一种低温降解玉米秸秆的复合菌剂的制作方法

1.本发明涉及微生物及其应用技术领域，具体涉及一种低温降解玉米秸秆的复合菌剂。


背景技术：

2.东北地区是我国最大的玉米生产区，每年可收获玉米秸秆数千万吨。玉米秸秆一般指收获玉米籽粒后的剩余部分，在过去被认为用处不大，多数被直接弃置甚至焚烧，不仅没有合理的开发利用，还对环境造成了严重污染。然而，玉米秸秆是一种极具潜力的生物质资源，它富含氮、磷、钾、钙、镁和有机质等，利用玉米秸秆还田可以将其中的营养归还给土壤，缓解土壤养分不足，增加土壤肥力；玉米秸秆还田可以增加土壤微生物活性及多样性，使土壤微生物分解土壤中的有机物和养分转化能力大大增强，土壤理化性质得到改善；秸秆还田可以避免资源浪费，实现农业可持续发展。
3.但是，由于玉米秸秆本身纤维素含量高，木质纤维素的结构十分稳定，且我国东北低温地区秋收后地温迅速降低，温低、干燥等实际问题导致玉米秸秆还田腐解缓慢，影响土壤墒情，不仅不能很好利用玉米秸秆改善土壤理化性质，还对农田土壤整地播种质量产生不利影响。利用微生物腐熟菌剂降解秸秆具有能耗低、污染较小、经济成本低等优点。国内现有的秸秆腐熟剂有很多，但其所含的秸秆降解菌主要在中高温或者常温条件下发挥作用，由于环境温度或菌体生长速度的限制，这些菌株不适合在北方地区低温条件下应用。且现有的复合菌系通常是以具有降解木质纤维素能力的菌株和不具备降解木质纤维素的菌株相互作用，来维持其降解能力，且降解过程中需要对秸秆进行预处理，才能达到较好的降解效果。
4.因此筛选或选育在较低温度条件下高效降解玉米秸秆的微生物，制备低温型玉米秸秆腐熟菌剂，无需预处理秸秆，就能促进东北低温地区还田秸秆的高效腐解是亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.基于现有技术的不足，本发明目的在于提供一种低温降解玉米秸秆的复合菌剂，高效腐熟玉米秸秆，加快较低温度下的玉米秸秆还田腐熟速度，提高玉米秸秆的降解率。
6.本发明目的通过如下技术方案实现：
7.一种低温降解玉米秸秆的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂由蜡样芽孢杆菌(bacill sererus)tk-2、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌 (bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegateriumde bary)、莓实假单胞菌(pseudomonas fragi)、绿色木霉(trichoderma viride)、黑曲霉 (aspergillus niger)、白腐菌(phanerochaete)白囊耙齿菌(irpex lacteus)组成，其中莓实假单胞菌培养温度为10℃；所述蜡样芽孢杆菌tk-2是实验室从长白山分离、筛选及诱变处理得到的，其已在中国典型培养物保藏管理中心(cctcc) 进行保藏，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类名为
蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)tk-2，保藏编号为cctcc no：m2021433，保藏日期为2021年4月22日。
8.本发明中所采用的菌株中，除了tk-2和莓实假单胞菌，其余菌株均是在 25～30℃的常温环境中能快速生长，而在低于该温度下的生长活性明显下降，产酶能力受阻的常温菌，在低温环境下，各菌株的生长长势弱，产酶酶活低，导致在低温环境下复合菌剂并不能发挥降解玉米秸秆中木质纤维素的作用。而本发明中蜡样芽孢杆菌tk-2和莓实单胞菌在低温环境下较快生长，在低温环境生长过程中产生丰富的低温代谢物，与上述常温菌复合后，低温代谢产物作为生长因子促进了常温菌在低温环境下出现高活性生长趋势，因而在低温环境下，各菌株也能高效生长和产酶，从而发挥上述协同作用，高效降解玉米秸秆。
9.所述枯草芽孢杆菌的保藏号编为：cctcc m:2019185；
10.所述地衣芽胞杆菌的保藏号编为：cgmcc 1.8805；
11.所述巨大芽孢杆菌的保藏号编为：cgmcc 1.7146；
12.所述莓实假单胞菌的保藏号编为：cgmcc 1.7757；
13.绿色木霉保藏号编为：cgmcc 3.3744；
14.所述黑曲霉的保藏号编为：cgmcc 3.17612；
15.所述白腐菌的保藏号编为：accc 30942；
16.所述白囊耙齿菌的保藏号编为：cgmcc 5.939。
17.木质纤维素降解过程中，通常需要优先将包裹在外面的木质素和半纤维素结构破坏，才能暴露内部的纤维素，与纤维素酶接触进一步降解。因此，常采用分别具有降解纤维素、半纤维素和木质素能力的菌株复合后降解玉米秸秆。漆酶是降解木质素的主要降解酶之一，但是漆酶及其降解产物浓度过高时，会对复合菌剂中的纤维素酶活造成抑制，且木质素在降解过程中降解产物容易重新聚合，无法达到彻底降解。
18.本发明中采用白腐菌和白囊耙齿菌主要降解木质素，其余枯菌主要降解纤维素，其中蜡样芽孢杆菌tk-2能在低温环境下同时产生纤维素酶和降解半纤维素的木聚糖酶。在该体系中，通过白腐菌和白囊耙齿菌的复合，体系中同时存在具有降解木质素的漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶，改变了体系中漆酶的占比，降低漆酶对纤维素酶的抑制，其中蜡样芽孢杆菌tk-2中产生的木聚糖酶除了降解体系中的半纤维素，还作为低分子氧化还原中介体，在漆酶的催化降解过程中起到传递电子的作用，从而提高漆酶的催化降解能力，结合其他木质素降解酶，将漆酶的降解产物进一步降解，从而达到彻底降解木质素的作用，减少降解产物对纤维素的抑制。此外，多种不同产纤维素酶的菌株由于性质差异，得到的纤维素酶性质也存在差异，也减少了漆酶的抑制作用。
19.进一步，上述复合菌剂中各菌株分别进行活化、培养至活菌数达到2x10
8 cfu/ml，然后按照等体积比进行混合。
20.进一步，上述黑曲霉、绿色木霉、白腐菌和白囊耙齿菌采用的活化培养基是lb液体培养基：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l，ph为7.0，分别培养至活菌数均达到2.0
×
108cfu/ml；其余菌株采用pda液体培养基：200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂15g/l，培养至各菌液的活菌数达到2.0
×
108cfu/ml。
21.本发明制备的复合菌剂也适用于其他降解含有大量木质纤维素的秸秆，例如棉花秸秆、藜麦秸秆等。
22.本发明具有如下技术效果：
23.本发明以包括蜡样芽孢杆菌在内的9种菌株形成的复合菌剂，协同增效，在15℃的室内恒温下，降解效率达到38.71％，在1～10℃的自然环境中可以高效降解玉米秸秆，加快腐熟时间，同时具有较高的降解率，30天后玉米秸秆的降解率达到35.93％，且稳定性优异。
附图说明
24.图1：各菌株单独的秸秆液态发酵降解测定。
25.图2：本发明复合菌剂对玉米秸秆固态发酵30天前后腐熟情况对比。
26.图3：本发明复合菌剂对玉米秸秆固态发酵30天前后的扫描电镜图。
27.图4：本发明复合菌剂对玉米秸秆固态发酵过程中产纤维素酶活。
28.图5：本发明复合菌剂对玉米秸秆固态发酵过程中木聚糖的酶活。
29.图6：本发明复合菌剂对玉米秸秆固态发酵过程中降解率曲线图。
30.图7：本发明复合菌剂对玉米秸秆固态发酵中总有机碳含量变化曲线图。
具体实施方式
31.下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
32.实施例1蜡样芽孢杆菌的筛选及诱变
33.(1)分离和筛选
34.采集长白山自然保护区林区5g土样，溶于100ml配制的盐溶液，于10℃， 180rpm下振荡培养2～4h，盐溶液是0.006mm feso4·
7h2o；0.01mmcaco3·
7h2o；0.08mm mgso4·
7h2o；0.07mm mnso4·
7h2o和0.006mmznso4·
7h2o组成。
35.将混匀的土样盐溶液1ml进行不同梯度(10-2
、10-3
、10-4
)稀释，取200ul 的稀释液分别涂布于r2a固体平板中，放置于10℃恒温培养箱中静置培养 7～10d，tsb平板固体培养基表面。
36.tsb平板固体培养基中含有0.5g酵母浸出粉、0.5g蛋白胨、0.5g酪蛋白水解物、0.5g葡萄糖、0.5g可溶性淀粉、0.3g磷酸二氢钾、0.024g无水硫酸镁、 0.3g丙酮酸钠、15.0g琼脂、1000蒸馏水，最终ph 7.2
±
0.2。
37.将挑取的单菌落用生理盐水(0.8％的氯化钠溶液)溶解，用接种环沾取适量菌液在lb固体培养基进行划线培养，经多次传代，结合显微镜观察，挑取菌落形态单一且状态一致的单菌落置于lb液体培养基中，在180rpm和10℃的条件下摇瓶培养3～4d。取摇瓶培养的菌液150ul，测定其od
600
值，利用牙签沾取 od
600
在0.6-0.8之间的菌液，点样至木聚糖-刚果红固体培养基中，将接菌的固体平板转移至10℃恒温培养箱中。挑取生长良好且透明圈最明显的菌株，命名为tk-1，接种至lb液体培养基中，180rpm，10℃下振荡培养。
38.(2)诱变
39.功率100w，诱变工作气体为氦气，气流量12s/m，距离为3mm下进行照射，进行诱变，将诱变后的菌悬液稀释后，取100μl稀释液在pda平板中涂布，置于培养箱中培养。取培养至对数期(od600在0.6～0.8之间)的菌液1ml于 1.5ml的离心管中，10000rpm，离心2min，弃上
清，菌体用生理盐水重悬2次得菌悬液，稀释调节细胞数在10
6-108个/ml。
40.并取150ul的稀释菌悬液进行lb平板涂布后，静置培养3-7d。将lb突变株生长快速的菌株点样至羧甲基纤维素/木聚糖-刚果红固体平板，进行透明圈观察。对透明圈大的菌株进行摇瓶发酵，采用dns法分别进行内切纤维素酶活力和木聚糖酶活力的测定。取40μl酶液加入80μl含有0.2g/ml的木聚糖或纤维素底物中，50℃水浴10min，加入dns试剂240μl，沸水煮沸5min，对照葡萄糖/木糖标准曲线，得生成的还原糖浓度。
41.通过检测各酶活可知，本发明的菌株tk-2具有在低温环境下产纤维素酶和木聚糖酶的能力，纤维素酶和木聚糖酶的酶活分别为28.2iu/ml和 60.57iu/ml。
42.(3)菌株的鉴定
43.菌株tk-2用lb平板培养出来适量菌体，通过革兰氏染色，观察菌株的形态、颜色等，菌株tk-2为一种棒状细菌，具有大体积，不透明，白色毛玻璃状的粗糙表面。通过使用blastn与ncbi数据库中所有可用的16s rdna序列进行比较，相似性最高的结果是芽孢杆菌，结合形态，生理和生化鉴定，其中与蜡样芽孢杆菌的基因组序列上90％以上的相似度，进一步确定突变后的菌株tk-2 为蜡样芽孢杆菌。
44.实施例2
45.各菌株拮抗性测试
46.除了上述蜡样芽孢杆菌tk-2，
47.本发明中还用到枯草芽孢杆菌的保藏号编为：cctcc m:2019185；地衣芽胞杆菌的保藏号编为：cgmcc 1.8805；巨大芽孢杆菌的保藏号编为：cgmcc1.7146；莓实假单胞菌的保藏号编为：cgmcc 1.7757；绿色木霉保藏号编为： cgmcc 3.3744；黑曲霉的保藏号编为：cgmcc 3.17612；白腐菌的保藏号编为： accc 30942；白囊耙齿菌的保藏号编为：cgmcc 5.939。
48.利用平板交叉划线法与点种法对拟定构建菌剂的各种菌株间拮抗性进行测定，具体方法如下：
49.(1)细菌间拮抗性实验
50.将细菌在lb平板上两两交叉划线，15℃恒温倒置培养2-7d，观察两种菌划线的交叉处是否形成无菌区。
51.(2)真菌间拮抗实验
52.将所筛选真菌用10mm规格打孔器接种到tsb固体培养基上的三角形的三个顶点，其余真菌以同样方式接种到正中间，15℃，2-7d观察是否形成无菌区。
53.(3)真菌与细菌间拮抗实验
54.考虑到真菌繁殖产生孢子会盖满平板，先将细菌点种在tsb固体培养基的三角形的三个顶点，15℃培养2d。长出菌落后再将真菌用打孔器接于与细菌正中间。15℃下3-7d观察是否形成无菌区。
55.经测定，所选菌株间没有或无明显拮抗抑制性。
56.实施例3
57.各菌株分别对秸秆液态发酵降解率的测定：
58.称重5.00g玉米秸秆，粉碎过20目筛，并配制赫奇逊氏(hutchinson)培养基(g/l)，将9种菌株按照1％的接种量分别接种于液体发酵培养基中震荡培养48h后，转接入无机盐
培养基中，于15℃、160r/min震荡培养15天，每个处理设3个重复试验，结束后取发酵物烘干称重，测量各菌株对秸秆的降解率。如图3所示，其中黑曲霉的降解效果最好，降解率达到40.75％，比最慢的莓实假单胞菌高出15.54％。其次是白囊耙齿菌和白腐菌，降解率分别为38.77％和38.84％。
59.以蜡样芽孢杆菌tk-2、莓实假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉、6株菌株为基础，该菌系命名为kp，将黑曲霉、白腐菌、白囊耙齿菌3株菌株命名为z5、z6、z7，组合加入其中，通过秸秆液态发酵降解实验筛选出最佳的菌剂组合，各组合液态秸秆的降解率如表1所示。
60.表1：各组合复合菌剂对秸秆降解率
[0061][0062]
由上表可以看出相较于单菌株的秸秆降解效率，复合菌系均有所提高，菌系kp的秸秆降解率43.17％，在此基础上，加入单独降解率最好的黑曲霉(z5)， kp z5降解率达到45.29％，但是kp z5 z7的降解效率明显小于kp z5与 kp z7的组合，甚至较kp组还要略低，由此可以看出菌株降解秸秆的效率绝不是各单菌株降解能力的叠加，微生物之间存在一定的协同效应，此外， kp z6 z7的组合降解率均高于kp z6和kp z7，可见，z6和z7之间存在协同作用，降低了对纤维素酶的抑制，使得降解率得到显著提升，而kp z5 z6 z7 的组合降解率最高，相较于单菌株最多提升了31.08％，故确定了制备菌剂的菌株组合即为上述特定的9种菌株。
[0063]
实施例4
[0064]
低温降解玉米秸秆的复合菌剂的制备，具体是由蜡样芽孢杆菌tk-2(bacillsererus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌(bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegateriumde bary)、莓实假单胞菌(pseudomonas fragi)、绿色木霉(trichoderma viride)、黑曲霉(aspergillus niger)、白腐菌 (phanerochaete)白囊耙齿菌(irpex lacteus)按照等体积组成。其中黑曲霉、绿色木霉、白腐菌和白囊耙齿菌采用的活化培养基是lb液体培养基：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l，ph为7.0，分别培养至活菌数均达到2.0
×
108cfu/ml；其余菌株采用pda液体培养基：200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂15g/l，培养至各菌液的活菌数达到2.0
×
108cfu/ml。
[0065]
所述枯草芽孢杆菌的保藏号编为：cctcc m:2019185；
[0066]
所述地衣芽胞杆菌的保藏号编为：cgmcc 1.8805；
[0067]
所述巨大芽孢杆菌的保藏号编为：cgmcc 1.7146；
[0068]
所述莓实假单胞菌的保藏号编为：cgmcc 1.7757；
[0069]
绿色木霉保藏号编为：cgmcc 3.3744；
[0070]
所述黑曲霉的保藏号编为：cgmcc 3.17612；
[0071]
所述白腐菌的保藏号编为：accc 30942；
[0072]
所述白囊耙齿菌的保藏号编为：cgmcc 5.939；
[0073]
所述蜡样芽孢杆菌tk-2是实验室从长白山分离、筛选及诱变处理得到的，其已在
中国典型培养物保藏管理中心(cctcc)进行保藏，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类名为蜡样芽孢杆菌 (bacillus cereus)tk-2，保藏编号为cctcc no：m2021433，保藏日期为2021 年4月22日。
[0074]
实施例5
[0075]
上述低温降解秸秆复合菌剂的应用效果检测
[0076]
将实施例4制备的复合菌剂，采用固态发酵的方式对玉米秸秆腐熟相关指标进行测定以此作为低温型玉米秸秆降解菌剂降解效果评价的依据。
[0077]
实验的玉米秸秆来自吉林农业大学试验田，收获后的秸秆粉碎成20-30cm 的段状，自然风晾。
[0078]
营养液：酵母提取物10g/l、(nh4)2so
4 10g/l、mgso
4 1.25g/l、cacl
2 0.5g/l、 kh2po
4 2.5g/l、caco
3 0.5g/l、cocl2·
6h2o 0.5g/l、吐温80 1ml/l。
[0079]
固态发酵装置由2个封盖高460mm、桶口内直径210mm、桶直径300mm、桶重1.5kg的发酵桶组成，下方有透气阀门定时通风，保证通气，上方有留有2cm小孔作为出风口。
[0080]
具体步骤：
[0081]
将4kg秸秆放入发酵桶中，添加本发明复合菌剂1200ml，按照总体系固液比1：1补充营养液，，置于15℃环境中发酵。对照组则不添加秸秆发酵复合菌剂计为ck。每隔5d在桶内上中下三处多点取样，充分混匀，定时进行翻堆和通氧，测定秸秆腐熟相关指标。
[0082]
秸秆物理状态测定：
[0083]
每隔5d观察桶内秸秆颜色、形态、味道变化拍照记录结果。
[0084]
表2为秸秆发酵30d物理状态变化情况。
[0085][0086]
外观变化：颜色变化可以反映秸秆的分解及腐殖化程度，图2a-c分别是初始秸秆、30d空白处理ck、与发酵30d添加菌剂秸秆，可以看出，秸秆颜色随发酵时间变长而加深，其中加入菌剂的处理，其颜色呈现出由黄色
→
黄棕
→
黄褐
→
棕褐
→
暗褐的变化过程，颜色逐渐变深，逐渐接近土壤的颜色；其形态上呈现出由松散
→
稀松
→
散块状
→
大块状
→
泥块状的变化过程。空白处理则只是颜色逐渐加深发酵30d呈现轻微棕褐色，形态上仍然松散。
[0087]
发酵秸秆残留物的电镜扫描：
[0088]
取少量秸秆残留物样品并用导电双面胶带固定在样品观测台上，并在真空环境下进行镀金。在材料表面上形成导电膜后，通过扫描电子显微镜(sem， shimadzu s-550，操作电压：15kv)观察玉米秸秆残留物样品(仅观察初始秸秆、添加菌剂发酵30d及空白处理30d的秸秆)。
[0089]
图3a-c分别是初始秸秆、30d空白处理ck、与发酵30d添加复合菌剂降解的秸秆扫描电镜图，从图中可以看出，未处理的玉米秸秆的表面是光滑的并且没有微生物附着。添加菌剂发酵30d可以看出秸秆的原始结构被破坏，产生大量裂缝。因为大量的微生物粘附在玉
米秸秆的表面上，破坏了秸秆的原始结构。这些大的丝状真菌通过狭窄的间隙侵入玉米秸秆的内部，并产生机械效应，例如挤压和膨胀，最终使秸秆分解。而ck处理秸秆表面结构变得粗糙，出现一些裂隙，可能是发酵过程中混入空气中的杂菌。
[0090]
固态发酵酶活的测定：
[0091]
取样品1g，将样水比按1∶50混合，25℃180rpm震荡30分钟，10000rpm 离心10min取上清液即为粗酶液。纤维素酶活，木聚糖酶活的测定方法同上液态酶活测定方法。
[0092]
如图4和图5所示，整个添加复合菌剂后发酵过程中产生了大量纤维素酶与木聚糖酶，其中两种酶活均是程先上升后下降的趋势，并且在20d达到最大值。这是因为微生物在发酵初期加入到一个新的环境，然后经过慢慢适应期之后在中期开始以秸秆为碳源进行快速生长繁殖，进而分泌产生大量纤维素酶与木聚糖酶，而到了发酵后期，随着碳源的减少，微生物活性逐渐降低，相应的纤维素酶活、木聚糖酶随之降低，这个过程纤维素酶和木聚糖酶都保持着较好的酶活，并没有收到漆酶及其降解产物的抑制。
[0093]
降解率的测定：
[0094]
每天从均匀混合的样品中取出10g样品，烘干前，需用自来水进行样品冲洗，直至滴下的水无色，然后将样品置85℃烘干至恒重，准确称重并记录秸秆的重量n
x
。按下列公式：
[0095]wx
＝(n
0-n
x
)/n0计算出0-30d内的秸秤失重率w
x
，
[0096]
其中，n0表示第0天的称取的样品重量，秸秆在发酵过程中损失的重量能直观反应秸秆的腐解效果。图6表示30d内添加本发明复合菌剂降解的玉米秸秆与空白ck组的秸秆降解率的变化曲线。尽管秸秆的降解率都随发酵时间逐渐升高，但是明显看出对比，添加本发明制备的复合菌剂的秸秆30d累计降解达到38.71％，而ck仅仅为10.81％。
[0097]
秸秆全碳含量重铬酸钾法测定采用方法进行测定。秸秆有机碳含量变化可以大致反应在整个发酵过程中微生物的繁殖情况，如图7可以看出秸秆有机碳含量在0-10d变化不明显，微生物在消耗培养基中碳源，10d左右待培养基碳源消耗殆尽，微生物开始主要以秸秆作为碳源生长，有机碳下降速度加快，至整个发酵过程结束，经检测，秸秆中有机碳总量下降至41.52％。
[0098]
室外降解秸秆的降解率的测定：
[0099]
在吉林省吉林农大试验田中，气温1～10℃起伏变化，玉米秸秆收获后将秸秆铺于实验田中，添加本发明复合菌剂，实验田按照每亩施用2kg实施例4制备的复合菌剂，然后灌水，对照组则采用除了蜡样芽孢杆菌tk-2和莓实假单胞菌的其余6种菌作为复合菌剂。
[0100]
结果表明，与对照组复合菌剂相比，本发明中的复合菌剂能将秸秆降解腐熟时间提前到8～10天，较没有添加任何菌剂的秸秆比降解腐熟时间提前了 12～13天，大大节约了腐熟时间，在该低温环境下，30天后玉米秸秆的降解率达到35.93％，而对照组降解率仅仅达到14.47％，不添加任何菌剂的秸秆30天后的降解率仅为6.42％。
[0101]
本发明制备的复合菌剂可以通过离心冷冻制备成冻干粉，更方便使用。