一种鉴定广地龙配方颗粒的特异性引物对及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种鉴定广地龙配方颗粒的特异性引物对及其应用。


背景技术：

2.地龙配方颗粒系指将地龙饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒。地龙是我国传统名贵中药，2015年版《中国药典》将其分为来源于参环毛蚓pheretima aspergillum(e.perrier)的“广地龙”和来源于通俗环毛蚓pheretima vulgaris chen威廉环毛蚓pheretimaguillelmi(michaelsen)或栉盲环毛蚓pheretimapectinifera michaelsen的“沪地龙”两类。根据“国家药监局《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(2021年第16号)”的要求，来源如为多基原中药材，应固定一个基原，不同基原的中药材不可相互混用。故而，必须建立配方颗粒专属性鉴别方法。
3.地龙是中药商品基原物种最为复杂的中药之一，在我国主要药材市场至少有40种蚯蚓作为地龙入药。经课题起草单位2014～2018年对安徽亳州、河北安国、广州清平、广东普宁、山东舜王城、广西玉林、成都荷花池等主要药材市场进行市场调查发现，经随机采样抽取232批药材进行物种鉴定发现，我国地龙类药材共有34个物种基原，包括《中国药典》规定的参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓和栉盲环毛蚓，及主要非药典品保宁腔蚓metaphire magna(chen,1938)，多肉远盲蚓amynthascarnosus(goto&hatai,1899)，暗孔远盲蚓amynthasobscuritoporus(chen,1930)等，其中以保宁腔蚓居多，市售药材中少见威廉环毛蚓和栉盲环毛蚓。在抽取的样品中，市售地龙商品总正品率为55％。
4.《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》还指出，中药配方颗粒各品种及其原料的性质可采用理化鉴别、色谱鉴别等方法，建立的方法应符合重现性、专属性和耐用性的验证要求。对于来源复杂的原料药材，必要时采用dna分子鉴别技术进行物种真伪鉴别。由于地龙配方颗粒已失去所有形态特征，无法通过性状、显微鉴定，也难以找到专属性化学成分，故而增加dna分子鉴定方法有助于进一步提高配方颗粒物种基原专属性控制水平。


技术实现要素：

5.本发明提供了广地龙特异引物对，所述广地龙特异引物对由核苷酸序列如seq id no.1所示的单链dna分子和核苷酸序列如seq id no.2所示的单链dna分子组成。
6.可选地，所述广地龙特异引物对中的核苷酸序列是seq id no.1的单链dna分子和核苷酸序列是seq id no.2的单链dna分子的摩尔比为1:1。
7.所述广地龙特异引物对可以用于鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品，所述常见广地龙混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓。
8.本发明还提供了一种鉴定广地龙的试剂，包括上述的广地龙特异引物对。
9.所述试剂可以用于鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品，所述常见广地龙
混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓。所述试剂可为pcr试剂。
10.本发明还提供了一种用于鉴定广地龙的试剂盒，包括上述的广地龙特异引物对或上述的试剂。
11.所述试剂盒可以用于鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品，所述常见广地龙混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓。所述试剂盒可为pcr试剂盒。
12.上述的广地龙特异引物对、上述的试剂或上述的试剂盒的应用也在本发明保护范围内。
13.该应用为如下a1)-a8)任一种中的应用：
14.a1)在鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品中的应用，所述常见广地龙混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓；
15.a2)在制备鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品的产品中的应用，所述常见广地龙混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓；
16.a3)在鉴定或辅助鉴定广地龙中的应用；
17.a4)在制备鉴定或辅助鉴定广地龙的产品中的应用；
18.a5)在鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有广地龙中的应用；
19.a6)在制备鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有广地龙的产品中的应用；。
20.a7)在制备鉴别广地龙配方颗粒真伪的产品中的应用；
21.a8)在鉴别广地龙配方颗粒真伪中的应用。
22.本发明还提供了一种检测或辅助检测待测样本是否为广地龙或是否含有广地龙的方法，所述方法包括如下步骤：
23.a1)采用上述广地龙特异引物对对所述待测样本的基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物；
24.a2)凝胶电泳检测所述扩增产物，根据检测结果按照如下确定所述待测样本是否为广地龙或是否含有广地龙：若所述扩增产物在100～250bp之间(如170bp)有单一dna条带者，则所述待测样本为或候选为广地龙，或者含有或候选含有广地龙；若所述扩增产物在100～250bp之间(如170bp)没有dna条带者，则所述待测样本不为或候选不为广地龙，或者不含有或候选不含有广地龙。
25.具体地，上述方法中，所述pcr扩增采用的引物退火条件为62℃退火2min。
26.具体地，上述方法中，所述pcr扩增中采用的pcr反应程序为：94℃初始变性5min；94℃变性30s，62℃退火2min，72℃延伸30s，36个循环；72℃终延伸60min。
27.具体地，上述方法中，所述方法中pcr反应体系中模板dna浓度为30ng/25μl，taq dna聚合酶为2
×
m5pcr mix。
28.本发明建立了可同时区分广地龙及常见广地龙混伪品通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓或暗孔远盲蚓的pcr检测体系。
3)；22：棋盘远盲蚓(dl-2)；23：十字远盲蚓(dl-39)；24：舒脉腔蚓(dl-43)；25：双颐腔蚓(dl-9)；26：透明远盲蚓(dl-6)；27：王氏远盲蚓(dl-44)；n：空白对照(以dd h2o为模板)。
35.图6为本发明实施例2中使用本发明的pcr鉴别方法所有收集的广地龙(参环毛蚓)药材和配方颗粒的结果。图中，泳道m：dl 2000dna分子量标准；泳道p：对照药材(批号：120987-201508)；泳道1～15：固定产采集的广地龙药材(批号：1905004，1905005，1905007，1905008，1905010，1905011，1905013，1905014，1905018，1906019，1906020，1906021，1906022，1906023，1906024)，泳道16～25：10批不同市场采集的广地龙药材(样本号：20180303051，20180303059，20180305016，20180605004，20170711003，20170711013，20170711015，20180402001，20180402002，20180402006，20180116017)，泳道26～40：15批广地龙标准汤剂冻干粉(1906011y，1906008y，1906014y，1907018y，1906004y，1906005y，1907022y，1907023y，1907024y，1906010y，1907019y，1906007y，1906013y，1907020y，1907021y)；泳道41～43：广地龙中试冻干粉(5200601y，5200602y，5200603y)；泳道44～46：地龙(参环毛蚓)配方颗粒(华润三九医药股份有限公司，2007001y，2007002y，2007003y)，泳道n：空白对照(以dd h2o为模板)pcr凝胶电泳图谱。
具体实施方式
36.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
37.下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
38.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
39.实施例1 pcr鉴别引物及鉴别方法的构建与优化
40.一、广地龙pcr鉴别引物设计
41.本发明选择的是以参环毛蚓，以及以参环毛蚓为基原的广地龙(参环毛蚓)配方颗粒建立专属的鉴别方法。
42.通过引物设计和条件优化，确定广地龙(参环毛蚓)配方颗粒鉴别引物：
43.f：5'-gtgccatgtttcttgctgaa-3'(如seq id no.1所示)；
44.r：5'-gactgctcccacttatactaaga-3'(如seq id no.2所示)。
45.二、pcr检测方法的构建
46.以广地龙为阳性对照，以无菌双蒸水为空白对照，采用由f和r组成的引物对对待测样本基因组dna进行pcr扩增。
47.pcr反应体系总体积为25μl，包括2
×
pcr mix 12.5μl，上下游引物(10μmol/l)各0.4μl，dna模板1μl，以无菌双蒸水补足至25μl。
48.pcr扩增循环程序及参数如下：
49.初始变性条件：94℃，5min；
50.变性条件：94℃，30s；
51.退火条件：62℃，30s；
52.延伸条件：72℃，30s；
53.循环数：36个；
54.终延伸条件：72℃，5min。
55.取5μl pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳。
56.结果判定标准为：在阳性对照和空白对照结果符合规定的情况下，待测样品相应泳道上在100～200bp(如170bp)有单一dna条带者为阳性结果(即待测样品含有广地龙)，反之为阴性结果(即待测样品不含广地龙)。
57.上述pcr扩增方式的具体优化过程如下：
58.分别选取广地龙药材、广地龙标准汤剂浸膏、广地龙配方颗粒，及混伪品通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和暗孔远盲蚓待测样品各1个，使用sv genomic dna purification system提取试剂盒提取基因组dna作为模板，进行pcr参数优化。
59.1退火温度
60.使用广地龙特异性鉴别引物进行pcr扩增，分别设置退火温度60、62、64及66℃，结果表明在62～64℃时，广地龙药材、广地龙标准汤剂浸膏、广地龙配方颗粒能扩增得约170bp的亮带，混伪品和阴性对照在此范围内均未扩增，60℃时部分样本有弱扩增，产生假阳性条带，66℃时退火温度过高，所有样品均无扩增，如图1。选择pcr退火温度为62℃。
61.2循环次数考察
62.分别选用32、34、36和38个循环进行考察，结果如图2，表明在32～40循环时广地龙药材、广地龙标准汤剂浸膏、广地龙配方颗粒能扩增得约170bp的亮带，均能得到正确鉴别结果，混伪品和阴性对照在此范围内均未扩增。为保证结果的稳定性和准确性，选择中间的36个循环进行pcr反应。
63.3不同taq酶考察
64.使用2
×
t5 super mix(擎科生物公司)，2
×
mightyamptaq(takara公司)，2
×
m5pcr mix(聚合美公司)，以及2
×
i5hifitaq mix(mclab公司)进行试验，pcr扩增体系参数：94℃初始变性5min；94℃变性30s，62℃退火2min，72℃延伸30s，36个循环；72℃终延伸60min。
65.结果见图3，不同公司的酶由于活力不同其扩增条带的亮度有差异，且在部分taq条件下均产生了假阳性条带(图5，泳道7,8,10)，在i5和t5 pcr mix扩增效果不佳，仅部分样品获得扩增。其中2
×
m5pcr mix的pcr结果可获得明显且明亮条带，故选择2
×
m5pcr mix作为广地龙(参环毛蚓)配方颗粒pcr鉴别用酶，该酶也在其他配方颗粒pcr鉴定中(如当归配方颗粒、紫河车配方颗粒、人参配方颗粒)中有较好的表现，是一种适用于配方颗粒pcr鉴定的通用酶。
66.1.4 dna模板量考察
67.对25μl pcr反应体系中的模板dna用量进行了考察，调整dna浓度约30ng/μl，分别设置相当于3μl、1μl、1/3μl、1/9μl量的dna模板(dna量分别为90ng，30ng，10ng及3ng)。以2
×
m5pcr mix作为taq dna聚合酶，pcr扩增体系参数：94℃初始变性5min；94℃变性30s，62℃退火2min，72℃延伸30s，36个循环；72℃终延伸60min。
68.结果见图4，结果表明1/9～1μl均能扩增，而浓度过高则扩增受到抑制。为防止模
板浓度过高产生假阳性或过低产生假阴性的错误鉴别结果，选择25μl体系中加入1μl(30ng/μl)作为最终模板浓度，即pcr反应体系中模板dna浓度为30ng/25μl。
69.经以上条件考察后，获得最优pcr反应参数：
70.pcr反应体系总体积为25μl，包括2
×
pcr mix 12.5μl，上下游引物(10μmol/l)各0.4μl，dna模板1μl(30ng)，以无菌双蒸水补足至25μl。
71.扩增体系：94℃初始变性5min；94℃变性30s，62℃退火2min，72℃延伸30s，36个循环；72℃终延伸60min；4℃保温。
72.实施例2 pcr方法的准确性与适用性考察
73.收集15批固定产地的广地龙药材(见表1)，3批广地龙配方颗粒成品、15批配方颗粒标准汤剂(即标准汤剂冻干粉)和3批中试冻干粉(见表2)，多批市售药材样品(见表3，含广地龙药材和混伪品药材)，5批混伪品配方颗粒(见表4)。
74.表1 15批固定产地的广地龙(参环毛蚓)药材
[0075][0076][0077]
表2 广地龙(参环毛蚓)标准汤剂冻干粉、中试冻干粉、配方颗粒成品
[0078]
[0079][0080]
表3 市售药材样品信息表
[0081]
[0082]
[0083]
[0084][0085]
表4 广地龙(参环毛蚓)配方颗粒混伪品颗粒
[0086][0087]
进行pcr扩增，检测实施例1中建立的pcr方法的专属性，适用性和耐用性。药材经性状鉴定后，使用dna测序进行辅助鉴定，以两者一致结果为最终鉴定结果。
[0088]
1专属性考察
[0089]
使用实施例1中建立的pcr方法对表1、表2、表3、表4中的部分广地龙药材，配方颗粒标准汤剂、中试冻干粉和配方颗粒成品及其混伪品(包括原动物和配方颗粒冻干粉)进行鉴定。
[0090]
结果见图5，广地龙药材，配方颗粒标准汤剂，中试冻干粉和配方颗粒成品均能扩增出与对照药材一致的100～250bp之间(如170bp)之间特异性鉴别条带，20种混伪品均在100～250bp之间(如170bp)之间无条带。
[0091]
2适用性考察
[0092]
使用实施例1中建立的pcr方法对结果所有15批固定产地的广地龙药材、10批市售广地龙药材，15批广地龙配方颗粒标准汤剂，3批广地龙中试冻干粉和3批广地龙配方颗粒成品(来自表1、表2、表3)进行鉴定。
[0093]
结果见图6，所有15批固定产地的广地龙药材、10批市售广地龙药材，15批广地龙配方颗粒标准汤剂，3批广地龙中试冻干粉和3批广地龙配方颗粒成品pcr产物凝胶电泳图谱中在与广地龙(参环毛蚓)对照药材电泳图谱相应的位置上，在100～250bp之间(如170bp)有单一dna条带，空白对照无条带。
[0094]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。