制造抗原特异性T淋巴细胞的方法与流程

技术特征：
1.一种制备用单克隆抗体标记并分选的抗原特异性t淋巴细胞的方法，其中，所述淋巴细胞：a)通过使用载有抗原的自体单核细胞而产生；b)使要产生的调节性t淋巴细胞或效应性t淋巴细胞悬浮在pbs中并用荧光染料在细胞内染色；c)接着避光孵育淋巴细胞；d)随后将淋巴细胞用培养基强力洗涤数次；e)使用细胞内荧光染料染色的调节性t淋巴细胞或效应性t淋巴细胞悬浮在载有抗原的经伽马射线辐照的自体cd14 单核细胞的培养基中；f)将调节性t淋巴细胞或效应性t淋巴细胞与cd14 单核细胞的共培养物与抗cd154和抗cd28抗体共同孵育；g)将共培养物在培养基中孵育；和h)将孵育后的抗原特异性t淋巴细胞基于低强度的细胞内染料进行分类，其中低强度的荧光是抗原特异性的标志，因为荧光损失与增殖强度相关。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调节性t淋巴细胞或效应性t淋巴细胞以以下浓度悬浮：1
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106个细胞/ml pbs。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞用以下荧光染料之一染色：终浓度为1-5μm的cfse或violet blue。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞在室温或37℃孵育20分钟。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自体单核细胞以1:1的单核细胞:淋巴细胞最终比率添加到所述共培养物中。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单核细胞经伽马射线辐照。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，单核细胞和淋巴细胞的所述共培养物与终浓度为5μg/ml的抗cd154抗体和终浓度为5μg/ml的抗cd28抗体一起孵育。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养物在37℃下在5％co2中孵育。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在功能测试中评估对抗原的特异性，所述功能测试中抗原特异性t淋巴细胞比非特异性t淋巴细胞更具活性，其中，在调节性t淋巴细胞的情况下，活性被定义为对效应性t淋巴细胞功能的抑制，而在效应性t淋巴细胞的情况下，活性被定义为增殖强度提高和细胞因子和细胞毒性因子的产生强度提高。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗原特异性t淋巴细胞是基于细胞内染料的低荧光而分选的t淋巴细胞。11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述非特异性t淋巴细胞是基于保留的细胞内染料的高荧光而分选的t淋巴细胞。

技术总结
本发明涉及一种体外制造抗原特异性T淋巴细胞(CellTrAg)的新方法，该细胞用细胞内燃料标记并在载有抗原的单核细胞的存在下扩增，随后基于低强度的细胞内染料进行分类，其中低强度荧光是抗原特异性的标志，因为荧光损失与增殖强度相关。在功能测试中评估抗原特异性，该功能测试中基于低荧光而分选的抗原特异性淋巴细胞在分选过程中比具有高荧光的非特异性淋巴细胞更具活性；在调节性T淋巴细胞的情况下，活性被定义为抑制效应性淋巴细胞功能，而在效应性T淋巴细胞的情况下，活性被定义为增强这些细胞的特征，比如增殖、细胞因子和细胞毒性因子的产生。毒性因子的产生。毒性因子的产生。


技术研发人员：P
受保护的技术使用者：格但斯克医科大学
技术研发日：2020.08.24
技术公布日：2022/4/1