一种抗体及其在抗肿瘤中的应用的制作方法

1.本发明属于肿瘤免疫治疗领域和生物技术领域，具体提供了一种抗体及其在抗肿瘤中的应用。


背景技术：

2.肿瘤因其具有难治愈性、高死亡率、低愈后临床表现，而成为威胁人类健康的最严重的疾病之一，为此研究人员先后尝试了多种肿瘤治疗手段和技术，包括手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、基因治疗等等，但是截至目前仍未找到行之有效的治疗手段。随着生物技术和免疫学研究的深入，肿瘤免疫治疗和抗肿瘤抗体受到业内的重视，自上世纪80年代以来，全球范围内已有上百种抗体被批准用于肿瘤治疗，目前每年提交申请进行临床试验的抗体更是多达数千种。这是由于抗体治疗具有较高的靶向性和选择性，且治疗效果明显，不但可有效抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，还能够免于对正常组织或细胞造成不利影响，保证患者的正常生活状态，因而在白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等造血系统肿瘤和胃癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌等实体肿瘤中都有广泛应用。
3.受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor1，ror1)是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，rtks)家族成员之一，与生长因子受体的酪氨酸激酶结构域具有很高的同源性。人ror1分子由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞外区包括一个免疫球蛋白样结构域(immunoglobulin-like domain，ig-like)、两个富含半胱氨酸卷曲的结构域(cysteine-rich domain or frizzled，crd or fzd)和一个kringle(kng)结构域；胞内区含有一个酪氨酸激酶结构域(tyrosine kinase domain，tkd)、两个富含丝氨酸/苏氨酸结构域(serine/threonines-rich domain，ser/thrd)和一个富含脯氨酸富集结构域(proline-rich domain，prd)。大量研究显示ror1在促进肿瘤的生长和转移、诱导肿瘤细胞耐药和抑制细胞凋亡等方面起到了关键性的作用，尤其是ror1正常组织中低水平表达，而高表达于多种恶性肿瘤或组织中，如慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌等等。ror1在肿瘤组织中具有高度识别性，基于这种特性，使得ror1成为一种新型的肿瘤特异性标志物和抗肿瘤靶点。
4.针对ror1靶点，已经开发出了多种肿瘤免疫疗法，包括：(1)单克隆抗体，是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，该类抗体灵敏度高，特异性强，交叉反应少，制备成本低，是目前应用最为广泛的抗体药物。目前研究人员针对ror1靶点开发了多种单克隆抗体，如jp2021522162a、wo2021202863a1、ep3842072a1、cn112384533a等公开了相应的抗ror1单克隆抗体；(2)双特异性抗体，该类抗体含有2种特异性抗原结合位点，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁应，激发具有导向性的免疫反应，进一步增强抗体治疗的靶向性，ep2984107a1公开了针对ror1和cd3靶点的双特异性抗体，可有效抵抗白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤；(3)嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)t细胞，car由两个主要的结构域组成：胞外域
和胞内信号转导区，胞外域位于细胞外部与环境相互作用，胞内信号转导区位于细胞内，将细胞外的信号传递到细胞内部，这种经过基因工程改造的t细胞能够特异性识别肿瘤细胞，而且能够利用激活的t细胞发挥强大的抗肿瘤作用，目前这种疗法在血液肿瘤上取得了较大成功，已有多款商品被批准上市。能够用于构建嵌合抗原受体的抗肿瘤靶点相当广泛，ror1也已报道被用于构建car，如wo2021202863a1、wo2020014366a1等公开了靶向ror1的car结构；(4)抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，adc)，是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中，这种组合药物既具有生物分子的靶向性，又具有化学药较强的肿瘤杀伤能力，为了降低毒副作用，往往要求生物分子具有较高的特异性，对于连接生物分子和化学药物的连接子也需要进行精确设计，以便充分发挥协同效应。针对ror1的adc药物也已经被报道，如peyman等(peyman b，mozafar m，ali hakakian.anti-ror1 scfv-endog as a novel anti-cancer therapeutic drug，apjcp，2017，19(1)：97-102)将抗ror1 scfv与免疫毒素结合，可快速导致肿瘤细胞凋亡；(5)抗体衍射物，除单克隆抗体、双特性抗体等具有经典结构的抗体之外，研究人员还针对ror1靶点开发出诸如单链片段可变抗体(scfv)、fab抗体片段等抗体衍生物，均取得了一定的治疗效果。
5.虽然以ror1为靶点的肿瘤免疫疗法已被广泛报道，但是上述药物或产品仍面临靶向性不强，易形成脱靶效益，排斥反应强烈，肿瘤免疫逃逸现象时有发生，抗肿瘤活性有待强化等技术问题。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明中提供了一种新型的抗ror1抗体，具体的该抗体包含重链可变区、和轻链可变区；所述重链可变区包含分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；所述轻链可变区包含分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
7.进一步的，该抗体所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。
8.进一步的，所述抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。
9.提供了一种编码上述抗体的核酸，以及包括所述核酸的重组表达载体和重组表达转化体。
10.提供了一种上述抗体的制备方法，包括如下步骤：培养如权利要求6所述的重组表达转化体，从培养物中获得所述抗ror1抗体。
11.提供了一种上述抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤为ror1阳性造血系统恶性肿瘤或实体瘤，具体包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性粒细胞白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性粒细胞白血病(cml)、骨髓瘤等等。
12.有益效果
13.本发明中所提供的抗ror1抗体，为单克隆抗体，其成分单一，纯度高，序列结构明显，易于通过生物发酵方式实现大规模生产，生产成本低，适用于临床应用。本发明中所述抗体与目标抗原具有较强的亲和力，能够有效识别目标抗原，特异性高，靶向性强，可有效防止脱靶效益的发生。本发明中所述抗体能够明显抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，且对多种
肿瘤细胞均有杀伤效果，在动物实验中，能够显著抑制肿瘤生长，促进免疫因子分泌，充分调动机体免疫系统，发挥协同抗肿瘤效果。
附图说明
14.图1：抗ror1抗体对血液肿瘤细胞的杀伤效应
15.图2：抗ror1抗体对卵巢癌细胞的杀伤效应
16.图3：抗ror1抗体对k562小鼠模型肿瘤体积的影响
17.图4：抗ror1抗体对k562小鼠模型ifn-γ水平
18.图5：抗ror1抗体对skov3小鼠模型肿瘤体积的影响
19.图6：抗ror1抗体对skov3小鼠模型vegf水平
具体实施方式
20.实施例1抗ror1抗体的筛选
21.本发明中通过融合杂交瘤技术筛选并获得靶向ror1的鼠单克隆抗体。
22.1.1实验小鼠免疫
23.使用重组人ror1蛋白免疫小鼠，具体步骤包括：(1)选择6-8周龄balb/c雌性小鼠共20只，正常饲养3天，使其适应实验环境；(2)将ror1蛋白与等体积弗氏完全佐剂进行乳化，共振30min，使其充分混合，皮下多点注射于小鼠体内；(3)首次免疫两周后，进行小鼠效价检测，选择效价高的免疫小鼠进行腹腔注射冲击免疫；(4)将ror1蛋白与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，共振30min，使其充分混合，腹腔注射小鼠；(5)重复(4)步骤3次，强化免疫应激反应。
24.1.2细胞融合
25.选取血液中抗ror1抗体效价高的小鼠，脱颈处死，在无菌工作台上取小鼠脾脏，使用无菌pbs清洗3次；使用注射器向脾脏中注射dmem培养液，反复冲洗收获脾脏细胞；将获得的脾脏细胞，1000rpm 4℃离心5min，然后使用dmem培养液重悬细胞；将获得的脾脏细胞与对数生长期的小鼠骨髓瘤细sp2/0按1:1比例混合，使用peg催化法进行细胞融合；细胞融合后，将细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃培养箱进行培养。
26.1.3阳性克隆的筛选和保藏
27.细胞融合10天后，取细胞上清，elisa法检测阳性克隆，将获得的阳性克隆杂交瘤细胞扩大培养，然后收集细胞保藏于-80℃冰箱中，进行后续实验。
28.1.4抗ror1抗体筛选
29.复苏和培养阳性杂交瘤细胞，以2
×
106个细胞/ml将杂交瘤细胞接种到基于透析的生物反应器中，每周收获一次含有抗体的上清液。借助fplc使用protein a(购自pharmacia公司)纯化小鼠单克隆抗体。通过bca试剂盒或a280吸光值来确定抗体浓度，抗体纯度通过sec(尺寸排阻色谱)确定，并通过sds(十二烷基硫酸钠)凝胶电泳和考马斯亮蓝染色来检查纯度，经检测抗体纯度符合后续实验要求。
30.使用fortebio生物大分子相互作用仪(购自美国艾瑞生物公司)，检测抗ror1抗体与人ror1的亲和力。本发明经过多轮筛选，获得了多个备选抗体，其中与目标抗原亲和力较高的部分抗体亲和力数据结果如表1所示。
31.表1抗ror1抗体与人ror1亲和力
[0032][0033][0034]
为了使得抗ror1抗体能够与靶标进行高效特异性结合，降低脱靶现象发生的几率，本发明中选用亲和力最高的#66号抗体进行后续实验。
[0035]
1.5抗ror1抗体序列测定
[0036]
培养66号抗体对于的杂交瘤细胞株，采用trizol法提取rna，反转录制备cdna，用设计合成的小鼠igg特异引物组测序。结果显示，该抗体重链可变区包含分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；所述轻链可变区包含分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。
[0037]
实施例2抗ror1抗体的制备
[0038]
根据测序结果，设计适当引物序列，通过重叠延伸pcr反应分别获得抗体的重链和轻链可变区核苷酸序列。通过基因重组方式，将抗体轻重链核苷酸序列构建分别到真核表达载体pcdna3.4-g418和pcdna3.4-dhfr中。利用电转染方法将上述真核表达载体导入cho细胞中，在5l生物反应器中采用分批补料方式培养cho细胞，每天检测细胞密度和活力，当细胞活力降至75％以下或培养周期达到14天，离心收集细胞培养上清，采用hplc方法测定细胞上清抗体表达水平。采用protein a(购自pharmacia公司)亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化所述抗体，并用sds-page电泳证明，所得产物纯度大于90％，然后将亲和层析的产物再次经过分子筛层析，获得纯度》98％的样品。
[0039]
实施例3抗ror1抗体对肿瘤细胞的杀伤效应
[0040]
据报道，ror1抗体对多种血液肿瘤和实体肿瘤具有抑制作用，为了验证本发明所述抗体的生理活性，选用多种血液瘤细胞系和实体瘤细胞进行考察。
[0041]
3.1抗ror1抗体对血液肿瘤细胞的杀伤效应
[0042]
多种造血系统肿瘤中均表达ror1，本发明中选用nb4(急性髓系白血病细胞系)、k562(慢性髓系白血病细胞系)、raji(淋巴瘤细胞系)和u266(多发性骨髓瘤细胞系)作为研究对象，通过cck-8法检测杀伤作用。具体方法包括：
[0043]
(1)将细胞接种于96孔板，细胞接种量为2
×
104/孔，每组设置3个复孔；
[0044]
(2)细胞生长至对数生长期后，更换新鲜培养基；
[0045]
(3)每孔加入10μg/ml的抗ror1抗体，37℃细胞培养箱孵育12、24、36小时；
[0046]
(4)每孔加入cck-8(dojindo，日本)试剂(20μl/孔)，37℃细胞培养箱孵育2小时后，450nm处测定吸光度；
[0047]
(5)根据cck-8试剂盒(dojindo，日本)说明书，统计活细胞数目并推算杀伤效率：杀伤率＝[((t e)-t&e)/t]
×
100％
[0048]
其中，t代表活的靶细胞数量；e代表活的效应细胞数量；则t e等于活的靶细胞和效应细胞的总数；t&e代表靶细胞经效应细胞杀伤后的活细胞数量。
[0049]
如图1所示，本发明所提供的抗体对于多种血液肿瘤细胞均有抑制作用，其中对于nb4、k562、raji的杀伤效应最强，处理24小时候可达到约50％的杀伤率，处理36小时后这一效果得到强化；但对于u266却展示出了中等杀伤作用，且处理时间从24小时延长至36小时后，杀伤率未见明显增强，上述结果说明，本发明所提供的抗体对于白血病和淋巴瘤细胞具有较强的抑制作用，而对于骨髓瘤细胞具有中等抑制效果，说明该抗体可用于治疗包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤在内的多种造血系统恶性肿瘤。
[0050]
3.2抗ror1抗体对卵巢癌细胞的杀伤效应
[0051]
本发明中选用caov3、es2、skov3和hey等卵巢癌细胞系作为实验对象，研究本发明中所提供的抗体对卵巢癌的杀伤作用。仍采用cck-8法检测和计算肿瘤细胞杀伤率，实验步骤参照3.1节进行。
[0052]
如图2所示，本发明所提供的抗ror1抗体对于多种卵巢癌细胞也展现出了不同的杀伤效果，其中对于skov3和caov3的杀伤效果最强，作用36小时后可以达到超过50％的杀伤率，而对于es2和hey的杀伤作用次之。与作用血液肿瘤细胞不同的是，本发明所提供的抗体对于实体肿瘤发生杀伤作用的处理时间似乎更长，例如对于caov3细胞，在24小时杀伤作用仍较弱，但在36小时却得到了显著增强。这种结果似乎与实体肿瘤的生理特性有关，有研究认为实体肿瘤可分泌更多的细胞外基质，延缓或阻碍抗体分子浸润，从而延长了响应时间。
[0053]
实施例4抗ror1抗体对血液肿瘤的体内抑制效应
[0054]
为了进一步验证本发明中所提供的抗体的抗肿瘤效果，本节中主要研究本发明所提供的抗ror1抗体在小鼠体内的抗肿瘤作用，选择采用k562细胞构建动物模型。
[0055]
4.1动物模型制备与治疗
[0056]
采用c57bl/6小鼠，6-8周龄，均为雌性，体重18-23g。实验动物在spf级恒温恒湿房间内饲养5天，适应环境；在37℃5％co2环境中培养k562细胞，每2-3天进行传代培养，调整细胞至对数生长期；离心收集细胞，无菌生理盐水重悬细胞，调整浓度为1
×
107个/ml，剃去c57bl/6小鼠右侧腹部体毛，将100μl细胞悬液注射入小鼠右前侧胁部皮下。每日观测肿瘤生长情况，当肿瘤直径达到3mm和5mm之间时进行后续实验。
[0057]
造模成功后，将实验动物随机分为两组，每周注射抗ror1抗体(10mg/kg)和等体积的生理盐水，每周检测肿瘤体积，治疗4周后尾静脉取血，留存血液样本，处死小鼠。
[0058]
4.2肿瘤体积
[0059]
实验动物给药后每周检测肿瘤体积变化，使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，肿瘤体积(l x w2)/2估算，其中l是长度或最长尺寸，w是肿瘤的宽度。
[0060]
结果如图3所示，使用抗ror1抗体治疗，可有效抑制白血病细胞在小鼠体内的生长速度，明显降低肿瘤体积，治疗4周后，治疗组肿瘤体积约为对照组的50％，说明本发明所提
供的抗ror1抗体可限制抑制血液肿瘤的体内增殖过程。
[0061]
4.3抗ror1抗体对血液肿瘤模型中炎症因子表达的影响
[0062]
血液肿瘤的发生发展受多种因素影响，抗体发挥抗肿瘤作用与细胞因子分泌、免疫细胞活化、缺氧环境形成和肿瘤微环境变化等多种因素相关，其中在抗体治疗过程中，免疫因子的表达水平发生变化，可介导一系列免疫机制，发挥协同抗肿瘤作用。因此，本发明中为初步探讨抗ror1抗体的作用机制，检测了治疗后小鼠血浆中ifn-γ水平变化。
[0063]
治疗4周后尾静脉取血，离心收集血浆，使用elisa法检测血浆中的ifn-γ浓度，结果如图4所示。使用抗ror1抗体治疗后，可显著提高血液中ifn-γ表达水平，而ifn-γ属于ⅱ型干扰素中的一种，具有较高的抗病毒活性和广泛的免疫调节作用，提示本发明中的抗ror1抗体能够通过激活ifn-γ表达，诱导机体内多种免疫途径，进而发挥协同抗肿瘤作用。
[0064]
实施例5抗ror1抗体对卵巢癌的体内抑制效应
[0065]
为了进一步验证本发明中所提供抗体的抗肿瘤效果，本节中主要研究本发明所提供的抗ror1抗体在小鼠体内的抗肿瘤作用，选择采用skov3细胞构建动物模型。
[0066]
5.1动物模型制备与治疗
[0067]
采用c57bl/6小鼠，6-8周龄，均为雌性，体重18-23g。实验动物在spf级恒温恒湿房间内饲养5天，适应环境；在37℃5％co2环境中培养skov3细胞，每2-3天进行传代培养，调整细胞至对数生长期；离心收集细胞，无菌生理盐水重悬细胞，调整浓度为1
×
107个/ml，剃去c57bl/6小鼠右侧腹部体毛，将100μl细胞悬液注射入小鼠右前侧胁部皮下。每日观测肿瘤生长情况，当肿瘤直径达到3mm和5mm之间时进行后续实验。
[0068]
造模成功后，将实验动物随机分为两组，每周注射抗ror1抗体(10mg/kg)和等体积的生理盐水，每周检测肿瘤体积，治疗4周后尾静脉取血，留存血液样本，处死小鼠。
[0069]
5.2肿瘤体积
[0070]
实验动物给药后每周检测肿瘤体积变化，使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，肿瘤体积(l x w2)/2估算，其中l是长度或最长尺寸，w是肿瘤的宽度。
[0071]
结果如图5所示，使用抗ror1抗体治疗，可有效抑制卵巢癌细胞在小鼠体内的生长速度，明显降低肿瘤体积，治疗4周后，治疗组肿瘤体积约为对照组的50％；值得注意的是，似乎抗ror1抗体在体内的起效时间也晚于血液瘤，如血液瘤模型中治疗两周后，治疗组的肿瘤生长速度明显小于对照组，而在实体瘤模型中，治疗三周后这一趋势才逐渐明显，与在细胞实验的结果趋势一致。
[0072]
5.3抗ror1抗体对血液肿瘤模型中炎症因子表达的影响
[0073]
与存在于体液环境中的造血系统肿瘤不同，实体肿瘤往往不能随血液流动，因此养料的供给对肿瘤细胞的生长至关重要，据报道在实体肿瘤的发生过程中常常伴随着血管的异常增殖，在这一过程中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)发挥了重要作用。因此，本发明中为初步探讨抗ror1抗体的作用机制，检测了治疗后小鼠血浆中vegf水平变化。
[0074]
治疗4周后尾静脉取血，离心收集血浆，使用elisa法检测血浆中的vegf浓度，结果如图6所示。使用抗ror1抗体治疗后，可显著抑制vegf的表达，使得肿瘤组织难以通过血液循环系统获得足够的营养成分，从而限制其生长，当然抗ror1抗体发挥抗肿瘤作用的机制是多方面的，我们推测在实体肿瘤模型中，抗ror1抗体也可能通过调节免疫因子水平和激
活t细胞等免疫细胞，共同发挥抗肿瘤作用。
[0075]
虽然本发明参考其示例性的实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。