免疫磁分离-环介导等温扩增快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的方法

技术特征：
1.芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的lamp检测引物组合，其特征在于，所述引物组合由引物f3、b3、fip、bip和lb组成，它们的序列分别如seq id no:1-5所示。2.用于分离和富集芽孢杆菌的免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠是将羧基磁珠经过活化后，在磁珠表面偶联芽孢杆菌特异性抗体制得的。3.根据权利要求2所述的免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠的制备方法包括：取羧基磁珠0.8-1mg于3ml pb中，磁分离10min后移去上清，重复清洗3次，复溶于3ml pb，每次复溶后超声10s；分别称取1mg的乙基二甲氨基碳化二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺，使用100μl的pb溶解，随后将两种溶液立即加入磁珠溶液，在37℃180-220rpm摇床反应1-2h；磁分离10min后移去上清，使用pb清洗2次，最后使用3ml pb复溶；取100μg芽孢杆菌特异性抗体加入上述磁珠溶液，涡旋混匀，在37℃220rpm摇床反应2h；称取40mg脱脂乳溶于400μl pb，并加入上述溶液，封闭反应4h；磁分离10min后移去上清，使用pb清洗2次，最后使用1ml复溶液复溶，4℃保存；其中，所述磁珠的平均粒径为180nm；所述pb的浓度为0.01m，ph 6.0；所述复溶液为25％蔗糖 1％脱脂乳 0.7％procllin。4.根据权利要求2所述的免疫磁珠，其特征在于，所述芽孢杆菌特异性抗体为多克隆抗体；多克隆抗体采用如下方法制得：1)制备免疫原；2)免疫动物；3)测定血清效价；4)纯化抗血清；5)抗体特异性检测。5.用于检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合和权利要求2-4任一项所述的免疫磁珠。6.免疫磁分离-环介导等温扩增快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetl的方法，其特征在于，采用权利要求5所述试剂盒进行检测；所述方法包括免疫磁分离、核酸提取和环介导等温扩增的步骤。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠的添加量为20μl。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用煮沸法提取芽孢杆菌核酸；反应条件为：100℃，10min。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进行环介导等温扩增所使用的lamp反应体系为：12.5μl lamp混合液，2.5μl引物混合物，模板5μl，染料0.5μl，超纯水补至25μl；其中，所述lamp混合液含有8000u/ml bst 2.0聚合酶；所述引物混合物含有引物f3/b3各0.2μmol/l，引物fip/bip各1.6μmol/l以及引物lf/lb各0.4μmol/l；所述lamp反应程序为：65℃，1min，共45-49个循环，每个循环结束后收集荧光信号。10.权利要求5所述试剂盒或权利要求6-9任一项所述方法在样品中芽孢杆菌检测中的应用；所述芽孢杆菌包括蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌。

技术总结
本发明提供一种免疫磁分离-环介导等温扩增快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的方法。所述方法包括将羧基磁珠与芽孢杆菌多克隆抗体偶联制备免疫磁珠，然后将免疫磁珠添加到待测样品，得到免疫磁珠-芽孢杆菌复合物(磁细菌)；通过煮沸法提取芽孢杆菌核酸；针对四环素耐药基因tetL设计特异性LAMP引物，将上述核酸加入LAMP反应体系，于实时荧光定量PCR仪扩增并检测荧光信号。本方法可以快速检测巴氏杀菌乳中芽孢杆菌的四环素耐药基因tetL，降低耐药基因水平转移带来的危害。该方法特异性强，灵敏度高，检测时间短，实现对耐药芽孢杆菌的快速检测。速检测。


技术研发人员：郝彦玲 李雪利 翟征远
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2022.01.04
技术公布日：2022/4/8