从土壤中分离的芽孢杆菌及其应用

1.本发明涉及从土壤中分离的芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.中国的矿产资源丰富，尽管矿产资源对社会经济发展具有重要的促进作用，但在这些资源的开发过程中，将会释放重金属和其它有害物质，从而破坏生态环境。土壤和水体中重金属含量过高会降低土壤的生产力和质量，一方面影响植物的生长，另一方面影响微生物群落多样性、代谢潜力和相关生态系统的功能循环。重金属在环境中长期存在，这些重金属会通过食物链富集到人体当中最终威胁人类身体健康。例如钒的急性吸入可能引发支气管肺炎，慢性吸入会对神经系统和呼吸系统造成伤害，严重将会导致中毒型肾病和蛋白代谢异常。铬的暴露会导致肾脏的疾病和抑制相关基因的表达可能会诱发癌症。
3.钒是一种过渡金属元素，原子序数为23，广泛的存在于地壳中。因为具有高熔点、质地坚硬、韧性好等优良特性，被广泛用于工业生产中，例如冶金、原子能工业、化学和纺织等领域。随着科学技术的发展，对钒制品的需求不断增加，含钒燃料的燃烧和含钒矿物的提取和冶炼产生大量的钒，这些钒通过大气和溶液的形式迁移到环境中。钒在自然水域中以 3、 4和 5的氧化状态存在。钒酸盐物种五价钒在氧化条件下热力学上是稳定的，而四价钒在亚氧条件下是稳定的，三价钒在缺氧环境中发现。钒的毒性随价态的增加而增加，五价钒毒性最高。
4.作为土壤中常见的污染物，铬有几种氧化状态，从-2到 6。其中，元素铬cr(0)在生物材料中是惰性的，在土壤中不自然存在。铬污染主要来自于人为活动，除了矿物开采和冶炼之外，制革厂、造纸厂等工业废水的排放也造成了严重的铬污染。自然界中，铬通常以三价铬cr(iii)和六价铬cr(vi)两种形态存在，且在特定条件可以相互转化。三价铬相对稳定，是生物体内必需的微量元素之一，在水中容易形成沉淀，实现固液分离达到去除目的；而六价铬毒性大、迁移能力强、氧化性强，是公认的致癌物之一，毒性是三价铬的约100倍。因此，把毒性强的cr(vi)还原为cr(iii)，是减少环境中铬污染的主要途径。
5.由于钒和铬都属于变价元素，并且位于元素周期表的同一主族。高价态的金属毒性远大于低价态的金属，因此治理钒和铬污染的地下水通常采用还原的方法来降低二者对环境的危害。但是目前采用的物理和化学修复技术成本高，并且会对环境造成二次污染。大多数化学材料在实验室操作条件下具有良好的还原效果，但是实际环境中条件复杂，能否在实际环境中达到理想的修复效果还需要跟进一步的研究。
6.生物修复技术主要分为微生物和植物修复，由于它的操作简单，并且对环境友好，在环境治理领域受到广泛的关注。微生物和植物通过自生功能代谢吸收或者将高价态的金属还原，从而实现对土壤和水体中重金属的修复。某些特定的微生物能够通过细胞表面吸附，还原和胞内生物积累，降低环境中重金属的含量。细胞表面存在的胞外多糖具有特定的官能团，如氨基、羧基和羟基等，这些官能团通过静电作用力能够吸收金属阳离子或者氧阴离子；在外界电子供体的作用下，微生物通过自身的酶传导电子，重金属作为最终电子受
体，被还原为低价态的金属阳离子；微生物通过主动运输吸收重金属离子，这些离子与细胞中的脂质结合从而滞留在细胞中。通过上述三个过程，微生物能够有效实现环境中重金属的修复。此外，这些微生物都来自于污染区域，通过原位筛选出的微生物能够更好的适应当地的环境，并且这些微生物的添加能够协调原位微生物群落结构，能更好的实现重金属的原位修复。
7.申请号为201910681909.0的中国发明专利公开了一株白色杆菌及其在还原六价铬中的应用，该菌株对六价铬的耐受能力达30g/l，且菌株lyc-2的培养和还原六价铬的过程均可以在好氧、常压、较宽的温度范围(25-35℃)及较宽的ph范围(ph7-11)条件下进行，能有效地将高毒性的六价铬还原为低毒性的三价铬。
8.申请号为201610723745.x的中国发明专利公开了对钒具有耐受性的芽孢杆菌及其用途，该细菌除了能够高耐钒，而且对cd、cr、pb、ni、co和zn等重金属均具有耐受性，对钒的耐受性高达2000mg/l。同时该菌株具备在基本培养基中将五价钒还原成四价钒的能力，转化率为46.7％，能达到降低溶液中高价钒毒性的特性，尤其可开发运用于含其它重金属污染物的高钒毒性液体环境中钒毒性的去除的菌剂，在对重金属污染环境的生物修复中具有很好的应用前景。
9.可见，目前，针对两种变价元素钒和铬的生物还原方面的研究还没有很好的实用方案。现有公开的菌，很少能够同时还原钒和铬，且对钒的还原率不高，需要进一步的提升。


技术实现要素：

10.针对以上缺陷，本发明解决的第一个技术问题是提供一种能同时还原钒和铬的细菌，即芽孢杆菌bacillus pacificus sm02。
11.本发明从土壤中分离的芽孢杆菌bacillus pacificus sm02，于2021年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：m 20211039。
12.在本发明的一个实施方式中，所述芽孢杆菌bacillus pacificus sm02的16s rdna的核苷酸序列为seq id no.1所示。
13.本发明解决的第二个技术问题是提供一种钒铬毒性去除剂。
14.本发明钒铬毒性去除剂，其活性成分包含本发明所述的芽孢杆菌bacillus pacificus sm02。
15.本发明还提供本发明所述芽孢杆菌bacillus pacificus sm02在还原五价钒或/和六价铬中的应用。
16.本发明芽孢杆菌bacillus pacificus sm02，能将五价钒还原为四价钒，将六价铬还原为三价铬，具有很好的还原五价钒和六价铬的功能，其中，五价钒的还原率可达98.43
±
0.42％，六价铬的还原率可达100％，还原率高。
17.本发明还提供一种同时还原钒铬的方法。
18.本发明同时还原钒铬的方法，包括以下步骤：在含五价钒和六价铬的土壤或水体中，将加入本发明所述的芽孢杆菌bacillus pacificus sm02。
19.在本发明的一个实施方式中，还添加柠檬酸作为电子供体。
20.在本发明的一个实施方式中，加入生长至对数期的bacillus pacificus sm02，该bacillus pacificus sm02的接种量为1％。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
22.1、本发明芽孢杆菌bacullus sp sm02从土壤中分离得到，对环境中的钒和铬具有较高的耐受性，对钒和铬的耐受浓度高达1200mg
·
l-1
和1000mg
·
l-1
，能够适应高背景污染区域的生存条件。并且这是首次报道bacillus pacificus sm02能够同时将五价钒还原为四价钒和六价铬还原为三价铬，为钒和铬污染提供生物修复技术。
23.2、本发明只需要简单采用lb液体培养基将bacillus pacificus sm02培养16-20h生长至对数期，洗涤之后，添加柠檬酸作为营养物质和电子供体供细菌还原五价钒和六价铬，该操作流程简单。
24.3、本发明所述的钒铬毒性去除剂能够完全将六价铬还原，对五价钒实现98.43
±
0.42％的还原率，还原率远高于之前报道中细菌对五价钒和六价铬的还原率，具有便捷和高效的优势。
具体实施方式
25.本发明采集攀枝花钒钛磁铁矿冶炼厂附近重度钒和铬污染地区土壤，通过分离、纯化得到一株细菌，经形态学以及16s rdna鉴定，该细菌与芽孢杆菌bacillus pacificus具有98％同源度，命名为bacillus pacificus sm02。该细菌已于2021年8月16日向中国典型培养物保藏中心提交生物保藏，保藏号为cctcc no：m 20211039。中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。
26.研究发现，该细菌对环境中的钒和铬具有较高的耐受性，对钒和铬的耐受浓度高达1200mg
·
l-1
和1000mg
·
l-1
，能够适应高背景污染区域的生存条件。且该细菌能够将五价钒还原为四价钒，将六价铬还原为三价铬，还原率高，为钒和铬污染提供生物修复技术。
27.该细菌的适合的培养条件为：胰蛋白胨10g/l，酵母5g/l，氯化钠10g/l，ph 7.2。
28.在本发明的一个实施方式中，所述芽孢杆菌bacillus pacificus sm02的16s rdna的核苷酸序列为seq id no.1所示。提取该细菌的16s rdna后进行pcr扩增测序，发现该细菌的16s rdna的核苷酸序列为seq id no.1所示，该细菌与芽孢杆菌bacillus pacificus具有98％同源度，因此，将该菌株命名为bacillus pacificus sm02。
29.本发明解决的第二个技术问题是提供一种钒铬毒性去除剂。
30.本发明钒铬毒性去除剂，其活性成分包含本发明所述的从土壤中分离的芽孢杆菌bacillus pacificus sm02。
31.本发明还提供本发明所述从土壤中分离的芽孢杆菌bacillus pacificus sm02在还原五价钒或/和六价铬中的应用。
32.本发明从土壤中分离的芽孢杆菌bacillus pacificus sm02，能将五价钒还原为四价钒，将六价铬还原为三价铬，具有很好的还原五价钒和六价铬的功能，其中，五价钒的还原率可达98.43
±
0.42％，六价铬的还原率可达100％，还原率高。
33.本发明还提供一种同时还原钒铬的方法。
34.本发明同时还原钒铬的方法，包括以下步骤：在含五价钒和六价铬的土壤或水体中，将加入本发明所述的从土壤中分离的芽孢杆菌bacillus pacificus sm02。
35.在本发明的一个实施方式中，还添加柠檬酸作为电子供体。
36.在本发明的一个实施方式中，加入生长至对数期的bacillus pacificus sm02，该
bacillus pacificus sm02的接种量为1％。
37.下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
38.实施例1 bacillus pacificus sm02的分离纯化及鉴定
39.选取攀枝花钒钛磁铁矿冶炼厂附近重度钒和铬污染地区，根据测试结果当地土壤中的钒和铬的含量最高可达4156.47mg
·
kg-1
和1377.15mg
·
kg-1
。
40.1、细菌的分离和纯化
41.(1)选取污染区域土壤1g，加入到含有99ml灭菌去离子水的锥形瓶中，38℃150rpm震荡两小时后，取1ml上清液加入到9ml无菌水中，混匀，重复上述步骤，分别获得浓度为原液的10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
，取10-3
，10-4
，10-5
倍原液浓度涂布到lb固体培养基中，30℃恒温培养24h。
42.(2)分别挑选步骤(1)固体培养基中的单株细菌，再次接种到含有钒和铬的浓度100mg
·
l-1
固体培养基中，30℃恒温培养24h。
43.(3)将步骤(2)中长势良好的细菌接种到钒和铬的浓度分别为300mg
·
l-1
和100mg
·
l-1
的固体培养基中，30℃恒温培养24h。
44.(4)将步骤(3)中长势良好的细菌接种到钒和铬的浓度分别为500mg
·
l-1
和300mg
·
l-1
的固体培养基中，30℃恒温培养24h。
45.(5)将步骤(4)中长势良好的细菌接种到钒和铬的浓度分别为700mg
·
l-1
和500mg
·
l-1
的固体培养基中，30℃恒温培养24h。
46.(6)将步骤(5)中长势良好的细菌接种到钒和铬的浓度分别为900mg
·
l-1
和700mg
·
l-1
的固体培养基中，30℃恒温培养24h。
47.(7)随着接种浓度逐渐增加，最终获得一株耐受的细菌，命名为sm02。将这株细菌在无重金属的平板上划线纯化，挑取单菌落接种到lb液体培养基中，30℃150rpm培养20h。
48.上述lb固体培养基配方为：在1l水中加入胰蛋白胨10g，酵母5g，氯化钠10g，琼脂15g，调节ph为7.2。
49.lb液体培养基配方：在1l水中加入胰蛋白胨10g，酵母5g，氯化钠10g，调节ph为7.2。
50.2、细菌鉴定
51.sm02菌落形态呈圆形，乳白色，表面光滑湿润，呈粘稠状。将细菌进行革兰氏染色，为紫色，并且呈短小杆状外形，为革兰氏阳性细菌。
52.提取细菌16s rdna后进行pcr扩增测序，通用引物为27f(seq id no.2，agtttgatcmtggctcag)和1492r(seq id no.3，ggttaccttgttacgactt)，扩增长度为1500bp左右。pcr反应程序为：
①
94℃预变性5min；
②
94℃变性30s；
③
54℃退火30s；
④
72℃延伸1min 30s；重复步骤
②
、
③
、
④
39次，
⑤
72℃延伸10min；4℃保存。将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(2ul样品 6ul溴酚蓝)，300v电压下12min。将pcr产物送至北京擎科生物科技有限公司测序，用contigexpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分，将拼接好的序列在ncbi数据库(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对，采用mega软件进行系统发育构建。
53.sm02与芽孢杆菌bacillus pacificus具有98％同源度，将该细菌命名为bacillus pacificus sm02。
54.实施例2耐受浓度测试
55.将bacillus pacificus sm02采用连续划线的方法接种到含有钒的浓度为1000mg
·
l-1
，1100mg
·
l-1
，1200mg
·
l-1
，1300mg
·
l-1
，铬的浓度为900mg
·
l-1
，1000mg
·
l-1
，1100mg
·
l-1
，1200mg
·
l-1
的固体培养基中，30℃恒温培养24h。最终在钒和铬浓度为1200mg
·
l-1
和1000mg
·
l-1
时细菌生长情况逐渐减弱。表明这株细菌对钒和铬的耐受浓度分别达到1200mg
·
l-1
和1000mg
·
l-1
。
56.实施例3还原效果测试
57.将bacillus pacificus sm02接种到lb液体培养基中扩大培养20h，30℃150rpm，之后用无菌水洗涤两次细菌，调节od
600
为1。按照1％的接种量加入到含有有50mg
·
l-1
的v(
ⅴ
)和50mg
·
l-1
的cr(ⅵ)溶液中，并且添加柠檬酸作为电子供体，柠檬酸投加量为6mm，38℃150rpm恒温培养24h，4000rpm离心，取上清液过滤后采用紫外分光光度法分别测量溶液中五价钒和六价铬浓度，icp-oes测定全钒和全铬含量。同时设置灭活细菌组对照测定细菌是否具有吸附作用。其结果如表1所示：
58.表1
[0059][0060]
其中，
“‑”
表示无数据，因为浓度太高用分光光度法测出来的浓度不准，稀释后测的数据差异也很大。
[0061]
结果表明，bacillus pacificus sm02能够完全还原六价铬，五价钒的还原率为98.43
±
0.42％。其中，本发明还原率的计算方法为：re＝(c
(0)-c)/c
(0)
[0062]
c为反应后溶液中五价钒和六价铬的浓度；c
(0)
为溶液中初始五价钒和六价铬浓度。
[0063]
可见，本发明从土壤中分离的芽孢杆菌bacillus pacificus sm02，能够适应高浓度的钒和铬，且能够很好的还原六价铬和五价钒，还原率高。