对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用，更具体的，本发明涉及对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法、构建突变受精卵细胞的方法、构建纯合hdr受精卵细胞的方法、构建致死基因单缺失受精卵细胞的方法、构建突变动物的方法以及对动物受精卵进行透明带弱化处理的方法。


背景技术：

2.基因工程小鼠在生物学研究中具有重要意义，据《2018年英国活体动物科学程序年度统计》报导的180万例实验程序，60％的程序以小鼠为实验动物；172万例创造和繁育基因工程动物实验程序中，87％的程序是为培育基因工程小鼠。据报道，中国对模拟人类疾病的动物模型需求激增，基因工程小鼠市场需求快速增长，2022年市场需求将突破15.9亿美元。
3.基因工程小鼠需求庞大，但目前对小鼠胚胎进行基因编辑的主流技术为显微注射技术，其通量低，效率低，成本高。同时，构建多基因敲除小鼠模型，成本高，周期长，成功率低，严重限制了小鼠模型的应用。
4.基于电转染的胚胎基因编辑技术近几年刚刚出现，依然处于研究摸索阶段。因此，现有基于电转染的胚胎基因编辑技术仍有待改进。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有能够有效地将基因编辑系统电转染进入动物胚胎，并实现高效同源重组的手段。
6.本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
7.发明人在研究过程中发现，现有的受精卵细胞基因编辑技术效率不稳定，通常只在一到两个单基因上进行了测试，没有稳定地在不同的基因位点上实现高效率的单基因编辑，没有高效的获取纯合的突变受精卵细胞，而且无法实现多基因编辑，这在很大程度上限制了对应稀缺小鼠模型的应用。本发明的发明人在深入分析后，意外发现在进行小鼠胚胎电转染时，用于基因编辑的外源基因导入小鼠胚胎的时间节点对于最终的电转染效率至关重要，从而完成了本发明提出一种能够高效实现电转染外源物质进入受精卵细胞的方法，进一步可以稳定地在不同的基因位点上实现高效率的基因编辑，而高效地获取重组受精卵细胞，这在很大程度上促进了对应稀缺小鼠模型的应用。
8.由此，本发明提出了一套高效稳定的动物受精卵细胞(在本文中有时也称为“胚胎”)电转染基因编辑系统，根据本发明的实施例，利用该系统能够增加通量、提高基因编辑敲除效率、提高杂合hdr胚胎比例、提高纯合hdr胚胎比例、实现多基因编辑，从而降低基因工程小鼠的培育成本，为高效培育基因工程小鼠奠定良好基础。
9.在本发明的第一方面，本发明提出了一种对动物受精卵进行电转染基因编辑的方
法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)对处于s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，其中，所述外源物质包括cas9蛋白和sgrna。
10.根据本发明的实施例，发明人通过大量实验意外地发现，动物受精卵进行电转染基因编辑时，动物受精卵细胞透明带弱化处理及所处的细胞周期阶段对于电转染基因编辑的效率影响至关重要，其中，所述透明带弱化处理是通过使所述动物受精卵细胞与台式液接触4～10秒钟，以cas9蛋白和sgrna混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率。
11.当采用s期以前的动物受精卵细胞时，以cas9蛋白和sgrna混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率。
12.本发明的发明人发现，对于动物胚胎，尤其是小鼠胚胎而言，进行透明带弱化处理，具体的是，将动物胚胎与台式液进行接触，该步骤的处理时间长短对于后续电转染的效率以及得到纯合hdr突变体的效率是至关重要的，如果接触的时间过短，则会造成透明带的弱化程度不足，如果时间过长，则会造成透明带弱化程度过高，会影响胚胎的存活。另外，发明人还通过大量实验发现，通过8次脉冲完成电穿孔转染(在本文中“电穿孔转染”与“电转染”可以互换使用)能够有效地提高转染效率，并且维持胚胎的生存活力，尤其是实现多基因的高效率基因编辑。根据本发明的实施例，按照上述步骤处理的动物受精卵，其电转染效率明显得到提高。
13.在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建突变受精卵细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)对处于s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，其中，所述外源物质包括cas9蛋白和至少一种sgrna，基于重量，所述cas9蛋白与所述至少一种sgrna重量的比例为2～6：1。
14.如前所述，根据本发明的实施例，采用s期以前的动物受精卵细胞时，并且以cas9蛋白和sgrna混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率，从而可以进一步提高构建突变受精卵细胞的效率。
15.在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建突变受精卵细胞的方法，所述突变受精卵细胞为纯合hdr受精卵细胞，根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)对处于s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，以便获得经过转染的受精卵细胞，其中，所述外源物质包括cas9蛋白、至少一种sgrna和至少一种与所述sgrna对应的ssodn，其中，基于重量，所述cas9蛋白与所述至少一种sgrna重量的比例为2～6：1；和(3)从所述经过转染的受精卵细胞中选择所述纯合hdr受精卵细胞。纯合hdr受精卵细胞的比例能够达到20％。
16.如前所述，根据本发明的实施例，采用s期以前的动物受精卵细胞时，并且以cas9蛋白和sgrna混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率，从而可以进一步提高构建突变受精卵细胞的效率。另外意外地发现，纯合hdr受精卵细胞的比例能够达到20％。
17.在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建突变受精卵细胞的方法，所述突变受精卵细胞为致死基因单缺失受精卵细胞。根据本发明的实施例，所述方法包括(1)对处于
s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，以便获得经过转染的受精卵细胞，其中，所述外源物质包括cas9蛋白、至少一种sgrna和至少一种与所述sgrna对应的ssodn，其中，基于重量，所述cas9蛋白与所述至少一种sgrna重量的比例为2～6：1；和(3)从所述经过转染的受精卵细胞中选择所述致死基因单缺失受精卵细胞，其中，所述至少一种sgrna和所述ssodn是基于致死基因确定的。
18.如前所述，根据本发明的实施例，采用s期以前的动物受精卵细胞时，并且以cas9蛋白和sgrna混合物的方式进行电转染，能够提高构建突变受精卵细胞的效率。另外根据本发明的实施例，意外地发现，在所得到的经过转染的受精卵细胞中，存在单缺失的致死基因比例高达54％，从而，能够有效地获得具有单缺失致死基因的受精卵细胞，进一步，可以在受精卵细胞存活的状态下研究该致死基因的生物活性。
19.在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建突变动物的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：(a)按照前面所述的方法，构建突变受精卵细胞；和(b)培育所述突变受精卵细胞，以便获得所述突变动物。
20.如前所述，在前面获得纯合hdr受精卵细胞或者致死基因单缺失的受精卵细胞基础上，可以进一步获得携带这些基因突变的动物。由此，这些动物可以用于进行基因研究或者药物筛选。
21.在本发明的第六方面，本发明提出了一种构建动物模型的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：(i)基于预定疾病类型，确定与疾病关联基因相关的sgrna以及任选的ssodn；(ii)利用所sgrna和cas9蛋白，按照前面所述的方法构建动物模型。
22.由此，根据本发明的实施例，可以针对已知的疾病关联基因进行构建相应的突变动物，从而可以作为用于该疾病研究或者药物筛选的动物模型。
23.在本发明的第七方面，本发明提出按照前面所述的方法构建的突变动物或动物模型在筛选药物中的用途。
24.在本发明的第八方面，本发明提出了一种对动物受精卵进行透明带弱化处理的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：将处于s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理，所述透明带弱化处理是通过使所述动物受精卵细胞与台式液接触4～10秒钟进行的。
25.本发明的发明人发现，对于动物胚胎，尤其是小鼠胚胎而言，进行透明带弱化处理，具体的是，将动物胚胎与台式液进行接触，该步骤的处理时间长短对于后续电转染的效率以及得到纯合hdr突变体的效率是至关重要的，如果接触的时间过短，则会造成透明带的弱化程度不足，如果时间过长，则会造成透明带弱化程度过高，会影响胚胎的存活。另外，发明人还通过大量实验发现，通过8次脉冲完成电穿孔转染(在本文中“电穿孔转染”与“电转染”可以互换使用)能够有效地提高转染效率，并且维持胚胎的生存活力，尤其是实现多基因的高效率基因编辑。根据本发明的实施例，按照上述步骤处理的动物受精卵，其电转染效率明显得到提高。
26.需要说明的是，在不同方面所描述的方案、特征和优点，除非特别说明，是可以互相适用的，在此不再赘述。
附图说明
27.图1显示了根据本发明的一个实施例利用设计的针对小鼠胚胎emx1基因电转染基因编辑后一代测序的结果，有套峰的地方就说明存在不同基因组序列，说明产生了基因编辑。
28.图2显示了根据本发明的一个实施例纯合hdr突变体一代测序结果图，其中，红色矩形所示区域，碱基全部变为和ssodn相同的突变，并且无杂峰出现，编辑的靶标基因为emx1，sgrna的向导序列为gagtctgagcagaagaagaa，对应的ssodn序列为gagtccgagcagaagaaaaa。ssodn总长为130nt，其余碱基序列与小鼠基因组相同。
具体实施方式
29.下面详细描述本发明的实施例，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。其中，在本文中所使用的试剂除非特别说明，均为本领域中可以商业购买的。
30.术语定义
31.除非特别说明，本发明中所使用的术语为本领域中公知的含义，其中，
32.在文本中使用的术语“受精卵”或者“受精卵细胞”是指精子和卵子进行受精并且卵原核和精原核的染色体融合在一起之后，但并未进行分裂的合子细胞，在本文中由于采集受精卵细胞是按照采集胚胎的方式进行采集的，因此，有时也会称这个阶段的受精卵细胞为“胚胎”。
33.在本文中使用的术语“电转染”有时也称为“电穿孔(electroporation)”，是通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。在本文中，通过该技术将外源物质导入到受精卵细胞内部，主要的外源物质是包括cas9蛋白和sgrna，另外根据情况需要还可以添加ssodn。其中，cas9蛋白发挥分子剪刀的作用，sgrna也称为小向导rna(small guide rna，sgrna)发挥引导作用，可以将cas9蛋白导引至靶基因使其发挥分子剪刀的功能。单链寡聚核苷酸(single
‑
stranded oligodeoxyribonucleotide，ssodn)作为同源重组修复模板可以促进同源重组修复以实现基因序列的替换。本领域技术人员可以采用常规的电转染设备进行电转染处理。
34.在本文中使用的术语“基因编辑”是指是能对生物体基因组特定目标基因(也称为“靶基因”或者“靶标”)进行修饰(包括但不限于插入、删除或者替换)，根据本发明的实施例，在sgrna(识别目标基因)的引导下，采用作为“分子剪刀”的核酸酶cas9，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(dsb)，进一步诱导生物体通过非同源末端连接(nhej)或同源重组(hr)(也称为“hdr”(homology directed repair，同源介导的双链dna修复))来修复dsb，从而实现特定的修饰，其中，为了提高同源重组介导的双链dna修复(hdr)的效率会添加额外的基于靶基因序列设计的单链寡聚核苷酸(single
‑
stranded oligodeoxyribonucleotide，ssodn)作为同源重组修复模板。
35.在本文中所使用的术语“致死基因”是指在在对二倍体细胞的两个等位基因均进行突变或者敲除时，会造成细胞死亡的基因。根据本发明的实施例，可以采用的“致死基因”包括但不限于pkd1、foxg1、chd2、virma、c
‑
myc、p38α和dutpase的至少之一。需要说明的是，在对细胞进行基因编辑时，如果二倍体细胞致死基因的两个等位基因均被敲除或者突变，
极大可能会造成细胞死亡，因此在进行功能研究时，需要进行单敲除，即敲除一个等位基因上的致死基因，由此，可以确保致死基因被进行基因编辑后，所得到的的重组细胞尤其是受精卵细胞仍能够存活。
36.在本文中所使用的术语“透明带弱化处理”是指，与未经过处理的胚胎(或者受精卵细胞)相比，其透明带至少一部分被去除。根据本发明的实施例，透明带是卵母细胞质膜周围的糖蛋白层，可能会形成屏障，会阻止crispr/cas9成分通过电穿孔进入受精卵，从而会影响后续基因编辑的效率，另外，对透明带的过度处理又可能会影响受精卵细胞的生存状态。根据本发明的实施例，可以使用的台式液进行透明带弱化处理。
37.在本文中所使用的术语“s期”和“g1”期是指受精卵细胞在细胞周期中所处于的位置。细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期(m期)两个阶段。其中，间期又分为三期、即dna合成前期(g1期)、dna合成期(s期)与dna合成后期(g2期)。g1期为从有丝分裂到dna复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成rna和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成rna和蛋白质，细胞体积显著增大。s期为dna合成期，在此期，除了合成dna外，同时还要合成组蛋白。dna复制所需要的酶都在这一时期合成。g2期为dna合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，dna合成终止，大量合成rna及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。在本文中所使用的术语“s期之前”是指受精卵细胞处于s期或者g1期甚至g0期(即停止分裂状态的时期，对于受精卵细胞比较少见)，其中，优选g1期。本领域技术人员可以通过常规的手段，例如显微镜下观察形态变化或者染色手段来区分受精卵细胞所处于的周期阶段。另外，根据本发明发明人的多次试验发现，对于小鼠而言，雌雄同笼次日10点之前优选9点半之前，可以确保动物受精卵处于s期之前，通常为处于g1期。
38.在本文中使用的术语“台式液”tyrode's solution属于平衡盐溶液的一种，主要由氯化钠、磷酸盐、氯化钙、葡萄糖等组成，不含hepes。根据本发明的一些实施例，1000ml台式液含有nacl 8.0g、10％kcl 2.0ml(0.2g)、10％mgso4.7h2o 2.6ml(0.26g)、5％nah2po4.2h2o 1.3ml(0.065g)、nahco
3 1.0g、1m cacl
2 1.8ml(0.2g)和葡萄糖1.0g。
39.在本文中所使用的术语“用量”如无特别说明指的是重量单位。
40.在本文中使用的术语“突变受精卵细胞”的含义是，受精卵细胞的基因组与未突变的受精卵细胞的基因组(或者野生型基因组)相比，存在至少一处变异，该变异可以一个或者多个碱基甚至核苷酸片段的插入、缺失和/或替换，从而可以对相应基因的功能进行调节或者改变，例如实现基因的表达上调或下调、新基因的敲入或者野生型基因的编码或者非编码序列的改变、野生型基因的敲除等。有时“突变细胞”也称为“重组细胞”，是可以互换使用的。
41.在本文中使用的术语“纯合”是指对于二倍体，两个同源染色体具有相同的等位基因或者突变，例如对于一对同源染色体上的一条染色体敲除了基因a，另一条染色体也敲除了基因a，则该细胞针对基因a是“纯合”突变的。
42.在本文中使用的术语“纯合hdr”是指一对同源染色体的特定位置均发生了“hdr”(homology directed repair，同源介导的双链dna修复)。由此，该特定位置所对应的基因发生了相同的功能变化，例如上调、下调、氨基酸突变或者功能缺失。
43.在本文中使用的术语“单缺失”是指针对一对同源染色体的特定基因，一条染色体
上的该特定基因的功能发生变化，例如功能丧失或者表达量比野生型下降，另一条染色体上的该基因的功能没有发生变化。如前所述，对于致死基因而言，如果二倍体细胞致死基因的两个等位基因均被敲除或者突变，极大可能会造成细胞死亡，因此在进行功能研究时，需要进行单敲除，即敲除一个等位基因上的致死基因，由此，可以确保致死基因被进行基因编辑后，所得到的的重组细胞尤其是受精卵细胞仍能够存活。
44.对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法
45.本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
46.发明人在研究过程中发现，现有的通过基因编辑获得同源定向修复(hdr)受精卵细胞的效率比较低或基因编辑效率不稳定，通常只在一到两个单基因上进行了测试，没有稳定地在不同的基因位点上实现高效率的单基因编辑，而且没有高效的获取纯合的突变受精卵细胞，这在很大程度上限制了对应稀缺小鼠模型的应用。本发明的发明人在深入分析后，意外发现在进行小鼠胚胎电转染用于基因编辑的外源基因的处理时机对于最终的电转染效率至关重要，从而完成了本发明提出一种能够高效实现电转染外源物质进入受精卵细胞的方法，进一步可以稳定地在不同的基因位点上实现高效率的基因编辑，而高效地获取重组受精卵细胞，这在很大程度上促进了对应稀缺小鼠模型的应用。
47.由此，本发明提出了一套高效稳定的动物受精卵细胞(在本文中有时也称为“胚胎”)电转染基因编辑系统，根据本发明的实施例，利用该系统能够增加通量、提高基因编辑效率、提高重组受精卵细胞的比例、实现多基因编辑，从而降低基因工程小鼠的培育成本，为高效培育基因工程小鼠奠定良好基础。
48.在本发明的第一方面，本发明提出了一种对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
49.首先，对处于s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理。
50.本发明的发明人发现，在电转染引入外源物质的过程中，动物受精卵细胞透明带的存在会阻碍外源物质进入受精卵细胞。因此，需要通过对透明带进行弱化处理，从而能够有助于外源物质进入受精卵细胞。
51.对于动物胚胎，尤其是小鼠胚胎而言，进行透明带弱化处理，根据本发明的实施例，通过将动物胚胎与台式液进行接触，该步骤的处理时间长短对于后续电转染的效率是至关重要的，如果接触的时间过短，则会造成透明带的弱化程度不足，降低基因编辑效率，如果时间过长，则会造成透明带弱化程度过高，会影响胚胎的存活。
52.根据本发明的实施例，所述透明带弱化处理是通过使所述动物受精卵细胞与台式液接触0～40秒钟进行的。优选的，根据本发明的实施例，所述透明带弱化处理是通过使所述动物受精卵细胞与台式液接触5秒钟进行的。由此，可以确保在提高电转染效率的同时，能够不影响胚胎或者受精卵细胞在电转染后的存活能力。
53.根据本发明的实施例，所述动物为哺乳动物。根据本发明的实施例，所述动物包括啮齿类动物、犬、猫、兔、猴。根据本发明的实施例，所动物包括小鼠和大鼠。
54.如前所述，根据本发明的实施例，所述动物受精卵处于g1期。根据本发明的实施例，在受精后10小时内，完成所述电穿孔转染处理。
55.根据本发明的实施例，所述动物为啮齿科动物，可选的，所述啮齿科动物包括小鼠、大鼠。根据本发明的实施例，所述动物受精卵细胞处于s期以前。
56.根据本发明的实施例，发明人通过大量实验意外发现，进行电转染处理的时间非常重要，根据本发明的实施例，当动物胚胎处于s期之前，优选g1期时，通过电转染能够有效地提高获得基因突变的效率，尤其是多基因的纯合突变的效率。如前所述，在实践操作中，可以按照在雌雄同笼次日10点之前启动转染处理，从而电转染处理可以在10点之前结束，例如9点之前，8点之前，7点之前，6点之前等，其中，优选的是，在9点至9点半进行的。发明人认为可能的原因是鼠胚胎从受精到进入s期，需10个小时。可以默认小鼠交配、受精的实际时间，但通常认为小鼠的交配时间在午夜12点，因此，发明人认为需要需在合笼后的次日上午10时之前完成从胚胎采集到电转染的一系列操作。需要说明的是，根据本发明的实施例，当采用其他手段，例如注射法时，通常操作效率低，对于超过100个小鼠胚胎，将很难在10点之前结束全部转染操作，并且由于操作的持续时间久，所以很难能够保证转染处理的均一性和同步性。
57.根据本发明的实施例，本发明还提出了一种对动物受精卵进行透明带弱化处理的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：将处于s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理，所述透明带弱化处理是通过使所述动物受精卵细胞与台式液接触4～10秒钟进行的。
58.本发明的发明人发现，对于动物胚胎，尤其是小鼠胚胎而言，进行透明带弱化处理，具体的是，将动物胚胎与台式液进行接触，该步骤的处理时间长短对于后续电转染的效率是至关重要的，如果接触的时间过短，则会造成透明带的弱化程度不足，降低基因编辑效率，如果时间过长，则会造成透明带弱化程度过高，会影响胚胎的存活。另外，发明人还通过大量实验发现，通过8次脉冲完成电穿孔转染(在本文中“电穿孔转染”与“电转染”可以互换使用)能够有效地提高转染效率，并且维持胚胎的生存活力，尤其是实现多基因的高效率基因编辑。根据本发明的实施例，按照上述步骤处理的动物受精卵，其电转染效率明显得到提高。
59.据本发明的实施例，步骤(1)中的弱化处理通过调整实验时间(早9:00
‑
9:30开始做电转染实验)，发现能得到纯合hdr突变体。图1显示了利用设计的针对小鼠胚胎emx1基因电转染基因编辑后一代测序的结果，有套峰的地方就说明存在不同基因组序列，说明产生了基因编辑。测序结果如图2所示：红色矩形所示区域，碱基全部变为和ssodn相同的突变，并且无杂峰出现。图2显示了根据本发明的一个实施例纯合hdr突变体一代测序结果图，其中，灰色矩形所示区域，碱基全部变为和ssodn相同的突变，并且无杂峰出现，编辑的靶标基因为emx1，sgrna的向导序列为gagtctgagcagaagaagaa，对应的ssodn序列为gagtccgagcagaagaaaaa。ssodn总长为130nt，其余碱基序列与小鼠基因组相同。
60.为进一步验证电转染时间对纯合hdr突变体比例的影响，发明人将同一批小鼠中获取的胚胎，在几个不同时间段分别进行电转染实验。除电转染起止时间不同外，其余条件均相同。结果如下表所示。
61.表1：电转染时间对纯合hdr突变体比例的影响
62.63.可以看出，控制电转染时间对提高纯合hdr突变体的比例至关重要：早10时之前完成电转染，能得到纯合hdr突变体，且纯合hdr突变体所占比例较大；早10时之后开始电转染实验，几乎无法得到纯合hdr突变体。
64.之后，发明人又在zswim3、tyr以及致死基因foxg1测试了胚胎电转染，电转染均在十点之前完成，三个基因hdr比例如下表。结果发现，在十点之前结束胚胎电转染后zswim3基因hdr比例为23％，tyr基因hdr比例为16％，foxg1基因hdr比例为30.8％，显著高于已发表文章中的5％。
65.表2：不同基因编辑位点纯合hdr突变体比例
[0066][0067][0068]
需要说明的是，根据本发明的实施例，当采用其他手段，例如注射法时，通常操作效率低，对于超过100个小鼠胚胎，将很难在10点之前结束全部转染操作，并且由于操作的持续时间久，所以很难能够保证转染处理的均一性和同步性。而对于电转染，则可以很轻松地通过一次或者几次电穿孔处理同事完成数百个小鼠胚胎(受精卵细胞)的转染。
[0069]
接下来，将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，其中，所述外源物质包括cas9蛋白和sgrna。
[0070]
根据本发明的实施例，按照重量，所述外源物质中所述cas9蛋白的用量是sgrna用量的2～6倍。优选的，根据本发明的实施例，按照重量，所述外源物质中所述cas9蛋白的用量是sgrna用量的4倍。在利用cas9技术进行基因编辑操作时，外源cas9和sgrna的提供形式和相应的使用量比例，对于转染效率和后续基因编辑的效率非常重要，本领域技术人员也是一直在探索。本发明的发明人发现当cas9以蛋白的形式，sgrna以rna分子的形式提供，并且其用量重量比为2～6：1时，其基因编辑的效率将得到显著提高。
[0071]
如前所述，本领域技术人员能够理解的是，为了促进hdr的发生，还可以进一步提供ssodna分子。由此，根据本发明的实施例，所述外源物质包括：至少一种sgrna，所述至少一种sgrna分别针对不同的靶点；和至少一种与所述sgrna对应的ssodn，所述ssodn的序列是基于所述靶点两侧预定长度而确定的。本领域技术人员可以根据目的基因选择相应的sgrna和ssodna，在此不在赘述。
[0072]
发明人发现，利用本发明的技术，能够实现同时进行多个基因的基因编辑。根据本发明的实施例，可以实施最多12个基因的同时编辑。根据本发明的实施例，所述外源物质包括2～12种sgrna，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种sgrna。根据本发明的实施例，基于10微升的电转染预混液，每种sgrna的用量为1微克，所述cas9蛋白的用量为所至少一种sgrna总量的2～6倍，例如2、3、4、5或6。根据本发明的实施例，基于10微升的电转染预混液，所述cas9蛋白的用量不超过20微克，优选不超过16微克。根据本发明的实施例，所述电穿孔转染处理采用5～10次脉冲，例如5、6、7、8、9或10次脉冲。根据本发明的实施例，所述电穿孔转染
处理采用8次脉冲。由此，可以提高电转染进行多基因编辑的效率。发明人还通过大量实验发现，通过8次脉冲完成电穿孔转染(在本文中“电穿孔转染”与“电转染”可以互换使用)能够有效地提高转染效率，并且维持胚胎的生存活力，尤其是实现多基因的高效率基因编辑。
[0073]
根据本发明的实施例，在多基因编辑时，发明人采用台式液处理透明带5秒钟，并且保持每一种sgrna的浓度为0.1ug/ul，而cas9蛋白浓度改为总的sgrna浓度的4倍；同时，发明人进一步优化了电转染参数，使用8次脉冲数。下表统计了发明人在同一个胚胎里同时电转染8个不同基因的sgrna时，同时至少发生6个基因编辑的比例为100％，同时发生8个位点基因编辑的比例为33％，这表明优化后的胚胎电转染基因编辑技术可以实现高效率的多基因编辑。
[0074]
表3:小鼠胚胎电转染多基因编辑效率
[0075][0076]
为了进一步确认多基因编辑效率，发明人增加了检测编辑效率的胚胎的数量。随机选取四个基因进行一代测序，统计多基因编辑效率。如下表所示，在统计了10枚胚胎编辑效率后，发明人发现，在同一个胚胎同时实现至少6个位点同时基因编辑的效率为80％，同时8个位点全部基因编辑的效率高于30％。
[0077]
表4：小鼠胚胎电转染多基因编辑效率
[0078][0079]
由此，根据本发明的实施例，本发明提出一种对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法，其优势在于下列的至少之一：
[0080]
(1)高通量，根据本发明的实施例，每次电转染实验可以同时编辑高达400枚胚胎；
[0081]
(2)高效率，根据本发明的实施例，单位点基因编辑效率高于90％；
[0082]
(3)高纯合hdr突变体比例，根据本发明的实施例，纯合hdr突变体比例高于16％；
[0083]
(4)可以同时实现多基因编辑，根据本发明的实施例，已对同时编辑8个基因进行效率统计，在同一个胚胎同时实现至少6个位点基因编辑的效率为80％以上，甚至可达100％，同时全部8个基因编辑的效率高于30％。在对单基因编辑效率优化时已经提到，发明人优化了对透明带的处理，优化了cas9以及sgrna的浓度。
[0084]
(5)高hdr突变小鼠获取效率，根据本发明的实施例，单位点基因编辑，hdr突变小鼠获取效率高于55.6％，纯合hdr突变体小鼠获取效率高于30％。其中，单缺失致死基因的突变体小鼠获取效率高达100％。
[0085]
突变受精卵细胞的构建方法及其应用
[0086]
在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建突变受精卵细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)对处于s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，其中，所述外源物质包括cas9蛋白和至少一种sgrna，基于重量，所述cas9蛋白与所述至少一种sgrna重量的比例为2～6：1，优选4:1。
[0087]
如前所述，根据本发明的实施例，采用s期以前的动物受精卵细胞时，并且以cas9蛋白和sgrna混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率，从而可以进一步提高构建突变受精卵细胞的效率。前面对于相关步骤的特征和描述，同样适用该方法，在此不再赘述。如前所，通过该方法能够有效地构建基因突变的突变受精卵细胞，例如基因敲除或者基因同源重组修复(hdr)的突变受精卵细胞。
[0088]
本领域技术人员能够理解的是通过采用上述方法获得的受精卵细胞，可以通过常规的生物学方法，例如测序等方法进行验证是否在特定位置发生了相应的突变。
[0089]
如前所述，本领域技术人员能够理解，可以根据需要添加额外的外源物质，例如，对于基因同源重组修复(hdr)的突变受精卵细胞的构建，需要添加ssodn，并且以外地发现通过本发明的方法获得纯合hdr受精卵细胞的比例得到显著提高，可以高达30％，比现有技术提高了近10倍。
[0090]
由此，在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建突变受精卵细胞的方法，所述突变受精卵细胞为纯合hdr受精卵细胞，根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)对处于s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，以便获得经过转染的受精卵细胞，其中，所述外源物质包括cas9蛋白、至少一种sgrna和至少一种与所述sgrna对应的ssodn，其中，基于重量，所述cas9蛋白与所述至少一种sgrna重量的比例为2～6：1；和(3)从所述经过转染的受精卵细胞中选择所述纯合hdr受精卵细胞。根据本发明的实施例，所述cas9蛋白与所述至少一种sgrna重量的比例为4：1。另外，根据本发明的实施例，所述外源物质包括：1～2种sgrna；以及1～2种与所述sgrna对应的ssodn。根据本发明的实施例，通过采用该方法能够获得高比例的纯合hdr受精卵细胞，甚至可以获得双基因的纯合hdr。如前所述，根据本发明的实施例，采用s期以前的动物受精卵细胞时，并且以cas9蛋白和sgrna混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率，从而可以进一步提高构建突变受精卵细胞的效率。另外意外地发现，针对一种sgrna纯合hdr受精卵细胞的比例能够达到20％。
[0091]
在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建突变受精卵细胞的方法，所述突变受精卵细胞为致死基因单缺失受精卵细胞。根据本发明的实施例，所述方法包括(1)对处于s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，以便获得经过转染的受精卵细胞，其中，所述外源物质包括cas9蛋白、至少一种sgrna和至少一种与所述sgrna对应的ssodn，其中，基于重量，所述cas9蛋白与所述至少一种sgrna重量的比例为2～6：1；和(3)从所述经过转染的受精卵细
胞中选择所述致死基因单缺失受精卵细胞，其中，所述至少一种sgrna和所述ssodn是基于致死基因确定的。
[0092]
如前所述，根据本发明的实施例，采用s期以前的动物受精卵细胞时，并且以cas9蛋白和sgrna混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率，从而可以进一步提高构建突变受精卵细胞的效率。另外根据本发明的实施例，意外地发现，在所得到的经过转染的受精卵细胞中，存在单缺失的致死基因比例高达54％，在这些受精卵细胞中，发生hdr的位置实际上是被保护起来未被敲除或者功能丧失。从而，能够有效地获得具有单缺失致死基因的受精卵细胞，进一步，可以在受精卵细胞存活的状态下研究该致死基因的生物活性。
[0093]
在获得了受精卵细胞后，本领域技术人员可以通过常规手段获得突变动物，这些动物携带相应的受精卵细胞中的突变基因。
[0094]
由此，在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建突变动物的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：(a)按照前面所述的方法，构建突变受精卵细胞；和(b)培育所述突变受精卵细胞，以便获得所述突变动物。
[0095]
如前所述，在前面获得纯合hdr受精卵细胞或者致死基因单缺失的受精卵细胞基础上，可以进一步获得携带这些基因突变的动物。由此，这些动物可以用于进行基因研究或者药物筛选。
[0096]
在本发明的第六方面，本发明提出了一种构建动物模型的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：(i)基于预定疾病类型，确定与疾病关联基因相关的sgrna以及任选的ssodn；(ii)利用所sgrna和cas9蛋白，按照前面所述的方法构建动物模型。
[0097]
由此，根据本发明的实施例，可以针对已知的疾病关联基因进行构建相应的突变动物，从而可以作为用于该疾病研究或者药物筛选的动物模型。这些相应的关联基因可以包括但不限于：dhodh、rbm10、setbp1、gpsm2、flvcr2、mll2、wdr35、wdr62、pigv、sdccag8、masp1、acad9、angptl3、fadd、tgm6、cep152、dhdds、tecr、arhgap31、aars2、impad1、banf1、kif1a、fam20a、ap4s1、ap4b1、ap4e1、zbtb24、ncstn、vps35、ccdc8、akt1、psmc3ip/hop2、adk、kat6b、megf10、wdr19、prrt2、polr3a、polr3b、idh1、csf1r、gatad1、ezh2、kif22、kif22、pla2g5、prrt2、dlx5、ezh2、klhl3,cul3、ndufb3,agk、ripk4、slc6a3、brat1、cradd、tubgcp6、flvcr1、snip1、hars、slco2a1、thra、actb,actg1、agk、ddost、eftud2、gpr179、kif11、rad51、rtn2、srcap、aco2、arid1b、ctc1、dnajb6、klhl3、mafb、mcm4、smarcb1、smarca4、smarca2、smarce1、arid1a、arid1b、xrcc2、trpv3、c5orf42、chst8、ciz1、dst、exosc3、gucy2c、lztfl1、mff、fars2、ndufs8、mtfmt、ndufb3、pde4d、pde4d、pigl、rogdi、adcy5、cep135、cyp4v2、dnajc6、dync1h1、kiaa1530(uvssa)、nnt、plcb4、gnai3、sf3b4、srp72、abcc9、agk、akt3、pik3r2and pik3ca、mto1、nsun2、serac1、card14、cd27、fan1、lars、pigo、rab33b、tgfb2、ccdc78、fam38a、ifitm5、ifitm5、lrba、mll、pfn1、poc1a、slco2a1、tctn3、tfg、col14a1、grm1、gtdc2、nmnat1、nmnat1、nmnat1、pmca3、slc52a2 and slc52a3、sorl1、tspear、aagab、abcd4、alg13、dpagt1、pgm1、atp1a3、clic2、fars2、heatr2、hydin、plcg2、rmnd1、rogdi、slco2a1、tmem231、tmem38b、cd59、cyp26c1、dync1h1、hoxc13、igsf1、kcnt1、kcnt1、nin、pnpt1、ski、slc29a3、znf141、actg2、agk、ano3、ccdc114、dgat1、dgke、dhtkd1、eps8l3、exph5、gnal、herc2、inppl1、kcnd3、kcnd3、lrit3、pacs1、pdgfrb、
pla2g4a、slc5a7、tecpr2、ube3b、uqcrc2、wdr45、slc26a3、hsd17b4、vcp、bag3、notch2、rmrp、pth1r、mct8、dnajc5、slc29a3、smad4、tk2、kat6b、kat6b、piga、dync1h1、loxhd1、pldn、cav1、mpl、abcc9、dnmt1、kif7、rsph9、gpsm2、grn、pik3ca、pik3ca、akt3、mtor、tcf4、ttn、asah1、dpagt1、gata1、reep1、fus、hdac8、atp1a3、atp1a3、mvk、mybpc1、kcnj13、lhcgr、afg3l2、elovl4、smad4、hsd17b4、aifm1、c12orf65、rp1l1、snap29、st3gal3、hpse2、ap4b1、cyp24a1、spr、alg8、c10orf2(twinkle)、gcdh、ofd1、fa2h、spg11、vps13a、bola3、c19orf12、slc40a1、atp13a2、cd45、kcnj11、aspm、glb1、il
‑
10r1、kctd7、pkhd1、sacs、cacna1s、cask、efhc1、kcnq2、capn3、cln6、des、gm3、mpv17、upf3b、apoe、ryr1、dnajc5、aifm1、trem2、c5orf42、evc2、sec8、rbp4、slc52a2、sucla2、wdr35、csf1r、cyp1b1、myoc、ltbp2、dnajc6、dpagt1、dpagt1、gbe1、kctd7、rp1、stat1、ush1c、lmna、tgm6、trappc9、ofd1、prkcg、trpv4、dfna9、abca4、rds/prph2、elovl and crb1、cul7、snrnp200、sod1、vcp、cdhr1、ddx11、pik3ca、slx4/fancp、ubqln2、bscl2、fgd1、gata4、kif7、vcp、ccdc88c、des and flnc、abcd4、gars。
[0098]
本发明构建的突变受精卵细胞，在体外正常培养到二细胞时期后，可回植到母鼠体内，经历胚胎的正常发育周期，可以获得相应的突变小鼠。上文所提到的，通过本发明构建的emx1、zswim3、tyr以及致死基因foxg1突变受精卵细胞，均可在二细胞时期回植到母鼠体内，用于产生突变小鼠模型。回植突变受精卵细胞得到的基因突变小鼠的基因型鉴定结果如下表。值得关注的是，致死基因foxg1突变的受精卵细胞是无法正常发育成小鼠的，所以单缺失致死基因的突变体小鼠能够帮助我们研究致死基因在小鼠中的生物学功能，利用本发明获得的foxg1突变受精卵，回植出生后的小鼠均为单缺失致死基因的突变体，效率高达100％。因此，本发明能够有效地构建具有单缺失致死基因的小鼠动物模型。
[0099]
表5：突变受精卵细胞回植后出生小鼠突变体类型
[0100][0101]
注：ki突变体为含有hdr突变类型的突变体。
[0102]
根据本发明的实施例，该构建动物模型的方法具有高hdr突变小鼠获取效率的优点。根据本发明的实施例，单位点基因编辑中，hdr突变小鼠获取效率高于55.6％，纯合hdr突变体小鼠获取效率高于30％；其中，单缺失致死基因的突变体小鼠获取效率高达100％。
[0103]
在本发明的第七方面，本发明提出按照前面所述的方法构建的突变动物或动物模型在筛选药物中的用途。
[0104]
本领域技术人员可以采用本领域中公知的技术进行药物筛选，在此不再赘述。
[0105]
在本发明的第八方面，本发明提出了一种对动物受精卵进行透明带弱化处理的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：将处于s期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理，所述透明带弱化处理是通过使所述动物受精卵细胞与台式液接触4～10秒钟进行的。
[0106]
本发明的发明人发现，对于动物胚胎，尤其是小鼠胚胎而言，进行透明带弱化处
理，具体的是，将动物胚胎与台式液进行接触，该步骤的处理时间长短对于后续电转染的效率以及得到纯合hdr突变体的效率是至关重要的，如果接触的时间过短，则会造成透明带的弱化程度不足，如果时间过长，则会造成透明带弱化程度过高，会影响胚胎的存活。另外，发明人还通过大量实验发现，通过8次脉冲完成电穿孔转染(在本文中“电穿孔转染”与“电转染”可以互换使用)能够有效地提高转染效率，并且维持胚胎的生存活力，尤其是实现多基因的高效率基因编辑。根据本发明的实施例，按照上述步骤处理的动物受精卵，其电转染效率明显得到提高。
[0107]
需要说明的是，在不同方面所描述的方案、特征和优点，除非特别说明，是可以互相适用的，在此不再赘述。
[0108]
下面通过具体的实施例对本发明进行描述，除非特别说明，在具体的实施例中所采用的处理手段和试剂均为常规的或者市售可得的。
[0109]
实施例1
[0110]
1、体外制备基因编辑体系
[0111]
cas9蛋白的纯化
[0112]
表达cas9蛋白所需的质粒为pet28a(
‑
)his( )ha
‑
nls
‑
spcas9。
[0113]
第一天：质粒转化
[0114]
根据感受态细胞提供的实验步骤将含有t7启动子的pet28a
‑
spcas9质粒转化进rosetta de3。简而言之，将约200ng的质粒dna添加到50μl刚解冻的感受态细胞中，并在冰上孵育30分钟。通过在42℃下孵育60s来热激细胞，然后将细胞在冰上放置3分钟。向细胞中加入500μllb(luria broth)培养基，并在振荡培养箱中于37℃培养1h。然后将感受态细胞均匀涂布到含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养板上，在37℃下过夜孵育。
[0115]
第二天：细菌扩大培养和蛋白诱导表达
[0116]
从琼脂平板上挑一个菌落，接种10ml含50μg/ml卡那霉素的lb培养基。在震荡培养箱(250rpm)中于37℃孵育预培养过夜。在2l带培养瓶中，将10ml的预培养物接种到含有50μg/ml卡那霉素的1l预热lb培养基，在摇动培养箱(220rpm)中于37℃扩大培养细菌，同时通过测量600nm(od 600)的光密度监测细胞生长。当od升高至至0.6～0.8，将温度降至16℃。通过向每个烧瓶中加入2ml 100mm异丙基
‑
β
‑
d
‑1‑
硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg终浓度200μm)来诱导蛋白质表达。继续在16℃震荡培养过夜，持续12
‑
16小时。
[0117]
第三天：cas9蛋白ni柱亲和纯化
[0118]
在含有摆桶式转子的离心机中4000rpm离心10分钟收获细胞。倒出上清液，每升菌液收集的细菌约用40ml预冷的裂解缓冲液(20mm tris
‑
cl，ph 8.0，500mm nacl 10％甘油，1mm tcep，1mm苯基甲基磺酰氟pmsf)重悬细胞沉淀。重悬的细胞沉淀既可以直接用于进一步纯化，也可以在液氮中速冻并在
‑
80℃下保存几个月，而不会损失cas9的酶活性。
[0119]
用超声波破碎重悬的细菌至菌液变得澄清透明，超声波破碎程序(超声1s，停止3s，50％功率，总时长10min)。之后将细菌裂解液转移到50mlbeckman离心管中，使用25.5号转子15000rpm在4℃离心30min分离上清和沉淀。将含有cas9蛋白的上清液转移到镍柱上4℃孵育1小时。孵育前镍柱柱材(2ml)依次用20ml双蒸水和10ml细菌裂解缓冲液冲洗平衡。孵育结束后收集镍柱流穿液，用50ml的清洗液(20mm tris
‑
cl，ph 8.0，250mm nacl，20mm imidazole，ph 8.0，5％glycerol)清洗镍柱，直到镍柱流出的清洗液不再使bradford染液
变色。之后用50ml的洗脱缓冲液(20mm tris
‑
cl，ph 8.0，250mm nacl,250mm imidazole，ph 8.0，10％glycerol，1mm tcep)洗脱镍柱上的蛋白，直到镍柱流出的洗脱缓冲液不再使bradford染液变色。将洗脱下来的蛋白溶液转移到孔径为100kda的透析膜中，并将装有cas9蛋白的透析膜放入1l透析液(20mm hepes
‑
koh，ph 7.0，125mm kcl，10％(v/v)glycerol，1mm dithiothreitol(dtt))中4℃透析过夜(透析3小时后更换新的透析液)。
[0120]
第四天：阳离子交换柱和分子筛
[0121]
从透析膜中回收透析样品。通常，透析后会出现明显的沉淀。在4℃下以4000rpm离心5分钟以除去沉淀物。用阳离子交换(iex)缓冲液a(20mm hepes
‑
koh，ph 7.0，100mm kcl，10％甘油)和缓冲液b(20mm hepes
‑
koh，ph 7.0，1m kcl，10％甘油)交替洗涤5ml hitrap sp hp色谱柱(ge healthcare)。洗涤完成后用缓冲液a平衡色谱柱，直到盐浓度和uv280吸光度的曲线变为直线，然后将uv280吸光度自动归零。然后使用上样泵将cas9蛋白以约5ml/min的流速上样到柱上。上样完成后用10ml iex缓冲液a洗涤色谱柱，之后在缓冲液a中逐渐升高缓冲液b的体积比(从0％升高到50％)，进而升高盐浓度梯度洗脱结合在阳离子交换住上的蛋白。cas9通常在两个峰中洗脱，两个峰在260和280nm(a260/a280)处具有不同的吸收率。第一个峰在大约15％iex缓冲液b处开始洗脱，最大值在～20％处洗脱，第二个峰在～25
‑
40％处洗脱，最大值在～30％处洗脱，用收集管收集洗脱蛋白，每个管收集2ml。使用sds
‑
page分析洗脱溶液中分是否存在cas9，并将含有cas9蛋白的洗脱液合并在一起。
[0122]
使用100,000mwco离心浓缩管以4000rpm的速度将含有cas9蛋白的阳离子交换洗脱液浓缩至1ml。将浓缩液回收到1.5ml eppendorf管中，并在4℃下以12,000rpm离心10分钟以除去沉淀的物质。同时，用分子筛缓冲液(20mm hepes
‑
koh，ph 7.0，250mm kcl，10％甘油，1mm tcep)平衡superdex 200 10/300凝胶过滤柱(ge healthcare，24ml柱体积)。使用1ml样品定量环将浓缩的cas9注入色谱柱。用25ml分子筛缓冲液以0.5ml/min的流速洗脱，用收集管收集洗脱液，每管收集500ul。cas9通常以约12ml的体积洗脱。使用sds
‑
page分析收集管中洗脱液是否含有cas9，将含有cas9的蛋白合并在一起。
[0123]
第四天：蛋白质浓缩和储存
[0124]
使用100,000mwco离心浓缩管浓缩cas9溶液(加入10％甘油)至下一步实验所需的浓度(通常～5mg/ml)，浓缩完成后向蛋白溶液中补充10％的甘油，用于长期储存蛋白。根据以下假设确定浓度：1mg/ml在280nm处的吸光度为0.76(基于计算的消光系数120,450m
‑
1cm
‑
1)。为了避免不必要的冻融循环而导致酶活性下降，将浓缩的蛋白质样品分成10
‑
20μl的分试样，并在液氮中快速冷冻。冷冻的cas9可以在
‑
80℃下保存几个月，而不会失去活性。使用前，将分试样解冻，并用存储缓冲液稀释至所需浓度。通常将cas9稀释至2μm进行核酸内切酶活性测定。如果用于多个实验，cas9可以在冰上或4℃下保存至少2天，而不会失去活性。但是，建议定期检查储存的样品中是否有任何沉淀物质，并通过sds
‑
page检测蛋白质质量。
[0125]
sgrna的体外转录
[0126]
a、设计正向引物、t7启动子序列，向导序列，和sgrna骨架(sgrna scalffold)
[0127]5’
端前20个碱基共同构成sgrna ivt f primer。
[0128]
需要的是t7启动子的序列为：5
′
taatacgactcactatag 3
′
。t7 rna聚合酶从t7启动子序列标有下划线的g处开始转录，若无g，转录几乎不会发生。若向导序列的5’末端(紧挨
着t7启动子3’端的位置)本身无碱基g，可以增加一个碱基g，两个碱基g(t7启动子3’端的g和向导序列5’端的g)可以提高体外转录效率，增加sgrna产量(neb官网)。
[0129]
b、设计反向引物。sgrna骨架3’端序列添加poly t作为转录终止信号，反向互补后得到的序列即为sgrna scal r primer序列：aaaaaaacaccgactcggtgcc。
[0130]
pcr方法构建体外转录所需dna模板。pcr反应体系如下：
[0131]
表6：用于构建体外转录模板所需pcr体系
[0132][0133][0134]
pcr程序如下：95℃，3min；{98℃，20sec；60℃，15sec；72℃，15sec}35个循环；72℃，1min；4℃，∞。
[0135]
琼脂糖凝胶电泳和胶回收。
[0136]
用neb t7 transcription kit进行体外转录。在rna超净台中按下表配制体外转录体系。
[0137]
表7：neb t7 rna聚合酶体外转录体系
[0138]
成分用量(单位：μl)无核酶水18
‑
xntp缓冲液混合物(6.7mm)10模板dnaxt7 rna聚合酶2总体积30
[0139]
注：模板dna的实际用量为1μg为宜，具体用量xμl由步骤5胶回收得到的dna模板的浓度计算得到。
[0140]
上述体系配制完成后，充分吹吸混匀，放入pcr仪中，37℃下放置16h，然后将产物进行纯化。若短时间内不进行纯化操作，将产物放于
‑
20℃冰箱中，防止rna降解。
[0141]
体外转录产物纯化。下列操作尽可能在rna超净台中进行，防止rnase污染导致rna降解。
[0142]
(1)dna消化。每份样品中加入2μl dnase1和18μl超纯水(ultrapure water)，吹吸混匀后放入pcr仪中：37℃，15min。
[0143]
(2)向每份样品中加入50μl洗脱液(elution solution)，此时总体积为100μl，吹吸混匀。
[0144]
(3)向每份样品中加入350μl结合液(binding solution)，用移液枪轻轻吹吸混匀。
[0145]
(4)向每份样品中加入250μl的100％乙醇溶液(neb的t7体外转录试剂盒当中没有100％无水乙醇，需要实验室另行购买)，用移液枪轻轻吹吸混匀。
[0146]
(5)将带有滤芯的吸附管(filter catridge)放入接收洗脱管(collection and elution tube)中。将上述rna混合液加入吸附管中。
[0147]
(6)12000rpm离心1min，使液体通过滤芯，在此过程中，rna产物会与吸附管的滤芯结合，余下物质会随同液体进入接收管中。
[0148]
(7)弃去接收管中的废液，向吸附管中加入500μl清洗液(wash solution)。12000rpm离心1min，使清洗液通过滤芯，在此过程中，杂质会从吸附管的滤芯上洗脱、随同清洗液进入接收管中。
[0149]
(8)重复步骤(7)。
[0150]
(9)12000rpm离心2min，通过该步骤使酒精进一步挥发。
[0151]
(10)将带有滤芯的吸附管转移至一个新的接收管中，在rna超净台中敞口放置5
‑
10min，使酒精彻底挥发。同时用金属浴在55℃下预热适量超纯水。
[0152]
(11)待酒精彻底挥发后，向吸附管的滤芯上滴加50
‑
100μl已预热的超纯水，置于rna超净台，静置2min，使rna产物充分溶解进入超纯水中。
[0153]
(12)12000rpm离心1min，使rna产物随超纯水进入接收管，弃去吸附管，用nanodrop测定rna浓度。做好标记，放入
‑
20℃冰箱中保存。
[0154]
外源模板ssodn的设计与合成
[0155]
根据已设计的向导序列，确定其在基因组上的靶标序列，引入2处同义突变(突变碱基的位置尽可能靠近向导序列)，用以辨别是否发生同源修复，同时防止对基因功能造成影响。靶标序列上下游分别延伸50
‑
55nt，得到约130nt的ssodn序列。序列信息交由生工生物工程股份有限公司进行合成、纯化。
[0156]
小鼠胚胎的获取与培养
[0157]
雌鼠的超数排卵
[0158]
(1)选择c57bl/6n雌鼠。
[0159]
(2)根据雌鼠的订购日期和体重，选定相应日期对雌鼠注射第一针pmsg(孕马血清促性腺激素)。每只雌鼠腹腔注射0.2ml(10u)的pmsg。本实验对雌鼠注射pmsg的时间通常为下午3:30
‑
4:30。
[0160]
(3)46
‑
48小时后每只雌鼠腹腔注射0.2ml(10u)的hcg(绒毛膜促性腺激素)，本实验对雌鼠注射hcg的时间通常为下午2:30
‑
3:30。
[0161]
(4)雌鼠注射hcg后，将雌鼠与雄鼠按1:1比例合笼。合笼的时，换一个新的鼠笼，先将雄鼠放入鼠笼，再将雌鼠放入。
[0162]
(5)次日清晨检查雌鼠是否有阴道栓产生，未见阴道栓的雌鼠进行安乐死，有阴道栓产生的雌鼠取回实验室用于胚胎采集。
[0163]
小鼠胚胎的获取
[0164]
(1)将雌鼠用颈部脱臼法处死，打开腹腔，找到输卵管、子宫以及膨大的壶腹部，用剪子将输卵管上附着的粘膜剥离，剪下壶腹部及附近的少量组织(尽量不要将子宫剪下，可
以剪下少量的输卵管)，放入提前预热的dpbs中。
[0165]
(2)再用钝头镊子将输卵管转移至另外一管已预热的dpbs中。
[0166]
(3)向3.5mm的培养皿上滴加提前预热的m2培养基，每个液滴20μl，用钝头镊子将输卵管转移至m2液滴中，每个液滴中放一个输卵管。
[0167]
(4)双手分别持一把尖头镊子，在体式显微镜下，将壶腹部以外多余的部分去除，用尖头镊子将壶腹部撕开，把胚胎释放出来。向20μl m2液滴中加入10μl 300ng/μl的透明质酸酶，待卵丘细胞从胚胎上消化下来，用口吸管将胚胎转移至新的m2液滴中，转移3
‑
4次，以彻底去除透明质酸酶和杂质。
[0168]
小鼠胚胎的培养
[0169]
(1)向3.5mm的胚胎培养皿上滴加40μl ksom液滴，每个培养皿可滴加3个液滴，液滴之间距离适当即可。加入3ml的矿物油，保证能完全覆盖液滴，若液滴覆盖不完全，会导致ksom液滴挥发，各成分的浓度发生变化，影响胚胎存活。培养皿可提前一天制备，放入培养箱中平衡过夜。
[0170]
(2)将胚胎转入提前置于培养箱中平衡、覆盖着矿物油的ksom液滴中进行培养。
[0171]
(3)培养箱的条件为：5％co2浓度，95％氧气(氧气纯度≥99％即可)浓度，饱和湿度，37℃恒温培养。
[0172]
多基因基于非同源修复(nhej)的小鼠受精卵的电转染
[0173]
以同时编辑8个基因为例。
[0174]
下表为同时编辑的8个基因的名称以及对应的sgrna序列。
[0175]
表8：同时编辑的8个基因的名称以及对应的sgrna序列
[0176]
基因名称(编辑区域)向导序列lyl1(intron)caatgtgggaagtcacacacnop14(intron)ccatgacagtattcgtcccgemx1(exon)gagtctgagcagaagaagaazswim1(intron)agtctttcatcggcgaaatgzswim3(utr)gggtcaaaggattgtcacagltv1(intron)ttccggtcttagacgacaggtyr(intron)agatattggaagtcacgcaacenpq(utr)tattaatgataagcccacac
[0177]
1.配制电转染预混液a。
[0178]
表9：电转染预混液a配方
[0179]
电转预混体系a用量5
×
rnp缓冲液2μlcas9蛋白16μg多个sgrna(每个1μg，总共8ug)te缓冲液补齐至10μl总体积10μl
[0180]
注：te缓冲液5
×
rnp缓冲液的配方参见表4和表5。
[0181]
表10：te缓冲液配方
[0182][0183][0184]
表11：rnp缓冲溶液配方
[0185]
rnp缓冲液成分用量(ml)1m hepes，ph 7.51.03m氯化钾2.51m氯化镁0.05100％甘油5.05mm tcep0.5去核酸酶水(nuclease
‑
free water)0.95总体积10
[0186]
2.将电转染预混液a放入pcr仪，37℃，10min；该步骤的目的是使cas9蛋白和sgrna在体外结合。
[0187]
3.将胚胎从放入已预热的m2液滴当中，清洗2次。
[0188]
4.将胚胎转移至台式液中，处理5sec。
[0189]
5.将胚胎转移至已预热的optimemⅰ液滴中，清洗2次。
[0190]
6.向10μl optimemⅰ中，加入10μl预混液，吹吸混匀；取15μl加入电转染皿中，将胚胎加入余下5μl液滴中，用移液枪轻轻吹吸打混匀，将胚胎转移至电转染皿中，再将余下液体补加至电转染皿中。
[0191]
7.按表12调整电转染仪参数，确认无误后，点击“start”，从体视镜中可以观察到电击瞬间，电转染皿有气泡产生，电击结束后，将胚胎转移到ksom当中，放入培养箱继续培养。
[0192]
表12：电转染参数设置
[0193]
电转染条件电转染参数电压(voltage)30v脉冲次数(pulses)8脉冲长度(pulses length)3ms脉冲间隔(pulse interval)100ms
[0194]
一代测序检测基因编辑效率
[0195]
1.利用ncbi网站上的primer
‑
blast分别在编辑位点上下游300bp附近的位置设计一对tide引物，分别命名为tide f primer和tide r primer。将引物序列交由生物公司进行合成。
[0196]
2.观察胚胎发育情况，通常情况下，受精卵取出后96h左右，即可发育成囊胚，根据需检测的囊胚个数或组数将quickextract分装至pcr管中，quickextract的用量可以为10μ
l。
[0197]
3.用口吸管将发育至囊胚期的胚胎转入m2液滴中清洗1
‑
2次，然后加入分装有quickextract的pcr管中。做好标记。
[0198]
4.用涡旋振荡器震荡15
‑
30sec后，将样品放入pcr仪，运行下列程序：65℃，15min；68℃，15min；98℃，10min。即可得到胚胎基因组。用nanodrop测定基因组dna浓度。
[0199]
5.用pcr方法将编辑位点附近的片段扩增，用于进行一代测序。具体步骤如下：
[0200]
(1)配制pcr体系。
[0201]
表13：用于进行基因编辑结果检测的pcr体系
[0202]
成分用量(单位：μl)基因组dna(20ng/μl)2.0tide f primer(10μm)1.0tide r primer(10μm)1.02
×
vazyme phanta master mix10.0ddh2o6.0总体积20.0
[0203]
(2)将上述样品混匀后，放入pcr仪中。pcr程序如下：95℃，3min，{98℃，20sec；tm℃，15sec；72℃，tsec}34个循环，72℃，1min；4℃，∞。[注：tm为退火温度，按公司合成的引物侧壁标记的退火温度进行设置即可；t为延伸时间，vazyme公司的phanta以基因组为模板时，扩增速度按1kb/60sec进行计算即可]
[0204]
(3)将pcr产物交由测序公司进行一代测序。
[0205]
(4)结合一代测序结果，利用在线平台tide(https://tide.deskgen.com/)对编辑效率进行计算。
[0206]
二代测序检测基因编辑效率
[0207]
1.对于一代测序结果中出现非纯和突变样品，采用二代测序的方法，对编辑基因的类型进行精准鉴定，具体方法如下：利用ncbi网站上的primer
‑
blast分别在编辑位点上下游100bp附近的位置设计一对tide引物，分别命名为tide f1和tide r1，在引物的5’端分别加上用于二代测序pcr扩增的引物结合序列，序列如下，将引物序列交由生物公司进行合成。
[0208]
tide f1添加序列：5
’‑
tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag
‑3’
；
[0209]
tide r1添加序列：5
’‑
tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag
‑3’
。
[0210]
2.使用tide f primer和tide r primer按照表13中反应体系对胚胎基因组进行第一轮扩增，将第一轮产物用作于第二轮pcr扩增的底物，根据下表中的反应体系进行pcr扩增。
[0211]
表14：二代测序进行基因编辑结果检测的第二轮pcr体系
[0212]
[0213][0214]
barcode i5 f和barcode i7 r序列如下，nnnnnnnn为序列条码用于标记二代测序样品，n为随机碱基：
[0215]
barcode i5 f：
[0216]5’‑
aatgatacggcgaccaccgagatctacacnnnnnnnntcgtcggcagcgtc
‑3’
[0217]
barcode i7 r：
[0218]5’‑
caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnngtctcgtgggctcgg
‑3’
。
[0219]
3.pcr反应完成后，将样品加到1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳条件为130v 20min，电用完成后用刀片将pcr目的条带(根据ncbi设计的pcr引物所产生的条带计算大小，通常为300bp左右)切下来，使用诺唯赞公司的胶回收试剂盒回收纯化pcr产物，将纯化好的产物送给二代测序公司测序。
[0220]
4.返回的测序结果使用软件crispresso进行分析，判断基因组突变类型，具体分析流程参照软件说明。
[0221]
实验结论：本实施例中可以实现八个位点同时编辑。
[0222]
实施例2
[0223]
在本实施例中，如无特别说明，按照实施例1的方法进行。
[0224]
1、透明带处理时间优化
[0225]
发明人测试了在酸性台式液中处理透明带的时间。结果发现，透明带处理方案为酸性台式液中放置5s，加转移时间总共为10s。在这一条件下，发明人电转染编辑emx1基因，电转染后获取emx1基因被编辑囊胚比例最高，可以达到96％。结果如表15所示。
[0226]
表15：小鼠胚胎透明带处理对囊胚发育率、编辑效率影响
[0227][0228]
2、外源基因的比例优化
[0229]
不同浓度比例的cas9/sgrna混合物基因编辑效率会有不同，发明人对此进行了测试，发现高浓度cas9/sgrna可以实现较高的编辑效率，但是考虑到高浓度cas9/sgrna可能带来的脱靶率高等风险，发明人降低了cas9/sgrna浓度，在cas9/sgrna浓度分别为0.4ug/微升，0.1ug/微升时可以实现100％基因编辑效率；当浓度进一步降低后，基因编辑效率显
著降低。在结果如表16所示。
[0230]
表16：不同浓度比例的cas9/sgrna混合物基因编辑效率结果
[0231][0232]
在进行多基因编辑时，发明人同样测试了不同浓度比例的cas9/sgrna的多基因编辑效率。依据单基因编辑获取的cas9/sgrna浓度，发明人从总的cas9/sgrna浓度分别为0.4ug/微升，0.1ug/微升开始测试，分别提高cas9以及sgrna的浓度。发明人以编辑5个基因作为测试，最终发现在每个基因对应的sgrna浓度为0.1ug/微升，cas9浓度为总的sgrna浓度的四倍时，多基因编辑效率最高。
[0233]
表17：5个基因编辑效率结果
[0234][0235]
3、转染时机优化
[0236]
在优化hdr效率时，发明人发现杂合hdr比例很高，但是无法获取纯合hdr胚胎。发明人优化了cas9/sgrna/ssodn的浓度，ssodn的长度，电转染的参数等，都没有获得纯合hdr胚胎。猜测可能是细胞周期的原因，于是，发明人测试了电转染的时间，发现在s期以前进行电转染可以显著提高纯合hdr比例。结果如下表所示。
[0237]
表18：电转染时间对纯合hdr突变体比例的影响
[0238][0239]
4、电转染参数优化
[0240]
在优化电转染参数之前，发明人已经优化过了cas9/sgrna浓度，发现每个基因对应的sgrna浓度为0.1ug/微升，cas9浓度为总的sgrna浓度的四倍时，多基因编辑效率最高。在此基础上，发明人进一步优化了电转染的参数。发明人首先提高了电压，发现在高电压情况下，胚胎囊胚发育率显著降低。于是，发明人保持电压不变，优化了脉冲次数，发现在8次脉冲时，可以得到最高的多基因编辑效率。参数结果如下表所示。
[0241]
表19：电转染参数
[0242]
电转染仪btx gemini2电转染仪电转染条件电转染参数电压(voltage)30v
脉冲次数(pulses)8脉冲长度(pulses length)3ms脉冲间隔(pulse interval)100ms
[0243]
5、编辑胚胎回植后出生小鼠突变类型鉴定
[0244]
本发明建立了一项成熟高效的胚胎电转染基因编辑技术，同时也建立了高效获取获取基因突变小鼠的方法。我们将利用该技术获取的突变受精卵细胞回植到母鼠体内，让突变受精卵细胞经历正常的胚胎发育周期，直至小鼠出生。待小鼠出生后2周左右，剪取小鼠的脚趾放入20ul quickextract中，利用实施例1中所描述的步骤提取小鼠基因组和鉴定出生小鼠的突变类型。
[0245]
通过本发明构建的emx1、zswim3、tyr以及致死基因foxg1突变受精卵细胞回植后所出生的突变小鼠突变类型鉴定结果如下表。经鉴定，所有通过本发明获取的小鼠在相应的位点均发生了基因编辑，编辑效率100％。此外，利用本发明获得的foxg1突变受精卵，回植出生后的小鼠均为单缺失致死基因的突变体，效率高达100％。因此，本发明能极大提高单缺失致死基因的突变体的获取效率，有效地推动致死基因在动物中生物学功能研究。除致死基因外，其他基因编辑的突变受精卵细胞发育成的小鼠均具有较高纯合hdr突变比例，突变比例均高于30％。
[0246]
表20：突变受精卵细胞回植后出生小鼠突变体类型
[0247][0248]
注：ki突变体为含有hdr突变类型突变体。
[0249]
综上，本实施例的方法可以实现小鼠胚胎电转染基因编辑，并且，其优势在于下列的至少之一：
[0250]
(1)高通量，每次电转染实验可以同时编辑400枚胚胎。
[0251]
(2)高效率，单位点基因编辑效率高于90％。
[0252]
(3)高纯合hdr突变体比例，纯合hdr突变体比例高于14％。
[0253]
(4)可以同时实现多基因编辑，已对同时编辑8个基因进行效率统计，在同一个胚胎同时实现至少6个位点基因编辑的效率为100％，同时全部8个基因编辑的效率高于30％。(5)高hdr突变小鼠获取效率，单位点基因编辑，hdr突变小鼠获取效率高于55.6％，纯合hdr突变体小鼠获取效率高于30％。其中，单缺失致死基因的突变体小鼠获取效率高达100％。
[0254]
在本发明的描述中，“多个”或“至少一个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0255]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任
一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0256]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。