1.本发明属于生物
技术领域：
：，涉及一种双特异性抗体的生产方法。
背景技术：
：：2.肿瘤(tumour)根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类；其中恶性肿瘤疾病是当今社会上危害人类健康的重大疾病，致死程度高居第二，常见肿瘤有肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌等。3.恶性肿瘤由于其个体差异，一般会对大部分患者进行综合治疗，即综合采用手术、化疗、放疗、免疫治疗、中医中药治疗、介入治疗、微波治疗等手段，以期较大幅度地提高治愈率，并改善患者的生活质量。其中免疫治疗(immunotherapy)是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法。免疫治疗的方法有很多，适用于多种疾病的治疗，旨在激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。与以往的手术、化疗、放疗和靶向治疗不同的是，免疫治疗针对的靶标不是肿瘤细胞和组织，而是人体自身的免疫系统，包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。4.目前上市在售的抗体药物多为单克隆抗体，治疗性单克隆抗体已被用于治疗癌症、自身免疫病、炎症和其他疾病，多数是针对一个靶标的特异性。然而，病人接受单克隆抗体治疗可能产生耐药性或无应答，并且有些疾病在体内的影响因素是多方面的，包括不同的信号通路、不同的细胞因子和受体的调节机制等，单一靶点的免疫疗法似乎并不足以摧毁癌细胞。因此，需要通过组合不同的药物，或是使用多特异性抗体的多重靶向策略来实现，如cn109942712a提供了一种抗pd-l1/vegf双特异性抗体，包括：抗pd-l1的抗体或元件；和与所述抗pd-l1的抗体或元件相连接的抗vegf的抗体或元件，可同时与vegf及pd-l1结合，从而发挥对vegf和pd-l1阳性的肿瘤细胞-的治疗作用，双功能抗体虽然是抗体药物研发的方向，但面临诸多挑战，比如临床前评价模型、表达量低、稳定性差、工艺复杂、质控差异性大等问题，因此一直以来双功能抗体的研发困难重重。5.综上所述，针对由于双特异性抗体产业化生产复杂、生产成本高制约了其临床应用的问题，亟需一种既能提高双特异性抗体表达量又不影响其安全性、特异性和纯度且能降低生产成本的方法。技术实现要素：6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种双特异性抗体的生产方法，所述生产方法能够高效生产高纯度双特异性抗体，工艺稳定、可靠且成本低，能够显著促进双特异性抗体的临床应用。7.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：8.本发明提供一种双特异性抗体的生产方法，所述方法包括以下步骤：9.(1)构建生产双特异性抗体的细胞，并进行筛选；10.(2)培养步骤(1)筛选获得的细胞，获得培养液并进行分离纯化，获得双特异性抗体；11.所述细胞包括哺乳动物细胞；12.所述培养的方式包括分批补料培养或灌流培养，所述分批补料培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括dynamistmagttm培养基，所述补料培养基包括cellboosttm7a和cellboosttm7b，所述分批补料培养的温度为31℃～37℃，包括但不限于32℃、33℃、34℃、35℃或36℃，所述分批补料培养的ph为6.8～7.3，包括但不限于6.9、7.0、7.1或7.2，所述分批补料培养的溶氧为10％以上，所述灌流培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括eden-300s培养基和high-intensityperfusioncho培养基，所述灌流培养的温度为31℃～37℃，包括但不限于32℃、33℃、34℃、35℃或36℃，所述分批补料培养的ph为6.8～7.3，包括但不限于6.9、7.0、7.1或7.2，所述灌流培养的溶氧为10％以上。13.本发明中，筛选能够高产双特异性抗体的菌株，对高产菌株进行培养，综合分析影响发酵培养多种因素，通过控制发酵方式、培养基组合、培养温度、培养ph和溶氧，利用各因素协同，实现了高效生产双特异性抗体。14.优选地，所述双特异性抗体包括pd-l1/vegf双特异性抗体。15.优选地，所述pd-l1/vegf双特异性抗体的氨基酸序列包括seqidno.1和seqidno.2所示的序列。16.seqidno.1(双特异性抗体重链)：17.qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrrysiswvrqapgqglewmggiipvfgaakyaqkfqgrvtitadeftstaymelssltsedtavyycalsgdsdafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsgdtgspfvemyseipeiihmtegselvipcrvtspditvtlkkfpldtlipdgkriiwdsrkgfiisdatykeiglltceatvnghlyktnylthrqtntiidvvlspshgielsvgeklvldctartelnvgidfnweypsskhqhkklvnrdlktqsgsemkkflstltidgvtrsdqglytcaassglmtkkdstfvrvhek。18.seqidno.2(双特异性抗体轻链)：19.qsvltqppsasgtpgqrvtiscsgsssnigsntvnwyqqlpgtapklliysnnqrpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyycatwdlslnawvvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs。20.优选地，所述哺乳动物细胞包括hek293细胞或中国仓鼠卵巢(cho)细胞，优选为中国仓鼠卵巢细胞。21.本发明中，通过配制培养基为dynamistmagttmmedium，能够进一步提高双特异性抗体产量。22.优选地，所述分批补料培养的基础培养基中含有f-68biochemica。23.本发明中，在培养基中加入f-68biochemica能够有效解决培养过程中细胞结团问题，从而利于细胞快速生长。24.优选地，所述cellboosttm7a补料流加比例为2％～3％，包括但不限于2.2％、2.4％、2.6％、2.7％、2.8％或2.9％，所述cellboosttm7b补料流加比例为0.2～2.5％，包括但不限于0.3％、0.4％、0.6％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.3％或2.4％。25.优选地，所述分批补料培养的接种密度为不低于0.15×106cells/ml，包括但不限于0.36×106cells/ml、0.38×106cells/ml、0.4×106cells/ml、0.45×106cells/ml、0.5×106cells/ml或0.6×106cells/ml。26.优选地，所述分批补料还包括补加葡萄糖。27.优选地，所述葡萄糖的流加量为1.0～10g/l，包括但不限于1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l。28.优选地，所述灌流培养的补料培养基包括eden-f400a和eden-f200。29.优选地，步骤(2)所述分离纯化包括以下步骤：30.(1’)对所述培养液进行深层过滤，获得澄清液；31.(2’)对所述澄清液进行亲和层析；32.(3’)调节亲和层析产物ph并进行孵育；33.(4’)调节孵育产物ph并进行深层过滤；34.(5’)对深层过滤产物进行阴离子交换层析；35.(6’)对阴离子交换层析产物进行阳离子交换层析；36.(7’)对阳离子交换层析产物进行纳滤。37.本发明中，双特异性抗体存在一定比例的多聚体，严重影响纯化过程中的收率和蛋白纯度，通过控制纯化工艺提升多聚体与双特异性抗体的分离度，能够进一步提高双提异性抗体的收率和纯度。38.优选地，步骤(1’)所述深层过滤的过滤器的滤芯包括zetaplusezp滤芯e16e07a60sp02a(3m公司)。39.优选地，步骤(2’)所述亲和层析的洗脱缓冲液包括醋酸和醋酸钠。40.优选地，步骤(2’)所述亲和层析的层析柱的填料包括mabselectprisma。41.优选地，步骤(3’)所述ph为3～4。42.优选地，步骤(3’)所述孵育的温度为18℃～26℃，包括但不限于19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃，所述孵育的时间为50～70min，包括但不限于51min、52min、53min、54min、55min、56min、60min、61min、62min、65min、66min、67min、68min或69min。43.优选地，步骤(5’)所述阴离子交换层析的层析柱的填料包括captoadhere。44.优选地，所述captoadhere的载量定为≤30g/l。45.优选地，步骤(5’)所述阴离子交换层析在ph为5.8～6.0下进行，优选为5.9。46.优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析的层析柱的填料包括ceramiccm和/或nuviahrs。47.优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析的平衡缓冲液包括醋酸和醋酸钠。48.优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析在ph为5.4～5.6下进行，优选为5.5。49.优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析的洗脱液包括精氨酸。50.优选地，所述洗脱液中精氨酸的浓度为0.18～0.20mol/l。51.优选地，所述分离纯化还包括制备抗体原液的步骤。52.优选地，所述抗体原液的制备方法包括：53.对所述阳离子交换层析的产物进行超滤，使用无菌过滤膜对超滤产物进行过滤，得到所述抗体原液。54.作为优选的技术方案，所述双特异性抗体的生产方法包括以下步骤：55.(1)构建生产双特异性抗体的细胞，并进行筛选；56.(2)培养步骤(1)筛选获得的细胞，获得培养液；57.(3)使用zetaplusezp滤芯e16e07a60sp02a过滤器对所述培养液进行深层过滤，获得澄清液；58.(4)使用mabselectprisma填充层析柱，对所述澄清液进行亲和层析，使用含有醋酸和醋酸钠的洗脱缓冲液进行洗脱；59.(5)调节亲和层析产物ph为5.8～6.0，并于18℃～26℃进行孵育50～70min；60.(6)调节孵育产物ph为5.4～5.6并进行深层过滤；61.(7)使用captoadhere填充层析柱，使用含有醋酸和醋酸钠的平衡缓冲液进行柱平衡，对深层过滤产物进行阴离子交换层析；62.(8)使用ceramiccm和/或nuviahrs填充层析柱，使用含有醋酸和醋酸钠的平衡缓冲液进行柱平衡，对阴离子交换层析产物进行阳离子交换层析；63.(9)对阳离子交换层析产物进行纳滤；64.(10)对所述纳滤产物进行超滤，使用无菌过滤膜对超滤产物进行过滤，得到所述抗体原液。65.所述培养的方式包括分批补料培养或灌流培养。66.所述分批补料培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括dynamistmagttm培养基，所述补料培养基包括cellboosttm7a和cellboosttm7b，所述分批补料培养的温度为31℃～37℃，所述分批补料培养的ph为6.8～7.3，所述分批补料培养的溶氧为10％以上。67.所述灌流培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括eden-300s培养基和high-intensityperfusioncho培养基，所述灌流培养的温度为31℃～37℃，所述灌流培养的ph为6.8～7.3，所述灌流培养的溶氧为10％以上。68.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：69.本发明中，综合分析发酵培养和分离纯化中各种影响因素，通过有效控制，使得各因素间能够有效协同，从而实现高效生产高纯度的双特异性抗体，日产量可达3g/l以上，经纯化后双特异性抗体的sec-hplc纯度可达在90％以上，并对生产工艺进行了放大验证，工艺稳定、可靠且成本低，与现有生产方法相比实现了巨大突破，对于双特异性抗体的广泛临床应用具有重要意义。附图说明70.图1为b1962-vector-3-pchugun-kan质粒结构示意图；71.图2为5l反应器中细胞生长曲线图；72.图3为5l反应器中葡萄糖代谢曲线图；73.图4为5l反应器中乳酸代谢曲线图；74.图5为5l反应器中铵代谢曲线图；75.图6为5l反应器中蛋白表达产量图；76.图7为200l反应器中细胞生长曲线图；77.图8为200l反应器中葡萄糖代谢曲线图；78.图9为200l反应器中乳酸代谢曲线图；79.图10为200l反应器中蛋白表达产量图；80.图11为灌流培养细胞密度图；81.图12为灌流培养细活率图。具体实施方式82.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。83.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。84.实施例185.本实施例构建表达双特异性抗体pd-l1/vegf的细胞株。86.本实施例的生物源性物料为中国仓鼠卵巢细胞(cho，chinesehamsterovary)，表达载体b1962载体命名为b1962-vector-3-pchogun-kan，该质粒含有sv40启动子：介导重组蛋白的高表达；gs：谷氨酰胺合成酶基因；sv40polya：polya尾信号，有效终止mrna转录并使其多腺苷酸化；kan：卡那抗性基因，用于转化e.coil时筛选；pnicchogunelement：pnicchogun元件；bghpolya：bgh多腺苷酸化信号，所用的宿主细胞为chocells，为cho-gs敲除表达系统，购买于horizondiscoveryltd，天士力生物建立了gs-cho-k1工作细胞库(mcb)，代次为p10，建立了gs-cho-k1wcb，代次为p13。87.目的氨基酸序列(seqidno.1和seqidno.2)由圆祥生物科技股份有限公司研发，以圆祥生物开发的氨基酸序列为基础，在不改变pd-l1/vegf双特异性抗体氨基酸序列的前提下，按照宿主细胞gs-cho-k1密码子偏好，在dna水平对pd-l1/vegf双特异性抗体序列进行优化，抗体目的基因序列如seqidno.3和seqidno.4所示。88.seqidno.3(双特异性抗体重链dna序列)：89.caggtgcagctggtgcagtccggcgccgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtgagctgtaaggcttccggcggcaccttcaggaggtacagcatcagctgggtgaggcaggcccctggccagggactggagtggatgggcggcatcatccctgtgttcggcgctgctaagtacgcccagaagttccagggccgggtgaccatcaccgccgatgagttcaccagcaccgcctacatggagctgtcctccctgacctccgaggataccgctgtgtattattgtgccctgtccggcgacagcgatgccttcgacatctggggccagggcacaatggttaccgtgtcctccgcttccaccaagggcccctccgtgttccccctggccccttcttccaagtccaccagcggcggcaccgccgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagcctgtgaccgtgagctggaatagcggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagagcagcggcctgtactccctgtcctccgtggtgaccgtgcccagctcctccctgggcacccagacctacatctgtaatgtgaatcacaagcccagcaataccaaggtggacaagaaggtggagcccaagagctgcgataagacccacacctgtcctccttgtcccgcccccgagctgctgggaggaccatctgtgttcctgttccctcccaagcctaaggataccctgatgatctccaggacccctgaggtgacctgtgtggtggtggatgtgagccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaatgccaagaccaagcccagggaggagcagtacgcttccacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtataagtgcgctgtgagcaataaggctctgcccgcccccatcgagaaaactattagtaaggccaagggccagcccagggagccccaggtgtataccctgcccccttcccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaaaggcttctacccttccgacatcgctgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaattataagaccacccctcccgtgctggacagcgatggctccttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaatgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtcccccggcggcggaggaggatctggaggaggaggcagcggcggcggaggttctggagacaccggctcccccttcgtggagatgtactccgagatccctgagatcatccacatgaccgagggctccgagctggtgatcccctgtcgggtgaccagccccgatatcaccgtgaccctgaagaagttccctctggataccctgatccccgacggcaagaggatcatctgggatagcaggaagggcttcatcatctccgatgctacctataaggagatcggcctgctgacctgtgaggctaccgtgaatggccacctgtacaagaccaactacctgacccaccggcagaccaataccatcatcgacgtggtgctgagccctagccacggcatcgagctgtccgtgggcgagaagctggtgctggactgcaccgccaggaccgagctgaatgtgggcatcgacttcaactgggagtaccctagcagcaagcaccagcacaagaagctggtgaatagggacctgaaaactcaatctggcagcgagatgaagaagttcctgagcaccctgaccatcgatggcgtgaccaggtccgatcagggcctgtacacctgtgctgcttcttccggcctgatgaccaagaaggactccaccttcgtgagggtgcacgagaag。90.seqidno.4(双特异性抗体轻链dna序列)：91.cagagcgtgctgacccagcccccttccgctagcggcacccctggacagagggtgaccatcagctgttccggcagcagcagcaacatcggctccaacaccgtgaactggtaccagcagctgcctggcaccgcccccaagctgctgatctatagcaacaaccagcggccctccggcgtgcctgatcggttctccggctccaagtccggcacctccgcctccctggccatctccggtctgcagagcgaggatgaggccgactactactgcgctacctgggacctgagcctgaacgcttgggtggtgttcggcggcggcaccaagctgaccgtgctgggacagcctaaggctgctccctccgtgaccctgttccctcctagctccgaggagctgcaggctaataaggctaccctggtgtgcctgatctccgacttctatcccggcgccgtgaccgtggcttggaaggctgactccagccccgtgaaggccggagtggagaccaccaccccttccaagcagagcaacaataagtacgctgccagcagctatctgagcctgacccccgagcagtggaagagccaccggagctatagctgccaggtgacccacgagggctccaccgtggagaaaactgttgctcccaccgagtgtagc。92.通过电转染的方法将表达载体导入到宿主细胞gs-cho-k1中，在传代培养过程中经过不含有谷氨酰胺(glutamine，gln)而含有蛋氨酸亚氨基代砜(methioninesulfoximine，msx)的培养基筛选后得到稳定的细胞群，再通过有限稀释法(0.45个细胞/孔，96孔板)、单克隆成像(分板后将96孔板离心进行首次拍照，后续于24h、48h、72h、168h拍照)、表达量检测等一系列的筛选得到单克隆细胞株，将高产单克隆进行补料发酵(fed-batch)培养，根据生长状态、质量分析(纯度、活性等关键质量属性)、分子表征(质谱法高分辨相对分子量分析、肽段覆盖率、质谱法n/c末端序列分析、edman降解法n端序列分析)、基因组水平测序确证、初步稳定性研究获得最优克隆，命名为131-35。93.实施例294.本实施例进行摇瓶fed-batch培养。95.根据确定的摇瓶fed-batch培养工艺，开展了摇瓶阶段fed-batch培养工艺确认试验，基础培养基为dynamistmagttmmedium(含有1.0g/lf-68biochemica)，补料培养基为cellboosttm7a和cellboosttm7b，按照接种密度0.60×106cells/ml接种，培养体积50ml，共接种3个平行(编号为35-12、35-13、为35-14)，工艺确认方案见表1，细胞生长数据和目的蛋白表达量见表2，样品(35-12、35-13、35-14)经过captoadhere纯化后，对关键质量属性进行检测，结果如表3所示，3个摇瓶样品的sec-hplc、ce-sds、icief数据具有可比性。96.表1[0097][0098]表2[0099][0100]表3[0101][0102]实施例3[0103]本实施进行5l生物反应器细胞培养。[0104]复苏3支wcb细胞至250ml摇瓶，培养体积80ml，培养3天以0.45×106cells/ml密度放大至1l摇瓶中，培养体积250ml；1l摇瓶培养3天以0.55×106cells/ml密度放大至2l摇瓶中，培养体积600ml，2l摇瓶培养3天活细胞密度＞5.00×106cells/ml，活率＞90.00％，接种于3个5l反应器a3、a4和b2，培养基为dynamistmagttmmedium(含有1.0g/lf-68biochemica)，a3、a4、b2三个反应器的接种密度均为0.65×106cells/ml，第3天(d3)开始流加，d4开始降温培养，fed-batch培养流加工艺和补糖量见表4；三个反应器培养至第四天(d4)(细胞密度≥12.00×106cells/ml)降温至33℃，细胞培养活率低于70.00％以下时终止培养，反应器关键参数见表5。[0105]表4[0106][0107][0108]表5[0109][0110]3个5l反应器接种至培养结束时细胞密度、活率、培养天数和目的蛋白表达量等见表6，细胞生长曲线见图2，a3、a4和b2反应器的细胞均在第7天(d7)达到密度峰值，密度峰值约为20.00×106cells/ml；整个fed-batch培养过程中，细胞密度和活率正常，3批平行反应器的密度和活率基本一致，结束培养时细胞活率均大于80.00％，中控跟踪细胞代谢情况见图3-图5，葡萄糖检测值较为平稳，fed-batch后期葡萄糖维持在0.6～1.6g/l之间；fed-batch培养至d6时乳酸开始下降，后期到结束培养，乳酸含量为极低；整个流加过程中nh4 有累积增加的趋势，累积过程相对平缓。[0111]3个反应器的蛋白表达量见图6，细胞培养液中聚体比例见表6，细胞结束培养时3个平行反应器聚体比例(hmw)均低于8.0％。发酵液经过mabselectprisma亲和捕获和captoadhere纯化后，检测sec-hplc、ce-sds、icief，结果如表7所示：3个反应器平行批次的sec-hplc、ce-sds、icief结果差别不大，批次间一致性较好。[0112]表6[0113][0114]表7[0115][0116][0117]实施例4[0118]本实施例进行200l生物反应器细胞培养。[0119]在gmp条件下进行了2批次200l规模的细胞培养(批号200716、200830)，细胞培养过程对每个操作步骤的工艺参数进行控制，摇瓶阶段对温度、co2、转速、细胞密度进行控制，wave培养过程中对温度、do、ph、转速、细胞密度进行控制，200l培养过程中对温度、do、ph、转速、培养时间、细胞活率进行控制，培养结果见表8，200l细胞培养阶段的细胞生长见图7，200l细胞培养阶段葡萄糖代谢参数见图8和图9，目的蛋白表达产量见图10，结果表明培养工艺稳定可靠，重现性好，在该培养工艺条件下的细胞生长、代谢和蛋白表达量较一致，培养液中目的蛋白表达量分别为3.560g/l和3.845g/l。[0120]表8[0121][0122]实施例5[0123]本实施例进行灌流培养。[0124]培养规模为50mltpp培养管，所用灌流培养基为eden-300s(倍谙基，本实施例命名为52#)和high-intensityperfusionchomedium(gibco，本实施例命名为75#)。[0125]52#灌流培养基搭配补料eden-f400a(倍谙基)和eden-f200(倍谙基)，即根据细胞生长补充eden-f400a为培养体积2.5％～12％；eden-f200为eden-f400a补加体积的10％。[0126]使用52#灌流培养基的细胞灌流前期葡萄糖控制约10g/l；灌流中后期葡萄糖控制在10～20g/l，使用75#灌流培养基的细胞灌流过程葡萄糖控制在10～12g/l。[0127]52#培养基细胞密度达3×107cells/ml降温至33℃，75#培养基细胞密度达3.5×107cells/ml降温至33℃。[0128]1培养管52#培养基细胞密度6.5×107cells/ml～9.0×107cells/ml每天排培养体积10％的细胞液；1培养管75#培养基细胞密度4.5×107cells/ml～6.0×107cells/ml每天排培养体积10％的细胞液，细胞培养周期为20天，灌流培养细胞密度和活率见图11和图12，52#培养基细胞密度峰值较高，约8.0×107cells/ml～10.0×107cells/ml；75#培养基细胞密度峰值约5.0×107cells/ml～6.0×107cells/ml，灌流培养表达量如表9所示，75#在灌流中后期每天表达量＞2g/l；52#在灌流中后期每天表达量更高，表达量＞3g/l。[0129]表9[0130][0131]实施例6[0132]本实施例进行pd-l1/vegf双特异性抗体纯化。[0133]在5l小试纯化工艺开发和确认基础上，进行了200l发酵规模纯化工艺放大研究，建立了原液纯化工艺，确定了以mabselectprisema填料(cytiva医疗集团)亲和层析为基础，低ph孵育(ph3.5±0.1)第一次除病毒，以captoadhere复合填料(cytiva医疗集团)阴离子层析和nuviahrs填料(biorad)阳离子交换层析为精细纯化，1.0m2bioex纳滤膜(旭化成)过滤进行第三次除病毒，以截留分子量50kda的切向流超滤膜p2b050a25(默克密理博)进行浓缩原液制备的纯化工艺，纯化过程对微生物限度、hcp残留、dna残留、内毒素、中间体含量和纯度进行控制检测。在符合gmp条件下进行了两批次原液生产，经放行检验均符合质量标准，工艺稳定、可靠，批次之间具有较好的一致性，用于ind申报。[0134]1、纯化放大工艺各步骤溶液配制见表10。[0135]表10[0136][0137][0138]2、以下按工艺步骤列出各纯化工艺的操作参数。[0139](1)深层过滤澄清[0140]深层过滤器是针对预处理料液的粒径分布而特别设计的，具有梯度密度结构的澄清滤器。发酵完毕的样品经深层过滤澄清，除大颗粒物质，为捕获做准备，深层过滤放大工艺操作参数见表11，进行两批试验(编号为200716和200830)，深层过滤工艺产品纯度和收率如表12所示；[0141]表11[0142][0143]表12[0144]项目/批号200716200830纯度(％)50.8％50.7％收率(％)95.9％89.6％[0145](2)亲和层析捕获与低ph孵育灭活病毒工艺[0146]亲和捕获层析利用目标蛋白抗体与proteina特异性吸附作用，达到捕获目标蛋白的目的，mabselectprisma捕获放大工艺操作参数见表13，产品纯度和收率见表14；[0147]表13[0148][0149][0150]表14[0151]项目/批号200716200830纯度(％)94.0％，94.0％92.9％，93.3％收率(％)92.3％，91.0％94.2％，93.3％[0152](3)captoadhere层析[0153]利用captoadhere携带的阴离子和疏水配基对dna、宿主蛋白等杂质的特异性吸附进行纯化，去除目标蛋白中残留的dna及hcp，将捕获后的样品进行中和、过滤，进行adhere流穿工艺，收集流穿液，captoadhere层析工艺放大操作参数见表15，层析产品纯度和收率见表16；[0154]表15[0155][0156][0157]表16[0158]项目/批号200716200830纯度(％)95.6％，95.3％97.6％，96.9％收率(％)85.8％，86.1％85.3％，89.2％[0159](4)阳离子交换层析[0160]利用阳离子交换层析的特性，对目标蛋白组分进行吸附—洗脱模式分离纯化，主要去除聚集体或者片段类与目标蛋白性质接近的杂质，同时去除部分宿主蛋白残留及dna类残留，达到纯化效果，nuviahrs阳离子交换层析工艺操作参数见表17，层析产品纯度和收率见表18；[0161]表17[0162][0163][0164]表18[0165]项目/批号200716200830纯度(％)99.0％99.0％收率(％)91.7％93.9％[0166](5)除病毒纳滤[0167]纳滤放大工艺操作参数见表19，纳滤膜水通量监测表如表20所示；[0168]表19[0169][0170]表20[0171][0172][0173](6)原液制备[0174]对纳滤产品进行抗体原液制备，抗体原液制备放大工艺操作参数见表21，产品纯度和收率见表22。[0175]表21[0176][0177]表22[0178]项目/批号200716200830纯度(％)99.0％99.1％收率(％)100.0％100％[0179]可见，通过控制纯化过程包括亲和层析的洗脱液、阳离子层析的ph和填料等，能够有效去除多聚体，大幅提高双特异性抗体的收率和产品纯度。[0180]实施例7[0181]与实施例3相比，区别仅在于培养温度为31℃，其它与实施例3相同。[0182]实施例8[0183]与实施例3相比，区别仅在于培养温度为37℃，其它与实施例3相同。[0184]实施例9[0185]与实施例3相比，区别仅在于培养ph为6.8，其它与实施例3相同。[0186]实施例10[0187]与实施例3相比，区别仅在于培养ph为7.3，其它与实施例3相同。[0188]对比例1[0189]与实施例3相比，区别仅在于将培养基dynamistmagttm培养基替换为等量actiprotm培养基，其它与实施例3相同，细胞生长速度变慢。最终影响细胞密度峰值，造成产量降低。[0190]对比例2[0191]与实施例3相比，区别仅在于将培养基dynamistmagttm培养基替换为等量expichostableproduction培养基，其它与实施例3相同。细胞生长速度变慢，最终影响细胞密度峰值，造成产量降低。[0192]对比例3[0193]与实施例3相比，区别仅在于将培养基dynamistmagttm培养基替换为等量cdforticho培养基，其它与实施例3相同。细胞生长速度变慢，最终影响细胞密度峰值，造成产量降低。[0194]对比例4[0195]与实施例3相比，区别仅在于培养温度为25℃，其它与实施例3相同。培养温度较低会导致细胞生产缓慢，最终影响细胞的密度峰值，造成产量的降低。[0196]对比例5[0197]与实施例3相比，区别仅在于培养温度为40℃，其它与实施例3相同。高温对细胞培养不利，细胞会受到一定损伤，同时造成产物的不稳定降解。[0198]对比例6[0199]与实施例3相比，区别仅在于培养ph为5.5，其它与实施例3相同。产物蛋白对于ph较为敏感，较低的ph会导致产物降解，造成产量损失。[0200]对比例7[0201]与实施例3相比，区别仅在于培养ph为8.1，其它与实施例3相同。过高的ph对细胞生长有一定的抑制作用，影响细胞的密度峰值，最终影响产量，同时高ph会导致抗体的碱性峰增加，对产品的质量造成一定的影响。[0202]对比例8[0203]与实施例3相比，区别仅在于培养溶氧(od)为5％，其它与实施例3相同。do过低会改变细胞的代谢，葡萄糖生产乳酸的比例上升，培养基的有效利用率明显降低，降低细胞蛋白表达水平，甚至因缺氧而导致细胞逐渐凋亡。[0204]比较实施例3和实施例7-9及对比例1-8可知，实施例7-9中双特异性抗体产量亦可达5g/l以上，而对比例1-7中双特异性抗体产量均显著降低，说明双特异性抗体产量受多种因素影响，且对各因素变化非常敏感，而本发明综合分析各影响因素，系统地控制各影响因素，协同发挥作用，显著提高双特异性抗体产量。[0205]综上所述，本发明综合分析发酵培养和分离纯化中各种影响因素，通过有效控制，使得各因素间能够有效协同，从而实现高效生产高纯度的双特异性抗体，灌流生产日产量可达3g/l以上，经纯化后双特异性抗体的sec-hplc纯度可达在90％以上，并对生产工艺进行了放大验证，工艺稳定、可靠且成本低，与现有生产方法相比实现了巨大突破，对于双特异性抗体的广泛临床应用具有重要意义。[0206]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
：的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：，涉及一种双特异性抗体的生产方法。
背景技术：
：：2.肿瘤(tumour)根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类；其中恶性肿瘤疾病是当今社会上危害人类健康的重大疾病，致死程度高居第二，常见肿瘤有肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌等。3.恶性肿瘤由于其个体差异，一般会对大部分患者进行综合治疗，即综合采用手术、化疗、放疗、免疫治疗、中医中药治疗、介入治疗、微波治疗等手段，以期较大幅度地提高治愈率，并改善患者的生活质量。其中免疫治疗(immunotherapy)是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法。免疫治疗的方法有很多，适用于多种疾病的治疗，旨在激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。与以往的手术、化疗、放疗和靶向治疗不同的是，免疫治疗针对的靶标不是肿瘤细胞和组织，而是人体自身的免疫系统，包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。4.目前上市在售的抗体药物多为单克隆抗体，治疗性单克隆抗体已被用于治疗癌症、自身免疫病、炎症和其他疾病，多数是针对一个靶标的特异性。然而，病人接受单克隆抗体治疗可能产生耐药性或无应答，并且有些疾病在体内的影响因素是多方面的，包括不同的信号通路、不同的细胞因子和受体的调节机制等，单一靶点的免疫疗法似乎并不足以摧毁癌细胞。因此，需要通过组合不同的药物，或是使用多特异性抗体的多重靶向策略来实现，如cn109942712a提供了一种抗pd-l1/vegf双特异性抗体，包括：抗pd-l1的抗体或元件；和与所述抗pd-l1的抗体或元件相连接的抗vegf的抗体或元件，可同时与vegf及pd-l1结合，从而发挥对vegf和pd-l1阳性的肿瘤细胞-的治疗作用，双功能抗体虽然是抗体药物研发的方向，但面临诸多挑战，比如临床前评价模型、表达量低、稳定性差、工艺复杂、质控差异性大等问题，因此一直以来双功能抗体的研发困难重重。5.综上所述，针对由于双特异性抗体产业化生产复杂、生产成本高制约了其临床应用的问题，亟需一种既能提高双特异性抗体表达量又不影响其安全性、特异性和纯度且能降低生产成本的方法。技术实现要素：6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种双特异性抗体的生产方法，所述生产方法能够高效生产高纯度双特异性抗体，工艺稳定、可靠且成本低，能够显著促进双特异性抗体的临床应用。7.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：8.本发明提供一种双特异性抗体的生产方法，所述方法包括以下步骤：9.(1)构建生产双特异性抗体的细胞，并进行筛选；10.(2)培养步骤(1)筛选获得的细胞，获得培养液并进行分离纯化，获得双特异性抗体；11.所述细胞包括哺乳动物细胞；12.所述培养的方式包括分批补料培养或灌流培养，所述分批补料培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括dynamistmagttm培养基，所述补料培养基包括cellboosttm7a和cellboosttm7b，所述分批补料培养的温度为31℃～37℃，包括但不限于32℃、33℃、34℃、35℃或36℃，所述分批补料培养的ph为6.8～7.3，包括但不限于6.9、7.0、7.1或7.2，所述分批补料培养的溶氧为10％以上，所述灌流培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括eden-300s培养基和high-intensityperfusioncho培养基，所述灌流培养的温度为31℃～37℃，包括但不限于32℃、33℃、34℃、35℃或36℃，所述分批补料培养的ph为6.8～7.3，包括但不限于6.9、7.0、7.1或7.2，所述灌流培养的溶氧为10％以上。13.本发明中，筛选能够高产双特异性抗体的菌株，对高产菌株进行培养，综合分析影响发酵培养多种因素，通过控制发酵方式、培养基组合、培养温度、培养ph和溶氧，利用各因素协同，实现了高效生产双特异性抗体。14.优选地，所述双特异性抗体包括pd-l1/vegf双特异性抗体。15.优选地，所述pd-l1/vegf双特异性抗体的氨基酸序列包括seqidno.1和seqidno.2所示的序列。16.seqidno.1(双特异性抗体重链)：17.qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrrysiswvrqapgqglewmggiipvfgaakyaqkfqgrvtitadeftstaymelssltsedtavyycalsgdsdafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsgdtgspfvemyseipeiihmtegselvipcrvtspditvtlkkfpldtlipdgkriiwdsrkgfiisdatykeiglltceatvnghlyktnylthrqtntiidvvlspshgielsvgeklvldctartelnvgidfnweypsskhqhkklvnrdlktqsgsemkkflstltidgvtrsdqglytcaassglmtkkdstfvrvhek。18.seqidno.2(双特异性抗体轻链)：19.qsvltqppsasgtpgqrvtiscsgsssnigsntvnwyqqlpgtapklliysnnqrpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyycatwdlslnawvvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs。20.优选地，所述哺乳动物细胞包括hek293细胞或中国仓鼠卵巢(cho)细胞，优选为中国仓鼠卵巢细胞。21.本发明中，通过配制培养基为dynamistmagttmmedium，能够进一步提高双特异性抗体产量。22.优选地，所述分批补料培养的基础培养基中含有f-68biochemica。23.本发明中，在培养基中加入f-68biochemica能够有效解决培养过程中细胞结团问题，从而利于细胞快速生长。24.优选地，所述cellboosttm7a补料流加比例为2％～3％，包括但不限于2.2％、2.4％、2.6％、2.7％、2.8％或2.9％，所述cellboosttm7b补料流加比例为0.2～2.5％，包括但不限于0.3％、0.4％、0.6％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.3％或2.4％。25.优选地，所述分批补料培养的接种密度为不低于0.15×106cells/ml，包括但不限于0.36×106cells/ml、0.38×106cells/ml、0.4×106cells/ml、0.45×106cells/ml、0.5×106cells/ml或0.6×106cells/ml。26.优选地，所述分批补料还包括补加葡萄糖。27.优选地，所述葡萄糖的流加量为1.0～10g/l，包括但不限于1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l。28.优选地，所述灌流培养的补料培养基包括eden-f400a和eden-f200。29.优选地，步骤(2)所述分离纯化包括以下步骤：30.(1’)对所述培养液进行深层过滤，获得澄清液；31.(2’)对所述澄清液进行亲和层析；32.(3’)调节亲和层析产物ph并进行孵育；33.(4’)调节孵育产物ph并进行深层过滤；34.(5’)对深层过滤产物进行阴离子交换层析；35.(6’)对阴离子交换层析产物进行阳离子交换层析；36.(7’)对阳离子交换层析产物进行纳滤。37.本发明中，双特异性抗体存在一定比例的多聚体，严重影响纯化过程中的收率和蛋白纯度，通过控制纯化工艺提升多聚体与双特异性抗体的分离度，能够进一步提高双提异性抗体的收率和纯度。38.优选地，步骤(1’)所述深层过滤的过滤器的滤芯包括zetaplusezp滤芯e16e07a60sp02a(3m公司)。39.优选地，步骤(2’)所述亲和层析的洗脱缓冲液包括醋酸和醋酸钠。40.优选地，步骤(2’)所述亲和层析的层析柱的填料包括mabselectprisma。41.优选地，步骤(3’)所述ph为3～4。42.优选地，步骤(3’)所述孵育的温度为18℃～26℃，包括但不限于19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃，所述孵育的时间为50～70min，包括但不限于51min、52min、53min、54min、55min、56min、60min、61min、62min、65min、66min、67min、68min或69min。43.优选地，步骤(5’)所述阴离子交换层析的层析柱的填料包括captoadhere。44.优选地，所述captoadhere的载量定为≤30g/l。45.优选地，步骤(5’)所述阴离子交换层析在ph为5.8～6.0下进行，优选为5.9。46.优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析的层析柱的填料包括ceramiccm和/或nuviahrs。47.优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析的平衡缓冲液包括醋酸和醋酸钠。48.优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析在ph为5.4～5.6下进行，优选为5.5。49.优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析的洗脱液包括精氨酸。50.优选地，所述洗脱液中精氨酸的浓度为0.18～0.20mol/l。51.优选地，所述分离纯化还包括制备抗体原液的步骤。52.优选地，所述抗体原液的制备方法包括：53.对所述阳离子交换层析的产物进行超滤，使用无菌过滤膜对超滤产物进行过滤，得到所述抗体原液。54.作为优选的技术方案，所述双特异性抗体的生产方法包括以下步骤：55.(1)构建生产双特异性抗体的细胞，并进行筛选；56.(2)培养步骤(1)筛选获得的细胞，获得培养液；57.(3)使用zetaplusezp滤芯e16e07a60sp02a过滤器对所述培养液进行深层过滤，获得澄清液；58.(4)使用mabselectprisma填充层析柱，对所述澄清液进行亲和层析，使用含有醋酸和醋酸钠的洗脱缓冲液进行洗脱；59.(5)调节亲和层析产物ph为5.8～6.0，并于18℃～26℃进行孵育50～70min；60.(6)调节孵育产物ph为5.4～5.6并进行深层过滤；61.(7)使用captoadhere填充层析柱，使用含有醋酸和醋酸钠的平衡缓冲液进行柱平衡，对深层过滤产物进行阴离子交换层析；62.(8)使用ceramiccm和/或nuviahrs填充层析柱，使用含有醋酸和醋酸钠的平衡缓冲液进行柱平衡，对阴离子交换层析产物进行阳离子交换层析；63.(9)对阳离子交换层析产物进行纳滤；64.(10)对所述纳滤产物进行超滤，使用无菌过滤膜对超滤产物进行过滤，得到所述抗体原液。65.所述培养的方式包括分批补料培养或灌流培养。66.所述分批补料培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括dynamistmagttm培养基，所述补料培养基包括cellboosttm7a和cellboosttm7b，所述分批补料培养的温度为31℃～37℃，所述分批补料培养的ph为6.8～7.3，所述分批补料培养的溶氧为10％以上。67.所述灌流培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括eden-300s培养基和high-intensityperfusioncho培养基，所述灌流培养的温度为31℃～37℃，所述灌流培养的ph为6.8～7.3，所述灌流培养的溶氧为10％以上。68.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：69.本发明中，综合分析发酵培养和分离纯化中各种影响因素，通过有效控制，使得各因素间能够有效协同，从而实现高效生产高纯度的双特异性抗体，日产量可达3g/l以上，经纯化后双特异性抗体的sec-hplc纯度可达在90％以上，并对生产工艺进行了放大验证，工艺稳定、可靠且成本低，与现有生产方法相比实现了巨大突破，对于双特异性抗体的广泛临床应用具有重要意义。附图说明70.图1为b1962-vector-3-pchugun-kan质粒结构示意图；71.图2为5l反应器中细胞生长曲线图；72.图3为5l反应器中葡萄糖代谢曲线图；73.图4为5l反应器中乳酸代谢曲线图；74.图5为5l反应器中铵代谢曲线图；75.图6为5l反应器中蛋白表达产量图；76.图7为200l反应器中细胞生长曲线图；77.图8为200l反应器中葡萄糖代谢曲线图；78.图9为200l反应器中乳酸代谢曲线图；79.图10为200l反应器中蛋白表达产量图；80.图11为灌流培养细胞密度图；81.图12为灌流培养细活率图。具体实施方式82.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。83.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。84.实施例185.本实施例构建表达双特异性抗体pd-l1/vegf的细胞株。86.本实施例的生物源性物料为中国仓鼠卵巢细胞(cho，chinesehamsterovary)，表达载体b1962载体命名为b1962-vector-3-pchogun-kan，该质粒含有sv40启动子：介导重组蛋白的高表达；gs：谷氨酰胺合成酶基因；sv40polya：polya尾信号，有效终止mrna转录并使其多腺苷酸化；kan：卡那抗性基因，用于转化e.coil时筛选；pnicchogunelement：pnicchogun元件；bghpolya：bgh多腺苷酸化信号，所用的宿主细胞为chocells，为cho-gs敲除表达系统，购买于horizondiscoveryltd，天士力生物建立了gs-cho-k1工作细胞库(mcb)，代次为p10，建立了gs-cho-k1wcb，代次为p13。87.目的氨基酸序列(seqidno.1和seqidno.2)由圆祥生物科技股份有限公司研发，以圆祥生物开发的氨基酸序列为基础，在不改变pd-l1/vegf双特异性抗体氨基酸序列的前提下，按照宿主细胞gs-cho-k1密码子偏好，在dna水平对pd-l1/vegf双特异性抗体序列进行优化，抗体目的基因序列如seqidno.3和seqidno.4所示。88.seqidno.3(双特异性抗体重链dna序列)：89.caggtgcagctggtgcagtccggcgccgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtgagctgtaaggcttccggcggcaccttcaggaggtacagcatcagctgggtgaggcaggcccctggccagggactggagtggatgggcggcatcatccctgtgttcggcgctgctaagtacgcccagaagttccagggccgggtgaccatcaccgccgatgagttcaccagcaccgcctacatggagctgtcctccctgacctccgaggataccgctgtgtattattgtgccctgtccggcgacagcgatgccttcgacatctggggccagggcacaatggttaccgtgtcctccgcttccaccaagggcccctccgtgttccccctggccccttcttccaagtccaccagcggcggcaccgccgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagcctgtgaccgtgagctggaatagcggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagagcagcggcctgtactccctgtcctccgtggtgaccgtgcccagctcctccctgggcacccagacctacatctgtaatgtgaatcacaagcccagcaataccaaggtggacaagaaggtggagcccaagagctgcgataagacccacacctgtcctccttgtcccgcccccgagctgctgggaggaccatctgtgttcctgttccctcccaagcctaaggataccctgatgatctccaggacccctgaggtgacctgtgtggtggtggatgtgagccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaatgccaagaccaagcccagggaggagcagtacgcttccacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtataagtgcgctgtgagcaataaggctctgcccgcccccatcgagaaaactattagtaaggccaagggccagcccagggagccccaggtgtataccctgcccccttcccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaaaggcttctacccttccgacatcgctgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaattataagaccacccctcccgtgctggacagcgatggctccttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaatgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtcccccggcggcggaggaggatctggaggaggaggcagcggcggcggaggttctggagacaccggctcccccttcgtggagatgtactccgagatccctgagatcatccacatgaccgagggctccgagctggtgatcccctgtcgggtgaccagccccgatatcaccgtgaccctgaagaagttccctctggataccctgatccccgacggcaagaggatcatctgggatagcaggaagggcttcatcatctccgatgctacctataaggagatcggcctgctgacctgtgaggctaccgtgaatggccacctgtacaagaccaactacctgacccaccggcagaccaataccatcatcgacgtggtgctgagccctagccacggcatcgagctgtccgtgggcgagaagctggtgctggactgcaccgccaggaccgagctgaatgtgggcatcgacttcaactgggagtaccctagcagcaagcaccagcacaagaagctggtgaatagggacctgaaaactcaatctggcagcgagatgaagaagttcctgagcaccctgaccatcgatggcgtgaccaggtccgatcagggcctgtacacctgtgctgcttcttccggcctgatgaccaagaaggactccaccttcgtgagggtgcacgagaag。90.seqidno.4(双特异性抗体轻链dna序列)：91.cagagcgtgctgacccagcccccttccgctagcggcacccctggacagagggtgaccatcagctgttccggcagcagcagcaacatcggctccaacaccgtgaactggtaccagcagctgcctggcaccgcccccaagctgctgatctatagcaacaaccagcggccctccggcgtgcctgatcggttctccggctccaagtccggcacctccgcctccctggccatctccggtctgcagagcgaggatgaggccgactactactgcgctacctgggacctgagcctgaacgcttgggtggtgttcggcggcggcaccaagctgaccgtgctgggacagcctaaggctgctccctccgtgaccctgttccctcctagctccgaggagctgcaggctaataaggctaccctggtgtgcctgatctccgacttctatcccggcgccgtgaccgtggcttggaaggctgactccagccccgtgaaggccggagtggagaccaccaccccttccaagcagagcaacaataagtacgctgccagcagctatctgagcctgacccccgagcagtggaagagccaccggagctatagctgccaggtgacccacgagggctccaccgtggagaaaactgttgctcccaccgagtgtagc。92.通过电转染的方法将表达载体导入到宿主细胞gs-cho-k1中，在传代培养过程中经过不含有谷氨酰胺(glutamine，gln)而含有蛋氨酸亚氨基代砜(methioninesulfoximine，msx)的培养基筛选后得到稳定的细胞群，再通过有限稀释法(0.45个细胞/孔，96孔板)、单克隆成像(分板后将96孔板离心进行首次拍照，后续于24h、48h、72h、168h拍照)、表达量检测等一系列的筛选得到单克隆细胞株，将高产单克隆进行补料发酵(fed-batch)培养，根据生长状态、质量分析(纯度、活性等关键质量属性)、分子表征(质谱法高分辨相对分子量分析、肽段覆盖率、质谱法n/c末端序列分析、edman降解法n端序列分析)、基因组水平测序确证、初步稳定性研究获得最优克隆，命名为131-35。93.实施例294.本实施例进行摇瓶fed-batch培养。95.根据确定的摇瓶fed-batch培养工艺，开展了摇瓶阶段fed-batch培养工艺确认试验，基础培养基为dynamistmagttmmedium(含有1.0g/lf-68biochemica)，补料培养基为cellboosttm7a和cellboosttm7b，按照接种密度0.60×106cells/ml接种，培养体积50ml，共接种3个平行(编号为35-12、35-13、为35-14)，工艺确认方案见表1，细胞生长数据和目的蛋白表达量见表2，样品(35-12、35-13、35-14)经过captoadhere纯化后，对关键质量属性进行检测，结果如表3所示，3个摇瓶样品的sec-hplc、ce-sds、icief数据具有可比性。96.表1[0097][0098]表2[0099][0100]表3[0101][0102]实施例3[0103]本实施进行5l生物反应器细胞培养。[0104]复苏3支wcb细胞至250ml摇瓶，培养体积80ml，培养3天以0.45×106cells/ml密度放大至1l摇瓶中，培养体积250ml；1l摇瓶培养3天以0.55×106cells/ml密度放大至2l摇瓶中，培养体积600ml，2l摇瓶培养3天活细胞密度＞5.00×106cells/ml，活率＞90.00％，接种于3个5l反应器a3、a4和b2，培养基为dynamistmagttmmedium(含有1.0g/lf-68biochemica)，a3、a4、b2三个反应器的接种密度均为0.65×106cells/ml，第3天(d3)开始流加，d4开始降温培养，fed-batch培养流加工艺和补糖量见表4；三个反应器培养至第四天(d4)(细胞密度≥12.00×106cells/ml)降温至33℃，细胞培养活率低于70.00％以下时终止培养，反应器关键参数见表5。[0105]表4[0106][0107][0108]表5[0109][0110]3个5l反应器接种至培养结束时细胞密度、活率、培养天数和目的蛋白表达量等见表6，细胞生长曲线见图2，a3、a4和b2反应器的细胞均在第7天(d7)达到密度峰值，密度峰值约为20.00×106cells/ml；整个fed-batch培养过程中，细胞密度和活率正常，3批平行反应器的密度和活率基本一致，结束培养时细胞活率均大于80.00％，中控跟踪细胞代谢情况见图3-图5，葡萄糖检测值较为平稳，fed-batch后期葡萄糖维持在0.6～1.6g/l之间；fed-batch培养至d6时乳酸开始下降，后期到结束培养，乳酸含量为极低；整个流加过程中nh4 有累积增加的趋势，累积过程相对平缓。[0111]3个反应器的蛋白表达量见图6，细胞培养液中聚体比例见表6，细胞结束培养时3个平行反应器聚体比例(hmw)均低于8.0％。发酵液经过mabselectprisma亲和捕获和captoadhere纯化后，检测sec-hplc、ce-sds、icief，结果如表7所示：3个反应器平行批次的sec-hplc、ce-sds、icief结果差别不大，批次间一致性较好。[0112]表6[0113][0114]表7[0115][0116][0117]实施例4[0118]本实施例进行200l生物反应器细胞培养。[0119]在gmp条件下进行了2批次200l规模的细胞培养(批号200716、200830)，细胞培养过程对每个操作步骤的工艺参数进行控制，摇瓶阶段对温度、co2、转速、细胞密度进行控制，wave培养过程中对温度、do、ph、转速、细胞密度进行控制，200l培养过程中对温度、do、ph、转速、培养时间、细胞活率进行控制，培养结果见表8，200l细胞培养阶段的细胞生长见图7，200l细胞培养阶段葡萄糖代谢参数见图8和图9，目的蛋白表达产量见图10，结果表明培养工艺稳定可靠，重现性好，在该培养工艺条件下的细胞生长、代谢和蛋白表达量较一致，培养液中目的蛋白表达量分别为3.560g/l和3.845g/l。[0120]表8[0121][0122]实施例5[0123]本实施例进行灌流培养。[0124]培养规模为50mltpp培养管，所用灌流培养基为eden-300s(倍谙基，本实施例命名为52#)和high-intensityperfusionchomedium(gibco，本实施例命名为75#)。[0125]52#灌流培养基搭配补料eden-f400a(倍谙基)和eden-f200(倍谙基)，即根据细胞生长补充eden-f400a为培养体积2.5％～12％；eden-f200为eden-f400a补加体积的10％。[0126]使用52#灌流培养基的细胞灌流前期葡萄糖控制约10g/l；灌流中后期葡萄糖控制在10～20g/l，使用75#灌流培养基的细胞灌流过程葡萄糖控制在10～12g/l。[0127]52#培养基细胞密度达3×107cells/ml降温至33℃，75#培养基细胞密度达3.5×107cells/ml降温至33℃。[0128]1培养管52#培养基细胞密度6.5×107cells/ml～9.0×107cells/ml每天排培养体积10％的细胞液；1培养管75#培养基细胞密度4.5×107cells/ml～6.0×107cells/ml每天排培养体积10％的细胞液，细胞培养周期为20天，灌流培养细胞密度和活率见图11和图12，52#培养基细胞密度峰值较高，约8.0×107cells/ml～10.0×107cells/ml；75#培养基细胞密度峰值约5.0×107cells/ml～6.0×107cells/ml，灌流培养表达量如表9所示，75#在灌流中后期每天表达量＞2g/l；52#在灌流中后期每天表达量更高，表达量＞3g/l。[0129]表9[0130][0131]实施例6[0132]本实施例进行pd-l1/vegf双特异性抗体纯化。[0133]在5l小试纯化工艺开发和确认基础上，进行了200l发酵规模纯化工艺放大研究，建立了原液纯化工艺，确定了以mabselectprisema填料(cytiva医疗集团)亲和层析为基础，低ph孵育(ph3.5±0.1)第一次除病毒，以captoadhere复合填料(cytiva医疗集团)阴离子层析和nuviahrs填料(biorad)阳离子交换层析为精细纯化，1.0m2bioex纳滤膜(旭化成)过滤进行第三次除病毒，以截留分子量50kda的切向流超滤膜p2b050a25(默克密理博)进行浓缩原液制备的纯化工艺，纯化过程对微生物限度、hcp残留、dna残留、内毒素、中间体含量和纯度进行控制检测。在符合gmp条件下进行了两批次原液生产，经放行检验均符合质量标准，工艺稳定、可靠，批次之间具有较好的一致性，用于ind申报。[0134]1、纯化放大工艺各步骤溶液配制见表10。[0135]表10[0136][0137][0138]2、以下按工艺步骤列出各纯化工艺的操作参数。[0139](1)深层过滤澄清[0140]深层过滤器是针对预处理料液的粒径分布而特别设计的，具有梯度密度结构的澄清滤器。发酵完毕的样品经深层过滤澄清，除大颗粒物质，为捕获做准备，深层过滤放大工艺操作参数见表11，进行两批试验(编号为200716和200830)，深层过滤工艺产品纯度和收率如表12所示；[0141]表11[0142][0143]表12[0144]项目/批号200716200830纯度(％)50.8％50.7％收率(％)95.9％89.6％[0145](2)亲和层析捕获与低ph孵育灭活病毒工艺[0146]亲和捕获层析利用目标蛋白抗体与proteina特异性吸附作用，达到捕获目标蛋白的目的，mabselectprisma捕获放大工艺操作参数见表13，产品纯度和收率见表14；[0147]表13[0148][0149][0150]表14[0151]项目/批号200716200830纯度(％)94.0％，94.0％92.9％，93.3％收率(％)92.3％，91.0％94.2％，93.3％[0152](3)captoadhere层析[0153]利用captoadhere携带的阴离子和疏水配基对dna、宿主蛋白等杂质的特异性吸附进行纯化，去除目标蛋白中残留的dna及hcp，将捕获后的样品进行中和、过滤，进行adhere流穿工艺，收集流穿液，captoadhere层析工艺放大操作参数见表15，层析产品纯度和收率见表16；[0154]表15[0155][0156][0157]表16[0158]项目/批号200716200830纯度(％)95.6％，95.3％97.6％，96.9％收率(％)85.8％，86.1％85.3％，89.2％[0159](4)阳离子交换层析[0160]利用阳离子交换层析的特性，对目标蛋白组分进行吸附—洗脱模式分离纯化，主要去除聚集体或者片段类与目标蛋白性质接近的杂质，同时去除部分宿主蛋白残留及dna类残留，达到纯化效果，nuviahrs阳离子交换层析工艺操作参数见表17，层析产品纯度和收率见表18；[0161]表17[0162][0163][0164]表18[0165]项目/批号200716200830纯度(％)99.0％99.0％收率(％)91.7％93.9％[0166](5)除病毒纳滤[0167]纳滤放大工艺操作参数见表19，纳滤膜水通量监测表如表20所示；[0168]表19[0169][0170]表20[0171][0172][0173](6)原液制备[0174]对纳滤产品进行抗体原液制备，抗体原液制备放大工艺操作参数见表21，产品纯度和收率见表22。[0175]表21[0176][0177]表22[0178]项目/批号200716200830纯度(％)99.0％99.1％收率(％)100.0％100％[0179]可见，通过控制纯化过程包括亲和层析的洗脱液、阳离子层析的ph和填料等，能够有效去除多聚体，大幅提高双特异性抗体的收率和产品纯度。[0180]实施例7[0181]与实施例3相比，区别仅在于培养温度为31℃，其它与实施例3相同。[0182]实施例8[0183]与实施例3相比，区别仅在于培养温度为37℃，其它与实施例3相同。[0184]实施例9[0185]与实施例3相比，区别仅在于培养ph为6.8，其它与实施例3相同。[0186]实施例10[0187]与实施例3相比，区别仅在于培养ph为7.3，其它与实施例3相同。[0188]对比例1[0189]与实施例3相比，区别仅在于将培养基dynamistmagttm培养基替换为等量actiprotm培养基，其它与实施例3相同，细胞生长速度变慢。最终影响细胞密度峰值，造成产量降低。[0190]对比例2[0191]与实施例3相比，区别仅在于将培养基dynamistmagttm培养基替换为等量expichostableproduction培养基，其它与实施例3相同。细胞生长速度变慢，最终影响细胞密度峰值，造成产量降低。[0192]对比例3[0193]与实施例3相比，区别仅在于将培养基dynamistmagttm培养基替换为等量cdforticho培养基，其它与实施例3相同。细胞生长速度变慢，最终影响细胞密度峰值，造成产量降低。[0194]对比例4[0195]与实施例3相比，区别仅在于培养温度为25℃，其它与实施例3相同。培养温度较低会导致细胞生产缓慢，最终影响细胞的密度峰值，造成产量的降低。[0196]对比例5[0197]与实施例3相比，区别仅在于培养温度为40℃，其它与实施例3相同。高温对细胞培养不利，细胞会受到一定损伤，同时造成产物的不稳定降解。[0198]对比例6[0199]与实施例3相比，区别仅在于培养ph为5.5，其它与实施例3相同。产物蛋白对于ph较为敏感，较低的ph会导致产物降解，造成产量损失。[0200]对比例7[0201]与实施例3相比，区别仅在于培养ph为8.1，其它与实施例3相同。过高的ph对细胞生长有一定的抑制作用，影响细胞的密度峰值，最终影响产量，同时高ph会导致抗体的碱性峰增加，对产品的质量造成一定的影响。[0202]对比例8[0203]与实施例3相比，区别仅在于培养溶氧(od)为5％，其它与实施例3相同。do过低会改变细胞的代谢，葡萄糖生产乳酸的比例上升，培养基的有效利用率明显降低，降低细胞蛋白表达水平，甚至因缺氧而导致细胞逐渐凋亡。[0204]比较实施例3和实施例7-9及对比例1-8可知，实施例7-9中双特异性抗体产量亦可达5g/l以上，而对比例1-7中双特异性抗体产量均显著降低，说明双特异性抗体产量受多种因素影响，且对各因素变化非常敏感，而本发明综合分析各影响因素，系统地控制各影响因素，协同发挥作用，显著提高双特异性抗体产量。[0205]综上所述，本发明综合分析发酵培养和分离纯化中各种影响因素，通过有效控制，使得各因素间能够有效协同，从而实现高效生产高纯度的双特异性抗体，灌流生产日产量可达3g/l以上，经纯化后双特异性抗体的sec-hplc纯度可达在90％以上，并对生产工艺进行了放大验证，工艺稳定、可靠且成本低，与现有生产方法相比实现了巨大突破，对于双特异性抗体的广泛临床应用具有重要意义。[0206]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
：的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12当前第1页12
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