一组胃癌前病变及胃癌早期诊断血浆RNA标志物组合及应用

一组胃癌前病变及胃癌早期诊断血浆rna标志物组合及应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一组胃癌前病变及胃癌早期诊断血浆rna标志物组合及应用。


背景技术：

2.胃癌(gastriccancer，gc)是全球第五大常见的恶性肿瘤，位于全球癌症相关死亡原因的第四位。根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症数据统计报告显示，2020年全球gc新发病例109万例、死亡病例77万例。由于世界人口的增长，相较于2018年全球gc的新发病例103万例、死亡病例78.3万例，gc的绝对数量保持稳定，但gc发病率总体表现下降。我国2020年gc新发病例48万例、死亡病例37万例，发病率和死亡率在恶性肿瘤中均高居第二位。近年来在群众卫生意识增强和社会医疗条件提高等多方面因素的共同作用下，gc发病率总体表现下降，但gc死亡率仍然居高不下，其中早期胃癌(earlygastriccancer，egc)较低的诊断率则是导致gc死亡率居高不下的一个重要因素。由于患者对肿瘤早筛的意识不强，在癌前和癌症初期的病症表现并不明显，以及肿瘤早筛检测的技术手段不够完善等因素，致使大多数患者在首次确诊时已发展到胃癌进展期阶段，进展期胃癌(advanced gastric cancer，agc)患者的治疗往往无效并且预后效果不佳。调查显示egc患者术后五年存活率为90％以上，而agc患者术后五年存活率只有30％左右。因此，egc的及时发现与治疗必须得到重视。
3.目前，由于缺乏合适的筛查手段，大规模的肿瘤早期筛查仍是不可行的。虽然胃镜结合组织活检(tissuebiopsy)是肿瘤检测和诊断的“金标准”，但胃镜检查受制于设备水平和医师手法，其检测结果并不稳定。此外胃镜对受测者伤害较大、且价格昂贵，难以应用到大规模的肿瘤早筛中，同时，出于各方面原因，癌前病变阶段的患者包括萎缩性胃炎、低级别异型增生或高级别异型增生的患者很难接受并应用这些检测方法。同时，由于组织标本无法区分肿瘤的异质性，常常会导致胃镜结果与病理诊断出现不相符的现象。胃癌的非侵入性检测方法有很多，包括癌胚抗原(cea)、糖蛋白抗原19-9(ca19-9)、ca72-4和胃蛋白酶原(pg)等，但这些常规的血清肿瘤生物标志物的特异性和敏感性不足，无法有效地应用于egc的诊断。因此，迫切需要一种新型、微创、高灵敏度和特异性的生物标志物来提高egc的诊断效率。通过液体活检(liquidbiopsy)可以对血液及其他体液中的循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,ctcs)、循环肿瘤dna(circulating tumor dna,ctdna)、循环游离rna(circulatingcell-free rna,cfrna)和细胞外囊泡(extracellularvesicles,evs)进行非侵入性检测。1977年首次报道癌症患者血清中的游离核酸水平升高。20世纪80年代末，癌症患者血清中的循环dna和rna被分离出来，并被鉴定为肿瘤来源，具有肿瘤特异性。cfrna在体液中的丰度较高，因此关于液体活检标志物的研究越来越多的集中到cfrna上。cfrna包括mirna(microrna)，lncrna(long non-coding rna)，circrna(circularrna)，trna(transferrna)等几乎所有类型的ncrna(non-codingrna)和mrna(messagerna)。已有研究发现，血浆中的cfrna可作为一种新型的肿瘤标志物，对多种癌症起到预测作用，包括
胃癌、肺癌、乳腺癌以及结肠癌等。由此可见，血浆中的cfrna作为癌症诊断和预后的分子标志物已逐渐得到认可，其在早期肿瘤诊断和筛查中是十分具有应用潜力的。
4.胃癌前病变是指一类容易发生癌变的胃黏膜病理组织学变化，即胃黏膜的异型增生和肠上皮化生，主要伴存于慢性萎缩性胃炎。胃癌是一个多步骤癌变的过程，即慢性浅表性胃炎
→
萎缩性胃炎
→
肠上皮化生
→
上皮内瘤变
→
胃癌，在这期间出现的病变称之为癌前病变。慢性萎缩性胃炎容易发生癌变，一般认为其癌变率是：5～10年癌变率为3％～5％，10年以上为10％，低级别上皮内瘤变10年癌变率为2.5％～35％，高级别上皮内瘤变10年癌变率为10％～83％。而目前关于在胃癌前驱病变阶段预测肺癌的标志物并不多，因此针对胃癌前病变阶段检测是否发生胃癌及其高风险程度的标志物具有重要价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一组胃癌前驱病变及胃癌早期诊断血浆rna标志物组合及应用。
6.第一方面，本发明要求保护rna组合作为生物标志物在如下a1-a4任一中的应用；或，用于检测rna组合的物质在如下a1-a4任一中的应用：
7.a1、制备用于诊断或辅助诊断胃癌前病变的产品；
8.a2、制备用于筛查或辅助筛查胃癌前病变的产品；
9.a3、制备用于区分或辅助区分胃癌前病变和健康者的产品；
10.a4、制备用于区分或辅助区分胃癌前病变患者为胃炎还是上皮内瘤变的产品。
11.所述rna组合由如下中的至少两种组成：cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18。
12.其中，cebpa-as1、inhba-as1、ak001058和uca1为长链非编码rna(lncrna)；ppbp和rgs18为mrna。
13.进一步地，所述rna组合可为如下任一：
14.(a1)inhba-as1、ak001058、uca1和rgs18；
15.(a2)cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1和rgs18；
16.(a3)inhba-as1、ak001058和rgs18；
17.(a4)ak001058和rgs18；
18.(a5)cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18。
19.在a1-a3中，所述胃癌前病变优选为上皮内瘤变。
20.在a4中，所述上皮内瘤变可为低级别上皮内瘤变或高级别上皮内瘤变。
21.第二方面，本发明要求保护rna组合作为生物标志物在如下b1-b3任一中的应用；或，用于检测rna组合的物质在如下b1-b3任一中的应用：
22.b1、制备用于诊断或辅助诊断胃癌的产品；
23.b2、制备用于筛查或辅助筛查胃癌的产品；
24.b3、制备用于区分或辅助区分胃癌和健康者的产品。
25.所述rna组合由如下中的至少两种组成：cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18。
26.进一步地，所述rna组合可为如下任一：
27.(b1)cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18；
28.(b2)cebpa-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18；
29.(b3)cebpa-as1、ak001058、uca1和rgs18；
30.(b4)cebpa-as1、ak001058和rgs18；
31.(b5)ak001058和rgs18。
32.进一步地，所述胃癌可为早期胃癌。
33.第三方面，本发明要求保护rna组合作为生物标志物在如下c1-c3任一中的应用；或，用于检测rna组合的物质在如下c1-c3任一中的应用：
34.c1、制备用于诊断或辅助诊断消化道癌的产品；
35.c2、制备用于筛查或辅助筛查消化道癌的产品；
36.c3、制备用于区分或辅助区分消化道癌和健康者的产品。
37.所述rna组合由如下中的至少两种组成：cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18。
38.其中，所述消化道癌为可食管癌或结直肠癌。
39.第四方面，rna作为生物标志物在制备用于区分或辅助区分癌症患者为如下d1还是d2的产品中的应用；或，用于检测rna的物质在制备用于区分或辅助区分癌症患者为如下d1还是d2的产品中的应用；
40.d1、胃癌患者；
41.d2、食管癌患者或结直肠癌患者。
42.所述rna由如下中的至少一种组成：cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1和rgs18。
43.进一步地，cebpa-as1、inhba-as1和uca1均可用于区分或辅助区分胃癌患者和食管癌患者，以及区分或辅助区分胃癌患者和结直肠癌患者。ak001058可用于区分或辅助区分胃癌患者和食管癌患者。rgs18可用于区分或辅助区分胃癌患者和结直肠癌患者。其中，所述胃癌患者为早期胃癌患者。
44.其中，所述癌症患者为胃癌患者(如早期胃癌患者)、食管癌患者或结直肠癌患者。
45.在本发明中，所述cebpa-as1的核苷酸序列如seq id no.1所示。所述inhba-as1的核苷酸序列如seq id no.2所示。所述ak001058的核苷酸序列如seq id no.3所示。所述uca1的核苷酸序列如seq id no.4所示。所述ppbp的核苷酸序列如seq id no.5所示。所述rgs18的核苷酸序列如seq id no.6所示。
46.在上述各方面中，所述物质可为能够与所述rna或其反转录所得dna特异性结合的物质。
47.在本发明的具体实施方式中，所述物质为引物对。
48.进一步地，用于检测cebpa-as1的引物对由seq id no.7和seq id no.8所示两条单链dna组成；用于检测inhba-as1的引物对由seq id no.9和seq id no.10所示两条单链dna组成；用于检测ak001058的引物对由seq id no.11和seq id no.12所示两条单链dna组成；用于检测uca1的引物对由seq id no.13和seq id no.14所示两条单链dna组成；用于检测ppbp的引物对由seq id no.15和seq id no.16所示两条单链dna组成；用于检测rgs18的引物对由seq id no.17和seq id no.18所示两条单链dna组成。
49.更进一步地，所述物质中还含有用于检测内参的引物对；所述内参为18s rrna。
50.所述用于检测内参的引物对由seq id no.19和seq id no.20所示两条单链dna组成。
51.在上述各应用中，待测样本为血浆。即rna为血浆中的rna，生物标记物为血浆中的生物标记物。
52.本发明为消化道癌特别是胃癌发生早期以及胃癌前驱病变提供血浆rna组合标志物及检测分析方法，为临床胃癌疾病早期以及癌前病变阶段的发现及诊断治疗提供支持。
附图说明
53.图1为胃癌前病变患者血浆rna的相对表达水平。a：cebpa-as1；b：inhba-as1；c：ak001058；d：uca1；e：ppbp；f：rgs18。***p《0.001。
54.图2为胃癌前病变不同阶段患者血浆中6条rna的表达差异。a：cebpa-as1；b：inhba-as1；c：ak001058；d：uca1；e：ppbp；f：rgs18。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
55.图3为胃癌前病变患者血浆中6条rna每一条rna的roc曲线分析。
56.图4为胃癌前病变患者血浆中不同种rna组合roc曲线分析。c：cebpa-as1；i：inhba-as1；a：ak001058；u：uca1；p：ppbp；r：rgs18。
57.图5为早期胃癌患者血浆rna的相对表达水平。a：cebpa-as1；b：inhba-as1；c：ak001058；d：uca1；e：ppbp；f：rgs18。normal：正常组；egc：早期胃癌；*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
58.图6为早期胃癌患者血浆中6条rna每一条rna的roc曲线分析。
59.图7为早期胃癌患者血浆中不同种rna组合roc曲线分析。c：cebpa-as1；i：inhba-as1；a：ak001058；u：uca1；p：ppbp；r：rgs18。
60.图8为6条rna在结直肠癌/食管癌血浆中相对表达水平。a：cebpa-as1；b：inhba-as1；c：ak001058；d：uca1；e：ppbp；f：rgs18。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
具体实施方式
61.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
62.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
63.下述实施例中将涉及6种血浆rna，分别如下：
64.4种长链非编码rna(lncrna)：cebpa-as1、inhba-as1、ak001058和uca1：
65.2种mrna：ppbp和rgs18。
66.所述cebpa-as1的核苷酸序列如seq id no.1所示。所述inhba-as1的核苷酸序列如seq id no.2所示。所述ak001058的核苷酸序列如seq id no.3所示。所述uca1的核苷酸序列如seq id no.4所示。所述ppbp的核苷酸序列如seq id no.5所示。所述rgs18的核苷酸
序列如seq id no.6所示。
67.实施例1、血浆rna组合在筛查胃癌前驱病变中的应用
68.120例健康者(来自体检中心进行健康体检的表观健康人群，常规实验室检测指标结果在参考区间范围内)对照血浆、119例胃癌前病变(包括胃炎10例，低级别上皮内瘤变53例，高级别上皮内瘤变56例，基本信息见表1)患者血浆样本由解放军总医院第一医学中心提供。健康群体和胃癌前病变患者群体的年龄分布和性别比例相似，无统计学差异。
69.表1、119例胃癌前病变患者基本信息
[0070][0071]
注：“结果数据”一栏括号外为例数，括号内为对应信息结果。
[0072]
血浆rna提取使用mirneasy serum/plasma kit进行操作，实验步骤参考说明书。
[0073]
血浆rna逆转录按照improm
‑ⅱ
tm逆转录酶试剂盒说明书进行。
[0074]
血浆中相关rna表达水平根据premixextaqtm实时定量试剂盒说明书进行操作。
[0075]
反应体系如下：10μl 2
×
sybr premix ex taq，0.4μl rox，1μl血浆反转录cdna产物，0.4μl上游引物(20μm)，0.4μl下游引物(20μm)，7.8μl depc水。
[0076]
实时荧光定量pcr的反应条件如表2。引物序列如表3所示。
[0077]
表2、实时荧光定量pcr反应条件
[0078][0079][0080]
表3、引物序列
[0081]
基因名称引物序列(5
′‑3′
)
随机引物nnnnnn18s rrna-fgtaacccgttgaaccccatt(seq id no.19)18s rrna-rccatccaatcggtagtagcg(seq id no.20)cebpa-as1-ftgcgtccctcgcattcttta(seq id no.7)cebpa-as1-rgacaggagacacttgagggc(seq id no.8)inhba-as1-fcctactacacacaggggctc(seq id no.9)inhba-as1-rttccagaagctcctcatggg(seq id no.10)ak001058-fctgctttgccatttcccctt(seq id no.11)ak001058-rgttgatgccacacagaggga(seq id no.12)uca1-faaccatcagatccttgccca(seq id no.13)uca1-raatatgtggaactggcccca(seq id no.14)ppbp-ftgagacagaatgaaacac(seq id no.15)ppbp-raggtgatgaatctgctg(seq id no.16)rgs18-ftggactagaggcttttac(seq id no.17)rgs18-ratttgttgaggtcccttg(seq id no.18)
[0082]
注：n表示a或t或c或g。
[0083]
检测结果以目的rna表达的ct值和18s rrna表达的ct值的差值(δct)表示。由于rt-pcr结果分析中，ct值增加意味着相应基因表达量下降，因此与对照相比δct降低意味着相应基因表达上调，与对照相比δct升高意味着相应基因表达下调。受试工作曲线(roc)以正常人血浆和病人血浆rna表达值(δct)应用graphpadprism软件作图分析计算。
[0084]
结果见图1至图4。
[0085]
cebpa-as1、inhba-as1、ak001058和uca1相较于健康对照者，在癌前病变患者血浆中表达显著上调；而ppbp和rgs18在前驱病变患者血浆中表达显著下调(图1)。
[0086]
这六条rna在胃癌前驱病变不同阶段(胃炎，低级别上皮内瘤变，高级别上皮内瘤变)的表达结果显示，其表达与胃炎中表达差异不大，但与低级别异型增生和高级别异型增生阶段的表达有显著关联(图2)。
[0087]
对cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18这6条rna分子在前驱病变患者和健康者血浆样本表达水平的受试工作曲线(receiver operating characteristic，roc)分析表明其auc值依次分别为0.651、0.639、0.741、0.692、0.721和0.773(图3)。
[0088]
联合不同种rna分子的表达水平进行roc分析。当联合c&i&a&u&p&r全部6条rna分子时，其auc值为0.805。当随机去除任何一条rna分子，联合余下的5条rna分子进行roc曲线分析，其中c&i&a&u&r组合的auc值为0.819，是所有的5条rna组合中auc值最大的组合。当随机去除2条rna分子，联合余下的4条rna分子进行roc曲线分析，i&a&u&r组合的auc值在4条rna组合中最大，为0.820。当随机去除3条rna分子，联合余下的3条rna分子进行roc曲线分析，i&a&r组合的auc值在3条rna组合中最大，为0.815。当随机去除4条rna分子，联合余下的2条rna分子进行roc曲线分析，其中a&r组合的auc值在2条rna组合中最大，为0.809。最终发现一个i&a&u&r的4条rna分子的组合，包括inhba-as1、ak001058、uca1和rgs18可以作为诊断前驱病变的候选分子标志物(图4)。其中，c、i、a、u、p、r分别表示cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18(首字母)。
[0089]
实施例2、血浆rna组合在筛查胃癌中的应用
[0090]
120例健康者(来自体检中心进行健康体检的表观健康人群，常规实验室检测指标结果在参考区间范围内)对照血浆和143例早期胃癌患者(基本信息见表4)血浆样本由解放军总医院第一医学中心提供。健康群体和早期胃癌患者群体的年龄分布和性别比例相似，无统计学差异。
[0091]
表4、143例早期胃癌患者的基本信息
[0092][0093][0094]
注：“结果数据”一栏括号外为例数，括号内为对应信息结果。
[0095]
血浆rna提取、rna逆转录和rt-pcr分析操作(包括rt-pcr、roc曲线绘制等)见实施例1。
[0096]
结果见图5至图7。
[0097]
cebpa-as1、inhba-as1、ak001058和uca1相较于健康对照者，在早期胃癌患者血浆中表示显著上调，ppbp和rgs18在早期胃癌患者血浆中表达显著下调(图5)。
[0098]
对4条lncrna cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1和2条mrna ppbp、rgs18在早期胃癌患者和健康者血浆样本中的表达水平进行roc曲线分析结果显示其auc值依次分别为0.587、0.606、0.681、0.683、0.739和0.801(图6)。
[0099]
当联合全部6条rna分子时，c&i&a&u&p&r的auc值为0.845。当随机去除任何一条rna分子，联合余下的5条rna分子进行roc曲线分析时，c&a&u&p&r组合，其auc值为0.843，是所有的5条rna组合中auc值最大的组合。当随机去除2条rna分子，联合余下的4条rna分子进行roc曲线分析，c&a&u&r组合，其auc值在4条rna组合中最大，为0.840。当随机去除3条rna分子，联合余下的3条rna分子进行roc曲线分析，c&a&r组合，其auc值在3条rna组合中最大，为0.835。当随机去除4条rna分子，联合余下的2条rna分子作联合roc曲线分析，a&r组合，其auc值在2条rna组合中最大，为0.823。最终发现一个6-rna组合c&i&a&u&p&r，包括cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18可以作为诊断早期胃癌的候选分子标志物(图7)。其中，c、i、a、u、p、r分别表示cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18
(首字母)。
[0100]
实施例3、血浆rna在筛查消化道癌以及区分不同消化道癌中的应用
[0101]
120例健康者(来自体检中心进行健康体检的表观健康人群，常规实验室检测指标结果在参考区间范围内)对照血浆、42例其他类型的消化道癌(11例结直肠癌、31例食管癌，基本信息见表5)患者血浆样本和143例早期胃癌患者(基本信息见表4)血浆样本由解放军总医院第一医学中心提供。各组人群的年龄分布和性别比例相似，无统计学差异。
[0102]
表5、42例其他类型的消化道癌的基本信息
[0103][0104]
注：“结果数据”一栏括号外为例数，括号内为对应信息结果。
[0105]
血浆rna提取、rna逆转录和rt-pcr分析操作见实施例1。
[0106]
结果见图8。
[0107]
cebpa-as1、inhba-as1、ak001058、uca1、ppbp和rgs18的表达水平在健康者(正常)和食管癌/结直肠癌中具有显著性差异；cebpa-as1、inhba-as1和uca1的表达水平在早期胃癌和食管癌/结直肠癌中具有显著性差异；ak001058的表达水平在早期胃癌和食管癌中具有显著性差异；rgs18的表达水平在早期胃癌和结直肠癌中具有显著性差异；ppbp的表达水平在早期胃癌和食管癌/结直肠癌均未显示出差异性。上述结果说明该6条rna分子并非是胃癌特异性差异表达的。但是，由于检测样本量小，上述结果仅起到了提示作用，尚需要进行大样本的比较分析。本结果提示这些血浆rna的表达可能成为通用的消化道癌预警检测生物标志物。
[0108]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，
可以进行一些基本特征的应用。