芝麻SiERF103基因在增强植物抗性中的应用的制作方法

芝麻sierf103基因在增强植物抗性中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及芝麻sierf103基因在增强植物抗性中的应用。


背景技术：

2.芝麻(sesamum indicum l.)是我国的特色油料作物，栽培历史久远，遍布全国各地，在世界范围内均有种植，中国是主要的生产国和贸易国，但自给不足。近年来，我国芝麻的产量下降严重，这与芝麻在生长发育过程中受到干旱、水涝等各类非生物胁迫的影响有着很大的关系。芝麻产业技术体系曾对我国大部分芝麻主产区的调查分析发现，我国芝麻常年受到渍害和干旱胁迫影响，严重影响了芝麻的生长发育，是造成芝麻减产的重要原因。因此，提高芝麻抗旱和耐渍性，促进高产稳产，对促进我国芝麻生产发展、解决总量自给不足问题尤为重要。目前关于芝麻抗旱和耐渍相关基因功能的研究还比较匮乏，分子相关的研究报道也相对较少，因此发掘芝麻抗逆功能基因，对开展芝麻抗逆分子育种、提高芝麻抗逆能力具有重要意义。
3.植物在生长发育中时常会受到诸多环境因素的影响，当胁迫发生时，植物可以迅速激活大量的应激反应基因并合成各种功能蛋白，通过形成一系列复杂的信号网络来抵御不利的环境，维持其自身正常的生理机能，达到规避胁迫伤害的目的。转录因子是一类能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分子，在植物逆境抗性中发挥了重要作用。如拟南芥rap2.2通过调控adh1、pdc1等低氧胁迫相关基因、糖类代谢及乙烯合成相关基因的表达来抵抗低氧胁迫。水稻sub1a
‑
1在淹水条件下抑制乙烯的产生以及生长和新陈代谢相关基因的转录，减少淀粉和糖的分解，使植物体保持低的新陈代谢状态而存活下来。芝麻作为重要的油料作物，分离鉴定其抗逆基因对于培育抗逆芝麻新品种具有非常重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术的空白，提供了芝麻sierf103基因在增强植物抗性中的应用，通过sierf103基因在模式植物转基因拟南芥中的过量表达实验，首次证实了芝麻sierf103基因具有增强植物渍害抗性和干旱抗性的功能，为植物抗旱和耐渍育种提供了基因资源。
5.本发明的目的之一在于提供了麻sierf103基因在增强植物抗性中的应用，其中所述芝麻sierf103基因的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示，所述抗性包括：抗渍害和/或抗干旱。
6.进一步地，所述芝麻sierf103基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no.2所示。
7.进一步地，用于扩增所述芝麻sierf103基因的引物序列如序列表seq id no.3
‑
4所示。
8.本发明的目的之二在于提供了一种包含上述芝麻sierf103基因的载体和/或细胞在增强植物渍害抗性和/或干旱抗性中的应用。
9.进一步地，所述包含芝麻sierf103基因的载体为克隆载体或过表达载体。
10.进一步地，所述过表达载体为将芝麻sierf103基因与植物表达载体pcambia1301s连接起来构建得到的载体pcambia1301s
‑
sierf103。
11.进一步地，所述包含芝麻sierf103基因的细胞的构建方法为：扩增得到如seq id no.1所示的芝麻sierf103基因，双酶切获得线性化表达载体，将所述芝麻sierf103基因与线性化载体连接并转入受体细胞中，培养筛选鉴定后得到。
12.本发明的目的之三在于提供了所述芝麻sierf103基因，或所述芝麻sierf103基因编码的蛋白，或所述包含芝麻sierf103基因的载体和/或细胞在增强植物耐渍害和/或耐干旱性能的应用。
13.本发明的目的之四在于提供了一种提高植物渍害和/或干旱抗性的方法，包括：将包含芝麻sierf103基因的过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，并侵染植物，得到渍害和干旱抗性提高的植物。
14.进一步地，所述渍害和干旱抗性提高的植物在经过干旱胁迫和/或渍害胁迫处理后，可恢复正常生长。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次报道了芝麻sierf103基因在增强植物抗性中的应用，具体为增强植物渍害抗性和/或干旱抗性。通过构建sierf103基因过表达载体，使其在模式植物拟南芥中过量表达，并进行干旱或渍害胁迫处理，研究发现经干旱或渍害胁迫处理后恢复正常生长条件，可使转基因拟南芥大量恢复正常生长。即本发明证实了芝麻sierf103基因具有提高植物渍害和干旱抗性的功能。这为作物抗旱和耐渍遗传改良提供了基因资源，对于促进作物稳产具有重要意义。
附图说明
16.图1为本发明实施例1中包含sierf103基因的植物表达载体pcambia1301s
‑
sierf103的构建；
17.图2为本发明实施例2中转sierf103基因拟南芥t1代植株荧光定量pcr检测结果；
18.图3为本发明实施例2中转sierf103基因拟南芥抗旱性测定结果，其中图3
‑
a为正常生长和干旱胁迫后恢复生长的转sierf103基因拟南芥和野生型拟南芥表型；图3
‑
b为干旱胁迫后转sierf103基因拟南芥和野生型拟南芥的存活率；
19.图4为本发明实施例2中转sierf103基因拟南芥耐渍性测定结果，其中图4
‑
a为正常生长和渍害胁迫后恢复生长的转sierf103基因拟南芥和野生型拟南芥表型；图4
‑
b为渍害胁迫后转sierf103基因拟南芥和野生型拟南芥的存活率。
具体实施方式
20.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
21.克隆本发明中所述的抗旱相关的基因sierf103的方法是本领域中所常用的方法。提取mrna的方法也有多种成熟的技术，可采用试剂盒(easy spin plus plant rna kit)，其可从商业途径获得(购于aidlab biotechnologies co.,ltd)。构建本发明中所述的载体和将载体转入植株所用到的酶切、连接、花序侵染等方法也是本领域中常用技术。其中所涉及的质粒(pcambia1301)，转染用媒体(根癌农杆菌lba4404和所用试剂成分如蔗糖、kan、潮霉素等)可从商业途径获得。
22.实施例1芝麻sierf103基因的获得与过表达载体构建
23.1、芝麻sierf103基因的获得
24.利用拟南芥erf基因的蛋白序列，通过同源性序列比对分析，在ncbi数据库中鉴定获得114个芝麻erf基因，其中包括sierf103基因(基因登录号为：loc105175593)。
25.为了分析sierf103基因在逆境抗性中的功能，根据sierf103基因的cds序列，设计可以扩增其完整cds序列的引物。取初花期抗逆芝麻品种中芝75渍害胁迫7天后的根组织，用easyspin plus植物rna提取试剂盒(购自aidlab公司)，提取总rna，利用反转录酶(购自vazyme公司)将其反转录合成cdna(方法根据vazyme公司反转录酶试剂说明书操作)。以反转录后的cdna为模板，用设计的引物进行常规pcr扩增。其中设计的引物名称与序列(包含修饰碱基)如下：
26.sierf103fl
‑
f:
27.agctttcgcgagctcggtaccatgagaatgattctcaagaaat(如seq id no.3所示)
28.sierf103fl
‑
r:
29.caggtcgactctagaggatcctcaaaccatctcacttgacacactac(如seq id no.4所示)
30.用上述引物扩增出包含sierf103基因完整编码区的cdna片断，将扩增得到的片段进行测序，获得sierf103基因的核苷酸序列，如seq id no.1所示。由其编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。
31.2、包含芝麻sierf103基因的过表达载体构建
32.将上述扩增得到的芝麻sierf103基因利用同源重组的方法与pcambia1301s(本实验室提供)质粒连接构建植物表达载体，命名为pcambia1301s
‑
sierf103(图谱如图1所示)，具体操作如下：
33.①
首先利用双酶切(kpni和bamhi)(takara)方法获得线性化载体，通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化获得高纯度线性化载体。
34.②
将目的片段dna和线性化载体以3:1的摩尔比加到1.5ml的离心管中进行重组反应，混匀后在37℃水浴中放置约30min，加入10μl的反应液到从
‑
80℃冰箱中取出已于冰上融化10min的50μl dh5a感受态细胞中，移液器轻轻混匀，再于冰上孵育20min，42℃水浴热激45秒后快速置冰上冷却2min。
35.③
洁净台中加入300μl lb液体培养基，37℃孵育60min。13,000rpm离心1min收集菌体，弃部分上清，用剩余的培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有kan抗性的lb固体培养基上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养16
‑
24h。
36.④
挑取若干个重组反应转化的克隆进行菌落pcr鉴定，之后将鉴定为阳性的各个单菌落，分别挑取于含有kan抗生素的液体lb培养基中37℃、200rpm培养箱中过夜培养，提取质粒或将菌液直接测序以及通过酶切电泳来鉴定载体准确性。
37.实施例2芝麻sierf103基因在增强植物渍害和干旱抗性中的应用
38.1、转sierf103拟南芥材料的获得
39.(1)重组载体转入农杆菌lba4404
40.①
每100μl lba4404农杆菌感受态细胞中加入2μg质粒dna，用手轻轻拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。
41.②
加入700μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养5h。13,000rpm离心1min收集菌体，留取100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，将其均匀地涂布于含有kan和rif的lb固体培养基上，28℃培养箱倒置培养2天，挑取若干个阳性克隆，用实施例1中的引物sierf103fl
‑
f/r进行菌落pcr，验证载体pcambia1301s
‑
sierf103已转入根癌农杆菌lba4404中。
42.(2)拟南芥培养
43.①
根据实验需要数出一定数量的拟南芥种子装于无菌的1.5ml离心管中。
44.②
加入1ml 75％乙醇，上下颠倒混匀，弃上清，重复1次。放入37℃200rpm摇床中摇10min表面灭菌。
45.③
弃75％乙醇，加入1ml 95％乙醇，上下颠倒混匀，弃上清，并重复1次。在超净工作台中，向各管种子加入300
‑
500μl无水乙醇，用1ml移液器将种子和无水乙醇一同喷洒到无菌滤纸上。
46.④
待乙醇挥发完，用牙签将已干的拟南芥种子点播于准备好的ms培养基的平板上。
47.⑤
将平板封口，黑暗条件下倒置于4℃春化48h，春化结束后，将平板置于光照培养箱中竖直培养，出苗一周后即可移栽。
48.⑥
用镊子将幼苗栽入小盆的土中，先用保鲜膜保湿48h，置于植物生长间中培养直至拟南芥生长抽薹时(约一个月)，用于转化实验。
49.(3)遗传转化
50.①
农杆菌活化：在20ml的lb液体培养基中分别加入20μl rif和kan，摇匀并接菌，28℃220rpm震荡活化8
‑
10h。
51.②
农杆菌扩大培养：在200ml的lb液体培养基中分别加入200μl rif和kan，再加入5
‑
10ml的活化菌液，28℃220rpm震荡培养14
‑
16h，至od值为1.6
‑
2.0，4500rpm离心10min，沉淀菌体弃上清，自然晾干。
52.③
在沉淀菌体中加入100ml 5％蔗糖溶液重悬菌体，移液器吹打均匀、重悬菌体。
53.④
将离心瓶中菌液加到平皿中，再加入100ml 5％蔗糖溶液，转化前加入40μl silwet
‑
l
‑
77(0.02％)，晃动平皿混匀。
54.⑤
将拟南芥花序合拢，浸入平皿，轻轻晃动15s。
55.⑥
用黑袋子将植株套好，避光保湿24h。
56.⑦
一周后再重复转化一次。
57.(4)t1代阳性植株筛选和荧光定量pcr检测
58.种植拟南芥t0代所收获的种子，将其消毒，接种含30mg/l潮霉素的ms筛选培养基(添加25mg/l头孢霉素抑菌)上22℃光照培养7
‑
10天，筛选获得阳性植株(幼苗和根系都正常生长的植株)，将阳性苗移栽到土壤中，用保鲜膜盖上2
‑
3天后揭膜，然后正常生长。
59.取阳性转基因植株和野生型拟南芥植株的幼嫩叶片，用rna提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取叶片总rna，然后用反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)获得cdna，以各自cdna为模板，以拟南芥β
‑
actin为内参，其中β
‑
actin基因的引物包括：
60.actin
‑
f：5
’‑
cccgctatgtatgtcgcca
‑3’
(如seq id no.7所示)；
61.actin
‑
r：5
’‑
aaccctcgtagattggcacag
‑3’
(如seq id no.8所示)；
62.用sierf103特异引物sierf103qrt
‑
f/r：
63.sierf103qrt
‑
f：5
’‑
gaactacagaggcgtgag
‑3’
(seq id no.5所示)；
64.sierf103qrt
‑
r：5
’‑
ttatcgtaagccaaagc
‑3’
(seq id no.6所示)。
65.对目标基因进行qrt
‑
pcr表达验证(qrt
‑
pcr mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；仪器：roche480)。
66.qrt
‑
pcr检测结果如图2所示，结果表明，以野生型植株为对照，sierf103基因在检测的3个转基因拟南芥株系(sierf103
‑
oe#1，
‑
oe#2，
‑
oe#3)中的表达量均显著提高。
67.将sierf103超量表达的转基因t1代植株进行单株收种，将t1代阳性植株收获的种子继续进行潮霉素筛选获得t2代阳性植株并单株收种。继续繁殖，直至获得纯合的sierf103超量表达转基因材料。
68.2、转基因拟南芥抗旱性测定
69.待t3代纯合转基因拟南芥生长至3对叶时期，分别对拟南芥转基因植株和野生型拟南芥植株进行干旱胁迫(即不浇水)处理14天，然后复水恢复生长7天，观察并统计各组恢复正常生长的株数，计算存活率。其中转基因家系和野生型材料各进行3次重复试验，每个重复对27株植株进行胁迫处理。
70.抗旱性测定结果如图3所示，结果显示，复水后野生型仅有5
‑
7株恢复正常，而转基因材料有23
‑
26株恢复，经计算，约90％的转sierf103基因的拟南芥株系恢复正常生长，而野生型拟南芥只有约22％的植株存活。该结果表明芝麻sierf103基因的过量表达可以显著提高植物的抗旱能力。
71.3、转基因拟南芥耐渍性测定
72.待t3代纯合转基因拟南芥生长至3对叶时期，分别对拟南芥转基因植株和野生型拟南芥植株进行渍害胁迫处理18天，渍害胁迫处理具体为：将种植植株的盒子置于水中，水高于土表面0.5cm，确保植物根部浸没于水中；然后恢复正常生长7天。观察并统计各组恢复正常生长的株数，计算存活率。其中转基因家系和野生型材料各进行3次重复试验，每个重复对27株植株进行胁迫处理。
73.耐渍性测定结果如图4所示，结果显示，经正常处理7天后，野生型有6
‑
9株恢复，转基因材料有18
‑
24株恢复。经计算，75％以上的sierf103超表达转基因株系逐渐恢复至正常生长，而野生型拟南芥只有约25％恢复正常，表明芝麻sierf103基因的过量表达可以提高植物的耐渍能力。
74.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。