一种高产香兰素的重组拟无枝酸菌、其构建方法与应用与流程

一种高产香兰素的重组拟无枝酸菌、其构建方法与应用
【技术领域】
1.本发明属于基因工程技术领域。更具体地，本发明涉及一种高产香兰素的重组拟无枝酸菌，还涉及所述重组菌的构建方法，以及在以阿魏酸为底物产香兰素中的应用。


背景技术：

2.香兰素又称香草醛(3
‑
甲氧基
‑4‑
羟基苯甲醛)，是世界上使用最广泛的调味料之一，在食品、药品、化妆品、农业等领域被广泛应用。香兰素具有“食品香料之王”的美称，有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，可在食品中起到助香、增味的作用；在医药方面，香兰素是合成多种药物的重要原料；香兰素在化妆品、香水等领域可作为调香剂；在农业生产中也可作为农作物的催熟剂和增产剂。由于其广泛的使用领域，国内外所生产出的香兰素远远不能满足目前的市场需求。
3.目前，市场上香兰素的生产方式主要包括植物提取、化学合成、微生物转化。随着消费者对天然香料需求的不断增长，利用微生物转化天然底物生产香兰素受到重视。目前，所用的天然底物主要是可再生资源阿魏酸或丁香酚等。其中阿魏酸，因其在自然界中分布广泛，且对微生物毒性作用小，而被认为是微生物生产香兰素首选的前体物质。研究表明，目前仅amycolatopsis和streptomyces两个属的多个菌株能将底物阿魏酸转化生成浓度大于10g/l的香兰素，基本可应用于工业化生产。德国steinb
ü
chel团队对amycolatopsis sp.atcc 39116(以前称为seteptiices setonii atcc 39116)菌株进行阿魏酸代谢分析(fleige c,meyer f,steinb
ü
chel a.metabolic engineering of the actinomycete amycolatopsis sp.strain atcc 39116 towards enhanced production of natural vanillin.applied and environmental microbiology,2016,82(11):3410
‑
3419)，认为阿魏酸在阿魏酰辅酶a合成酶、烯酰
‑
coa醛缩酶的依次作用下生成香兰素，在香兰素脱氢酶的作用下香兰素会进一步降解为香草酸，香草酸分别在香草酸脱羧酶和香草酸脱甲基酶作用下，降解为愈创木酚和原儿茶酸。其团队通过敲除编码香兰素脱氢酶的vdh基因，并对编码阿魏酰辅酶a合成酶基因(fcs)和编码烯酰
‑
coa醛缩酶基因(ech)进行过表达，使工程菌株产香兰素的浓度达到22.3g/l，为目前报道的最高水平。目前，拟无枝酸菌生物转化阿魏酸生产香兰素的基因已被解析，香兰素合成通路非常清晰，但fcs基因需要辅酶a和atp作为辅酶参与反应，辅酶a和atp都是非常昂贵的，要想进一步提高香兰素的产量，就需要更多的辅酶，而在拟无枝酸菌中构建辅酶再生系统是非常复杂的。如果辅酶依赖的途径可以被辅酶不依赖的途径所取代，那么生物催化过程就不需要构建辅酶再生系统或添加辅酶。
4.2014年，furuya等(furuya t,miura m,kino k.a coenzyme
‑
independent decarboxylase/oxygenase cascade for the efficient synthesis of vanillin.chembiochem:a european journal of chemical biology,2014,15(15):2248
‑
2254)将来源于短小芽孢杆菌(bacillus pumilus atcc 14884)的不依赖辅酶的阿魏酸脱羧酶(fdc)和来源于惰性柄杆菌(caulobacter segnis atcc 21756)的不依赖辅酶的4
‑
乙烯基愈创木酚加氧酶(cso2)在大肠杆菌中共表达，获得的菌株可以将阿魏酸转化成香兰
素，香兰素产量为1.2g/l。目前，在拟无枝酸菌中还没有人研究不依赖辅酶的香兰素合成路线。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术方案，通过基因工程技术提高拟无枝酸菌的香兰素产量。
6.本发明提供一种高产香兰素的重组拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)，所述重组拟无枝酸菌表达阿魏酸脱羧酶基因(opt fdc)和4
‑
乙烯基愈创木酚加氧酶基因(opt cso2)。
7.在本发明中，阿魏酸脱羧酶基因(opt fdc)是将来源于短小芽孢杆菌(bacillus pumilus atcc 14884)的fdc基因进行密码子优化，其核苷酸序列如seq id no.1所示，4
‑
乙烯基愈创木酚加氧酶基因(opt cso2)是将来源于惰性柄杆菌(caulobacter segnis atcc 21756)的cso2基因进行密码子优化，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明还提供上述重组拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)的构建方法，所述方法包括以下步骤：
9.(1)构建含有强启动子perme的质粒
10.合成强启动子perme，其基因序列如seq id no.3所示，将合成的基因序列用xbai/ecori酶切，酶切片段连接到pkc1139质粒的xbai/ecori位点，得到质粒pkc1139
‑
perme；
11.(2)构建含有opt fdc和opt cso2基因的质粒
12.分别用fdc
‑
for/fdc
‑
rev为引物，拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)基因组为模板，pcr扩增opt fdc基因序列，然后将opt fdc片段通过assembly试剂盒连接到pkc1139
‑
perme质粒的nsii位点，得到质粒pkc1139
‑
opt fdc；
13.分别用cso2
‑
for/cso2
‑
rev为引物，拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)基因组为模板，pcr扩增opt cso2基因序列，然后将opt cso2片段通过assembly试剂盒连接到pkc1139
‑
perme质粒的nsii位点，得到质粒pkc1139
‑
opt cso2的构建；
14.用xbai/spei酶切质粒pkc1139
‑
opt cso2上的opt cso2基因片段，连接到质粒pkc1139
‑
opt fdc的spei位点，得到pkc1139
‑
opt fdc
‑
cso2质粒；
15.(3)构建重组拟无枝酸菌
16.利用接合转移实验方法，将步骤(2)得到的pkc1139
‑
opt fdc
‑
cso2质粒转化到拟无枝酸菌中，根据阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得同时表达opt fdc和opt cso2基因的重组拟无枝酸菌。
17.在上述构建方法中，步骤(3)的拟无枝酸菌是拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)hm
‑
141，该菌株已于2021年7月9日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.22871。本领域技术人员也可以以其他拟无枝酸菌株作为出发菌株，构含有opt fdc和opt cso2基因的重组拟无枝酸菌。
18.拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)hm
‑
141是从西安、咸阳、渭南等地果树周围采集的土壤样品后，经常规技术进行分离，然后诱变后鉴定获得的。其中，所述诱变是以分离所得的原始菌株为出发菌株，进行复合诱变选育，紫外
‑
亚硝酸钠复合诱变筛出高产香兰素的
菌株：
19.将出发菌株在平板培养基上进行活化，然后挑取菌落溶于装有玻璃珠的10ml无菌水中，震荡混匀后得到菌悬液，梯度稀释获得od
600
为0.4
‑
0.6的菌悬液。取10ml菌悬液置于无菌培养皿中，在15w紫外灯的30cm处照射30s，然后避光培养1h，再向培养皿中加入0.1m的亚硝酸钠，在30℃，200rpm培养3min。
20.诱变结束后，立即加入磷酸氢二钠溶液终止反应。将诱变后的菌悬液进行梯度稀释，然后涂布于平板培养基上，挑取长出的单菌落接入装有种子培养基(种子培养基：葡萄糖25g/l，酵母浸粉10g/l，氯化钠0.8g/l，磷酸二氢钾5g/l，七水硫酸镁0.2g/l，氯化钙0.05g/l，其余为水，调节ph为7.2，在121℃下灭菌20min)的96孔板中培养，种子液以5％的接种量接入96孔板发酵培养基(发酵培养基：葡萄糖30g/l，酵母浸粉10g/l，氯化钠0.8g/l，磷酸二氢钾5g/l，七水硫酸镁1g/l，氯化钙0.05g/l，其余为水，调节初始ph为7.2，发酵培养基在121℃下灭菌20min)中，在30℃、200rpm摇床中培养，加入0.5g/l的底物阿魏酸，结合2，4
‑
二硝基苯肼显色法，用酶标仪在520nm处测吸光度，以此测定发酵液中香兰素的含量。
21.采用2，4
‑
二硝基苯肼显色法测定香兰素的产量：发酵转化后期每4h从96孔板的培养液中取出10μl菌液于24深孔板内，加入100μl 2，4
‑
二硝基苯肼溶液和5ml 0.8mol/l的naoh溶液，混匀，以蒸馏水作为空白对照，同时以出发菌株作为对照组，然后检测吸光度。筛选出正突变株进行摇瓶复筛，将在平板培养基上活化的正突变株分别接种于种子培养基，30℃、200rpm培养48
‑
72h，然后按照5％的接种量接种于发酵培养基中，30℃、200rpm条件下进行转化，底物阿魏酸初始浓度为10g/l。通过hplc测定最终发酵液中香兰素的含量。最终筛选出高产香兰素的菌株。
22.所得菌株采用16s rdna方法鉴定，确认筛选的菌株的16s rdna与拟无枝酸菌具有99％的同源性，因此，将拟无枝酸菌hm
‑
141定名为amycolatopsis sp.hm
‑
141。其生物学特性为：在固体培养基上能形成明显的菌落，其菌落形态见附图1，菌落为白色或淡黄色、不透明，表面干燥。革兰氏染色为阳性，菌体为细丝状。
23.拟无枝酸菌amycolatopsis sp.hm
‑
141产香兰素测定：
24.取一管
‑
80℃保藏的甘油菌种amycolatopsis sp.hm
‑
141，在固体平板(固体培养基：葡萄糖4g/l，酵母浸粉4g/l，麦芽提取物10g/l，琼脂20g/l，其余为水)上稀释涂布，平板倒置于30℃培养箱中培养3
‑
4d至长出菌落。
25.从活化平板上接一环菌到种子培养基中，在30℃培养48
‑
72h，转速为200rpm。
26.将种子液按照5％的接种量接种到5l发酵罐中(含有4l发酵培养基)，在30℃发酵培养，搅拌转速为800rpm，通气比为1vvm。培养24h后，加入底物阿魏酸22.5g/l(共90g，按照4l发酵液体积计算的阿魏酸浓度，将阿魏酸溶于0.5m naoh溶液中使其浓度为100g/l)，然后调节ph为8.2，继续发酵48h。
27.由于在4l发酵液的基础上加了0.9l的阿魏酸溶液，而在发酵期间对发酵液取样导致发酵液有所减少，在发酵结束时，测得实际的发酵液体积为4.5l，为了保持数据一致，以下数据均用4l发酵液进行计算。用hplc测定发酵液中香兰素的浓度为15.13g/l，残留的阿魏酸浓度为0.4g/l，如果计入未参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为85％；如果不计入未参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为87％。副产物香兰酸的含量为0.25g/l，发酵液中未检测到香兰醇。
28.根据一种可选的实施方式，步骤(3)中，所述阿伯拉霉素抗性筛选是将拟无枝酸菌涂布于含有50μg/ml阿伯拉霉素和25μg/ml萘啶酮酸溶液gym固体培养基中，在30℃培养4d至长出单菌落，所得单菌落即为阳性突变株。
29.基于此，本发明还提供重组拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)在产香兰素中的应用。
30.作为一种特别优选的实施方式，将上述工程菌株接种于50ml种子培养基m1中，在30℃、200rpm条件下培养72h；
31.将种子液按照质量比5％的接种量接种到含有4l发酵培养基m2的5l发酵罐中，在30℃、搅拌转速800rpm、通气比为1vvm条件下发酵培养24h；
32.然后加入第一批底物阿魏酸20g/l，当阿魏酸浓度下降至3
‑
4g/l时，再加入第二批底物阿魏酸12g/l，调节ph为8.2继续发酵48h；
33.所述m1培养基配方为：葡萄糖25g/l，酵母浸粉10g/l，氯化钠0.8g/l，磷酸二氢钾5g/l，七水硫酸镁0.2g/l，氯化钙0.05g/l，其余为水，调节ph为7.2；
34.所述m2培养基配方为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉10g/l，氯化钠0.8g/l，磷酸二氢钾5g/l，七水硫酸镁1g/l，氯化钙0.05g/l，其余为水，调节ph为7.2。
35.停止发酵后，经hplc测定，发酵液中香兰素的浓度为23.5g/l。
36.另一方面，本发明还提供阿魏酸脱羧酶基因(opt fdc)与4
‑
乙烯基愈创木酚加氧酶基因(opt cso2)的表达在提高拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)以阿魏酸为底物产香兰素的产量用的应用。
37.本发明验证了通过基因工程手段在拟无枝酸菌中同时表达不依赖辅酶a和atp的opt fdc基因和opt cso2基因，能够有效提高拟无枝酸菌的香兰素，其香兰素产量较出发菌株提高了55％，为工业生产进一步提高香兰素发酵产量提供技术支撑。
38.本发明涉及的拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)hm
‑
141已于2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为cgmcc no.22871。
【附图说明】
39.图1为本发明中pkc1139
‑
opt fdc
‑
cso2质粒的图谱
40.图2为本发明中pkc1139
‑
ech
‑
fcs质粒的图谱
【具体实施方式】
41.通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
42.在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为质量百分比，用于解释比例的“：”均为质量比。
43.实施例中使用到的菌株和质粒见表1，合成的引物序列见表2。
44.表1本发明所用的菌种和质粒
[0045][0046]
表2研究中所用的引物
[0047][0048][0049]
本发明涉及以下培养基：
[0050]
lb培养基配方为：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l。
[0051]
gym培养基配方为：葡萄糖4g/l、酵母提取物4g/l、麦芽提取物10g/l。
[0052]
gym固体培养基配方为：葡萄糖4g/l、酵母提取物4g/l、麦芽提取物10g/l、碳酸钙2g/l、琼脂粉20g/l。
[0053]
m1培养基配方为：葡萄糖25g/l，酵母浸粉10g/l，氯化钠0.8g/l，磷酸二氢钾5g/l，七水硫酸镁0.2g/l，氯化钙0.05g/l，其余为水，调节ph为7.2。
[0054]
m2培养基配方为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉10g/l，氯化钠0.8g/l，磷酸二氢钾5g/l，七水硫酸镁1g/l，氯化钙0.05g/l，其余为水，调节ph为7.2。
[0055]
以下实施例中使用的接合转移实验包括以下步骤：
[0056]
(1)将拟无枝酸菌amycolatopsis sp.(或其他工程菌株)在gym固体培养基上进行活化，在30℃培养3
‑
4d至长出菌落，然后接种菌株到50ml gym液体培养基中在30℃、200rpm培养2d。
[0057]
(2)将构建好的质粒热激转入e.coli et12567(puz8002)菌株，涂布于含有25μg/ml氯霉素、25μg/ml卡那霉素和50μg/ml阿伯拉霉素抗性的lb固体平板，在37℃培养12h至长出单菌落，接种单菌落于含有抗性的4ml lb液体培养基中37℃、200rpm过夜培养，然后按照1％的接种量接种于20ml lb中在37℃、200rpm培养4
‑
5h至od
600
为0.4
‑
0.6。
[0058]
(3)分别取拟无枝酸菌amycolatopsis sp.菌液2ml及携带目标质粒的e.coli et12567(puz8002)菌液1ml，5000g离心1min，用无抗lb清洗两遍，加入100μl无抗lb培养基，将拟无枝酸菌和e.coli et12567(puz8002)按体积比7:1混合，将混合好的菌液取30μl点在无抗gym固体培养基上30℃，14h正置培养。
[0059]
(4)将长出的菌斑刮下，涂布于含有50μg/ml阿伯拉霉素和25μg/ml萘啶酮酸溶液gym固体培养基中，在30℃培养4d至长出单菌落，即为正确的菌株。
[0060]
实施例1：不依赖辅酶a、atp的opt fdc和opt cso2基因表达菌株的构建
[0061]
opt fdc基因序列如seq id no:1所示，opt cso2基因序列如seq id no:2所示。为了构建opt fdc和opt cso2基因表达菌株，首先构建过表达质粒pkc1139
‑
opt fdc
‑
cso2：
[0062]
合成在拟无枝酸菌中使用的强启动子perme，其基因序列如seq id no:3所示。将合成的perme基因序列用xbai/ecori进行酶切，酶切片段连接到pkc1139质粒的xbai/ecori位点，得到质粒pkc1139
‑
perme。
[0063]
然后，分别用fdc
‑
for/fdc
‑
rev为引物，拟无枝酸菌基因组为模板，pcr扩增opt fdc基因序列，然后将opt fdc片段通过assembly试剂盒连接到pkc1139
‑
perme质粒的nsii位点，完成质粒pkc1139
‑
opt fdc的构建。分别用cso2
‑
for/cso2
‑
rev为引物，拟无枝酸菌基因组为模板，pcr扩增opt cso2基因序列，然后将opt cso2片段通过assembly试剂盒连接到pkc1139
‑
perme质粒的nsii位点，完成质粒pkc1139
‑
opt cso2的构建。用xbai/spei酶切质粒pkc1139
‑
opt cso2上的opt cso2基因片段，连接到质粒pkc1139
‑
opt fdc的spei位点，得到pkc1139
‑
opt fdc
‑
cso2质粒，pkc1139
‑
opt fdc
‑
cso2质粒图谱如图1所示。
[0064]
利用接合转移实验方法，将pkc1139
‑
opt fdc
‑
cso2质粒转化到拟无枝酸菌hm
‑
141中，根据阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得opt fdc和opt cso2基因表达的基因工程菌株amy/pkc1139
‑
opt fdc
‑
cso2。
[0065]
实施例2：依赖辅酶a、atp的ech和fcs基因过表达菌株的构建
[0066]
为了构建ech和fcs过表达菌株，首先构建过表达质粒pkc1139
‑
ech
‑
fcs。分别用ech
‑
for/ech
‑
rev为引物，拟无枝酸菌基因组为模板，pcr扩增ech基因序列，然后将ech片段通过assembly试剂盒连接到pkc1139
‑
perme质粒的nsii位点，完成质粒pkc1139
‑
ech的构建。
[0067]
然后，分别用fcs
‑
for/fcs
‑
rev为引物，拟无枝酸菌基因组为模板，pcr扩增fcs基因序列，然后将fcs片段通过assembly试剂盒连接到pkc1139
‑
perme质粒的nsii位点，完成质粒pkc1139
‑
fcs的构建。用xbai/spei酶切质粒pkc1139
‑
fcs上的fcs基因片段，连接到质粒pkc1139
‑
ech的spei位点，得到pkc1139
‑
ech
‑
fcs质粒，pkc1139
‑
ech
‑
fcs质粒图谱如图2所示。
[0068]
利用接合转移实验方法，将pkc1139
‑
ech
‑
fcs质粒转化到拟无枝酸菌hm
‑
141中，根据阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得ech和fcs基因过表达的基因工程菌株amy/pkc1139
‑
ech
‑
fcs。
[0069]
实施例3：原始菌株(hm
‑
141)与本发明的重组菌株的发酵对比
[0070]
分别用拟无枝酸菌hm
‑
141、实施例1
‑
2构建的amy/pkc1139
‑
opt fdc
‑
cso2、amy/pkc1139
‑
ech
‑
fcs菌株进行生物转化阿魏酸生产香兰素的发酵实验。实验方法如下：
[0071]
分别接种上述菌株于50ml种子培养基m1中，在30℃、200rpm培养72h，将种子液按
照5％的接种量接种到5l发酵罐中(含有4l发酵培养基m2)，在30℃发酵培养，搅拌转速为800rpm，通气比为1vvm。
[0072]
对照株(拟无枝酸菌hm
‑
141)培养24h后，加入底物阿魏酸22.5g/l(共90g，将阿魏酸溶于0.5m naoh溶液中使其浓度为100g/l)，然后调节ph为8.2，继续发酵48h，发酵结束用hplc测定发酵液中香兰素的浓度。
[0073]
实施例1和2的工程菌株培养24h后，先加入第一批底物阿魏酸20g/l，当阿魏酸还剩余3
‑
4g/l时，再加入第二批底物阿魏酸8g/l或12g/l(共112g或128g)，然后调节ph为8.2，继续发酵48h，发酵结束用hplc测定发酵液中香兰素的浓度。
[0074]
hplc测定发酵液中香兰素方法是：发酵液离心，取上清液进行hplc分析。采用安捷伦hplc1260分析转化产物，色谱柱为依利特hypersil ods2，5μm，4.6mm
×
250mm；检测波长295nm；柱温30℃；流速：1ml/min；进样量：10μl；流动相为乙腈和0.5％磷酸水溶液，0
‑
20min，10
‑
20％乙腈，20
‑
30min，20
‑
10％乙腈。
[0075]
发酵结果如下表1所示。
[0076]
表1拟无枝酸菌及其工程菌株的发酵实验结果
[0077][0078]
以上结果可以看出，在最优发酵条件下，本发明的重组拟无枝酸菌amy/pkc1139
‑
opt fdc
‑
cso2实现了将32g/l的阿魏酸转化为香兰素，所得香兰素在发酵液中的浓度达到23.5g/l，检测发现发酵液中的底物余量很低，表明底物基本被全部转化为产物，且其转化路径不依赖辅酶a和atp，具备更高的经济价值。与本发明的重组菌相比，出发菌株能实现的香兰素产物浓度为15.13g/l，即本发明的重组菌通过表达opt fdc和opt cso2基因实现了55％的产量提高。作为对照，在出发菌株中过表达依赖辅酶a和atp的ech和fcs基因时，香兰素产量虽然较出发菌株提高了34％，却依然显著低于本发明的重组菌，且该菌株合成香兰素的途径依赖辅酶a和atp的参与。
[0079]
综上所述，本发明的重组拟无枝酸菌通过表达opt fdc和opt cso2基因，实现了香兰素产量的显著提高，且其合成途径中不依赖辅酶a和atp而具备经济优越性。