中的溶解度低、吸附性强，导致微生物的降解作用受到限制。表面活性剂是一种由疏水部分和亲水部分组成的两性分子，可沿气-液和液-液界面聚集形成具有疏水核心的胶束，从而有助于增加多环芳烃在水中的溶解度，进而促进提高微生物对其降解率。然而，大部分合成表面活性剂不仅会对降解菌有毒害作用，而且可能对环境造成毒性或造成二次污染，所以合成表面活性剂并非是在生物修复中最佳选择。相反，生物表面活性剂具有生物降解性、环境相容性、较低的临界胶束浓度和较高的稳定性，使得生物表面活性剂备受关注。
3.由于生物表面活性剂生产成本高、产量低等原因，限制了生物表面活性剂在环境修复领域的大量使用。同时，由于环境修复的不利因素较多，所以需要开发高稳定性的生物表面活性剂来用于环境修复。餐饮业和生活垃圾中产生的厨余油是一种常见且价格较低的生活垃圾，且处理不当容易造成的环境污染。
4.因此，需要开发一种能够利用厨余油(kwo)发酵生产具有高稳定性生物表面活性剂的菌株，不仅可以降低生产成本以满足生物表面活性剂在各种环境修复中的大量应用，而且可以缓解厨余油(kwo)带来的环境压力。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种能够利用厨余油(kwo)生产具有高稳定性的鼠李糖脂类生物表面活性剂菌
‑‑
铜绿假单胞菌ay-1，利用该菌株不仅降低环境修生物表面活性剂在环境修复中成本问题，而且有利于缓解厨余油(kwo)带来的环境压力。
6.第一方面，本发明提供一种铜绿假单胞菌ay-1在发酵生产生物表面活性剂中的应用。
7.在具体实施方案中，所述铜绿假单胞菌ay-1的发酵碳源为葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸钠、石蜡油和/或厨余油，优选地，所述碳源为厨余油。
8.在具体实施方案中，所述铜绿假单胞菌ay-1的发酵氮源为硝酸铵、硝酸钠、尿素和/或蛋白胨，优选地，所述氮源为硝酸钠。
9.在具体实施方案中，所述铜绿假单胞菌ay-1的发酵碳氮比为10:1-35:1，优选地，
所述碳氮比为25:1。
10.在具体实施方案中，所述铜绿假单胞菌ay-1的发酵温度为25-45℃，优选地，最适发酵温度为35℃。
11.在具体实施方案中，所述铜绿假单胞菌ay-1的发酵ph为5.0-9.0，优选地，最适发酵ph为8.0；发酵时间为12-120h，优选地，最适发酵时间为96h。
12.第二方面，本发明提供一种铜绿假单胞菌ay-1发酵生产的生物表面活性剂。
13.在具体实施方案中，所述生物表面活性剂在4℃-120℃条件下，表面张力在27.91-30.73mn/m之间，具有温度稳定性。
14.在具体实施方案中，所述生物表面活性剂在ph＝2-12条件下，表面张力在29.55-34.16mn/m之间，具有耐酸碱性。
15.在具体实施方案中，所述生物表面活性剂在nacl浓度2-20％条件下，表面张力26.83-30.41之间，具有耐盐性。
16.第三方面，本发明提供一种第一方面所述铜绿假单胞菌ay-1发酵生产的生物表面活性剂在增溶多环芳烃的应用。
17.进一步地，所述生物表面活性剂浓度＝cmc(胶临界束浓度)，能增加水相中菲和芘溶解度2.092倍和4.754倍，其质量摩尔增溶比分别为wsr
菲
为0.00961，而wsr
芘
为0.00297。
18.有益效果
19.1、本发明筛选得到一株能够高效利用厨余油并发酵生产具有高稳定性的生物表面活性剂的菌株铜绿假单胞菌ay-1，不仅可以缓解厨余油带来的环境压力，同时可以降低生物表面活性剂环境修复中的生产成本。
20.2、本发明经过一系列实验验证，验证该铜绿假单胞菌ay-1的最适发酵碳源为厨余油，最适氮源为硝酸钠，最适碳氮比(w
碳源
:w
氮源
)为25:2，最适温度为35℃，最适ph为8.0，最适发酵时间为96h，在最适条件下，生物表面活性剂的产量高达5.86g/l。
21.3、利用本发明的铜绿假单胞菌ay-1发酵产生的生物表面活性剂在不同温度(4-120℃)、ph(2-12)和nacl(2-20％)浓度等环境因素下均具有较高稳定性，即具有较强的耐高温、耐酸碱、耐盐性能，同时在1cmc条件下增溶菲和芘为2.092倍和4.754倍，因此具有广泛的应用潜能。
22.说明书附图
23.图1、菌株在种子培养基中生长曲线测定
24.图2、不同碳源对菌株ay-1产表面活性剂的影响
25.图3、不同氮源对菌株ay-1产表面活性剂的影响
26.图4、不同碳氮比对表面活性剂产量的影响
27.图5、温度对菌株ay-1产表面活性剂的影响
28.图6、ph对菌株ay-1产表面活性剂的影响
29.图7、发酵时间对菌株ay-1产表面活性剂的影响
30.图8、生物表面活性剂电荷及组成成分分析
31.图9、生物表面活性剂ft-ir及tlc分析
32.图10、生物表面活性剂胶临界素浓度(cmc)测定
33.图11、生物表面活性剂稳定性分析
34.图12、菲和芘在二氯甲烷中标准曲线
35.图13、生物表面活性剂对菲和芘增溶效果
实施例
36.下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述实施例。
37.实施例1、生物表面活性剂菌的鉴定
38.将实验室前期筛选并鉴定的铜绿假单胞菌ay-1(食品工业科技，《毒死婢降解菌株的分离鉴定及降解条件优化》，2021年，第10期，75-82页)从-80℃中活化，然后将活化的菌液以5％的接种量接种于原油培养基中，在35℃、180rpm
·
min-1
的条件下振荡培养4d，发现原油具有乳化效果。
39.随后将铜绿假单胞菌ay-1菌株接种于lb液体培养基过夜培养，然后离心收集菌体并用无机盐培养基调节od
600
＝1，以5％接种量接种于葡萄糖发酵培养基中，在35℃，180rpm条件下进行发酵培养84h。待到发酵结束后，将培养基ph调为8.0，然后在4℃、9000rpm条件下离心15min去除菌体获得上清液。将发酵上清液进行石蜡油乳化指数和表面张力测定，实验结果如表1所示。
40.表1摇瓶发酵铜绿假单胞菌ay-1实验结果
[0041][0042]
从表1中可以看出，铜绿假单胞菌ay-1菌株发酵上清液对石蜡油的乳化指数和表面张力降低值表现出非常好的性能，分别为60％和42.44mn/m。
[0043]
实施例2、铜绿假单胞菌ay-1在种子培养基中生长曲线测定
[0044]
将菌株接种到种子培养基中，在35℃、转速为180rpm/min的恒温振荡培养箱中培养。将培养液稀释成适当倍数，每隔2h测定od
600
吸光度值，绘制其生长曲线。铜绿假单胞菌ay-1在种子培养基中生长曲线如图1所示。
[0045]
由图1所示，铜绿假单胞菌ay-1在0-2h生长较为缓慢，处于迟缓期；2h后，菌株生长较快，进入对数生长期；在22h和44h后，菌株分别进入稳定期和衰亡期。由于处于对数生长期中后期的菌株，生长活力高，且菌体浓度大，因此后期以18h的菌株进行后续研究。
[0046]
实施例3、铜绿假单胞菌ay-1发酵条件的优化
[0047]
(1)生物表面活性剂的分离提取
[0048]
将铜绿假单胞菌ay-1首先挑取于种子培养基中在35℃，180rpm条件下进行培养18h，然后以5％的接种量接种于葡萄糖发酵培养基中进行84h发酵。
[0049]
待到发酵结束后，为了增加表面活性剂在溶液中的溶解度，将发酵培养基通过6mol/l的naoh调节ph调节到8.0，在9000r/min下离心15min除去菌体。然后将去除菌体的发酵上清液在60℃的水浴条件下进行30min，目的是去除培养基中的酶等物质。然后再次离心获得上清液。将发酵上清液用6mol/l盐酸调节至ph＝2.0，4℃冷藏24h。在9000r/min离心10min获得表面活性剂沉淀，然后再用ph＝2.0的稀盐酸吹打悬浮表面活性剂沉淀，在转速为9000r/min，温度为4℃的冷冻离心机中离心15min，收集沉淀，最后通过0.05mol/l的
nahco3溶液进行溶解表面活性剂沉淀，抽滤去除不溶物质，获得表面活性剂粗品溶液。
[0050]
最后将获得的表面活性剂粗品溶液调节ph至2，然后加入等体积的乙酸乙酯或v
氯仿
：v
甲醇
＝2:1进行萃取三次，合并有机相。将有机相在40℃条件下进行烘干，并使用差重法得到表面活性剂纯品的质量，实验结果如表2所示。从表2中，可以得知，采用酸沉-乙酸乙酯萃取法更优于酸沉-v
氯仿
/v
甲醇
＝2:1，因此，采用酸沉-乙酸乙酯法提取表面活性剂。
[0051]
表2生物表面活性剂萃取结果
[0052][0053]
(2)不同种类碳源对表面活性剂产量的影响
[0054]
在基础无机盐培养基中，分别以20g/l(w/v)的葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸钠、液体石蜡油和废弃大豆油为碳源，以5％的接种量在35℃，180rpm/min进行发酵84h。待到发酵结束后，采用上述酸沉-乙酸乙酯萃取法获得表面活性剂，并测定其质量，实验结果如图2所示。
[0055]
图2结果表明，硝酸铵为氮源，以葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸钠、液体石蜡油和厨余油为碳源进行发酵产生表面活性剂的产量为0.13-2.07g/l。其中，当以厨余油为底物时，产生的生物表面活性剂量最高，为2.07g/l，其次为葡萄糖1.75g/l。有研究表明，与水溶性底物相比，铜绿假单胞菌以油类物质作为底物更有利于生物表面活性剂合成，其是由于油类物质富含合成生物表面活性剂的前体物质，如不饱和脂肪酸。然而，以石蜡油为底物时，生物表面活性剂产量却为0.13g/l，其原因可能是由于该底物不含有生物表面活性剂合成的前体物质。因此，利用厨余油发酵生产生物表面活性剂具有很大的应用潜能。综上所述，厨余油是铜绿假单胞菌ay-1产生物表面活性剂最适碳源。
[0056]
(3)不同种类氮源对表面活性剂产量的影响
[0057]
以上述最适碳源为基础，以2g/l(w/v)的硝酸铵、硝酸钠、尿素和蛋白胨等物质作为氮源，在上述相同条件下进行发酵，测定在不同氮源条件下表面活性剂质量，实验结果如图3所示。
[0058]
从图3中可以得知，当厨余油为碳源，以各种廉价含氮底物为氮源进行发酵时，生物表面活性剂产量在1.06-2.57g/l。当硝酸钠为氮源时，其生物表面活性剂量最高，为2.57g/l，其次硝酸铵为2.08g/l。
[0059]
(4)碳氮比对表面活性剂产量的影响
[0060]
以上述2g/l的最适氮源为基础，调整碳源含量形成10:1、15:1、20:1、25:1、30:1和35:1(w
碳源
:w
氮源
)的碳氮比，在上述相同条件下进行发酵，测定表面活性剂质量，实验结果如图4所示。
[0061]
从图4可以得知，当碳氮比在10:1-35:1(w
碳源
:w
氮源
)，铜绿假单胞菌ay-1产生物表面活性剂的产量随着碳氮比的增加而先增加后减少，其产量在2.57-5.01g/l。当培养基中的碳氮比为25:1时，生物表面活性剂产量最高为5.01g/l；其次是当碳氮比为20:1时，生物表面活性剂产量为4.34g/l。然而碳氮比大于25:1时，生物表面活性剂的量逐渐减少，其原因是由于厨余油过多导致培养基渗透压增强和含氧量不足导致微生物生长和相关代谢物的合成受到限制。因此，当培养基的碳氮比为25:1时，最适合铜绿假单胞菌ay-1产生生物表面活性剂。
[0062]
(5)发酵温度对生物表面活性剂产量的影响
[0063]
以上述最适条件为基础，分别在25℃、30℃、35℃、40℃和45℃条件下进行摇瓶发酵，测定表面活性剂质量，实验结果如图5所示。
[0064]
从图5可以得知，当发酵温度从25-45℃进行变化时，表面活性剂的产量从3.03上升至5.01g/l，然后又从5.01降至1.01g/l。当发酵温度为35℃时，pseudomonas aeruginosa ay-1表面活性剂产量最高，最高为5.01g/l。
[0065]
(6)发酵ph对生物表面活性剂产量的影响
[0066]
以上述最适条件为基础，分别在ph＝5、6、7、8和9条件下进行发酵，以上述相同的方法测定表面活性剂质量，实验结果如图6所示。
[0067]
从图6可以得知，当发酵初始ph从5-9进行变化时，生物表面活性剂的产量从0.09上升至5.41g/l，然后又从5.41降至4.18g/l。当发酵培养基初始ph为8时，生物表面活性剂的产量为5.41g/l。因此，初始ph为8是铜绿假单胞菌ay-1产表面活性剂的最适ph。
[0068]
(7)发酵时间对生物表面活性剂产量的影响
[0069]
以上述条件为基础，按照相同的方法，每隔12h测定表面活性剂的质量，实验结果如图7所示。
[0070]
从图7可以得知，生物表面活性剂的产量随着发酵时间的增加而先增加后减少。从12-96h，生物表面活性剂的质量一直随着发酵时间的延长而增加，在发酵时间为96h时，生物表面活性剂的产量达到5.86g/l。当发酵时间超过96h时，生物表面活性剂的产量逐渐减少到5.23g/l。因此，铜绿假单胞菌ay-1产表面活性剂的最适发酵时间为96h。
[0071]
实施例4、生物表面活性剂理化性质的表征
[0072]
(1)生物表面活性剂电荷及组成成分分析
[0073]
将表面活性剂配成400mg/的溶液，以亚甲基蓝显色法和酸性溴酚蓝法对表面活性剂的电荷性质。同时，别采用硫酸-蒽酮显色法和茚三酮显色法对铜绿假单胞菌ay-1合成的表面活性产物的结构组成成分进行初步分析。
[0074]
实验结果如图8中a和b所示，生物表面活性剂与亚甲基蓝生物蓝色络合物溶于氯仿层，然而确与酸性溴酚蓝溶液不发生任何颜色反应，证明该表面活性剂为阴离子表面活性剂。同理，图8中c和d实验结果可知，生物表面活性剂与硫酸-蒽酮溶液发生颜色反应，但与茚三酮不发生任何颜色反应，证明该表面活性剂亲水端是糖基。
[0075]
(2)生物表面活性剂ft-ir及tlc分析
[0076]
为确定该菌株产生的生物表面活性剂所含有的化学结构和官能团，使用ft-ir对其进行表征。将5mg纯化后生物表面活性剂与100mg溴化钾混合研磨，压制半透明薄片，然后4000-1
cm-400cm-1
波数范围内进行红外光谱扫描分析。同时，为进一步确定该菌株产生的生物表面活性剂种类，将该产物酸水解并用tlc进行分析。tlc分析的展开剂为正丁醇：吡啶：水＝6:4:3(v/v/v),显色剂为硫酸-苯酚试剂。实验结果如图9所示。
[0077]
从图9a可以得知，在3200cm-1-3420cm-1
处较宽的吸收峰和3281cm-1
处的吸收峰对应的是-oh的伸缩振动，表明了其分子结构中含有大量的-oh存在。2920cm-1
和2851cm-1
处的吸收峰为-ch2和-ch3的伸缩振动，且1365cm-1
处出现的吸收峰表明为烷基变角运动，表明其分子结构中含有脂肪酸链。在1725cm-1
出现强吸收，表明分析中含有羰基的存在，且位于1568cm-1
处的峰与羧基的-coo-键伸缩振动相关联。在1046cm-1
处的吸收峰归属于c-o-c基
团的伸缩振动，表面该说明分子中存在糖苷键和环状内酯结构。且该表面活性剂特征吸收峰与糖脂类表面活性剂基本一致，所以该表面活性剂为糖脂类表面活性剂。许多研究表明，铜绿假单胞菌产生的生物表面活性剂主要为鼠李糖脂，为进一步确定该表面活性剂组成，进行tlc分析。
[0078]
从图9b可得知，该生物表面活性剂的水解物与硫酸-苯酚显色剂生成一个棕黄色斑点，其rf值与鼠李糖标准品rf相同，这表明该生物表面活性剂亲水基团为鼠李糖。综上所述，该菌株产生的生物表面活性剂为鼠李糖脂。
[0079]
(3)生物表面活性剂胶临界束浓度(cmc)测定
[0080]
将生物表面活性剂配制成700mg/l的溶液，依次稀释成不同浓度，通过表面张力仪测定其表面张力值，实验结果如图10所示。
[0081]
从图10中可以得知，当生物表面活性剂浓度较低时，水溶液的表面张力降低较快。当其浓度达到一定值时，水溶液的表面张力下降速率减慢，逐渐趋于平缓。同时，从图中可以看出该表面活性剂的cmc为200mg/l，其要比一般化学表面活性剂(sds，2.01g/l)低很多。
[0082]
(4)生物表面活性剂稳定性分析
[0083]
将生物表面活性剂配制成400mg/l的溶液，在不同温度(4℃-120℃)、不同ph(2-12)和不同nacl浓度(0-20％,w/v)等条件下处理，测定溶液的表面张力值，实验结果如图11所示。
[0084]
从图11中可以得知，铜绿假单胞菌ay-1产生的生物表面活性剂对温度、ph和盐浓度均具有较高的稳定性。从图11a可以得知，当生物表面活性剂溶液经4℃-120℃处理，溶液表面张力值随温度的增加而降低，并在27.91-30.73mn/m间较窄范围内变化。溶液表面张力值的变化可能是由于温度的升高导致液-空界面生物表面活性剂分子数量增加，进而导致溶液表面张力值降低。从图11b和11c可以得知，溶液经不同ph和nacl浓度处理，生物表面活性剂的表面张力值分别在29.55-34.16mn/m和26.83-30.41mn/m变化。当ph＝8和nacl浓度为12％时，溶液的表面张力值最低，分别为29.55mn/m和26.83mn/m。生物表面活性剂溶液在不同ph和氯化钠浓度下，溶液表面张力值变化可能是由于溶液中电解质影响生物表面活性剂分子间静电作用力，进而导致表面张力值降低。然而当溶液ph＜3时，溶液表面张力值较大幅度的增加，其可能是由于生物表面活性剂发生沉淀，导致溶液表面张力值突然增加。以上结果表明，铜绿假单胞菌ay-1产生的生物表面活性剂在不同温度、ph和nacl浓度等环境因素下均具有较高稳定性，也具有广泛的应用潜能。
[0085]
实施例5、生物表面活性剂对多环芳烃增溶效果的研究
[0086]
为了研究生物表面活性剂对多环芳烃增溶作用，以多环芳烃中的菲和芘为研究对象对进行研究。
[0087]
(1)菲和芘标准曲线制作
[0088]
配制1000mg/l菲和芘的二氯甲烷标准储备溶液，分别将其稀释到0mg/l、0.4mg/l、0.8mg/l、1.2mg/l、1.6mg/l、2mg/l、2.4mg/l和和0mg/l、0.3mg/l、0.6mg/l，0.9mg/l、1.2mg/l、1.5mg/l和1.8mg/l。通过利用紫外分光光法分别在λ＝251nm和λ＝248nm条件下测定吸光度值，并绘制成标准曲线实验结果如图12所示。
[0089]
(2)生物表面活性剂对菲和芘增溶效果
[0090]
在50ml带盖玻璃离心管中加入过量的菲和芘，加入20ml不同浓度(0-600mg/l)的
生物表面活性剂的溶液，在25℃、180rpm/min恒温摇振荡48h。离心去除不溶性物质，用二氯甲烷分三次萃取水相中的菲和芘，并通过标准曲线测定其浓度，实验如图13所示。
[0091]
同时，为了比较铜绿假单胞菌ay-1产生的生物表面活性剂对菲和芘增溶能力的大小，用质量增溶比率(wsr)来计算，公式如下。
[0092]
质量增溶比率(wsr)＝(s*
pah,mc
–
s*
pah,cmc
)/(c
surf
–
cmc)，式中，s*
pah,mc
表示pseudomonas aeruginosa ay-1产生的生物表面活性剂浓度为csurf(c
surf
＞cmc)时菲和芘的溶解度，mg/l；s*
pah,cmc
表示铜绿假单胞菌ay-1产生的生物表面活性剂浓度为cmc时菲和芘的溶解度，mg/l。
[0093]
从图13中可以得知，铜绿假单胞菌ay-1产生的生物表面活性对菲和芘具有很高的增溶作用。当表面活性剂的浓度在0mg/l时，菲和芘在水相中的溶解度很小，分别为1.100mg/l和0.130mg/l。同时，当该表面活性剂溶液浓度小于胶临界束浓度时，由于溶液未能形成疏水的胶临界束，所以对菲芘的增溶效果不明显。然而，当溶液中生物表面活性剂的浓度等于胶临界束浓度时，生物表面活性剂对菲和芘有着明显的增溶作用，其在水相中溶解度分别为2.302mg/l和0.618mg/l，增加了2.092倍和4.754倍。同时，当溶液中生物表面活性剂浓度在200-600mg/l时，菲和芘在水相中的溶解度随着生物表面活性剂浓度的增加而直线增加。当溶液中的生物表面活性剂浓度为600mg/l时，菲和芘的在水相中溶解度分别为6.061mg/l和1.806mg/，增加了5.510倍和13.892倍。
[0094]
然而，该生物表面活性剂对两种多环芳烃的增溶效果确不一样，其wsr
菲
为0.00961，而wsr
芘
为0.00297。该生物表面活性剂对菲的增溶效果大于对芘的增溶效果。
[0095]
综上，铜绿假单胞菌ay-1产生的生物表面活性对菲和芘具有很高的增溶作用，且对菲的增溶能力大于芘。