麦角硫因、S-甲基-麦角硫因及其用途的制作方法

麦角硫因、s-甲基-麦角硫因及其用途
1.本技术要求于2019年7月26日提交的欧洲专利申请ep 19382644.3的权益。
技术领域
2.本发明属于医药领域。特别地，它属于肾病领域。本文提供的本发明特别适用于诊断和治疗胱氨酸结石。


背景技术：

3.胱氨酸尿是具有常染色体隐性遗传模式的疾病，其特征在于由氨基酸转运蛋白rbat/b
0,
at缺陷引起的胱氨酸和氨基二羧酸的肾再吸收和肠吸收问题。胱氨酸尿发展为胱氨酸结石，其由泌尿系统中形成结石的胱氨酸沉淀引起。这些结石可导致梗阻、感染并且最终导致肾衰竭。
4.迄今为止，已经鉴定了引起胱氨酸尿的两个基因slc3a1和slc7a9，它们编码负责b
0,
氨基酸转运系统的rbat/b
0,
at异聚复合物。这是胱氨酸在肾中的主要顶端重吸收系统。该转运蛋白属于异聚氨基酸转运蛋白(hat)家族，其由重亚基(rbat或4f2hc)通过二硫桥连接至一系列轻亚基(在rbat的情况下为b
0,
at)形成。
5.胱氨酸尿通过证明尿中胱氨酸和氨基二羧酸的选择性过度分泌来诊断。20-25％的胱氨酸尿患者的尿中出现六方晶体，因此胱氨酸尿的唯一经证实的临床表现是胱氨酸结石。事实上，所有儿童尿结石中高达10％的病因是胱氨酸尿。超过80％的胱氨酸尿患者在生命的前二十年内发展为其第一胱氨酸结石，75％在两个肾脏中。大多数患者在其一生中患有复发性结石形成，需要反复干预。目前，无法预测胱氨酸尿患者何时会发展胱氨酸结石。此外，检测患者是否已经形成结石的唯一方法是通过复杂的成像技术，例如kub x-射线、计算机断层扫描(ct)和超声。
6.通过高液体摄入、低盐饮食(《2g nacl/天)、适度减少蛋白质摄入(《0.8g/天)以及将尿碱化至ph值至少为7.5(在严重肾功能不全的情况下使用柠檬酸钾或碳酸氢钠)以使胱氨酸溶解度最大化来防止胱氨酸结石形成来治疗人胱氨酸尿。即使进行了医学管理，由于功效不足并且患者依从性低，长期结果较差。
7.如果预防失败，则治疗患者以溶解或破碎结石。通过外科肾镜取石术(大结石)、经皮肾镜碎石术、体内碎石术以及在最近形成结石的情况下通过体外冲击波碎石术去除结石。这些手术具有进行性肾功能损害的风险。
8.药理学途径是基于口服施用硫醇基试剂(如青霉胺和硫普罗宁)，其可以通过与半胱氨酸形成可溶性复合物而取代胱氨酸(不溶性)和半胱氨酸(可溶性)之间的氧化还原平衡。尽管这些试剂相当有效，但它们具有多种副作用，导致治疗中断和疾病复发(halperin ec et al.,“the use of d-penicillamine in cystinuria:efficacy and untoward reactions”,yale j biol med.,1981,vol.54(6),pp.439-46)。
9.因此，仍然需要简单且廉价的方法来确定胱氨酸尿患者中胱氨酸结石的发作，并且还需要有效且无毒的治疗来预防或延迟胱氨酸结石的形成。
10.发明概述
11.本发明人开发了基于检测患者尿样中的s-甲基-l-麦角硫因(s-met-l-erg)用于诊断胱氨酸结石的新方法。
12.如以下实施例所示，本发明人惊奇地发现，尿中氨基酸衍生物s-met-l-麦角硫因的水平可以用强统计能力确定肾胱氨酸结石的存在。这是非常出乎意料的，因为s-met-l-麦角硫因是没有任何已知的与人疾病的联系的代谢物，其从未在胱氨酸尿患者的样品中检测到。因此，本发明人开发了一种方法，该方法通过简单分析易于获得的样品中的单个代谢物，允许在胱氨酸尿患者中准确诊断胱氨酸结石。
13.在本发明之前，胱氨酸尿患者中胱氨酸结石的存在只能通过复杂的成像技术来确定。因此，胱氨酸尿患者的临床管理包括增加的液体摄取和尿碱化，直到尿胱氨酸的水平或肾疼痛指示结石发作的可能发作。只有那时，才能通过成像技术(如ct扫描或超声)来确定胱氨酸结石的存在。这些技术需要昂贵的设备，并且甚至不能将胱氨酸与其它结石化学成分区分开。
14.本文提供的方法的简单性和有效性允许在胱氨酸尿患者中常规测试尿石病。这种显著的改进将有助于在胱氨酸结石在患者中产生任何症状之前在其发作时检测胱氨酸结石，从而减少患者痛苦并允许治疗优化。
15.因此，第一方面，本发明提供s-甲基-l-麦角硫因，其用于诊断和/或预后。
16.第二方面，本发明提供用于诊断和/或预后肾病的方法，所述方法包括测定受试者的分离的测试样品中s-甲基-l-麦角硫因的量的步骤。
17.如以下实施例所述，在胱氨酸尿动物模型中，尿中s-甲基-l-麦角硫因的量低于对照动物(野生型-wt)。因此，s-甲基-l-麦角硫因是决定或推荐启动治疗性干预以避免、预防或减少尿石病的有用工具。
18.第三方面，本发明提供用于决定或推荐是否启动对疑似患有肾病的受试者的治疗性干预的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)测定所述受试者的分离的测试样品中s-甲基-l-麦角硫因的量；和
19.(b1)如果s-甲基-l-麦角硫因的量在患有肾病的受试者的参考值范围内，则决定或推荐开始治疗性干预；或者，
20.(b2)将所述受试者的分离的测试样品中所述s-甲基-l-麦角硫因的量与参考值进行比较，所述参考值为未患有肾病的受试者的参考值；其中，如果步骤(a)中测量的s-甲基-l-麦角硫因的量低于参考值，则指示受试者必须开始治疗性干预。
21.第四方面，本发明提供用于测定治疗性干预在已经诊断患有肾病的受试者中的功效的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在所述治疗性干预之前测量所述受试者的分离的测试样品中s-甲基-l-麦角硫因的量；(b)一旦治疗性干预开始，测量受试者的分离的生物样品中s-甲基-l-麦角硫因的量；和(c)比较步骤(a)和(b)中测得的量，使得如果步骤(b)中测得的s-甲基-l-麦角硫因的量高于步骤(a)中测量的s-甲基-l-麦角硫因的量，则指示所述医疗方案能有效治疗肾病；或者，所述方法包括以下步骤：(i)一旦治疗性干预开始，测量受试者的分离的测试样品中s-甲基-l-麦角硫因的量；和(ii)将步骤(i)中测得的量与s-甲基-l-麦角硫因的参考值进行比较，所述参考值为未患有肾病的受试者的参考值，或所述参考值为在之前测试时刻患有肾病的受试者的分离的测试样品中s-甲基-l-麦角硫因的量，
其中，如果步骤(i)中测得的s-甲基-l-麦角硫因的量不低于参考值，则指示所述医疗方案能有效治疗肾病。
22.第五方面，本发明提供装置用于在如上定义的方法中测定s-甲基-l-麦角硫因的量的用途。
23.第六方面，本发明提供s-甲基-l-麦角硫因作为用于在受试者的分离的测试样品中诊断和/或预后肾病的标记物的用途。
24.另一方面，本发明提供s-甲基-l-麦角硫因/l-麦角硫因之比，其用于诊断和/或预后。
25.本发明人还开发了用于胱氨酸结石的新疗法。
26.令人惊讶的是，如以下实施例所示，本发明人发现施用麦角硫因(erg)预防或延迟胱氨酸尿小鼠模型中肾结石的出现。
27.目前对胱氨酸结石的药理治疗是基于硫醇基试剂，其通过断裂二硫键来溶解胱氨酸结石，从而形成更易溶于尿的混合半胱氨酸二硫化物化合物。这些已知的药物表现出不同程度的功效和强的次级作用，这将它们的使用限制在短时间内(halperin ec等人，同上)。因此，胱氨酸尿患者呈现高的疾病复发率，这可导致感染和肾衰竭。
28.出乎意料的是，本发明人发现施用麦角硫因不仅预防和延迟胱氨酸结石形成，而且在胱氨酸尿小鼠中也不产生任何副作用。这将允许长期治疗胱氨酸尿患者，从而极大降低结石病发生和复发。不希望受理论束缚，本发明人发现的麦角硫因的不同作用机制可能是其非凡性质的原因。与目前使用的硫醇基试剂相反，麦角硫因不直接作用于胱氨酸结石。但是，它刺激谷胱甘肽的合成，并增加肾细胞中半胱氨酸、甲硫氨酸、g-谷氨酰基-半胱氨酸的细胞内水平和半胱氨酸/胱氨酸的细胞内比例，并降低尿的氧化还原电位。
29.本文提供的新疗法显示的显著优势是可用于预防或甚至治疗人患者的胱氨酸结石的明确指示。事实上，如以下实施例所示，麦角硫因使形成结石的小鼠的数量减少50％；并且，相对于未处理的小鼠，形成结石的其余50％延迟了1个月，此外，形成的结石的生长速率更低。
30.鉴于以上，本文提供的针对胱氨酸结石的新疗法构成医学领域，特别是用于治疗这种遗传性病症的巨大进步。
31.因此，第七方面，本发明提供麦角硫因，其用于治疗和/或预防肾结石或氨基酸尿。
32.该方面还可确切表达为麦角硫因在制备用于治疗和/或预防选自肾结石和氨基酸尿的疾病的药物中的用途。该方面还可确切表达为用于治疗和/或预防选自肾结石和氨基酸尿的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的麦角硫因。
33.麦角硫因的作用机制使其特别适于用胱氨酸增溶剂补充目前使用的疗法。它们的组合使用将允许同时去除形成的结石，并预防形成新的结石。此外，施用麦角硫因可允许降低目前治疗的毒性。
34.因此，第八方面，本发明提供麦角硫因，其用于与选自额外的胱氨酸增溶剂、l-胱氨酸二甲酯、l-胱氨酸甲酯、l-胱氨酸二酰胺、硫辛酸及其组合的化合物联合治疗，用于治疗和/或预防肾结石或氨基酸尿。
35.该方面还可确切表达为麦角硫因在制备用于与选自额外的胱氨酸增溶剂、l-胱氨酸二甲酯、l-胱氨酸甲酯、l-胱氨酸二酰胺、硫辛酸及其组合的化合物联合治疗以治疗和/
或预防选自肾结石和氨基酸尿的疾病的药物中的用途。该方面还可确切表达为用于治疗和/或预防选自肾结石和氨基酸尿的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的麦角硫因与选自额外的胱氨酸增溶剂、l-胱氨酸二甲酯、l-胱氨酸甲酯、l-胱氨酸二酰胺、硫辛酸及其组合的化合物的联合。
36.附图简要说明
37.图1.6月龄雄性小鼠尿中l-erg和s-met-l-erg的测定。6月龄wt和slc7a9-/-(ko)雄性小鼠的尿中l-erg和s-met-l-erg浓度。每个点表示样品，条表示平均值
±
sem。mann-whitney概率测试值显示在每个图表的顶部。
38.图2.不同年龄雄性小鼠尿中l-erg和s-met-l-erg浓度的差异。3月龄和6月龄wt和slc7a9-/-(ko)雄性小鼠的尿中l-erg和s-met-l-erg浓度。条表示平均值
±
sem。mann-whitney概率测试值表示为3月龄vs.6月龄的**，p≤0.01***，p≤0.001，和wt vs.ko的 ，p≤0.001。
39.图3.小鼠尿中l-erg和s-met-l-erg浓度的性别相关差异。6月龄wt和slc7a9-/-(ko)小鼠的尿中l-erg和s-met-l-erg浓度。条表示平均值
±
sem。mann-whitney概率测试值表示为*，p≤0.05，**，p≤0.01，***，p≤0.001，****，p≤0.0001vs.雄性小鼠，和 ，p≤0.05， ，p≤0.001vs.wt小鼠。“m”表示雄性，和“f”表示雌性。
40.图4.结石形成者和非形成者胱氨酸尿小鼠中l-erg和s-met-l-erg尿浓度。3月龄(a)和6月龄(b)胱氨酸尿小鼠(slc7a9-/-)的尿中l-erg和s-met-l-erg浓度与按性别区分的胱氨酸结石的存在(sf)或不存在(nsf)有关。在检测到结石时将结石形成者(sf)小鼠细分为：esf，3月龄前检测到结石，和lsf，3月龄后检测到结石。条表示平均值
±
sem。mann-whitney概率测试值表示为p≤0.1，*，p≤0.05，**，p≤0.01，***，p≤0.001，vs.非结石形成小鼠，和 ，p≤0.05， p≤0.05， ，p≤0.001vs.雄性小鼠。“m”表示雄性，和“f”表示雌性。
41.图5.胱氨酸尿小鼠的尿s-met-l-erg/l-erg之比。a.在结石形成者(sf)和非结石形成者(nsf)slc7a9-/-小鼠中的尿s-met-l-erg/l-erg之比。条表示平均值
±
sem。mann-whitney概率测试值表示为*，p≤0.05，***，p≤0.001，****，p≤0.0001vs.非结石形成小鼠。b.显示尿s-met-l-erg/l-erg之比在区分sf和nsf方面的表现的接受者-操作者特征曲线。auc，曲线下的面积。y轴表示真阳性分数，并且x轴表示假阳性分数。
42.图6(与实施例2有关).l-erg处理引起的代谢变化。在用饮用水中补充的不同浓度的l-erg处理之前(初始，左条，“b”)和之后(最终，右条，“a”)，通过小鼠表面(a)、ph(b)和氧化还原电位(c)标准化水摄取。每个点表示一个小鼠。wilcoxon测试结果。由于尿体积低于ph和氧化还原电极的下限，不能在所有经处理小鼠中测定ph和氧化还原电位。在用饮用水中补充的不同浓度的l-erg处理之前(b)(初始，左条)和处理之后(a)(最终，右条)，用于可视化目的的半对数标度的尿l-erg浓度(d)和s-met-l-erg(e)浓度。每个点表示小鼠，并且条表示平均值
±
sem。在所有小图中，ns，非显著；用wilcoxon符号秩检验，*p《0.05。处理之前的初始值对应于每个图(a-e)中的左侧条和/或每个l-erg测试剂量。处理之后的最终值对应于每个图(a-e)中的右侧条和/或每个l-erg测试剂量。x轴表示l-erg(mg/l)，并且y轴表示水摄取/体重
2/3
之比(ml/kg
2/3
)(a)；ph(b)；orp(mv)(c)；[尿中l-麦角硫因(μm)(d)；尿中[s-甲基-l-麦角硫因](μm)(e)。
[0043]
图7(与实施例2有关).l-erg处理的结石病小鼠的结石生长速率。用饮用水中的
60mg/l l-erg处理(erg)或不处理(c)雄性和雌性小鼠3个月。y轴表示结石生长速率(mg/天)。条表示通过13-15只小鼠的x射线成像每月测定的结石生长速率的平均值
±
sem。每个点表示对每只小鼠测定的胱氨酸结石生长速率。
[0044]
图8(与实施例2相关).慢性(6个月)l-erg处理对胱氨酸结石发作和代谢参数的影响。(a)对胱氨酸结石发作的影响。显示了l-erg处理(erg)和未处理的小鼠(对照)在6个月处理和尸检期间的结石病小鼠的百分比。y轴表示胱氨酸结石的％，并且x轴表示处理时间，以月表示。(b)对结石生长速度的影响。通过线性回归模型计算每只小鼠在具有多于2个数据点的那些结石上的结石生长速率。y轴表示结石生长速率(mg/天)。条显示未处理的小鼠(c，n＝7)和l-erg处理的小鼠(erg，n＝3)的平均值
±
sem。统计分析的结果显示在顶部。(c)对尿ph的影响。在处理期结束时监测l-erg处理(erg)和未处理(c)小鼠的尿ph。(d)对尿氧化还原电位的影响。在处理期结束时监测l-erg处理(erg)和未处理(对照)小鼠的尿orp。统计分析的结果显示在顶部。在(c)和(d)中，大黑点表示平均值，小黑点位于离群值的框之上和之下。
[0045]
图9(与实施例2相关).l-erg增加了转硫化途径组分的细胞内肾浓度。该图显示了长期处理和未处理小鼠肾脏中的转硫化途径的那些代谢物的细胞内含量。y轴表示nmol/mg蛋白质。(a)中的谷胱甘肽(gsh)；(b)中的氧化谷胱甘肽(gssg)；(c)中的gsh/gssg比；(d)中的半胱氨酸(cys)；(e)中的胱氨酸(cssc)；(f)中的cys/cssc比；(g)中的s-腺苷高半胱氨酸(sah)；(h)中的s-腺苷甲硫氨酸(sam)；(i)中的sam/sah比；(j)中的甲硫氨酸(met)；(k)中的γ-谷氨酰半胱氨酸(γglucys)；和(l)中的胱硫醚。每个点表示小鼠，条表示平均值
±
sem。在所有小图中；用wilcoxon符号秩检验，*p《0.05，**，p≤0.01，***，p≤0.001，****，p≤0.0001。
[0046]
图10(与实施例3相关).来自c57bl6/j遗传背景中胱氨酸尿的两种不同小鼠模型(slc7a9-/-或slc3a1
d140g
)的胱氨酸尿小鼠中的尿orp(mv)。来自i型胱氨酸尿小鼠模型129s2/svpascrl(slc3a1
e383k
)的初步数据。用wilcoxon符号秩检验，*p《0.05，**，p≤0.01。
[0047]
发明详述
[0048]
除非另有说明，否则本技术中所用的所有术语应以本领域已知的普通含义理解。本技术中使用的某些术语的其它更具体的定义如下所述，并且除非另有明确阐述的定义提供了更广泛的定义，否则其旨在统一地应用于整个说明书和权利要求书。
[0049]
如本文所用，不定冠词“一”和“一个”与“至少一个”或“一个或多个”同义。除非另有说明，本文使用的定冠词，例如“所述”也包括该名词的复数形式。
[0050]
如本文所用，“诊断”理解为变得知晓受试者中的特定医学病症并发症或风险；确定疾病或病症的性质；或将一种疾病或病症与另一种区分开。它既是指尝试确定或鉴定可能的疾病或病症的过程，也是指通过该过程获得的意见。在诊断程序的意义上，诊断可被认为是将个体的病症分类为允许作出关于治疗和预后的医学决定的单独且不同的类别的尝试。随后，诊断意见通常根据疾病或其它病症来描述。然而，诊断可以采取多种形式。它可能是检测疾病、病变、功能障碍或残疾的存在和命名的问题。它可能是将类别归属于管理或预后的练习。它可以指示连续体上的异常程度或分类中的异常类型。
[0051]
本文所用的“预后”是指预测疾病的可能发展和结果。在本案中，在特定的实施方案中，预后是指将发展为结石病的患者与将不发展为结石病的患者之间的区分。
[0052]
在本发明中，在本发明的方法中提及的术语“参考值”应理解为由样品或样品组中所述分子标志物的量得到的s-met-l-erg的预定值。样品取自受试者或受试者组，其中疾病的存在、不存在、阶段、组织学亚型或等级、或病程之间已适当进行。该值用作区分存在待分析病症的受试者与不存在此类病症的受试者的阈值。该参考值也可用于确定受试者是否必须启动医疗方案以及该方案有多有效。从其得到参考值的一个或多个受试者可包括其中病症不存在的受试者、其中病症存在的受试者或两者。利用一般知识，本领域技术人员能够选择更适于获得本发明的每种方法的参考值的受试者或受试者组。从所选择的受试者组中获得参考值的方法在现有技术中是众所周知的(burtis c.a.et al.,2008,chapter 14,section“statistical treatment of reference values”)。在特定情况下，“参考值”是通过常规roc分析(接受者-操作者特征分析)定义的截止值。本领域技术人员将理解，优化截止值将根据所述诊断或预后方法的特定应用来定义：用于诊断或预后的目的、目标人群、特异性和敏感性之间的平衡等。本文所用的术语“参考值”可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；个数值范围；平均值；中值；均值或与特定对照或基线值相比的值。
[0053]
当生物标志物的水平高于所述参考值至少1.5％，至少2％，至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，至少150％或更高时，认为生物标志(在本发明中为l-erg或s-met-l-erg中的任一种)的水平高于其参考值。同样，在本发明的上下文中，当样品中生物标志物的水平低于参考值时，所述生物标志物的水平降低。当生物标志物的水平低于所述参考值至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，至少150％或更高时，认为生物标志物的水平低于其参考值。
[0054]
本文所用的“治疗”是指涵盖完全或部分缓解或恢复患者的健康。“治疗性干预”是指施用适于特定疾病的治疗。在具体实施方案中，治疗性干预包括施用麦角硫因。
[0055]
术语“胱氨酸增溶剂”是指具有增加胱氨酸在尿道中的溶解度的能力的化合物。特别地，这些化合物是基于硫醇的试剂，例如青霉胺，其破坏胱氨酸的二硫键并形成混合的半胱氨酸二硫化物化合物。“额外的胱氨酸增溶剂”旨在包括除麦角硫因之外的任何胱氨酸增溶剂。
[0056]
表述“药物组合物”涵盖旨在用于人以及用于非人动物(即兽医用组合物)的两种组合物。特别地，麦角硫因还可用于治疗家畜，例如猫和狗，已知它们也会发展胱氨酸结石症。本发明的药物组合物含有治疗有效量的麦角硫因。如本文所用的表述“治疗有效量”是指当施用时足以预防所解决的疾病或病症的一种或多种症状的发展或在一定程度上减轻所解决的疾病或病症的一种或多种症状的化合物的量。根据本发明施用的试剂的具体剂量当然将由围绕该病例的具体情况决定，包括施用途径、所治疗的具体病症和类似的考虑。
[0057]
表述“药学上可接受的载体或赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物。每种组分在与药物组合物的其它成分相容的意义上必须是药学上可接受的。它还必须适用于与人和非人动物的组织或器官接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其它问题或并发症，具有合理的利益/风险比。
[0058]
合适的药学上可接受的赋形剂的实例是溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不期望的生物效应或以有害方式与药物组合物的任何其它组分相互作用，否则预期其用途在本发明的范围内。
[0059]
本发明的药物组合物中麦角硫因、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、大小和/或病症以及进一步根据组合物的施用途径而变化。
[0060]
用于制备药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散剂和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。赋形剂如着色剂、包衣剂、甜味剂和调味剂可以根据配制者的判断存在于组合物中。
[0061]
含有麦角硫因的药物组合物可以以任何剂型存在，例如固体或液体，并且可以通过任何合适的途径施用，例如口服、肠胃外、局部、鼻内或舌下途径，为此它们将包括配制所需剂型所必需的药学上可接受的赋形剂。
[0062]
本领域技术人员清楚的是，组合物可以使用现有技术的赋形剂并应用常用的药物技术来制备。
[0063]
剂型可以是固体药物组合物，例如片剂或包衣片剂、粉末、细颗粒、颗粒、胶囊(例如硬或软明胶胶囊)、锭剂(锭)、大丸剂和含有麦角硫因的可咀嚼制剂。
[0064]
或者，药物组合物可以是半固体或液体剂型，例如凝胶(例如水凝胶)、乳膏、软膏、洗剂、油包水或水包油乳液、悬浮液、气溶胶和液体制剂(如溶液)、酏剂、糖浆(包括干糖浆)。
[0065]
如果本发明的含有麦角硫因的药物组合物为口服施用的固体制剂(如片剂)或口服或经鼻施用的液体制剂的剂型，则其可以每日一次或数次以每日剂量分次向患者施用。
[0066]
在含麦角硫因的组合物的制备中，可以使用多种目前使用的添加剂，例如一种或多种填充剂、增稠剂、胶凝剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、包衣剂、缓释剂、稀释剂和/或一种或多种赋形剂。除了上述之外，如果需要，本发明的试剂还可以包含其它添加剂，例如增溶剂、缓冲剂、防腐剂、等渗剂、乳化剂、悬浮剂、分散剂、硬化剂、吸收剂、粘合剂、弹性剂、吸附剂、香料、着色剂、矫味剂、抗氧化剂、湿润剂、遮光剂、增白剂、增粘剂、油、压片助剂和/或抗静电剂。
[0067]
更具体地，这样的添加剂的实例包括一种或多种赋形剂，例如乳糖、玉米淀粉、甘露醇、d-山梨醇、结晶纤维素、赤藓醇和蔗糖；粘合剂，例如羟丙基纤维素(hpc-l)、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和胶凝淀粉；崩解剂，例如羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠和交联聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮)；润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石；香料，例如调味料或芳族油如苹果香精、蜂蜜香精、1-薄荷醇、香草醛、柠檬油、肉桂油、薄荷油或胡椒薄荷油；和/或吸附剂(如合成硅酸铝)和轻质无水硅酸。
[0068]
此外，还可以通过使用目前使用的包衣剂(如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素或聚乙烯基吡咯烷酮)制备包衣的药物制剂。
[0069]
如果需要，同样可以使用甜味剂，例如锭剂、糖浆剂和咀嚼制剂等。这种甜味剂的具体实例是甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、淀粉浆、麦芽提取物膏、麦芽糖醇、山梨醇、蔗糖、未精
炼的糖、果糖、乳糖、蜂蜜、木糖醇、绣球花茶、糖精、阿斯巴甜、环己氨基磺酸盐、天冬氨酰苯丙氨酸酯和其它麦芽糖寡糖，以及寡糖如麦芽糖基蔗糖、还原型异麦芽糖和棉子糖、乙酰氨基磺酸钾或任何种类的糖醇或其混合物如山梨糖醇、甘露醇和/或木糖醇。
[0070]
作为增溶剂，可以使用任何已知的适用于医学领域的增溶剂，例如聚乙二醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(例如泊洛沙姆188)、四甘醇、精氨酸、赖氨酸、蓖麻油、丙二醇、丙酮缩甘油、聚山梨醇酯、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、胆固醇、12-羟基硬脂酸-peg660-酯、丙二醇单硬脂酸酯、聚氧-40-氢化蓖麻油、聚烃氧基-10-油烯基-醚、聚烃氧基-20-鲸蜡基-硬脂基醚和聚烃氧基-40-硬脂酸酯或其混合物。
[0071]
可以使用已知用于药物领域的任何防腐剂，例如乙醇、苯甲酸及其钠盐或钾盐、山梨酸及其钠盐或钾盐、氯代丁醇、苯甲醇、苯基乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、选自phb酯的那些，例如phb-甲酯与phb-丙酯的混合物，季铵化合物如苯扎氯铵、硫柳汞、苯基汞盐(如硝酸盐，硼酸盐)。
[0072]
用于获得所需ph值的缓冲体系可以是例如甘氨酸、甘氨酸和hcl的混合物、甘氨酸和氢氧化钠溶液的混合物、及其钠和钾盐、邻苯二甲酸氢钾和盐酸的混合物、邻苯二甲酸氢钾和氢氧化钠溶液的混合物或谷氨酸和谷氨酸盐的混合物。
[0073]
合适的胶凝剂例如为纤维素及其衍生物，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚(乙烯)醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、泊洛沙姆、黄蓍胶、角叉菜胶、淀粉及其衍生物或任何其它用于制药技术的胶凝剂。
[0074]
可以提及的增粘剂是例如上述少量的胶凝剂、甘油、丙二醇、聚乙二醇或多元醇，如山梨醇和其它糖醇。
[0075]
除了现有技术已知的乳化剂之外，所用的乳化剂可以包括蓖麻油的聚氧乙烯衍生物或聚氧乙烯烷基醚。
[0076]
可以使用药物领域已知的合适的合成或天然着色剂，例如靛蓝胭脂红。
[0077]
可以存在的合适的油性组分是现有技术中已知的用于制备药物的任何油性物质，例如植物油，特别是例如棉籽油、花生油(groundnut oil)、花生油(peanut oil)、玉米油、菜籽油、芝麻油和大豆油，或中等链长的甘油三酯，例如分馏的椰子油，或肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸酯或矿物油或油酸乙酯。
[0078]
所用的抗氧化剂可以是现有技术中已知的任何抗氧化剂，例如α-生育酚、丁基羟基甲苯(bht)或丁基羟基苯甲醚(bha)。
[0079]
取决于剂型，含有这些添加剂的药物组合物可以根据本领域已知的任何方法制备。当然，在根据本发明使用的制剂中可以使用未明确讨论的其它添加剂。
[0080]
如上所述，本发明人首次发现s-met-l-erg与医学疾病或病症有关。因此，本发明提供用于诊断和/或预后的s-甲基-l-麦角硫因。
[0081]
s-甲基-l-麦角硫因是麦角硫因的已知甲基衍生物形式。
[0082]
麦角硫因具有iupac名称[1-羧基-2-(2-亚硫基-1,3-二氢咪唑-4-基)乙基]-三甲基氮杂铵，cas号497-30-3，和式(i)：
[0083][0084]
s-甲基-l-麦角硫因具有iupac名称(2-{s})-3-(2-甲硫基-1-{h}-咪唑-5-基)-2-(三甲基氮杂铵基)丙酸酯和式(ii)：
[0085][0086]
在任选与上文或下文提供的任何实施方案组合的特定实施方案中，s-甲基-l-麦角硫因用于诊断和/或预后肾病。在一个更具体实施方案中，肾病是肾结石或氨基酸尿。在另一个具体实施方案中，肾结石是胱氨酸结石。在一个更具体实施方案中，所述氨基酸尿是胱氨酸尿。
[0087]
如上所述，本发明的第二方面提供了用于诊断或预后肾病的方法，该方法包括测定受试者的分离的测试样品中s-甲基-l-麦角硫因的量的步骤。
[0088]
在任选与上文或下文提供的任何实施方案组合的上述方法的特定实施方案中，所述方法还包括将所述受试者的s-甲基-l-麦角硫因的量与参考值比较的步骤，其中如果在所述受试者中测定的量在患有肾病的受试者的参考值(参考值)范围内，则指示所述受试者疑似患有所述肾病；并且其中如果所述量在健康受试者或未患有任何肾病(特别是未患有肾结石或氨基酸尿)的受试者的值的范围内，则指示所述受试者不疑似患有所述肾病。
[0089]
在任选与上文或下文提供的任何实施方案组合的上述方法的特定实施方案中，所述方法还包括将受试者的s-甲基-l-麦角硫因的量与参考值比较的步骤，其中如果在受试者中测定的量不同于参考值，所述参考值为健康受试者或未患有任何肾病的受试者的参考值，则指示受试者疑似患有肾病。在一个具体实施方案中，如果在受试者中测定的量低于参考值，所述参考值为未患有肾病，特别是未患有肾结石或氨基酸尿的受试者的参考值，则指示受试者怀疑患有肾病。在另一个更具体实施方案中，如果在受试者中测定的量低于参考值，则指示不良预后。
[0090]
如下面的实施例所示，本发明人发现尿样中s-甲基-l-麦角硫因和l-麦角硫因的量之比为用于区分结石病小鼠和非结石病小鼠提供了更好的统计学结果(图5b)。事实上，s-甲基-l-麦角硫因/l-麦角硫因之比允许使用两种不同的分析方法以100％的特异性和灵敏度对小鼠进行分类。
[0091]
因此，在任选与上文或下文提供的任何实施方案组合的上述方法的特定实施方案中，所述方法还包括测定受试者的分离的测试样品中麦角硫因的量的步骤。在甚至更具体的实施方案中，该方法还包括测定受试者的分离的测试样品中麦角硫因的量并计算s-甲基-l-麦角硫因与l-麦角硫因的量之比的步骤。
[0092]
在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的上述方法的特定实施方案中，
所述方法还包括以下步骤：测定受试者的分离的测试样品中l-麦角硫因的量，计算s-甲基-l-麦角硫因与l-麦角硫因的量之比，并将所述比率与参考值比较，其中如果在受试者中测定的比率在患有肾病的受试者的参考值(参考值)的范围内，则指示所述受试者疑似患有所述肾病；并且其中如果所述比率在健康受试者或未患有任何肾病(特别是未患有肾结石或氨基酸尿)的受试者的值的范围内，则指示受试者不疑似患有所述肾病。
[0093]
在任选与上文或下文提供的任何实施方案组合的上述方法的特定实施方案中，所述方法还包括以下步骤：测定受试者的分离的测试样品中l-麦角硫因的量，计算s-甲基-l-麦角硫因与l-麦角硫因的量之比，并将所述比率与参考值比较，其中如果在受试者中测定的比率不同于参考值，所述参考值为健康受试者或未患有任何肾病，特别是未患有肾结石或氨基酸尿的参考值，则指示受试者疑似患有肾病。在更具体的实施方案中，如果在受试者中测定的比率低于所述参考值，则指示受试者疑似患有肾病。
[0094]
s-甲基-l-麦角硫因和l-麦角硫因水平可按照诊断学领域的常规技术测定。本领域技术人员可以调整技术的参数以获得最佳结果。因此，在上述方法的特定实施方案中，s-甲基-l-麦角硫因和/或l-麦角硫因的量通过质谱、高效液相色谱(hplc)、衍生化、化学检测及其组合来测定。
[0095]
如上所述，本发明的另一方面提供在如上定义的方法中测定s-甲基-l-麦角硫因的量的装置的用途。
[0096]
在任选与上文或下文提供的任何实施方案组合的特定实施方案中，所述装置形成试剂盒的一部分。
[0097]
如本文所用，术语“试剂盒”是指含有进行本发明方法所需的不同试剂(或试剂装置)的产品，所述试剂被包装以允许其运输和储存。适于包装试剂盒的组分的材料包括晶体、塑料(例如聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯)、瓶、小瓶、纸或包膜。
[0098]
在本发明的具体实施方案中，用于测定s-甲基-l-麦角硫因的量的装置包括同位素标记的s-甲基-l-麦角硫因和/或l-麦角硫因，更特别地氘化s-甲基-l-麦角硫因和/或l-麦角硫因，并且该方法通过向测试样品中添加标记的s-甲基-l-麦角硫因和/或标记的l-麦角硫因作为添加化合物或混合物来进行。在更具体的实施方案中，装置包括同位素标记的s-甲基-l-麦角硫因和同位素标记的l-麦角硫因的混合物。
[0099]
在使用同位素标记的s-甲基-l-麦角硫因和/或l-麦角硫因的该特定实施方案中，还包括在该方法中用作阳性对照手段的包含非同位素标记的s-甲基-l-麦角硫因和/或l-麦角硫因的装置。
[0100]
因此，用于实施本发明方法的具体试剂盒包含或由以下组成：具有包含同位素标记的s-甲基-l-麦角硫因和/或l-麦角硫因的组合物的第一小瓶；以及具有包含s-甲基-l-麦角硫因和/或l-麦角硫因的组合物的第二小瓶。在这些试剂盒中，第一小瓶包括用于将测试的分离样品添加到用于质量控制(qc)测试的标准曲线中的装置。第二小瓶包括制备标准曲线的装置。
[0101]
另外，本发明的试剂盒可包含同时、依次或分别使用不同装置以测定试剂盒中s-甲基-l-麦角硫因和/或l-麦角硫因的量的说明书。所述说明书可以是印刷材料的形式或能够存储易于阅读或理解的说明书的电子载体的形式，例如电子存储介质(例如磁盘、磁带)或光学介质(例如cd-rom、dvd)或音频材料。附加地或可选地，介质可以包含提供所述说明
书的因特网地址。
[0102]
如上所述，本发明另一方面提供s-甲基-l-麦角硫因作为用于在受试者的分离的测试样品中诊断和/或预后肾病的标志物的用途。在具体实施方案中，s-甲基-l-麦角硫因与l-麦角硫因一起用作在受试者的分离的测试样品中诊断和/或预后肾病的标志物。在更具体的实施方案中，s-甲基-l-麦角硫因和l-麦角硫因的量之比用作在受试者的分离的测试样品中诊断和/或预后肾病的标记。
[0103]
在任选地与以上或以下提供的任何实施方案组合的以上定义的方法和用途的特定实施方案中，分离的测试样品选自血清、血浆、唾液、胸膜液、脑脊液(csf)、血液、羊水、尿液、粪便、粘液、细胞提取物和脓液。在任选地与以上或以下提供的任何实施方案组合的更具体的实施方案中，分离的测试样品是尿样。
[0104]
在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的以上定义的方法和用途的特定实施方案中，受试者患有氨基酸尿。在更具体的实施方案中，所述氨基酸尿是胱氨酸尿。如以下实施例所示，本发明的方法特别可用于诊断患有胱氨酸尿的受试者的胱氨酸结石。
[0105]
已知各种哺乳动物由于在尿中产生胱氨酸异常积聚的情况而在肾中形成胱氨酸结石。本发明的方法可应用于所有这些方法。因此，在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的上文定义的方法和用途的另一个特定实施方案中，受试者是哺乳动物。在更具体的实施方案中，哺乳动物是家畜哺乳动物。在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的另一特定实施方案中，哺乳动物是人。
[0106]
在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的用于如上公开的用途、上文定义的方法和用途的s-甲基-l-麦角硫因的特定实施方案中，肾病是肾结石或氨基酸尿。在更具体的实施方案中，肾结石是胱氨酸结石。在另一个具体实施方案中，氨基酸尿是胱氨酸尿。
[0107]
因此，在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的特定实施方案中，所述方法用于诊断胱氨酸结石症。更特别地，该方法用于诊断患有胱氨酸尿的受试者的胱氨酸结石。在另一个具体实施方案中，所述方法用于胱氨酸尿的预后。本发明的方法可用于确定胱氨酸结石的存在，也可用于预测患有胱氨酸尿的受试者中胱氨酸结石的出现。
[0108]
如上所述，尽可能快地诊断尿石病以提供足够的治疗和避免由大肾结石产生的并发症(即阻塞、感染和肾衰竭)是特别重要的。本发明的方法允许这种及时诊断。
[0109]
本文提供的所有方法和用途可通过测定分离的测试样品中s-甲基-l-麦角硫因的量，或s-甲基-l-麦角硫因和l-麦角硫因的量并计算s-甲基-l-麦角硫因/l-麦角硫因之比来进行。
[0110]
因此，如上所述，在另一方面，本发明提供s-甲基-l-麦角硫因/l-麦角硫因之比，其用于诊断和/或预后。所有以上提供的实施方案还旨在应用于该另外的方面。
[0111]
发明人还认识到未形成胱氨酸结石的胱氨酸尿小鼠模型的尿氧化还原电位或氧化还原状态(orp)低于形成结石的小鼠中的尿orp。因此，也提出该参数用于胱氨酸尿动物(包括人)的体外鉴别诊断或预后。
[0112]
氧化还原电势(也称为氧化/还原电势，orp)是化学物种(即分离的样品；尿)从电极获取电子或从电极丧失电子，从而分别被还原或氧化的趋势的量度。氧化还原电势以伏特(v)或毫伏(mv)测量。每种物质具有其自身固有的氧化还原电位；例如，还原电位越正(由
于电化学中的一般形式而更经常使用还原电位)，物质对电子的亲和力和被还原的倾向越大。
[0113]
在以上公开的用于诊断或预后肾病，特别是肾结石或氨基酸尿，更特别是本文提供的胱氨酸结石症和胱氨酸尿的任何方法的更特别的实施方案中，该方法进一步包括：
[0114]
(a)测定受试者的分离样品，特别是尿样中的氧化还原电位(orp)；
[0115]
(b)将(a)的orp与参考值进行比较；和
[0116]
(c)如果(c1)orp在未形成结石的受试者的参考值范围内，或如果(c2)orp低于参考值，所述参考值从之前分类为形成结石的受试者获得，则将受试者诊断为未形成结石的受试者。
[0117]
术语“未形成结石的受试者”是指由于所述尿中的环境条件以及由于任何其它更复杂的原因(遗传背景、饮食等)，受试者具有在尿中形成结石的低或零趋势。
[0118]
因此，除了测定s-甲基-l-麦角硫因，或测定s-甲基-l-麦角硫因和l-麦角硫因的量外，用orp测定，通过检测具有更高的形成结石倾向的受试者获得关于疾病诊断或预后的额外可靠信息。然后，该信息对于开始适当的治疗性干预的建议或决定是有用的。
[0119]
本发明还涉及orp作为肾病的单一诊断或预后标志物的用途，更特别是肾结石或氨基酸尿，甚至更特别是胱氨酸结石或胱氨酸尿的诊断或预后标志物的用途。因此，本发明包括用于肾病的诊断或预后的体外方法，其包括测定受试者的分离样品，特别是尿中的氧化还原电位。在该方法的更具体的实施方案中，然后如上所述，将分离样品的所述orp与参考值进行比较，以将受试者分类为未形成结石的受试者或分类为形成结石的受试者。
[0120]
本发明的体外方法提供了诊断和/或预后信息。在一个实施方案中，本发明的方法还包括以下步骤：(i)收集诊断和/或预测信息，和(ii)将信息保存在数据载体中。
[0121]
在本发明的意义上，“数据载体”应被理解为包含用于肾结石和氨基酸尿的鉴别诊断和/或预后的有意义的信息数据的任何装置，例如纸。载体还可以是能够携带预后数据的任何实体或装置。例如，载体可以包括存储介质，例如rom，例如cd rom或半导体rom，或磁记录介质，例如软盘或硬盘。此外，载体可以是可传输的载体，例如电或光信号，其可以经由电缆或光缆或通过无线电或其它装置来传送。当诊断/预测数据体现在可通过电缆或其他设备或装置直接传送的信号中时，载体可由此类电缆或其他设备或装置构成。其它载体涉及usb设备和计算机存档。合适的数据载体的实例是纸、cd、usb、pc中的计算机存档、或具有相同信息的声音注册。
[0122]
本发明还提供了用于治疗患有肾结石或氨基酸尿，特别是胱氨酸尿的患者的方法，所述方法包括以下步骤：
[0123]
(a)测定受试者的分离的测试样品中s-甲基-l-麦角硫因的量，和任选地l-麦角硫因的量，并计算s-甲基-l-麦角硫因和l-麦角硫因的量之比；
[0124]
(b)将(a)中确定的量或比率与参考值进行比较；和
[0125]
(c1)其中如果(a)中测定的水平低于参考值，所述参考值为未患有肾结石或氨基酸尿的受试者，或(c2)其中如果(a)中测定的水平在患有肾结石或氨基酸尿的受试者的参考值范围内，则向有此需要的受试者施用药学有效量的胱氨酸增溶剂。
[0126]
本发明还提供了用于治疗患有肾结石或氨基酸尿的患者的方法，所述方法包括以下步骤：
[0127]
(a)测定受试者的分离的测试样品中s-甲基-l-麦角硫因的量，和任选地l-麦角硫因的量，并计算s-甲基-l-麦角硫因和l-麦角硫因的量之比；
[0128]
(b)将(a)中确定的量或比率与参考值进行比较；和
[0129]
(c1)其中如果(a)中测定的水平低于参考值，所述参考值为未患有肾结石或氨基酸尿的受试者，或(c2)其中如果(a)中测定的水平在患有肾结石病或氨基酸尿的受试者的参考值范围内，则向有需要的受试者施用药学有效量的麦角硫因。
[0130]
如前所述，本发明人还开发了对氨基酸尿和相关肾结石的有效和安全的治疗。
[0131]
在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的如上所述使用的麦角硫因的特定实施方案中，肾结石是胱氨酸结石。
[0132]
在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的如上所述使用的麦角硫因的另一特定实施方案中，氨基酸尿是胱氨酸尿。
[0133]
在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的如上所述使用的麦角硫因的具体实施方案中，麦角硫因以药物组合物的形式与一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体一起施用。在更具体的实施方案中，药物组合物是口服药物组合物。
[0134]
在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的特定实施方案中，麦角硫因以0.01-500mg/kg体重/天的剂量施用。在更具体的实施方案中，剂量为0.05-300mg/kg体重/天。在甚至更具体的实施方案中，剂量为0.1-200mg/kg体重/天。
[0135]
如上所述，本发明还提供麦角硫因，其用于与选自其它胱氨酸增溶剂、l-胱氨酸二甲酯、l-胱氨酸甲酯、l-胱氨酸二酰胺、硫辛酸及其组合的化合物联合治疗，用于治疗和/或预防肾结石或氨基酸尿。
[0136]
用于上述用途的麦角硫因的所有实施方案也适用于联合治疗中使用的麦角硫因。
[0137]
在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的以上定义的用于联合治疗的麦角硫因的特定实施方案中，额外的胱氨酸增溶剂选自：青霉胺、硫普罗宁、卡托普利和布西拉明。在更具体的实施方案中，胱氨酸增溶剂选自青霉胺和硫普罗宁。
[0138]
在如上定义的用于联合治疗的麦角硫因的具体实施方案中，麦角硫因与选自其它胱氨酸增溶剂、l-胱氨酸二甲酯、l-胱氨酸甲酯、l-胱氨酸二酰胺、硫辛酸及其组合的化合物同时、依次或分开施用。
[0139]
在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的如上所述的麦角硫因的用途的特定实施方案中，麦角硫因是l-麦角硫因。
[0140]
因此，在任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合的具体实施方案中，本发明提供用于治疗和/或预防肾结石或氨基酸尿的l-麦角硫因。更特别地，l-麦角硫因用于治疗和/或预防胱氨酸结石症或胱氨酸尿。
[0141]
在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和该词语的变型不旨在排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。
[0142]
此外，词语“包含”涵盖“由
…
组成”的情况。本发明的其它目的、优点和特征对于本领域技术人员而言在阅读本说明书后将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践而获知。提供以下实施例和附图作为说明，并且它们不旨在限制本发明。与附图相关并置于权利要求中的括号内的附图标记仅用于尝试增加权利要求的可理解性，而不应被解释为限制权利要求的范围。此外，本发明涵盖本文所述的特定和优选的实施方案的所有可能组合。
erg的代谢物)的浓度在slc7a9-/-雄性小鼠中显示出显著降低(图1)。这些结果表明尿中s-met-l-erg可以用作胱氨酸结石的生物标志物。
[0164]
寻找如在人中所报道的与年龄相关的任何差异，然后发明人研究了上述状况是否在另一年龄保持。在3月龄时，在wt和胱氨酸尿雄性小鼠之间没有检测到血液、血浆或rbc中l-erg浓度的差异，但是当比较6月龄与3月龄时，对于所有小鼠检测到rbc中l-erg浓度显著两倍增加(数据未显示)。类似地，在6月龄时尿中l-erg浓度也显著较高，并且检测到与年龄相关的s-met-l-erg的尿浓度没有差异(图2)。
[0165]
为了检查与性别有关的差异，发明人然后如上所述研究了血液和尿液中l-erg和尿液中s-met-l-erg的浓度。在3月龄时，在血液、血浆或rbc中的l-erg浓度中没有观察到与性别相关的差异，除了rbc中的l-erg浓度降低33％(p＝0.093)(数据未显示)。但s-met-l-erg的尿浓度在wt和slc7a9-/-雌性小鼠中均显著降低几乎2倍。此外，在雌性slc7a9-/-小鼠对雌性wt小鼠中检测到该代谢物浓度的显著降低和l-erg的显著增加(数据未显示)。
[0166]
相反，在6月龄雌性胱氨酸尿小鼠中，在血液、血浆和rbc中检测到l-erg浓度的性别相关的显著变化。在血液和rbc中观察到几乎2倍的减少和在血浆中观察到30％减少。在雌性小鼠的尿中观察到类似的情况，其中s-met-l-erg的浓度降低几乎2倍，而l-erg的浓度降低约30％(图3)。此外，雌性胱氨酸尿小鼠中l-erg的rbc浓度降低30％，并且雌性胱氨酸尿小鼠中s-met-l-erg的尿浓度显著低于雌性wt小鼠30％。
[0167]
与胱氨酸结石存在相关的尿中l-erg浓度差异
[0168]
胱氨酸尿的标志之一是胱氨酸尿患者和小鼠中存在胱氨酸结石。因此，发明人分析了3月龄和6月龄结石和非结石形成者胱氨酸尿小鼠中l-erg和s-met-l-erg的尿浓度(图4)。l-erg尿浓度在早期结石形成者(esf)雌性小鼠中显著较低(图4a)，同时s-met-l-erg在3月龄的esf雌性中(图4a)和在两种年龄的esf雄性中较高(图4a-b，对于3月龄的雄性，p＝0.062)。也可鉴定两种性别间两种年龄时l-erg和s-met-l-erg的差异，其中在雌性中的浓度通常较低，除了3月龄时的l-erg浓度(图4a-b)。发明人研究了s-met-l-erg的尿浓度是否可用于通过接受者-操作者特征(roc)曲线区分小鼠中的结石病表型，并获得超过0.65的曲线下面积，这表明s-met-l-erg可用作结石病生物标志物。
[0169]
由于s-met-l-erg是l-erg代谢的亚产物，发明人研究了s-met-l-erg和l-erg之比是否显示出与结石病表型相关的差异。如图5a所示，结石形成者(sf)小鼠中的比率通常显著低于非结石形成者(nsf)小鼠的2-3倍。由于该结果如此清楚，发明人研究了s-met-l-erg和l-erg的尿浓度之比是否可用于通过接受者-操作者特征(roc)曲线来区分小鼠中的结石病表型。如图5b所示，超过0.8的曲线下面积表明在胱氨酸尿小鼠中使用该比率作为结石病生物标志物的可能性。发明人想知道，根据年龄或性别，该比率的性能是否存在任何差异，证实在所有情况下都非常相似或略好。
[0170]
发明人还研究了胱氨酸结石的大小(以干重测定)与比率之间是否存在相关性，并观察到两个变量之间的轻微相关性(r＝0.28，p＝0.084)。
[0171]
因为已经表明l-erg通过octn1转运(slc22a4)并且s1c22a4-/-小鼠在肾脏中缺乏l-erg，所以发明人将s1c22a4-/-小鼠与slc7a9-/-小鼠杂交以产生双ko(slc7a9-/-s1c22a4-/-)以观察显示出结石病表型的小鼠的比例是否存在差异。
[0172]
与在slc7a9-/-小鼠中一样，对于所有s1c22a4基因型，雌性结石病小鼠的百分比显
著高于雄性。s1c22a4-/-的那些ko小鼠的结石病小鼠的百分比高8％，表明octn1是小鼠中胱氨酸结石的遗传调节剂。该基因也存在于人中(ncbi gene id 6583，或uniprot kb数据库idq9h015，2007年5月1日的序列第3版)，因此很可能相同的机制适用于该物种。引人注目的结果是在40周龄时，除了slc7a9-/-s1c22a4
/-(对于s1c22a4而言杂合)之外，结石病雌性的百分比高于雄性，在该年龄时，结石病雄性的百分比显示没有s1c22a4基因型相关的差异。
[0173]
为了更好地理解该结果，发明人分析了在3月龄的胱氨酸尿背景(slc7a9-/-)中缺乏octn1的小鼠(slc22a4)尿中l-erg和s-met-l-erg的量。在小鼠尿中可检测到与slc7a9-/-和wt小鼠相似的l-erg水平，但s-met-l-erg的量在slc7a9-/-小鼠中显著降低50％(p＝0.0022)。在slc7a9-/-背景中敲除s1c22a4产生尿中l-erg(对于s1c22a4
/-，p＝0.0382，对于s1c22a4-/-，p＝0.0138)和s-met-l-erg浓度的显著降低，其中s-met-l-erg的浓度低于所用方法的定量限。
[0174]
如所预期的，s1c22a4-/-小鼠显示比s1c22a4
/-小鼠更低的l-erg浓度。该数据表明另一种转运蛋白可能参与从饮食中吸收l-erg，但由于在尿中不能检测到代谢产物(s-met-l-erg)，因此需要octn1将l-erg转运到细胞中。
[0175]
实施例2：胱氨酸尿小鼠模型中胱氨酸结石的处理
[0176]
方法
[0177]
小鼠护理如实施例1所示。
[0178]
l-erg处理
[0179]
对小鼠施用三种不同的处理：对于结石病小鼠，1个月、3个月(亚慢性)和6个月(慢性暴露)。在所有情况下，在饮用水中施用l-erg。
[0180]
对于1个月的处理，向标准笼中的8只3月龄的雄性和雌性小鼠提供15或60mg/l的l-erg，持续4周，其中8只小鼠(4只雄性和4只雌性)自由获取水和食物。
[0181]
为了评价l-erg对结石病小鼠的作用，将15只小鼠(8只雄性和7只雌性)对饮用水中的60mg/l l-erg处理，并将13只小鼠(4只雄性和9只雌性)不做处理作为对照。在处理期开始时小鼠为10.9-26-9周龄，其中对照和l-erg处理组的平均年龄分别为15.3
±
1.4和16.9
±
1.01周。在3个月的处理期间，每周监测水摄取和小鼠体重。
[0182]
对于慢性暴露(6个月处理)，从断奶开始每笼4-6只小鼠处理6个月。为了控制l-erg剂量，监测水摄取和小鼠体重，并调节饮用水中的l-erg浓度以在第一个月内每3天和之后每周获得16mg/kg日剂量。在处理的最后一周，将所有小鼠单独笼养在代谢笼中以收集尿液，其中每天监测水摄取和小鼠体重。
[0183]
体内x射线成像检测胱氨酸结石
[0184]
使异氟烷麻醉的小鼠经受x射线成像以用于结石病检测并且遵循制造商的成像参数在相应的图例中指示的年龄用已知重量的胱氨酸石的校准曲线用ivis lumina xr series iii(caliper lifescience-vertex techniques)进行随访。使用与仪器一起提供的动态图像软件，通过手动划定结石面积进行结石定量，并从校准曲线内插估计的重量。
[0185]
对于生长速率分析，当超过2个数据点可用时，使用线性回归模型。模型中回归线的斜率用作生长速率。
[0186]
样品收集
[0187]
在任何处理期的最后一周，将小鼠单独圈养在代谢笼中4天，其中第一天作为适应
期。每天监测小鼠体重、水和食物摄取以及排泄的尿。收集24h尿样并保存在-80℃下直至用50μl在异丙醇中的百里酚10％作为防腐剂进一步分析。用ph计(cat.no.5209,crison)测定ph，并且用orp电极(cat.no.5265,crison)在室温下在microph 2000(crison)上测定氧化还原电位。
[0188]
最后一天，用异荧烷麻醉小鼠，通过心内穿刺取出血液，收集肾脏，称重并储存在-80℃下直至进一步使用。如果存在胱氨酸结石，将其取出、干燥、称重并在室温下储存。
[0189]
尿液中化合物浓度的分析
[0190]
在通过10kda mwco旋转过滤器(amicon ultra 0.5ml,millipore)过滤后，用制造商指定的肌酸酐测定试剂盒(sigma)测定解冻尿样中的肌酸酐浓度。
[0191]
如实施例1所述测定尿液中的l-erg和s-met-l-erg分析。为了测定转硫化途径代谢物浓度，使用预冷的研钵和杵在干冰上研磨冷冻的肾脏。然后，将100mg粉末状肾在补充有10mm nem的400μl pbs中均质化。为了诱导蛋白质沉淀，添加4％的pca，并将样品在4℃下在微型离心机中以10,000rpm离心15分钟。将上清液转移至新管中并储存在-80℃下直至进一步分析。通过uplc-ms/ms(escobar j,et al.development of a reliable method based on ultra-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry to measure thiol-associated oxidative stress in whole blood samples.j.pharm.biomed.anal.2016；123:104-112)测定转硫途径代谢物的细胞内含量。将蛋白质沉淀重悬于400μl 1m naoh中并通过bca蛋白质测定试剂盒(thermoscientific)将上清液用于测定总蛋白质浓度。
[0192]
l-erg-cys体外结合试验
[0193]
在室温下，在ph＝7.2的0.2m na2hpo4和ph＝11的硼酸缓冲液(ref.33650-1l，fluka)中的两种条件下体外测定l-erg与其自身和与cys的反应性17小时。通过lc/ms-ms测定l-erg-l-erg和l-erg-cys二聚体和胱氨酸的存在。
[0194]
统计分析
[0195]
非参数分析(wilcoxon-mann-whitney检验)用于使用rstudio评估显著性。如果p《0.05，统计显著性被认为是阳性的。
[0196]
结果
[0197]
首先，通过研究饮用水中两种不同浓度(15和60mg/l)的1个月l-erg处理对水摄取和尿ph和orp以及l-erg浓度的影响，确定处理小鼠的最佳工作剂量。进行了以下观察：
[0198]
i)在处理结束时，在通过表面标准化的水摄取中的任何测试的l-erg浓度的统计学非显著增加(分别为p＝0.11和p＝0.08)(图6a)，特别是在雌性中(性别数据未显示)；ii)在60mg/l时ph的统计学显著增加(图6b)，以及在15mg/l时ph的统计学非显著增加(p＝0.052)，尤其是在雄性中(数据未显示)；iii)尿氧化还原状态或电位(orp)的统计学非显著降低(图6c)；和iv)尿中l-erg和s-met-l-erg浓度的统计学显著增加(分别为图6d和6e)。有趣的是，在两种测试条件之间发现了l-erg和s-met-l-erg的尿浓度差异。在15mg/l时，l-erg和s-met-l-erg浓度分别增加3倍(3.4
±
0.4)和6倍(5.9
±
0.6)。在60mg/l时，l-erg和s-met-l-erg的增加分别为175倍(174.6
±
38.4)和15倍(14.7
±
1.9)。这些差异表明在60mg/l时，l-erg的内源性库和代谢可能接近饱和。为了最大化尿中可获得的l-erg的量，取饮用水中60mg/l的l-erg浓度用于进一步测定，其对应于13.6
±
1.6mg/kg/天的平均值
±
sem计算
剂量(数据未显示)。
[0199]
l-erg处理不改变胱氨酸结石生长(3个月)
[0200]
首先通过在3个月期间用x射线每月监测经处理和未经处理小鼠中的胱氨酸结石生长来检查l-erg处理(对饮用水60mg/l)对结石病小鼠中胱氨酸结石进展的影响。在测试条件下没有观察到处理对胱氨酸结石生长的影响(p＝0.61)(图7)。由于胱氨酸尿小鼠可具有多个或单个结石，还分析了对每种类型是否有影响。单个或多个结石均未观察到统计学显著影响(分别为p＝0.78和p＝0.41；数据未示出)。为了观察处理对不同代谢参数的影响，还分析了对尿ph和氧化还原状态以及表面校正的水摄取的影响，并且观察到在处理之前和之后l-erg处理的动物没有差异(数据未显示)。实验期间估计的平均值
±
sem l-erg剂量为(17.24
±
0.69mg/kg/天)。
[0201]
l-erg处理预防或延迟胱氨酸结石发作(erg处理6个月)
[0202]
然后，通过从断奶6个月后处理胱氨酸尿小鼠测试l-erg是否对胱氨酸结石形成有任何影响。考虑到之前对成年小鼠的实验，设定目标剂量为16mg/kg/天。为使小鼠生长，在整个实验期间监测小鼠生长和水摄取并调节饮用水中l-erg浓度，考虑了根据tordoff等人的结果(参见tordoff mg,bachmanov aa,reed dr.forty mouse strain survey of water and sodium intake.physiol.behav.2007；91:620-31)通过体表校正的水摄取。在6个月期间估计的平均值
±
sd剂量为16.25
±
6.29(数据未显示)。为了分析对结石病发作的影响，在6个月的处理期间，每月对处理和未处理的小鼠进行x射线成像。观察到结石病小鼠数量减少50％，与小鼠性别无关的延迟的结石病发作(图8a)(数据未显示)和l-erg处理组中结石生长几乎统计学显著减少(图8b)。
[0203]
为了分析长期处理的效果，测定尿ph和氧化还原电位，没有观察到尿ph的差异(图8c)，并且在l-erg处理的小鼠中观察到统计学显著更多的尿减少(图8d)。这种长期处理显示对水摄取或小鼠体重没有影响(数据未显示)。
[0204]
l-erg增加转硫化途径的组分的细胞内肾浓度
[0205]
l-erg的抗氧化能力可以解释尿氧化还原电位的降低，但其本身并不解释减少的结石病和所进行的两种不同处理之间在结石生长速率上观察到的差异。为了了解l-erg对胱氨酸结石的作用方式，首先通过lc/ms-ms在ph＝7.2和ph＝11的两种条件下体外分析二聚体l-erg-cys的形成(数据未显示)。既没有检测到l-erg-cys，也没有检测到l-erg-l-erg二聚体，这表明l-erg的作用方式并不暗示通过猝灭其一部分而降低l-cys浓度。
[0206]
与非结石病小鼠相比，s-met-l-erg(l-erg代谢物)和l-erg在结石病中的尿浓度之间的较低比率(参见实施例1中的数据)清楚表明胱氨酸结石中涉及细胞内机制。在这个意义上，已经报道l-erg通过上调nrf2激活谷胱甘肽(gsh)合成(kerley rn,et al.the potential therapeutic effects of ergothioneine in pre-eclampsia.free radio.biol.med.2018；117:145-157)和，在鉴定胱氨酸尿和wt小鼠之间的差异蛋白质表达的蛋白质组方法中，已经显示参与gsh合成的一些酶如anpep(anpe)、gpx1(gpx1)和gstt1(gstt1)和胱氨酸代谢如cdo1(cdo1)在胱氨酸尿小鼠肾刷状缘中下调。基于此，分析了慢性处理和未处理小鼠的肾脏中的转硫化途径的那些代谢物的细胞内含量。数据如图9(a-l)所示，gsh(1.4x)，cys(1.6x)，γ-谷氨酰半胱氨酸(1.7x)和met(1.7x)的胞内浓度显著增加约1.5倍，胱氨酸(11.1x)和s-腺苷高半胱氨酸(sah)(1.2x)的胞内浓度在l-erg处理的鼠中显
(feliubadalo等，同上)或slc3a1
d140g
)的胱氨酸尿小鼠中的尿orp显著更高。slc3a1
d140g
模型公开于peter et al.,“a mouse model for cystinuria type i”,hum mol genet.-2003vol.1；12(17),pp.:2109-20。来自i型胱氨酸尿小鼠模型129s2/svpascrl(slc3a1
e383k
)的初步数据显示出类似的结果，考虑了当测定时由该模型产生的散发性胱氨酸结石的量非常有限。所有这些数据示于图10中，并清楚地表明尿orp可用于胱氨酸结石的诊断或预后。当考虑两种性别时，尽管所有组均保持趋势，但c57bl6/j中仅来自slc7a9-/-的雄性和来自slc3a1
d140g
的雌性显示尿orp的显著降低(性别数据未显示)。
[0220]
有趣的是，129s2/svpascrl小鼠模型的非结石形成者组中的尿orp显著低于(p＝1.9e-09
)slc3a1
d140g
小鼠模型，尽管在两种模型中相同的基因受到影响，表明存在涉及尿orp的遗传因子。
[0221]
引文列表
[0222]
halperin ec et al.,“the use of d-penicillamine in cystinuria:efficacy and untoward reactions”,yale j biol med.,1981,vol.54(6),pp.439-46.
[0223]
burtis c.a.et al.,2008,chapter 14,section“statistical treatment of reference values”.
[0224]
kato y.et al.,“gene knockout and metabolome analysis of carnitine/organic cation transporter octn1”,pharm.res.,2010；vol 27,pp.832-40.
[0225]
sotgia s.et al.,“plasma l-ergothioneine measurement by high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis after a pre-column derivatization with 5-iodoacetamidofluorescein(5-iaf)and fluorescence detection”.antopolsky m,ed.plos one 2013；vol.8:e70374
[0226]
zinellu a.et al.,“assay for the simultaneous determination of guanidinoacetic acid,creatinine and creatine in plasma and urine by capillary electrophoresis uv-detection”,j.sep.sci.,2006
[0227]
escobar j,et al.,“development of a reliable method based on ultra-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry to measure thiol-associated oxidative stress in whole blood samples$.j.pharm.biomed.anal.2016；123:104-112 tordoff mg,bachmanov aa,reed dr.forty mouse strain survey of water and sodium intake.physiol.behav.2007；91:620-31
[0228]
kerley rn,et al.,the potential therapeutic effects of ergothioneine in pre-eclampsia.free radio.biol.med.2018；117:145-157
[0229]
feliubadalo et al.,“slc7a9-deficient mice develop cystinuria non-l and cystine urolithiasis”hum mol genet 2003；vol 12；pp.2097-2108
[0230]
peter et al.,“a mouse model for cystinuria type i”,hum mol genet.-2003 vol.1；12(17),pp.:2109-20.
[0231]
banjac et al.,“the cystine/cysteine cycle:a redox cycle regulating susceptibility versus resistance to cell death”；2008；oncogene；vol.27(11)；pp.1618-28.