免疫磁分离-环介导等温扩增快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的方法

免疫磁分离-环介导等温扩增快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，具体地说，涉及一种免疫磁分离-环介导等温扩增快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法。


背景技术：

2.抗生素被大量应用于治疗奶牛乳房炎等疾病，导致生牛乳中耐药细菌累积，在经过巴氏杀菌处理后，耐热的芽孢杆菌仍存在于乳中，使得巴氏杀菌乳和利用巴氏杀菌乳生产的产品含有耐药芽孢杆菌。耐药芽孢杆菌携带的耐药基因，尤其是四环素耐药基因能通过质粒或可移动元件转移给金黄色葡萄球菌和肠球菌，最终可能通过食物链转移给人体，给人类健康带来威胁。因此，有必要加强乳制品中耐药芽孢杆菌的检测，降低耐药基因水平转移可能带来的危害。
3.目前耐药芽孢杆菌检测包括培养法和分子生物学两种手段。基于培养法的检测因灵敏性差，耗时长，无法实现快速检测。分子生物学中环介导等温扩增(lamp)是一种体外核酸扩增技术，在恒温条件下即可对目标基因大量扩增，具有反应快速、操作简单和特异性强等优点。目前研究通常将lamp检测和增菌培养相结合，从而提高lamp检测方法的灵敏度，但是增菌培养一般需要18-24h，延长了整体检测时间，无法实现快速检测。另外，在实际检测巴氏杀菌乳中耐药芽孢杆菌时，由于基质复杂，同时可能存在其它菌的干扰，很难对耐药芽孢杆菌进行高灵敏、高特异性的检测。因此，如何建立一种特异性强、灵敏度高的快速检测巴氏杀菌乳中耐药芽孢杆菌的方法，仍是目前亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种免疫磁分离-环介导等温扩增(ims-lamp)快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法。
5.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一套芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的lamp检测引物组合，所述引物组合由引物f3、b3、fip、bip和lb组成，它们的序列分别如seq id no:1-5所示。
6.第二方面，本发明提供一种用于分离和富集芽孢杆菌的免疫磁珠，所述免疫磁珠是将羧基磁珠经过活化后，在磁珠表面偶联芽孢杆菌特异性抗体制得的。
7.具体地，所述免疫磁珠的制备方法包括：
8.取羧基磁珠0.8-1mg于3ml pb中，磁分离10min后移去上清，重复清洗3次，复溶于3ml pb，每次复溶后超声10s；分别称取1mg的乙基二甲氨基碳化二亚胺(edc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhss)，使用100μl的pb溶解，随后将两种溶液立即加入磁珠溶液，在37℃180-220rpm摇床反应1-2h；磁分离10min后移去上清，使用pb清洗2次，最后使用3ml pb复溶；取100μg芽孢杆菌特异性抗体加入上述磁珠溶液，涡旋混匀，在37℃220rpm摇床反应2h；称取40mg脱脂乳溶于400μl pb，并加入上述溶液，封闭反应4h；磁分离10min后移去上清，使用pb
清洗2次，最后使用1ml复溶液复溶，4℃保存。
9.优选地，所述磁珠的平均粒径为180nm。磁珠的材质为fe3o4。
10.所述pb的浓度为0.01m，ph 6.0。
11.所述复溶液为25％蔗糖 1％脱脂乳 0.7％procllin。
12.所述芽孢杆菌特异性抗体为多克隆抗体。
13.多克隆抗体采用如下方法制得：1)制备免疫原；2)免疫动物；3)测定血清效价；4)纯化抗血清；5)抗体特异性检测。
14.优选地，以蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌孢子为免疫原，免疫兔子，采集抗血清。
15.第三方面，本发明提供用于检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的试剂盒，包括所述的引物组合和所述的免疫磁珠。
16.第四方面，本发明提供免疫磁分离-环介导等温扩增快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法，采用所述的试剂盒进行检测；
17.所述方法包括免疫磁分离、核酸提取和环介导等温扩增等步骤(图1)。
18.优选地，所述免疫磁珠的添加量为20μl。
19.优选地，采用煮沸法提取芽孢杆菌核酸；反应条件为：100℃，10min。
20.进行环介导等温扩增所使用的lamp反应体系为：12.5μl lamp混合液，2.5μl引物混合物，模板5μl，染料0.5μl，超纯水补至25μl。
21.优选地，所述lamp混合液含有8000u/ml bst 2.0聚合酶。
22.优选地，所述引物混合物含有引物f3、b3各0.2μmol/l，引物fip、bip各1.6μmol/l以及引物lf、lb各0.4μmol/l。
23.所述lamp反应程序为：65℃，1min，共45-49个循环，每个循环结束后收集荧光信号。
24.第五方面，本发明提供所述试剂盒或所述方法在样品(食品、乳样)中芽孢杆菌检测中的应用。
25.所述芽孢杆菌包括但不限于蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌。
26.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
27.(一)利用免疫磁分离技术快速富集巴氏杀菌乳中的芽孢杆菌，消除食品基质及大肠杆菌的干扰，提高检测方法的灵敏度，缩短检测时间。
28.(二)lmap法检测芽孢杆菌的四环素耐药基因tetl，与pcr、qpcr相比，具有快速、特异、灵敏、操作简单等特点。
29.(三)采用本发明ims-lamp技术检测芽孢杆菌中四环素耐药基因tetl，所需时间仅为2h，大大缩短了检测时间，而且灵敏度比qpcr检测法高10倍。
30.(四)本发明提供的ims-lamp技术可以检测巴氏杀菌乳中2.15
×
101cfu/ml的耐药芽孢杆菌。
附图说明
31.图1为本发明ims-lamp技术检测巴氏杀菌乳中耐药芽孢杆菌流程图。
32.图2为本发明较佳实施例中免疫磁珠用量优化。**、***和****表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，**表示p《0.01，***表示p《0.001，****p《0.0001。ns表示无显著
性差异。
33.图3为本发明较佳实施例中免疫磁珠特异性检验。
34.图4为本发明较佳实施例中观察免疫磁珠-芽孢杆菌复合物。
35.图5为本发明较佳实施例中芽孢杆菌核酸提取方式比较。
36.图6为本发明较佳实施例中lamp引物优化。
37.图7为本发明较佳实施例中lamp反应温度优化。
38.图8为本发明较佳实施例中lamp反应模板量优化。
39.图9为本发明较佳实施例中ims-lamp方法特异性检验。
40.图10为本发明较佳实施例中ims-lamp方法灵敏度检验。
41.图11为本发明较佳实施例中qpcr方法灵敏度检验。
42.图12为本发明较佳实施例中ims-lamp方法检测人工污染乳。
具体实施方式
43.本发明提供一种免疫磁分离-环介导等温扩增(ims-lamp)快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法，所述方法包括将羧基磁珠与芽孢杆菌多克隆抗体偶联制备免疫磁珠，然后将免疫磁珠添加到待测样品，得到免疫磁珠-芽孢杆菌复合物(磁细菌)；通过煮沸法提取芽孢杆菌核酸；针对四环素耐药基因tetl设计特异性lamp引物，将上述核酸加入lamp反应体系，于实时荧光定量pcr仪扩增并检测荧光信号。本发明方法可以快速检测巴氏杀菌乳中芽孢杆菌的四环素耐药基因tetl，降低耐药基因水平转移带来的危害。该方法特异性强，灵敏度高，检测时间短，实现对耐药芽孢杆菌的快速检测。
44.具体地，本发明采用如下技术方案：
45.本发明提供一种ims-lamp快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法，采用免疫磁分离技术富集巴氏杀菌乳中芽孢杆菌。
46.本发明将免疫磁分离技术作为前处理方法，无需微生物增菌便实现芽孢杆菌的快速富集，并消除牛奶基质及大肠杆菌的干扰，从而提高检测方法的灵敏度，缩短检测时间。
47.优选地，所述免疫磁珠的添加量为20μl；
48.优选地，所述免疫磁珠由粒径180nm羧基磁珠和芽孢杆菌多克隆抗体混合制备，经大肠杆菌检验特异性后，再添加到所述含芽孢杆菌巴氏杀菌乳中；优选地，所述大肠杆菌为atcc80739。
49.优选地，所述芽孢杆菌包括但不限于蜡样芽孢杆菌ba117、蜡样芽孢杆菌s7、蜡样芽孢杆菌s11、蜡样芽孢杆菌atcc11778、蜡样芽孢杆菌ba128、地衣芽孢杆菌ba130、短小芽孢杆菌ba102。
50.本发明还提供一种煮沸法提取芽孢杆菌核酸的方法。
51.优选地，提取芽孢杆菌核酸采用煮沸法，反应条件为：100℃，10min(加热块)。
52.本发明还提供一种lamp检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法。
53.优选地，使用lamp引物设计软件primer explorer v4设计四环素耐药基因tetl的引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，lamp引物序列如下(5
′‑3′
)：
54.f3：agttctttgtgggggaatt
55.b3：agcagttaaaaagctaacagaa
56.fip：acttagctggtgaacatctttcatcttggaacagtagcagggt
57.bip：tgagtgtcattattttcggctacacgatgtttaacacgtataaaggac
58.lb：ggtgggatacttgttgatagaagag
59.优选地，所述lamp反应体系为：12.5μl lamp混合液(含8000u/ml bst 2.0聚合酶)、2.5μl引物混合物(外引物f3/b3各0.2μmol/l、内引物fip/bip各1.6μmol/l、环引物lf/lb各0.4μmol/l)，模板5μl，染料0.5μl，超纯水补至25μl。
60.优选地，所述lamp反应程序为：65℃，1min，共49个循环，每个循环结束后收集荧光信号。
61.本发明还提供ims-lamp技术在检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的应用。
62.本发明还提供上述方法在食品微生物(特别是耐药芽孢杆菌)检测中的应用。
63.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j & russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
64.以下实施例中使用的芽孢杆菌抗体为蜡样芽孢杆菌多克隆抗体。购自abcam，货号ab20556。
65.实施例1 免疫磁珠的制备
66.取羧基磁珠1mg(平均粒径180nm)于3ml pb(ph 6.0，0.01m)中，磁分离10min后移去上清，重复清洗3次，复溶于3ml pb(ph 6.0，0.01m)，每次复溶后超声10s；分别称取1mg的乙基二甲氨基碳化二亚胺(edc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhss)，使用100μl的pb(ph 6.0，0.01m)溶解，随后将两种溶液立即加入磁珠溶液，在摇床(37℃；220rpm)反应1h；磁分离10min后移去上清，使用pb(ph 6.0，0.01m)清洗两次，最后使用3ml pb(ph 8.0，0.01m)复溶；取100μg芽孢杆菌抗体加入上述磁珠溶液，充分涡旋混匀，在摇床(37℃；220rpm)反应2h；称取40mg脱脂乳溶于400μl pb(ph 8.0，0.01m)，并加入上述溶液，封闭反应4h；磁分离10min后移去上清，使用pb(ph 8.0，0.01m)清洗两次，最后使用1ml专用复溶液(25％蔗糖，1％脱脂乳，0.7％procllin)复溶，置于4℃冰箱备用。
67.实施例2 利用免疫磁珠富集芽孢杆菌的方法
68.1、免疫磁珠用量优化
69.本实施例使用的免疫磁珠同实施例1。将免疫磁珠添加到105cfu/ml蜡样芽孢杆菌ba117菌液，免疫磁捕获1h后于磁铁上磁分离3min，将原液及pbs重悬的沉淀涂于营养琼脂(na)培养基，30℃培养24h后计数，按下列公式计算捕获效率。免疫磁珠添加量分别为1、2、5、10、15、20、25、30μl。实验结果如图2所示，当免疫磁珠用量从1μl增加到20μl，捕获效率从2.3％显著增加到89.5％(p《0.05)，继续添加免疫磁珠用量至30μl，捕获效率无显著提高(p》0.05)。
[0070][0071]
2、免疫磁珠特异性检验
[0072]
本实施例使用的免疫磁珠同实施例1。取20μl免疫磁珠分别添加到6株浓度为105cfu/ml芽孢杆菌以及大肠杆菌菌液。免疫磁捕获1h后于磁铁上磁分离3min，将原液及pbs重悬的沉淀涂于na或lb培养基，30℃培养24h后计算捕获效率。另外，取20μl的免疫磁珠
添加到浓度为107cfu/ml蜡样芽孢杆菌ba117菌液，免疫磁捕获1h后于磁铁上磁分离3min，沉淀用ddh2o重悬，吸取10μl磁细菌滴加于载样铜网上，室温静置干燥过夜，用于后续透射电镜观察。
[0073]
实验结果如图3所示，免疫磁珠对芽孢杆菌的捕获效率分别为蜡样芽孢杆菌s7(94.8％)、蜡样芽孢杆菌s11(98.0％)、蜡样芽孢杆菌ba128(94.1％)、蜡样芽孢杆菌atcc11778(81.2％)、地衣芽孢杆菌ba130(61.9％)、短小芽孢杆菌ba102(60.5％)，对大肠杆菌atcc80739捕获率仅为3.8％，该结果表明本实验制备的免疫磁珠具有很高的特异性。此外，为进一步确认免疫磁珠和蜡样芽孢杆菌的免疫结合，利用透射电镜对制备的磁细菌进行观察(图4)，证明免疫磁珠捕获到了芽孢杆菌。
[0074]
实施例3 芽孢杆菌核酸提取
[0075]
分别以煮沸法和试剂盒法提取蜡样芽孢杆菌ba117的核酸，证明热裂解法提取核酸的可行性。
[0076]
1、煮沸法
[0077]
取蜡样芽孢杆菌ba117菌液(od
600
＝0.8)2ml，12000rpm离心1min，弃去上清后用200μl elution buffer复溶，于金属浴100℃处理10min，10000rpm离心1min，取上清作为模板，-20℃保存。
[0078]
2、试剂盒法
[0079]
取蜡样芽孢杆菌ba117菌液(od
600
＝0.8)2ml，12000rpm离心1min，弃上清后加入500μl tes重悬，10000rpm离心1min后弃去上清，重复上一步骤，除去上清；加入200μl溶菌酶，枪头吹打至充分混匀，37℃处理1h；离心除去上清，加入100μl btl buffer和20μlproteinase k solution涡旋混匀，55℃孵育1h，每20min涡旋混匀30s。加入5μl rnase a并上下颠倒混匀，在室温条件下孵育5min。随后离心(24℃，10000
×
g)2min，吸取上清于新1.5ml离心管中，加入220μl bdl buffer,涡旋混匀后65℃孵育10min。加入220μl无水乙醇，以最大速度涡旋20s使其充分混匀。将所有液体转移至套在收集管上的dna mini柱子内，室温离心(10000
×
g)1min，弃收集管和滤液。将dna mini柱套在新的2ml收集管上，加入500μl hbc buffer，室温离心(10000
×
g)1min，弃滤液。加700μl dna wash buffer，室温离心(10000
×
g)1min，弃滤液。重复上一步骤，弃滤液，将吸附柱放回收集管，室温离心(10000
×
g)2min，弃废液。将吸附柱转入1.5ml离心管，悬空向膜中央滴加200μlelution buffer，室温下放置3min，随后室温离心(10000
×
g)1min，收集dna溶液，-20℃保存。
[0080]
分别以上述两种方法提取的核酸为模板进行lamp扩增，实验结果如图5所示，试剂盒法对应的扩增曲线产生时间为10.3min，煮沸法为12.6min。尽管煮沸法扩增曲线产生时间晚于试剂盒法，但具有相同的扩增效果，而且将核酸提取时间由3h缩短为10min，大大缩短了整体检测时间，故优选煮沸法进行核酸提取。
[0081]
实施例4 lamp检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法
[0082]
1、引物优化
[0083]
利用primer explorer 4软件针对四环素耐药基因tetl的六个特异性区域设计3套引物，每套引物包括内引物bip/fip、外引物f3/b3以及环引物lf/lb，引物序列如表1所示。
[0084]
表1 lamp引物信息
[0085][0086]
煮沸法提取蜡样芽孢杆菌ba117的核酸作为模板，分别使用表1引物进行lamp扩增。其中lamp反应体系为：12.5μl lamp混合液(含8000u/ml bst 2.0聚合酶)、2.5μl引物混合物(外引物f3/b3各0.2μmol/l、内引物fip/bip各1.6μmol/l、环引物lf/lb各0.4μmol/l)，模板1μl，染料0.5μl，超纯水补充体积至25μl。另外，lamp反应程序为：65℃，1min，共49个循环，每个循环结束后收集荧光信号。结果如图6所示，tetl-1引物在17.1min时有扩增曲线产生，tetl-2和tetl-3引物的扩增曲线分别在33.9min和44.2min时才有扩增曲线产生，因此选择tetl-1引物用于后续实验。
[0087]
2、反应温度优化
[0088]
选择tetl-1引物进行lamp扩增，反应温度设为59℃、62℃、65℃、68℃、71℃，从而确定最佳反应温度。结果如图7所示，反应温度从59℃升高到65℃时扩增反应逐渐加快，扩增曲线产生时间从23.2min逐渐降低到15.64min，当反应温度进一步升高，扩增反应逐渐变慢，当反应温度为71℃时，扩增反应无荧光信号。故选择65℃作为本实验lamp反应温度。
[0089]
3、反应模板量优化
[0090]
使用煮沸法提取蜡样芽孢杆菌ba117的核酸，分别以1、2、3、4、5μl的粗dna为模板进行lamp扩增，获得最佳模板添加量。结果如图8所示，当模板添加量由1μl增加到4μl时，时间阈值由48.04min缩短到25.96min，继续增加模板用量，时间阈值继续缩短但不明显(p》0.05)，考虑到低浓度目标菌可能由于模板量低而无扩增产物，因此选择5μl作为实验最佳模板添加量。
[0091]
实施例5 ims-lamp检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法
[0092]
1、ims-lamp方法特异性检验
[0093]
使用20μl免疫磁珠捕获表2中芽孢杆菌，随后lamp扩增四环素耐药基因tetl，根据扩增曲线判断该方法的特异性。
[0094]
表2 检验ims-lamp方法特异性的实验菌株
[0095][0096]
结果如图9所示，只有携带四环素耐药基因tetl的蜡样芽孢杆菌ba117、蜡样芽孢杆菌s7和蜡样芽孢杆菌s11有扩增曲线，而蜡样芽孢杆菌atcc11778、蜡样芽孢杆菌ba128、地衣芽孢杆ba130、短小芽孢杆菌ba102均无扩增曲线，证明ims-lamp方法具有良好的特异性。
[0097]
2、ims-lamp方法灵敏度检验
[0098]
制备浓度为1.16
×
10
5-1.16
×
100cfu/ml的蜡样芽孢杆菌ba117菌液，使用本研究建立的ims-lamp法进行检测。结果如图10所示，该方法可检测到1.16
×
101cfu/ml的蜡样芽孢杆菌ba117。使用qpcr方法检测蜡样芽孢杆菌ba117，由下图可知最低检出限为2.12
×
102cfu/ml，故ims-lamp法灵敏度比qpcr法高10倍。qpcr方法灵敏度检验结果见图11。
[0099]
实施例6 检测人工污染乳中芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法
[0100]
将蜡样芽孢杆菌ba117菌液添加到无菌巴氏杀菌乳中，至终浓度为2.15
×
10
5-2.15
×
100cfu/ml。取20μl免疫磁珠加入人工污染乳反应1h，磁分离3min使牛奶基质和磁细菌分离，吸去上清后用50μl ddh2o复溶，煮沸法(100℃；10min)提取芽孢杆菌的核酸。磁分离3min，吸上清至lamp反应体系，于实时荧光定量pcr仪扩增并检测荧光信号。结果如图12所示，该方法可检测到巴氏杀菌乳中2.15
×
101cfu/ml的耐药蜡样芽孢杆菌ba117。
[0101]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。