具有能够表达由癌细胞靶向区与HVEM胞外结构域形成的融合蛋白的表达盒的重组单纯疱疹病毒和其用途的制作方法

技术特征：

1.一种重组单纯疱疹病毒，其中表达癌细胞靶向结构域与HVEM胞外结构域的融合蛋白的表达盒被插入到单纯疱疹病毒的基因组中，而没有抑制所述单纯疱疹病毒增殖。

2.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述HVEM胞外结构域是包含SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列的HveA82、包含SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列的HveA87、包含SEQ ID NO:11或12的氨基酸序列的HveA102或包含SEQ ID NO:13或14的氨基酸序列的HveA107。

3.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述融合蛋白被配置成所述癌细胞靶向结构域与所述HVEM胞外结构域(HveA)经由包含1个至30个氨基酸的连接肽连接。

4.如权利要求3所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述连接肽包含至少一个选自Ser、Gly、Ala和Thr的氨基酸。

5.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述癌细胞靶向结构域是特异性地识别和结合于靶分子的结构域，所述靶分子是作为靶细胞的癌细胞的靶分子，并且

所述靶分子是所述癌细胞的表面上的抗原或受体，它只在所述癌细胞中表达，或者与正常细胞相比，在所述癌细胞中过表达。

6.如权利要求5所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述抗原或所述受体是EGFRvIII、EGFR、转移抑制素受体、受体酪氨酸激酶、HER2(人表皮生长因子受体2)、酪氨酸激酶-18-受体(c-Kit)、HGF受体c-Met、CXCR4、CCR7、内皮素-A受体、PPAR-δ(过氧化物酶体增殖物激活受体δ)、PDGFR-α(血小板衍生生长因子受体α)、CD133、CEA(癌胚抗原)、EpCAM(上皮细胞粘附分子)、GD2(双唾液酸神经节苷脂)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、GD3(双唾液酸神经节苷脂)、HLA-DR(人白细胞抗原-DR)、MUC1(粘蛋白1)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌1)、LMP1(潜伏膜蛋白1)、TRAILR2(肿瘤坏死因子相关溶解诱导配体受体)、VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)、HGFR(肝细胞生长因子受体)、CD44或CD166。

7.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述癌细胞靶向结构域是特异性地识别和结合于HER2的结构域，HER2是作为靶细胞的癌细胞的靶分子，并且

所述结构域是scFv，其中SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:2的VL以VH、连接肽和VL的顺序经由所述连接肽连接。

8.如权利要求7所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述连接肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

9.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述癌细胞靶向结构域是特异性地识别和结合于CEA的结构域，CEA是作为靶细胞的癌细胞的靶分子，并且

所述结构域是scFv，其中SEQ ID NO:3的VL和SEQ ID NO:4的VH以VL、连接肽和VH的顺序经由所述连接肽连接。

10.如权利要求9所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述连接肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

11.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述重组单纯疱疹病毒被配置成gD(糖蛋白D)的氨基酸序列的位置222处的精氨酸(R)和位置223处的苯丙氨酸(F)分别经天冬酰胺(N)和异亮氨酸(I)取代。

12.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述重组单纯疱疹病毒被配置成将所述癌细胞靶向结构域插入到作为所述病毒的糖蛋白的gB、gC、gD或gH中。

13.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述重组单纯疱疹病毒是重组HSV-1病毒、重组HSV-2病毒或HSV-1和HSV-2嵌合病毒。

14.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述重组单纯疱疹病毒是源自于HSV-1KOS病毒株的重组HSV-1。

15.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述重组单纯疱疹病毒被配置成在不抑制所述单纯疱疹病毒增殖的情况下将表达选自以下中的任一者的表达盒进一步插入到所述单纯疱疹病毒的所述基因组中：(i)细胞因子；(ii)趋化因子；(iii)免疫检查点拮抗剂；(iv)诱导免疫细胞的激活的共刺激因子；(v)抑制对癌细胞的免疫应答的TGFβ拮抗剂；(vi)乙酰肝素酶，其降解实体瘤微环境的硫酸乙酰肝素蛋白多糖；(vii)抑制血管生成受体VEGFR-2(VEGF受体-2)的功能的拮抗剂；以及(viii)前药激活酶，其将前药转变成对癌细胞具有毒性的药物。

16.如权利要求15所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述细胞因子是选自以下中的至少一种：包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-24的白细胞介素、包括IFNα、IFNβ和IFNγ的干扰素、包括TNFα、GM-CSF和G-CSF的肿瘤坏死因子，

所述趋化因子是选自以下中的至少一种：CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20和XCL-1，

所述免疫检查点是选自以下中的至少一种：PD-1(程序性细胞死亡1)、PD-L1(程序性细胞死亡配体1)、PD-L2(程序性细胞死亡配体2)、CD27(分化簇27)、CD28(分化簇28)、CD70(分化簇70)、CD80(分化簇80)、CD86(分化簇86)、CD137(分化簇137)、CD276(分化簇276)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞活化基因3)、GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白)、GITRL(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体)和CTLA-4(溶细胞性T淋巴细胞相关抗原-4)，

所述共刺激因子是选自以下中的至少一种：CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、ICOS(诱导型T细胞共刺激物)、CD3γ、CD3δ和CD3ε，并且

所述前药激活酶是选自以下中的至少一种：胞嘧啶脱氨酶、大鼠细胞色素P450(CYP2B1)、羧酸酯酶、细菌硝基还原酶和从大肠杆菌分离的PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)。

17.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述融合蛋白的所述表达盒被插入所述病毒的所述基因组中的UL3与UL4基因之间、UL26与UL27基因之间、UL37与UL38基因之间、UL48与UL49基因之间、UL53与UL54基因之间或US1与US2基因之间。

18.如权利要求15所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述表达盒被插入所述病毒的所述基因组中的UL3与UL4基因之间、UL26与UL27基因之间、UL37与UL38基因之间、UL48与UL49基因之间、UL53与UL54基因之间或US1与US2基因之间，其中所述表达盒的插入基因座与所述融合蛋白的所述表达盒的插入基因座不同。

19.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述融合蛋白按NH2/癌细胞靶向结构域/HVEM胞外结构域/COOH的顺序或与之相反的顺序配置。

20.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述融合蛋白被配置成所述癌细胞靶向结构域和所述HVEM胞外结构域经由连接肽连接，并且所述融合蛋白按NH2/癌细胞靶向结构域/HVEM胞外结构域/COOH的顺序或与之相反的顺序配置。

技术总结
本发明公开了一种重组单纯疱疹病毒，它具有能够表达由癌细胞靶向区与HVEM胞外结构域形成的融合蛋白的表达盒；以及其用途。当重组HSV感染靶细胞，即癌细胞并进入靶细胞时，随着HSV增殖，融合蛋白的衔接蛋白在细胞中被表达，使得通过细胞溶解，与增殖的HSV病毒粒子一起被释放到细胞外，或者如果衔接蛋白包括前导序列，则甚至在病毒粒子通过细胞溶解而释放前释放。被释放到细胞外的融合蛋白诱导HSV病毒粒子感染周围的表达被衔接蛋白的癌细胞靶向区识别的靶分子的癌细胞，或者提高感染效率。

技术研发人员：权熙忠;白贤贞;朱显俞;
受保护的技术使用者：吉赛尔美德公司;韩国原子力医学院;
技术研发日：2020.08.24
技术公布日：2022.04.08