一种高效表达GDH的工程菌株及其制备方法和应用与流程

一种高效表达gdh的工程菌株及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种工程菌株及其制备方法和应用，更具体一点说，涉及一种高效表达gdh的工程菌株及其制备方法和应用，属于基因工程和发酵优化领域。


背景技术：

2.葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,ec1.1.1.47)是一种nad(p) 依赖型的氧化还原酶，可以催化nad(p) 与β_d-葡萄糖反应得到nad(p)h和d-葡萄糖酸-8-内酯。gdh在生物催化和燃料电池方面得到越来越广泛的应用。gdh是芽孢杆菌属细菌体内与芽孢形成有关的酶，在形成芽孢时被诱导生成是d-核糖生物合成途径中的限制性酶。目前葡萄糖脱氢酶已被用于测定体液中葡萄糖含量和制备微型生物传感器，其基因的克隆及其序列分析已有报道，但该酶的高活性表达和理想的活性检测方法未见报道。但是gdh来源较少，主要来源于动物肝脏和芽孢杆菌发酵。
3.芽孢杆菌来源的天然葡萄糖脱氢酶的稳定性差，它仅在芽孢形成的后期发现，而在营养体检测不到葡萄糖脱氢酶的活性。这些葡萄糖脱氢酶脱离了芽孢的保护后，在不添加任何保护剂的情况下，于40℃开始失活。
4.bacillusmegaterium iam1030中gdh是目前所知稳定性最差的，它在10℃就开始失活，在40℃下处理20min后就完全失去活性，这样的热稳定性是无法达到工业要求。gdh在生物催化和燃料电池方面得到越来越广泛的应用。但是gdh来源较少，主要来源于动物肝脏和芽孢杆菌发酵。目前迫切需要解决这个问题。因此，有必要发展一套稳定性较强的高效表达系统来表达gdh。目前，大肠杆菌商业化表达系统主要涉及单基因、单载体诱导表达，不适合多基因、多载体协同表达。而且中心法则已阐明，基因转录成mrna，再翻译成蛋白质。这个过程受到各种调控，例如dna甲基化、乙酰化、小rna、启动子强度、rbs翻译效率、酶的浓度和活性、分裂周期等。对于大肠杆菌而言，启动子、rbs、酶浓度和细菌生长状态是影响目标蛋白表达量的主要因素。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供具有能够高效表达gdh，酶活是每克菌体比活高等技术特点的一种高效表达gdh的工程菌株。
6.本发明还提供了一种高效表达gdh的工程菌株的制备方法和应用。
7.为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
8.本发明一种高效表达gdh的工程菌，含有seq id no1所述序列的质粒。
9.优选的，所述工程菌利用大肠杆菌rosetta(de3)作为宿主菌。
10.本发明一种重组gdh蛋白，通过培养诱导如权利要求1或2所述的工程菌获得。
11.本发明一种重组gdh蛋白的纯化方法，其特征在于该纯化方法包含以下步骤：
12.a：诱导表达权利要求1或2所述的工程菌，菌液离心集菌后，超声破碎，收集破碎后上清；
13.b：上清利用镍柱亲和层析；
14.c：超滤脱盐，冻干保存。
15.优选的，步骤b中镍柱洗脱液采用咪唑，所述咪唑浓度为200-500mmol/l。
16.本发明一种工程菌，或重组gdh蛋白在制备gdh产品中的应用。
17.本发明一种重组gdh蛋白的纯化方法在制备gdh产品中的应用。
18.本发明一种高效表达gdh的工程菌的构建方法，该构建方法包括如下步骤：将gdh原始基因构建到pet-14b质粒中，转化大肠杆菌rosetta，从而产生出一株高效表达gdh的工程菌。
19.优选的，其特征在于该构建方法为：
20.步骤1)获得原始基因gdh；
21.步骤2)根据氨基酸序列设计优化其编码核苷酸序列，全基因合成质粒pet-14b-gdh，所述质粒的序列如seq id no1所示；
22.步骤3)将构建好的质粒pet-14b-gdh热激转化大肠杆菌rosetta(de3)，转化pet1-4b-gdh后，培养基培养，获得高效表达gdh的工程菌。
23.优选的，步骤3)中采用的方法具体如下：
24.a)从-80℃冰箱内取出大肠杆菌rosetta(de3)感受态细胞，迅速插入冰盒内，使其溶解；
25.b)加入dna样品轻轻混匀，冰中放置30分钟，将合成基因的质粒pet-14b-gdh粉末离心5min，加100ul ddh2o，取5ul稀释至500ul，取稀释后的质粒pet-14b-gdh2ul加入大肠杆菌rosetta(de3)感受态细胞中获得；
26.c)在42℃条件下水浴热激45s，迅速放回冰中放置2min，保持不要晃动，添加700ul不含抗生素的无菌培养基，混合均匀；
27.d)在37℃条件下振荡培养1小时，再吸取100ul培养液均匀涂布到含氨苄抗生素的lb琼脂培养基平板中，在37℃条件下正置至液体被吸收，然后倒置过夜培养，获得高效表达gdh的工程菌。
28.有益效果：具有能够高效表达gdh，酶活是每克菌体比活高等技术特点。
附图说明
29.图1是重组好菌株基因型鉴定图。
30.图2是重组好菌株基因型鉴定的数据比对图。
31.图3是rosetta(de3)gdh pet-14b纯化蛋白电泳图。
32.图4是rosetta(de3)gdh pet-14b纯化蛋白电泳的数据比对图。
33.图5是bl21 plyss(de3)gdh pet-14b纯化蛋白电泳图。
34.图6是bl21 plyss(de3)gdh pet-14b纯化蛋白电泳的数据比对图。
35.图7是rosetta(de3)gdh pet-14b原酶液酶活检测曲线之一。
36.图8是rosetta(de3)gdh pet-14b原酶液酶活检测曲线之二。
37.图9是bl21 plyss(de3)gdh pet-14b原酶液酶活检测曲线。
具体实施方式
38.以下结合说明书附图，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
39.结合传统生物技术和合成生物学的理论及提供的信息，利用大肠杆菌作为宿主菌并且使用pet表达系统，高效表达gdh。本技术中高效表达gdh的工程菌株主要通过下述方法构建而成：将gdh原始基因构建到pet-14b质粒中，转化大肠杆菌rosetta，从而产生出一株高效表达gdh的工程菌。下面结合附图详细介绍该工程菌株的构建过程以及检测结果。
40.一.获得原始基因gdh
41.gdh的氨基酸序列如下：
42.mypdlkgkvvaitgaasglgkamairfgkeqakvvinyysnkqdpnevkeevikaggeavvvqgdvtkeedvknivqtaikefgtldiminnaglenpvpshemplkdwdkvigtnltgaflgsreaikyfvendikgnvinmssvhevipwplfvhyaaskggiklmtetlaleyapkgirvnnigpgaintpinaekfadpkqkadvesmipmgyigepeeiaavaawlaskeasyvtgitlfadggmtqypsfqagr。根据氨基酸序列设计优化其编码核苷酸序列，全基因合成质粒pet-14b-gdh，序列如下seq id no1：
43.ttcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccg
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44.二.构建好的质粒热激转化感受态细胞
45.将pet-14b-gdh分别用热激法转入bl21 plyss(de3)和rosetta(de3)感受态细胞中，转化pet14b-gdh，具体如下：
46.a)-80℃冰箱内取出大肠杆菌感受态细胞(bl21 plyss、rosetta)，迅速插入冰盒内，使其溶解。
47.b)加入dna样品(合成基因的质粒pet-14b-gdh粉末离心5min，加100ul ddh2o，取5ul稀释至500ul，取稀释后的质粒2ul加入感受态细胞中)轻轻混匀，冰中放置30分钟。
48.c)42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中放置2分钟，注意不要晃动，添加700ul不含抗生素的无菌培养基，混合均匀。
49.d)37℃振荡培养1小时(160-225rpm)，吸取100ul培养液均匀涂布到含氨苄抗生素的lb琼脂培养基平板中，37℃正置至液体被吸收，然后倒置过夜培养。
50.三.基因型鉴定
51.次日挑取单克隆到lb中培养，菌液pcr使用gdh特异性引物基因型鉴定，鉴定结果如图1-2所示，显示结果为鉴定成功。
52.pcr体系：
[0053][0054]
图1由左到右点样顺序：bl21 plyss kr pet_14b(菌落pcr 1)；dl2000 dna marker；rosetta(de3)gdh pet_14b(菌落pcr3～1)；bl21 plyssgdh pet_14b(大菌落斑2，1)。
[0055]
选取上述中bl21 plyssgdh pet_14b(菌落pcr 1)和rosetta(de3)gdh pet_14b(菌落pcr 1)菌进行以下实验，分别将转化好的bl21 plyssgdh pet_14b(菌落pcr 1)，rosetta(de3)gdh pet_14b(菌落pcr 1)菌接种到300ml的lb培养基中，37℃培养四小时后进行诱导，主要采用pet表达系统进行诱导。
[0056]
四.诱导表达
[0057]
接种培养4-5小时后，加入iptg(优选采用iptg终浓度0.8-1mmol/l)，在37℃条件
下诱导4-6小时，4小时后进行蛋白表达检测。
[0058]
五.蛋白表达检测及蛋白纯化
[0059]
将菌体原样制作蛋白样，取菌体1ml离心，去上清，加入200-500ml pbs重悬超声破碎(超声2s，暂停5s)五分钟，分别将超声上清和超声沉淀制作蛋白样。其中，超声上清进行进一步纯化，载体上边具有his标签，采用镍柱纯化。取上样5ml，使用五个浓度梯度的咪唑进行洗脱(具体为：50mm；100mm；200mm；300mm；500mm)，每次2倍柱体积孵育五分钟，每个梯度重复洗脱三次，并收集洗杂液。将流川液，五个浓度梯度的咪唑洗杂液分别制作蛋白样，进行sds-page蛋白电泳，结果如图3-4所示。
[0060]
图3由左到右点样顺序(rosetta gdh pet_14b点样顺序)：m；超声破碎上清；超声破碎沉淀；流穿液；50mm洗脱；100mm洗脱；200mm洗脱；300mm洗脱；500mm洗脱。
[0061]
bl21 plyss gdh-pet14b纯化蛋白电泳如图5-6所示。图5由左至右点样顺序(bl21 plyss gdh pet_14b点样顺序)：m；超声破碎上清；超声破碎沉淀；流穿液；50mm洗脱；100mm洗脱；200mm洗脱；300mm洗脱；500mm洗脱。
[0062]
gdh的蛋白大小是35kd左右，可见在35kd有明显表达，并且纯化效果非常可观，纯化出了单一条带且大小正确，并且可以直观地从蛋白电泳图(图3-4)上边看到rosetta菌种的重组gdh表达量可以达到70％以上。
[0063]
六.酶活测定
[0064]
取0.1g菌体，用1ml pbs(0.2m,ph＝7)重悬，200w，持续3s，间隔3s，超声至溶液澄清，12000rpm，4℃离心2min取上清，并用pbs(0.2m,ph＝7)稀释1000倍即得葡萄糖脱氢酶的粗酶液。
[0065][0066]
gdh的酶促反应机制如上公式所示，其中，gdh的最佳活性ph是7，酶促反应最适温度是27℃。通过紫外分光光度计测得该反应体系在340nm处吸光度的增大值来确定gdh酶的活性。
[0067]
酶促反应体系：
[0068][0069]
反应温度：27℃，酶活性检测曲线结果图见图7、图8所示。紫外吸光度数据如下：
[0070]
rosetta gdh pet_14b
[0071][0072][0073]
由该表可以看到300mm浓度咪唑洗脱液酶的活性最好。
[0074]
酶活性检测曲线结果图见图9所示，紫外吸光度数据如下：
[0075]
bl21 plyss gdh pet_14b
[0076]
时间原样上清流川50mm100mm200mm300mm500mm0min0.50.530.480.510.530.540.530.505min0.590.570.480.530.560.590.540.5210min0.630.650.530.540.630.610.600.5615min0.720.710.560.590.690.660.680.5820min0.770.790.590.630.770.740.690.61
[0077]
酶活计算公式：6/6.2*10*1000*k
[0078]
由酶活计算公式测得：
[0079]
rosetta gdh pet_14b原酶液酶活：6/6.2*10*1000*0.1882＝1821.29(u/g)；
[0080]
bl21 plyss gdh pet_14b原酶液酶活：6/6.2*10*1000*0.0134＝129.68(u/g)。
[0081]
因此，用本技术中的工程菌诱导表达获得的重组gdh的酶活远高于目前现有技术中的酶活。
[0082]
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。