油菜钙离子通道基因BnCNGC4在菌核病防控中的应用

油菜钙离子通道基因bncngc4在菌核病防控中的应用
技术领域
1.本发明属生物技术领域，涉及一种油菜钙离子通道基因bncngc4在菌核病防控中的应用。


背景技术：

2.1、植物基因功能分析技术植物基因功能通常通过比较分析基因的超常规表达与正常表达情况下的表型(phenotype)或功能发挥情况来判断和明确。基因的超常规表达包括高于正常水平的表达和低于正常水平的表达两大类。高于正常水平的表达主要为超表达/过表达(over-expression)，主要通过连接一个强启动子来驱动目的基因表达的方式来达到。低于正常水平的表达主要通过rna干扰(rna interfering,rnai)、基因敲除(knock-out)等方式来达到。rnai通过构建和转化一个含有同一序列片段相反方向插入一个内含子或其它不表达的序列形成的发卡结构来实现，结果是目的基因表达的降低。基因敲除(knock-out)则通过在植物基因组中的目的基因中插入一个长的非植物序列或切除目的基因等方式来达到，结果是目的基因表达的完全或近乎完全的抑制。通过构建基因超表达植株和/或rnai植株、基因敲除突变体，比较分析其表型和性状与野生型/正常植株的差异，可明确目的基因对该性状的调节功能。
3.2、植物抗病遗传学调控技术植物抗病性是由植物受体识别病原物配体激活抗病信号传导、活化系列防卫反应而产生的结果。从遗传学上看，受体-配体识别后，参与抗性调控的基因包括早期抗病信号传导基因和晚期防卫相关基因等。一般而言，通过早期抗病信号传导基因调控抗病性效果较好。钙是第二信使。钙信号途径是公认的关键早期信号传导途径。驱使植物抗病性产生的关键钙信号来自从细胞膜外向细胞质内的迅速和大量的钙内流(calcium influx)。目前已知激发钙内流的机制来自定位于质膜的钙离子通道，尤其是环核苷酸门控离子通道(cyclic nucleotide-gated ion channel，cngc)。利用cngc基因创制抗病性增强的作物种质预计效果好，但目前这方面的公开报告极少。
4.3、菌核病防控技术植物菌核病由核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)侵染所致。核盘菌是坏死营养型(necrotroph)病原真菌，寄主范围极广，是油料作物以及蔬菜作物等的主要病害。每年造成巨大经济损失。由于缺乏高抗品种，化学防治仍然是重要手段。由于一些农药存在生态污染、人畜毒害、易使病原物产生抗药性等问题，鉴定重要抗菌核病调控基因，创制和利用抗病品种，对于菌核病的绿色防控至关重要。
5.4、植物抗病育种技术植物抗病育种技术主要分为传统抗病育种和通过基因工程抗病育种两大类。传统抗病育种因为有天然遗传隔离现象使抗病资源可用范围受到显著限制，只能应用遗传关系较近的抗病资源，而且需要多次杂交和回交等，因此选育周期长，且需要大量人力物力。而
基因工程育种方法是通过将外源的抗病调控基因通过农杆菌介导的方法等技术导入植物，使其获得原来不具有的抗病性。因此，基因工程育种方法打破了天然遗传隔离现象的限制，拓宽了抗病资源可用范围，而且具有操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力的特点。另外，可通过导入一个广谱抗病调控基因，或者多个不同抗病谱的基因，创制具有广谱抗病的品种。因此具有特别适宜培育广谱、持久抗病品种等优点。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种油菜钙离子通道基因bncngc4在菌核病防控中的应用，所述油菜(brassica napus)钙离子通道基因bncngc4对抗病性有调控功能，可在创制抗核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)种质中的应用。
7.所述应用是通过创制转基因油菜来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用。是通过创制超表达bncngc4的转基因油菜来获得降低菌核病抗性的油菜材料中的应用，或通过创制bncngc4-rnai转基因油菜来获得增高菌核病抗性的油菜材料中的应用。
8.本发明以油菜(brassica napus)中双11品种cdna为模板，通过pcr克隆获得油菜基因bncngc4，其核苷酸序列如seq id：1所示，该基因的开放阅读框(orf)长2097bp，编码的蛋白由698个氨基酸组成，其序列如seq id：2所示。bncngc4蛋白包含跨膜结构域、环核苷酸结合结构域和cam结合结构域。本发明克隆的核苷酸序列与法国油菜品种darmor-bzh序列bnac09g30630d一致，与ncbi数据库中油菜品种zs11的loc111205393核苷酸序列仅有1个碱基的区别，但该碱基的变化不导致氨基酸的改变；本发明克隆的蛋白序列与bnac09g30630d和xp_022556856.1相同。
9.在本发明之前，该基因的功能没有任何公开报告。本发明首次通过构建该基因的超表达和rnai转基因油菜及其抗病分析，阐明了该基因对油菜菌核病抗性的调控作用及机制。结果显示，与转化空载体的转基因油菜植株相比，超表达转基因油菜植株更感核盘菌，而rnai转基因植株更抗核盘菌，说明bncngc4负调控油菜对核盘菌的抗性。此外，超表达转基因植株病健交界处积累的活性氧显著多于对照，而rnai转基因植株显著少于对照，表明bncngc4通过正向调控接种后期活性氧的积累负调控油菜对核盘菌的抗性。
10.基于以上本发明阐明的bncngc4基因功能，本发明的应用目的是提供所述的油菜bncngc4基因通过创制转基因油菜来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用，包括(1)在通过创制超表达bncngc4的转基因油菜来获得降低对菌核病抗性的油菜材料中的应用(具体见实施例1中的说明)；以及(2)在通过创制bncngc4-rnai的转基因油菜来获得增高对菌核病抗性的油菜材料中的应用(具体见实施例2中的说明)。
11.油菜bncngc4基因在通过创制超表达bncngc4的转基因油菜来获得降低对菌核病抗性的油菜材料中的应用，具体通过以下步骤实现：(1)bncngc4基因超表达结构的构建和获取：将bncngc4基因开放阅读框(orf)克隆入一个植物表达载体，使其受强启动子的驱使表达；(2)转化bncngc4基因超表达结构的农杆菌的获取：将构建好的bncngc4基因超表达结构通过电击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株；(3)超表达bncngc4的转基因油菜创制和获取：通过农杆菌介导法将bncngc4基因超表达结构导入油菜，获取转bncngc4基因超表达结构的油菜；
(4)超表达bncngc4的转基因油菜纯合系的获取：分别以抗生素抗性和bncngc4基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的超表达bncngc4的转基因油菜纯合系；(5)对菌核病抗性下降的超表达bncngc4的转基因油菜纯合系筛选鉴定和获取：以超表达bncngc4的转基因油菜纯合系为材料，检测分析对菌核病的抗性，获取抗病性下降的转bncngc4基因油菜。
12.油菜bncngc4基因在通过创制bncngc4-rnai的转基因油菜来获得增高对菌核病抗性的油菜材料中的应用。通过以下步骤实现：(1)bncngc4基因rnai结构的构建和获取：将bncngc4基因的一个特异性序列片段克隆入中间表达载体pkannibal，再将重组结构插入rnai载体(part27)，获取rnai结构part27-bncngc4；(2)转化bncngc4基因rnai结构的农杆菌的获取：将bncngc4基因rnai结构(part27-bncngc4)通过电击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株；(3)转bncngc4基因rnai结构油菜的创制和获取：通过农杆菌介导法将bncngc4基因rnai结构导入油菜，获取转bncngc4基因rnai结构的油菜；(4)转bncngc4基因rnai结构油菜纯合系的获取：分别以抗生素抗性和bncngc4基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转bncngc4基因rnai结构的油菜纯合系；(5)抗菌核病的转bncngc4基因rnai结构油菜纯合系的筛选鉴定和获取：以转bncngc4基因rnai结构(part27-bncngc4)的油菜纯合系为材料，检测分析对菌核病的抗性，获取抗菌核病的bncngc4基因rnai油菜。
13.本发明的优点：(1)本发明提供的bncngc4基因是优质抗菌核病调控基因资源，利用该基因获取的抗病材料具有抗病性较强等优点。油菜菌核病抗性是数量性状抗性，由多基因控制。一般而言，单个基因对该抗性的调控程度较低。因此，全世界范围内，油菜菌核病抗性材料都很匮乏，尚无高抗材料。bncngc4基因是钙离子通道基因，是早期抗病调控基因，作用位于信号传导的上游，抗性调控效果好，因而是优质抗病调控基因资源。利用cngc创制抗病品种和种质是病害绿色防控的经济有效和安全的途径。因此，bncngc4基因是一种适用于创制和选育抗菌核病油菜新材料和新品种的全新基因资源。(2)获取抗病材料周期短。获取抗病植物材料和品种的方法主要有常规的传统育种方法和利用抗病调控基因的基因工程育种方法。传统育种方法具有可用抗病资源范围受天然遗传隔离限制，选育周期长，需要大量人工物力等缺点。而基因工程育种方法则具有可用抗病资源范围广、操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力、特别适宜培育广谱、持久、高抗病性品种等优点。本发明利用抗病调控基因bncngc4，采用基因工程方法，创制培育高抗菌核病的油菜材料，具有周期短，选育快速等特点。
附图说明
14.图1提供本专利获取的各类转基因油菜植株的证据，显示转基因油菜植株中bncngc4基因表达检测结果。利用实时荧光定量pcr检测沉默bncngc4基因的rnai植株(a)以及超表达bncngc4基因的oe植株(b)中bncngc4基因表达水平。选用油菜bnactin7作为内参
基因，ev/zs11的相对表达量设置为1。qrt-pcr分析进行了三次生物学重复，每次包含三次技术重复，利用graphpad prism对表达结果进行student's t-test检验统计分析，数据以平均值
±
标准差表示。差异显著性以不同数量*号表示(*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.005)。结果显示，rnai植株中bncngc4的表达量显著降低，只有对照植株的32％(a)，而两个超表达株系line 4和line 5中，bncngc4的表达量均明显提高，分别为对照的11.0倍和15.2倍(b)。表明这些植株为真正的bncngc4基因rnai植株和超表达植株。
15.图2提供bncngc4基因抗菌核病调控功能的证据，显示bncngc4负调控油菜对核盘菌的抗性。对油菜bncngc4转基因植株进行了核盘菌uf-1的接种分析。图中显示接种后24h的表型(a)和病斑面积定量统计分析结果(b)。接种实验重复三次。利用graphpad prism对病斑面积进行student's t-test检验统计分析，数据以平均值
±
标准差表示。差异显著性以不同数量*号表示(***，p《0.005)。结果显示，rnai植株表现出比非转基因植株(zs11)和转空载体植株(ev)这两种对照更抗病的表型，而超表达植株则比对照明显更感病(a)。病斑面积定量分析结果显示，zs11和ev这两种对照植株的病斑面积分别为125.8mm2和121.9mm2，而rnai植株的病斑面积只有45.8mm2，显著小于对照，只有对照的37％；超表达植株的病斑面积则平均达到了176.9mm2，明显大于对照植株，为对照的1.43倍(b)。这些结果表明，bncngc4负调控油菜对核盘菌的抗性。
16.图3提供bncngc4基因抗菌核病调控作用机制的证据，显示bncngc4通过正调控发病后期植株体内活性氧的积累量，从而负调控油菜对核盘菌的抗性。对接种核盘菌uf-1 24h后的不同转基因植株叶片进行二氨基联苯胺(dab)染色，分析活性氧的积累量。a：接种24h后发病表型；b：a中叶片dab染色结果。接种分析结果显示，不同转基因株系接种后表型与图2相同，rnai植株病斑面积明显比对照更小，而oe植株则明显比对照更大(a)，该结果再次证明bncngc4负调控油菜对核盘菌抗性。dab染色结果显示，rnai植株叶片的病健交界处颜色明显浅于对照，说明rnai植株积累较少的活性氧，而oe植株叶片病健交界处颜色明显比对照更深，说明积累了更多的活性氧(b)。该结果表明，bncngc4通过正调控发病后期植株体内活性氧的积累量，从而负调控油菜对核盘菌的抗性。
具体实施方式
17.本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
18.实施例1本发明克隆了一个油菜基因bncngc4，首次通过构建超表达转基因油菜，阐明了该基因的抗菌核病调控功能，揭示了该基因对油菜菌核病抗性具有重要负调控功能。因为bncngc4基因的超表达导致油菜对菌核病抗性的显著下降，因此，可以通过构建bncngc4基因的超表达油菜纯合系来创建获取对菌核病抗性下降的油菜新材料，用于基因功能和作用机制分析等用途。bncngc4基因的克隆、功能及机制分析、对菌核病抗性下降的油菜新材料创制和获取的主要步骤包括：
19.1)油菜bncngc4基因的克隆和保存本发明提供的油菜bncngc4基因通过以下步骤克隆获得。先根据油菜基因组数据库中bncngc4序列设计了引物bncngc4-f(5
’‑
atg gca acc gag caa gaa tt-3’)(序列如seq id：3所示)，以及bncngc4-r(5
’‑
cta ata atc atc gaa atc gtc agg g-3’)(序列如
3d。
27.(iii)农杆菌侵染及共培挑取农杆菌于侵染液中，制备od
600
＝0.2的农杆菌重悬液，将外植体接种于农杆菌悬浮液中侵染10min。将侵染后的外植体接种于无菌滤纸上晾干，接种于共培养基上，23℃暗培养48-72h。
28.(iv)脱菌(延筛)将共培后的外植体接种于脱菌培养基上，23℃光照培养6d。
29.(v)筛选/分化将脱菌处理的外植体接种于筛选/分化培养基上，每皿30个外植体，23℃光照培养，15d换一次板。
30.(vi)生根培养将分化出的芽接种于生根培养基，23℃光照培养，直至生根。
31.(vii)检测采用ctab法提取油菜基因组dna，进行pcr检测抗性基因。
32.(viii)土壤种植等卡那霉素抗性苗长到根系完全后，将t0代无菌小苗在27℃下开盖培养锻炼2d，然后移栽到土中，置于培养箱中进行常规管理，最后收获得到t0种子。
33.5)转bncngc4基因超表达结构part-cam-bncngc4的油菜纯合系的筛选鉴定和获取分别以卡那霉素抗性和bncngc4基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况。卡那霉素抗性筛选在含卡那霉素的平板上针对油菜种子开展进行，观察能否在卡那霉素抗性平板上正常生长成健康小苗。基因表达采用实时荧光定量pcr等方法进行检测。获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转bncngc4基因超表达结构part-cam-bncngc4的油菜纯合系。
34.本发明获取了两个油菜纯合系，oe-line 4和oe-line 5，在卡那霉素抗性平板上全部能正常生长成健康小苗、且bncngc4基因表达水平均显著高于转空载体的对照，分别为对照的11.0倍和15.2倍(图1b)。表明这些植株为真正的bncngc4基因超表达植株。
35.6)bncngc4基因超表达油菜纯合系的抗病性检测分析以5)中获取的bncngc4基因超表达油菜纯合系为材料，通过接种核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)，检测分析其对油菜菌核病的抗性，从而明确bncngc4基因对油菜菌核病抗性的调控作用，为利用该基因创建和获取抗菌核病油菜奠定基础。
36.核盘菌的活化培养：选取饱满无污染的核盘菌菌核，用酒精灯灼烧过的无菌刀片将菌核切为两半，切面朝下放于pda固体平板上，23℃避光培养3d，选用直径4mm的打孔器打取菌落边缘向内3～5mm的菌丝块，带菌丝的一面朝下接种到新的pda固体平板上，23℃避光培养36h左右可进行接种。
37.核盘菌的接种：选取长势一致的油菜植株供接种。用直径4mm的打孔器打取菌落边缘向内3-5mm的菌丝块，菌丝面朝下接种到发育完全的叶片的中间位置，每叶左右半叶对称各接种一个菌丝块，覆膜保湿，置于23℃温室培养，适当时间(约24h)后进行拍照记录，病斑面积用imagej软件分析。
38.接种实验重复三次。对病斑面积进行student's t-test检验统计分析。结果显示，
bncngc4超表达植株比非转基因植株(zs11)和转空载体植株(ev)这两种对照明显更感病(图2a)。病斑面积定量分析结果显示，zs11和ev这两种对照植株的病斑面积分别为125.8mm2和121.9mm2，而超表达植株的病斑面积平均达176.9mm2，明显大于对照植株，为对照的1.43倍(图2b)。
39.这些结果表明，bncngc4超表达植株对菌核病的抗性显著低于非转基因植株和转空载体植株这两种对照。bncngc4基因的超表达导致油菜对菌核病抗性的显著下降，因此，bncngc4对油菜菌核病的抗性起负调控作用。可以通过构建bncngc4-rnai油菜来创建获取高抗菌核病的油菜新材料和新品种。
40.7)bncngc4基因超表达油菜接种核盘菌后活性氧积累量的检测分析为揭示bncngc4的抗病调控作用机制，以5)中获取的bncngc4基因超表达油菜纯合系为材料，采用二氨基联苯胺(dab)染色检测分析其接种核盘菌24h后活性氧积累情况。接种分析结果显示，bncngc4基因超表达(oe)植株接种后比对照更感病，病斑面积明显比对照更大(图3a)，该结果再次证明bncngc4负调控油菜对核盘菌抗性。dab染色结果显示，oe植株叶片病健交界处颜色明显比对照更深，说明积累了更多的活性氧(图3b)。该结果表明，bncngc4通过正调控发病后期植株体内活性氧的积累量，从而负调控油菜对核盘菌的抗性。
41.实施例2根据如上所述本发明阐明的油菜基因bncngc4对菌核病抗性的负调控功能，建立了一套利用构建该基因的rnai转基因油菜、采用基因工程技术创制和获取抗菌核病油菜新材料的技术体系。主要步骤包括：
42.(1)bncngc4基因rnai结构的构建和获取根据本发明克隆的bncngc4序列设计引物bncngc4-f3(5
’‑
ggagaggacacgctcgag atg gca acc gag caa gaa ttc-3’，斜体部分为包含xho i酶切位点、与线性化载体pkannibal一致的序列)(序列如seq id：7所示)，以及bncngc4-r3(5
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tttccttaccaattggggtacc cgc gca cac aag gag aaa g-3’，斜体部分为包含kpn i酶切位点、与线性化载体pkannibal一致的序列)(序列如seq id：8所示)；bncngc4-f4(5
’‑
ttcgaaatcgataagctt cgc gca cac aag gag aaa g-3’，斜体部分为包含hind iii酶切位点、与线性化载体pkannibal一致的序列)(序列如seq id：9所示)，以及bncngc4-r4(5
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ttaaagcaggactctaga atg gca acc gag caa gaa ttc-3’，斜体部分为包含xba i酶切位点、与线性化载体pkannibal一致的序列)(序列如seq id：10所示)。以实施例1的1)中获取的peasy-bncngc4质粒为模板，bncngc4-f3/bncngc4-r3为引物对，通过pcr扩增获取长为300bp的bncngc4正向片段(片段1)，然后通过xho i/kpn i双酶切pkannibal载体(片段2)，将片段1、2用重组连接酶重组连接、转化、卡那霉素培养基平板筛选、酶切、pcr鉴定和测序鉴定等步骤获取亚克隆了300bp bncngc4正向片段的中间表达载体pkannibal-bncngc4-1。将测序正确的质粒用xba i和hind iii双酶切，回收大片段(片段3)。同时以peasy-bncngc4质粒为模板，bncngc4-f4/bncngc4-r4为引物对，通过pcr扩增获取长为300bp的bncngc4反向片段(片段4)，并回收，将片段3、4用重组连接酶重组连接、转化、卡那霉素培养基平板筛选、酶切、pcr和测序鉴定等步骤获取含有正、反向bncngc4片段的pkannibal-bncngc4-rnai载体。将pkannibal-bncngc4-rnai载体和part27用not i酶切，t4连接。然后用xba i和xho i双酶切、pcr和测序鉴定是否在重组载体的pdk intron两端正反双向插入了300bp的
bncngc4片段，从而获取rnai结构part27-bncngc4。
43.(2)转化bncngc4基因rnai结构的农杆菌的获取将bncngc4基因rnai结构(part27-bncngc4)通过电击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株，如eha105，在含壮观霉素的yep培养基上筛选转化子，再通过xba i和xho i双酶切和pcr鉴定，获取携带bncngc4基因rnai结构part27-bncngc4的农杆菌。用于下一步油菜的遗传转化。
44.(3)转bncngc4基因rnai结构油菜的创制和获取通过农杆菌介导法将bncngc4基因rnai结构part27-bncngc4导入油菜，最后获取转part27-bncngc4的油菜t0代。具体操作步骤同实施例1的4)中如述。
45.(4)转bncngc4基因rnai结构油菜纯合系的获取分别以抗生素抗性和bncngc4基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况。卡那霉素抗性筛选在含卡那霉素的平板上针对油菜种子开展进行，观察能否在卡那霉素抗性平板上正常生长成健康小苗。基因表达采用实时荧光定量pcr等方法进行检测。获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转bncngc4基因rnai结构part27-bncngc4的油菜纯合系。这些油菜纯合系在卡那霉素抗性平板上全部能正常生长成健康小苗、且bncngc4基因表达水平显著低于转空载体的对照。
46.本发明获取了bncngc4-rnai油菜纯合系，在卡那霉素抗性平板上能正常生长成健康小苗、且bncngc4基因表达水平显著低于转空载体的对照，只有对照植株的32％(图1a)。表明这些植株为真正的bncngc4基因rnai植株。
47.(5)抗菌核病的转bncngc4基因rnai结构油菜纯合系的筛选鉴定和获取以转bncngc4基因rnai结构(part27-bncngc4)的油菜纯合系为材料，检测分析对菌核病的抗性。接种方法和抗病性评价同实施例1)的6)中所述。
48.对本发明构建的bncngc4-rnai植株进行核盘菌接种分析的结果显示，bncngc4-rnai植株比非转基因植株(zs11)和转空载体植株(ev)这两种对照明显更抗病(图2a)。病斑面积定量分析结果显示，zs11和ev这两种对照植株的病斑面积分别为125.8mm2和121.9mm2，而rnai植株的病斑面积只有45.8mm2，显著小于对照，仅为对照的37％(图2b)。表明bncngc4-rnai植株对菌核病的抗性显著高于非转基因植株和转空载体植株这两种对照。bncngc4基因的表达抑制导致油菜对菌核病抗性的显著增高。本发明通过构建bncngc4-rnai油菜成功地创制获取了高抗菌核病的油菜新材料。
49.为进一步阐明这些bncngc4-rnai的抗菌核病病作用机制，采用二氨基联苯胺(dab)染色检测分析其接种核盘菌24h后活性氧积累情况。接种分析结果显示，bncngc4-rnai植株接种后比对照更抗病，病斑面积明显比对照更小(图3a)，该结果再次证明bncngc4负调控油菜对核盘菌抗性。dab染色结果显示，rnai植株叶片病健交界处颜色明显比对照更浅，说明积累了更少的活性氧(图3b)。该结果再次证明，bncngc4通过正调控发病后期植株体内活性氧的积累量，从而负调控油菜对核盘菌的抗性。
50.综上，本发明结合图1-图3的结果，首次揭示了油菜钙离子通道基因bncngc4对油菜菌核病抗性起负调控作用，并揭示该基因通过正调控发病后期植株体内活性氧的积累量，从而负调控油菜菌核病抗性的作用机制。更重要的是，本发明提供了bncngc4在创制抗菌核病作物种质中的应用途径和应用技术，提供了实施例，并成功获取了高抗菌核病油菜。