非生物胁迫耐受性提高的植物和方法与流程

1.本发明涉及植物育种和遗传学等领域，尤其是，涉及到提高植物对非生物胁迫的耐受性。
2.发明背景
3.造成植物胁迫的原因可能同时有生物因素和非生物因素。生物因素的胁迫包括病毒感染、昆虫取食和植物寄生如榭寄生等；非生物因素胁迫包括水分的过量或不足、极端气候、除草剂等化学合成物。
4.非生物胁迫是引发全球作物减产的主要原因，导致主要农作物的平均产量减少50％以上(boyer,j.s.(1982)science 218:443-448；bray,e.a.等(2000)in biochemistry and molecular biology of plants,buchannan,b.b.等编著,amer.soc.plant biol.,pp.1158-1249)。因此，就需要开发能够提高植物非生物胁迫耐受性的组合物和方法，本发明提供了这种组合物和方法。
5.发明概述
6.以下实施例包括在本发明中涵盖的所有实施例：
7.在一个实施例中，本发明包括一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含有一个多肽，其氨基酸序列与seq id no：3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的一致性。并且提高植物中所述多核苷酸的表达能提高植物的耐旱性。在某些实施例中，所述分离的多核苷酸编码seq id no：3、6、9、12、15、18、21或24氨基酸序列。在某些实施例中，所述分离的多核苷酸包括seq id no：1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22或23核苷酸序列。在某些实施例中，干旱条件下提高植物中所述多核苷酸的表达能提高籽粒的产量。
8.本发明还提供了一种重组dna构建体，所述重组dna构建体包括一个分离的多核苷酸可操作地连接至少一个异源调控元件。其中，所述多核苷酸包含有一个多肽，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的一致性。
9.本发明进一步提供了一种改良的植物或种子，所述植物或种子能够提高至少一种多核苷酸的表达量或活性。所述多核苷酸包含有一种多肽，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％一致性。在某些实施例中，所述改良的植物或种子在其基因组中包含有一种重组dna构建体，所述重组dna构建体包含有一个多核苷酸操作地连接至少一个异源调控元件。其中所述多核苷酸编码一种多肽，这种多肽的氨基酸序列与seq id no：3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述改良的植物生长在干旱条件下时，与对照植物相比，明显有更高的干旱耐受性和更多的籽粒产量。
10.在某些实施例中，所述改良的植物或种子在其基因组位点上包含有一种靶向遗传修饰。所述的基因组位点包含有一种多核苷酸，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。所述的靶向遗传修饰能增加所述多肽的表达和/或活性。在某些实施例中，所述改良的植物生长在干旱条件下时，与对照植物相比，表现出提高的干旱耐受性和增加的籽粒产量。
11.在某些实施例中，所述植物包括水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
12.还提供了增加植物耐旱性的方法，所述方法包括提高至少一个多核苷酸的表达。所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。其中，与对照植物相比，所述获得的植物表现出增加的耐旱性。
13.在某些实施例中，所述能够提高耐旱性的方法包括：(a)向可再生植物细胞引入一个重组dna构建体。所述重组dna构建体包含有一个多核苷酸可操作地连接至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸编码的一个多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24相比至少有80％的序列一致性；和(b)获得所述植物的子代植物，其中所述植物基因组中含有所述重组dna构建体。
14.在某些实施例中，所述能够提高耐旱性的方法包括：(a)向可再生植物细胞的基因组位点引入一个靶向遗传修饰。所述靶向遗传修饰包含一个多核苷酸，所述多核苷酸编码的一个多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24相比至少有80％的序列一致性；和(b)获得所述植物的子代植物。其中，所述植物在其基因组中包含有所述引入的遗传修饰，并且能够提高所述多肽的表达量和/或活性。在某些实施例中，所述靶向遗传修饰的引入是通过多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、工程位点特异性大范围核酸酶或argonaute等基因组修饰技术。在某些实施例中，所述靶向遗传修饰存在于(a)所述编码区；(b)非编码区；(c)调控序列；(d)非翻译区；或(e)基因组位点上(a)-(d)的任意组合，所述基因组位点编码的多肽包含的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24相比有至少80％的序列一致性。
15.附图说明及序列表
16.根据以下发明详述和附图及序列表，可以更全面的理解本发明，以下发明详述和附图及序列表形成本发明的一部分。
17.表1序列表中核苷酸和氨基酸序列的编号
18.[0019][0020]
序列描述以及关联的序列表遵循如37c.f.r.
§
1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37c.f.r.
§
1.822中列出的规则。
[0021]
详细描述
[0022]
本发明中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本发明。
[0023]
如本发明所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
[0024]
定义：
[0025]
如本文所述，植物“提高的耐旱性”是指任何在生理或物理表型上可测量的提高。比如在干旱条件下，相对于参照植物或对照植物进行的产量测定。通常，一种基因组中包含有一个重组dna构建体或dna修饰的植物与基因组中不含有重组dna构建体或dna修饰的参照植物或对照植物相比，表现出增加的耐旱性。
[0026]
植物“增加的百草枯耐受性”反映了所述植物在经过百草枯溶液处理后，与参照植物或对照植物相比，发生更少的生理或物理伤害并存活下来的能力。一般来说，对于相对低水平的百草枯的耐受性可以作为对非生物胁迫耐受性的标志，比如干旱胁迫。
[0027]“农艺性状”作为可测量的参数包括但不限于：绿量、籽粒产量、生长率、总生物量
或累积速率、成熟期鲜重、成熟期干重、果实产量、种子产量、植株总氮素含量、果实氮素含量、种子氮素含量、叶片组织氮素含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、叶片组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、耐旱性、营养吸收速率、根倒伏、收获指数、茎倒伏、株高、穗位高、穗长、耐盐碱、分蘖数、圆锥花序大小、幼苗活力和低温出苗率。
[0028]“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组dna构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，例如重组dna构建体，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本发明所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
[0029]“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。例如，对照植物可能和受测试植物有着相同的基因背景，但是没有导致受测试植物或细胞发生所述的遗传变异。
[0030]“植物”包括植物全部植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及相同的子代植物。植物细胞包括但不限于来自于以下物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶片、根系、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
[0031]“子代”包括植物的任何后续世代。
[0032]“修饰的植物”包括在其基因组内有异源多核苷酸或修饰的基因或启动子的植物。例如，所述异源多核苷酸能够稳定整合进基因组内，并遗传连续的世代。所述异源多核苷酸能单独地或作为重组dna构建体的部分被整合进基因组内。
[0033]
对于序列而言的“异源”是指一个起源于外来物种的序列，是通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
[0034]“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”都可以互换并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链rna或dna聚合物。核苷酸(通常以它们的5
′‑
单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“a”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应rna或dna)，“c”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“g”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“u”表示尿苷酸，“t”表示脱氧胸苷酸，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。
[0035]“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。
[0036]“重组dna构建体”是指一个在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，一个重组dna构建体可能包含来源于不同物种的调控元件和编码序列；或者是来源于同一物种以一种不同于通常在自然界中发现的方式排列的调控元件和编码序列。
[0037]“调控元件”是指位于编码序列的上游(5'-非编码序列)、中间或下游(3'-非编码
序列)，并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控元件包括但不限于：启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列。术语“调控元件”和“调控序列”和“调控区”在本文中可以互换使用。
[0038]“启动子”是指能控制另一个核酸片段转录的核酸片段。“植物中有功能的启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论是否来源于植物细胞。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”是指占主导但不是必要的唯一的在一种组织或器官中表达，而且也可以在一种特定的细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”是一种其活性由生长期来决定的启动子。
[0039]“可操作地连接”是指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控一个核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
[0040]“表达”是指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成功能rna或mrna)，和/或mrna翻译成前体或成熟蛋白质。
[0041]
本文中“增加”、“提高”或类似词汇是指实验组(如本文中描述的有dna修饰的植物)中与对照组(如不含有dna修饰的野生型植物)进行比较时，任何可检测到的增加。因此，蛋白质表达的增加包括样本中蛋白质总水平的任何可检测的增加，可以使用本领域中的常规方法如蛋白质印迹法和elisa来确定。
[0042]
本文中使用的“产量”是指单位面积收获的农产品的总量，并且可根据谷物水分(如玉米通常为15％，水稻为13.5％)进行调整收获时每英亩作物的立方数或每亩作物的千克数。谷物水分在收获时测定。调整后的谷物重量的测试是确定为每株的磅或克的重量，由收获时的谷物水分来进行调整。
[0043]
本发明中，当在特定比对窗口中最大一致性比对时，两个多聚核苷酸或多肽序列的“序列一致性”或“一致性”指两序列中残基相同。当序列一致性百分数用于提及的蛋白质，被认为不同残基位置与保守氨基酸替代不同，氨基酸残基被具有相似化学性质的其它氨基酸残基(如电荷或疏水性)替代，而不改变分子的功能特性。当序列在保守区替代不同，序列一致性百分数可以上调以更正替代的保守性。保守替代不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。本领域的技术人员熟悉进行调整的方法，包括计算作为部分的而不是全长错配的保守替代，因而增加序列一致性百分数，因此，相同氨基酸给与1分，不保守的替代给与0分，保守替代给与0-1分，计算保守替代的得分，如在pc/gene执行(intelligenetics，mountain view，加州)。
[0044]
本发明中，“序列一致性百分数”是通过确定两个序列中一致的核酸碱基或氨基酸残基位置的数量计算出匹配位置的数量，匹配位置的数量除以对比窗口中位置的总量，并用结果乘以100。
[0045]
除非特别说明，本发明中的多序列比对采用clustal v比对方法(higgins和sharp.(1989)cabios.5：151-153)和缺省参数(间隙罚分＝10，间隙长度罚分＝10)，两个比对的缺省参数和计算氨基酸序列一致性百分数使用clustal v方法：ktuple＝1，间隙罚分＝3，窗口＝5和对角线拯救＝5；用于核酸序列的参数ktuple＝2，间隙罚分＝5，窗口＝4和对角线拯救＝4。序列比对后应用clustal v程序，通过观察“序列距离”表，可以得到“一致性百分比”和“散度”值，除非特别说明，一致性百分比和散度值以相同的方式获得。
[0046]
组合物：
[0047]
多核苷酸和多肽
[0048]
本发明中提供的多核苷酸编码的多肽如下：
[0049]
一方面，本发明提供了一个多核苷酸，所述多核苷酸编码的多肽包含有一个氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下任一氨基酸序列有至少80％(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)的一致性：seq id no:3(osdn-dtp8)、seq id no:6(oskik1)、seq id no:9(osrwdd1)、seq id no:12(osufd1)、seq id no:15(osppr2)、seq id no:18(ossaur28-1)、seq id no:21(oshys1)和seq id no:24(osfbid1)。
[0050]“osdn-dtp8”是指一种在过度表达时能够赋予水稻耐旱性状的多肽。所述osdn-dtp8多肽(seq id no:3)是由水稻基因位点loc_os09g04650.1上的编码序列(cds)(seq id no:2)或核苷酸序列(seq id no:1)编码，其在tigr中的注释为“表达蛋白”。“osdn-dtp8多肽”在本文中是指osdn-dtp8多肽及其旁系同源基因(如由seq id no:51编码的seq id no:52)或来自于其它生物的同源基因。
[0051]“oskik1”是指一种在过量表达时能赋予水稻耐旱性状的多肽。所述oskik1多肽(seq id no:6)是由水稻基因位点loc_os07g36570.1上的编码序列(cds)(seq id no:5)或核苷酸序列(seq id no:4)编码，其在tigr中注释为的“ki域相互作用激酶1，推定，表达”。“ki多肽”在本文中是指oskik1多肽及其旁系同源基因(如由seq id no:53编码的seq id no:54)，以及来自于其它生物的同源基因，例如玉米的同源基因(例如，由seq id no:55编码的seq id no:56)、高粱的同源基因(例如，由seq id no:57编码的seq id no:58)、拟南芥的同源基因(例如，由seq id no:59编码的seq id no:60)，或大豆的同源基因(例如，由seq id no:61编码的seq id no:62)。
[0052]“osrwdd1”是指一种在过量表达时能赋予水稻耐旱性状的多肽。所述osrwdd1多肽(seq id no:9)是由水稻基因位点loc_os02g46740.1上的编码序列(cds)(seq id no:8)或核苷酸序列(seq id no:7)编码，其在tigr中的注释为“含有rwd结构域的蛋白质，表达”。“rwdd1多肽”在本文中是指osrwdd1多肽及其旁系同源基因(如由seq id no:63编码的seq id no:64)，以及来自于其它生物的同源基因，例如玉米的同源基因(例如，由seq id no:65编码的seq id no:66)、高粱的同源基因(例如，由seq id no:67编码的seq id no:68)、拟南芥的同源基因(例如，由seq id no:69编码的seq id no:70)，或大豆的同源基因(例如，由seq id no:71编码的seq id no:72)。
[0053]“osufd1”是指一种在过量表达时能赋予水稻耐旱性状的多肽。所述osufd1多肽(seq id no:12)是由水稻基因位点loc_os01g68940.1上的编码序列(cds)(seq id no:11)或核苷酸序列(seq id no:10)编码，其在tigr中的注释为“泛素家族结构域蛋白，表达”。“ufd1多肽”在本文中是指osufd1多肽及其旁系同源基因(如由seq id no:73编码的seq id no:74)，以及来自于其它生物的同源基因，例如玉米的同源基因(例如，由seq id no:75编码的seq id no:76)、高粱的同源基因(例如，由seq id no:77编码的seq id no:78)、拟南芥的同源基因(例如，由seq id no:79编码的seq id no:80)，或大豆的同源基因(例如，由seq id no:81编码的seq id no:82)。
[0054]“osppr2”是指一种在过量表达时能赋予水稻耐旱性状的多肽。所述osppr2多肽
(seq id no:15)是由水稻基因位点loc_os03g06910.1上的编码序列(cds)(seq id no:14)或核苷酸序列(seq id no:13)编码，其在tigr中的注释为“含ppr重复序列的蛋白质”。“ppr2多肽”在本文中是指osppr2多肽及其旁系同源基因(如由seq id no:83编码的seq id no:84)，以及来自于其它生物的同源基因，例如玉米的同源基因(例如，由seq id no:85编码的seq id no:86)、高粱的同源基因(例如，由seq id no:87编码的seq id no:88)、拟南芥的同源基因(例如，由seq id no:89编码的seq id no:90)，或大豆的同源基因(例如，由seq id no:91编码的seq id no:92)。
[0055]“ossaur28-1”是指一种在过量表达时能赋予水稻耐旱性状的多肽。所述ossaur28-1多肽(seq id no:18)是由水稻基因位点loc_os06g48860.1上的编码序列(cds)(seq id no:17)或核苷酸序列(seq id no:16)编码，其在tigr中的注释为“ossaur28生长素反应性saur基因家族成员，表达”。“saur28-1多肽”在本文中是指ossaur28-1多肽及其旁系同源基因，以及来自于其它生物的同源基因，例如玉米的同源基因(例如，由seq id no:93编码的seq id no:94)、高粱的同源基因(例如，由seq id no:95编码的seq id no:96)、拟南芥的同源基因(例如，由seq id no:97编码的seq id no:98)，或大豆的同源基因(例如，由seq id no:99编码的seq id no:100)。
[0056]“oshys1”是指一种在过量表达时能赋予水稻耐旱性状的多肽。所述oshys1多肽(seq id no:21)是由水稻基因位点loc_os01g68970.1上的编码序列(cds)(seq id no:20)或核苷酸序列(seq id no:19)编码，其在tigr中的注释为“hys1,推定，表达”。“hys1多肽”在本文中是指oshys1多肽及其旁系同源基因(如由seq id no:101编码的seq id no:102)，以及来自于其它生物的同源基因，例如玉米的同源基因(例如，如由seq id no:103编码的seq id no:104)、高粱的同源基因(例如，由seq id no:105编码的seq id no:106)、拟南芥的同源基因(例如，由seq id no:107编码的seq id no:108)，或大豆的同源基因(例如，由seq id no:109编码的seq id no:110)。
[0057]“osfbid1”是指一种在过量表达时能赋予水稻耐旱性状的多肽。所述osfbid1多肽(seq id no:24)是由水稻基因位点loc_os04g31570.1上的编码序列(cds)(seq id no:23)或核苷酸序列(seq id no:22)编码，其在tigr中的注释为“f-box蛋白交换域蛋白，表达”。“fbid1多肽”在本文中是指fbid1多肽及其旁系同源基因(如由seq id no:111编码的seq id no:112)，以及来自于其它生物的同源基因。
[0058]
正如本领域内的技术人员所意识到的，本发明中包含的不仅仅是特定的典型性序列。核酸片段的改变导致在给定位点产生化学等效氨基酸，但不影响编码多肽的功能性质，这在本领域是众所周知的。例如，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可由编码另一疏水性较小的残基(例如甘氨酸)或疏水性较大的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电的残基替换另一个残基的变化，如用天冬氨酸替换谷氨酸，或一个带正电的残基替换另一个残基，如用赖氨酸替换精氨酸，也可预期产生功能等效的产物。导致多肽分子n端和c端部分改变的核苷酸变化也不会改变多肽的活性。所提出的每一个改良都在本领域的常规技术范围内，确定编码产品的生物活性的保留也是如此。
[0059]
重组dna构建体
[0060]
还提供了包含有本文中所描述的任何多核苷酸的重组dna构建体。在某些实例中，所述重组dna构建体进一步包含有至少一个调控元件。在某些实例中所述的至少一个调控
元件是一种异源调控元件。在某些实例中，重组dna构建体中的所述至少一个调控田间包含有一个启动子。在某些势力中，所述启动子是一种异源启动子。
[0061]
许多启动子能被用于本文中的重组dna构建体。所述启动子能依据所期望的结果进行选择，并且可以包括用于在宿主生物体中表达的组成型、组织特异性、诱导型或其他启动子。
[0062]“组成型”启动子是一种在大多数环境条件下活跃的启动子。组成型启动子包括，例如，wo 99/43838和美国专利号6072050中公开的rsyn7启动子和其他组成型启动子的核心启动子；核心camv 35s启动子(odell等(1985)nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白(mcelroy等(1990)plant cell 2:163-171)；泛素(christensen等(1989)plant mol.biol.12:619-632和christensen等(1992)plant mol.biol.18:675-689)；pemu(last等(1991)theor.appl.genet.81:581-588)；mas(velten等(1984)embo j.3:2723-2730)；als启动子(美国专利号5659026)等。其他组成型启动子包括例如美国专利号5608149；5608144；5604121；5569597；5466785；5399680；5268463；5608142；和6177611。
[0063]
组织特异性或生育调控启动子是一种dna序列，可以选择性调控植物细胞或植物组织(例如在这些细胞或组织的穗发育、结实或两者都至关重要的关键时期)中dna序列的表达，并且通常这种dna序列的表达仅限于在植物的重要发育期，如穗的发育或种子的成熟时期。任何可识别的能够引起期望的时间和空间表达的启动子都将用于本文的方法中。
[0064]
许多叶片优选启动子是本领域中已知的(yamamoto等(1997)plant j.12(2)：255-265；kwon等(1994)plant physiol，105:357-367；yamamoto等(1994)plant cell physiol，35(5):773-778；gotor等(1993)plant j.3:509-518；orozco等(1993)plant mol.biol，23(6):1129-1138；和matsuoka等(1993)proc.natl.acad.sci.usa，90(20)：9586-9590)。
[0065]
种子或胚胎特异性且可用于本公开的启动子，包括大豆kunitz胰蛋白酶抑制剂(kti3、jofuku和goldberg，(1989)plant cell 1:1079-1093)，豌豆球蛋白和豆科植物(豌豆子叶)(rerie、w.g等人(1991)mol.gen.genet.259:149-157；newbigin、e.j等人(1990)planta 180:461-470；higgins、t.j.v等人(1988)plant.mol.biol.11:683-695)，玉米醇溶蛋白(玉米胚乳)(schemthaner、j.p等人(1988)embo j.7:1249-1255)，菜豆蛋白(豆子叶)(segupta-gopalan、c等人(1985)proc.natl.acad.sci.82:3320-3324)，植物血凝素(豆子叶)(voelker，t等人(1987)embo j.6:3571-3577)，b-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(chen，z-l等(1988)embo j.7:297-302)，谷蛋白(水稻胚乳)，大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(marris，c.等人(1988)plant mol.biol.10:359-366)，谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(colot，v等(1987)embo j.6:3559-3564)。与嵌合基因结构中的异源编码区可操作地连接的种子特异性基因的启动子，维持它们在转基因植物中时间和空间的表达模式。这些实例包括拟南芥2s种子贮藏蛋白基因启动子在拟南芥和甘蓝型油菜种子中表达的脑啡肽(vanderkerckhove等人(1989)bio/technology 7:l929-932)，豆凝集素和豆β-菜豆蛋白启动子表达荧光素酶(riggs等(1989)plant sci.63:47-57)，和小麦谷蛋白启动子表达氯霉素乙酰转移酶(colot等(1987)embo j 6:3559-3564)。
[0066]
诱导启动子选择性表达一种可操作地连接dna序列对存在的内源性或外源性刺激进行响应，例如对化合物(化学诱导剂)或响应环境的、激素的、化学的和/或生育的信号。诱导性或调控型启动子包括受到如光、热、胁迫、洪水或干旱、植物激素、伤口或化学物质(乙
醇，茉莉酮酸盐，水杨酸或安全剂等)调控的启动子。
[0067]
同样值得考虑的还有包含有一个或多个异源调控元件组合的人工合成启动子。
[0068]
本发明中的重组dna构建体启动子可以是本领域技术人员所知的任何类型或类别的启动子，使得许多启动子中的任何一个都可以用于表达本文公开的各种多核苷酸序列，包括目的多核苷酸序列的天然启动子。用于本发明的重组dna构建体的启动子可以基于期望结构进行挑选。
[0069]
本文中所述重组dna构建体还可以包括其它调控元件，所述调控元件包括但不限于翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸识别序列。在某些实例中，一个重组dna构建体还包含有一个增强子或沉默子。
[0070]
一个内含序列能够被添加在5'非翻译区，所述蛋白编辑区或3'非翻译区，进而增加成熟信息的数量并积累在细胞质中。在植物和动物表达结构的转录单元中加入可剪接的内含子已被证明在mrna和蛋白质水平上增加基因表达可达1000倍(buchman和berg.(1988)mol.cell biol.8:4395-4405；callis等人(1987)genes dev.1:1183-1200)。
[0071]
植物和植物细胞
[0072]
提供了一种植物、植物细胞、植物组织、种子和籽粒，在其基因组中包含有本文描述的任一重组dna构建体，可使所述植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒编码所述多肽的表达量增加。
[0073]
提供了一种植物、植物细胞、植物组织、种子和籽粒，在其基因位点上含有一种引入的可编码一个多肽的基因修饰，所述多肽含有一个氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24这些氨基酸序列有至少80％的一致性。在某些实例中，所述基因修饰能增加所述编码多肽的活性。在某些实例中，所述基因修饰能增加所述编码多肽的水平。在某些实例中，所述基因修饰能同时增加所述编码多肽的活性和水平。
[0074]
所述植物可以是一个单子叶或双子叶植物，例如，水稻或玉米或大豆植物，比如玉米杂交或自交植物。所述植物还可以是向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。
[0075]
在某些实例中，所述植物和对照植物相比较时表现出增加的耐旱性。在某些实例中，所述植物和对照植物相比较时便显出至少一种农艺性状的改变。
[0076]
本领域普通技术人员熟悉用于模拟干旱条件和评估已经经受模拟或自然发生的干旱条件的植物的耐旱性的方案。例如，人们可以通过给予植物比通常需要的水少或一段时间内没有水来模拟干旱条件，并且可以通过寻找生理和/或物理条件的差异来评估耐旱性，包括(但不限于)活力，生长，大小或根长，或特别是，叶色或叶面积大小。评估耐旱性的其他技术包括测量叶绿素荧光，光合速率和气体交换速率。
[0077]
与其它目的性状的堆叠
[0078]
在某些实例中，本文公开的所述创造性的多核苷酸被设计成分子堆栈。这样，本文中所述的各种宿主细胞、植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒能进一步包含一个或多个目的性状。在某些实施例中，所述宿主细胞、植物、植物组织、种子和/或籽粒由一些目的多核苷酸序列的集合进行堆叠，进而创造出有多个目的性状集合的植物。就像在本文中所使用的，属于“堆叠”是指在同一植物或目的生物体中存在多种性状。例如，“性状堆叠”可以包括分子堆叠，其中序列在物理上彼此相邻。在本公开中，性状是指来源于一种特定序列或
序列组的表型。在某些实例中，所述分子堆叠包括至少一个能被赋予草甘膦耐性的多核苷酸。能够赋予草甘膦耐性的多核苷酸是本领域已知的。
[0079]
在某些实例中，所述分子堆叠包含有至少一个能够赋予草甘膦耐性的多核苷酸和至少一个补充的能赋予另一种除草剂耐性的多核苷酸。
[0080]
在某些实例中，有本发明的多核苷酸序列的植物、植物细胞、种子和/或籽粒可与一个或多个序列堆叠，这些序列如：肌萎缩侧索硬化抑制剂、hppd抑制剂、2,4-d、其他苯氧基生长素除草剂、芳氧基苯氧基丙酸除草剂、麦草畏、草铵膦除草剂、针对protox酶的除草剂(也称为“protox抑制剂”)。
[0081]
所述含有本发明的多核苷酸序列的植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒还可与至少一个其它特性相结合，从而制造出进一步包含各种期望性状组合的植物。例如，含有本发明的多核苷酸序列的植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒能与编码杀虫或杀虫活性的多肽的多核苷酸堆叠，或含有本发明的多核苷酸序列的植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒可与植物抗病基因结合。
[0082]
这些叠加组合能通过以下方法产生，但不限于通过任何常规方法或基因转化来进行育种。如果所述堆叠序列通过基因转化进入植物，所述期望多核苷酸序列能在任意时间以任意顺序被结合。所述性状可以在共转化方案中与任何转化盒组合提供的目标多核苷酸同时引入。例如，如果两个序列将会被引入，这两个序列可以包含在单独的转化盒(trans)中，也可以包含在相同的转化盒(cis)中。序列的表达可以被同一个启动子或不同的启动子驱动。在某些实例中，期望通过引入一个转化盒能够抑制目标多核苷酸的表达。可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合结合，以产生植物中所需的性状组合。还要进一步认识到所述多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统堆叠在期望的基因位点上。参见wo99/25821、wo99/25854、wo99/25840、wo99/25855和wo99/25853，所有这些均通过引用并入本文
[0083]
方法：
[0084]
提供了一个增加植物耐旱性和/或提高籽粒产量的方法。在植物中包含有至少一个多核苷酸表达量的增加，所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少80％(比如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性。
[0085]
在某些实例中，所述方法包括：(a)在一个可再生植物细胞中表达一个重组dna构建体，所述重组dna构建体包含有一个调控元件可操作地连接编码所述多肽的多核苷酸；和(b)基因组中含有所述重组dna构建体的植物所产生的植物。在某些实例中，所述调控元件是一个异源启动子。
[0086]
在某些实例中，所述方法包括：(a)向一个可再生植物细胞的基因组位点上引入一个编码所述多肽的靶向基因修饰；和(b)所述编码多肽的水平和/或活性增加的植物所产生的植物。在某些实例中，所述靶向基因修饰的引入可使用以下基因修饰技术：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程化位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实例中，所述靶向基因修饰存在于(a)编码区；(b)非编码区；(c)调控序列；(d)非翻译区；或(e)基因组任何(a)-(d)的组合。所述靶向基因修饰编码的多肽包含的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24这些氨基酸序列中的任一种有至少80％的一致性。
[0087]
在某些实例中，所述dna修饰是在基因位点上的一个或多个核苷酸的插入(最好是连续的)。例如，插入一个表达调制元件(eme)，如pct/us2018/025446所述的，与该基因进行可操作地连锁。在某些实例中，所述靶向dna修饰可以是内源性多肽启动子替换为本领域内已知的具有较高表达的其它启动子。在某些实例中，所述靶向dna修饰可以是本领域内已知的具有较高表达的启动子插入到5’utr，这样内源性多肽的表达由插入启动子控制。在某些实例中，多数dna修饰是一种多核苷酸修饰或snp，位于调节表达蛋白稳定性的位点上。
[0088]
使用本文方法的植物可以是本文描述的任何植物。在某些实例中，所述植物是玉米、大豆或水稻。
[0089]
向植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒中引入期望序列可以使用多种方法。“引入”意指使序列进入植物细胞内部的方式向植物、植物细胞、种子和/或籽粒赋予本发明中的多核苷酸或产生的多肽。本文中所述方法不依赖于向植物、植物细胞、种子和/或籽粒引入一个序列这一特定方法，只需要所述多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞内部。
[0090]
转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入植物的方案可以根据靶向转化的植物或植物细胞(即单子叶植物或双子叶植物)的类型而变化。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(crossway等人(1986)biotechniques 4:320-334)，电穿孔(riggs等人(1986)proc.natl.acad.sci.usa 83:5602-5606，农杆菌介导的转化(美国专利号5563055和美国专利号5981840)，直接基因转移(paszkowski等人(1984)embo j.3:2717-2722)和弹道粒子加速度(例如，参见美国专利4945050、美国专利5879918、美国专利5886244和5932782；tomes等人(1995)在植物细胞，组织和器官培养中的应用：基本方法.编辑gamborg和phillips(springer-verlag，berlin)；mccabe等(1988)biotechnology 6:923-926)；和lec1转化(wo 00/28058)。另见weissinger等(1988)ann.rev.genet.22:421-477；sanford等(1987)颗粒科学与技术5:27-37(洋葱)；christou等(1988)植物生理学87:671-674(大豆)；mccabe等(1988)bio/technology 6:923-926(大豆)；finer和mcmullen(1991)in vitro cell dev.biol.27p:175-182(大豆)；singh等人(1998)theor.appl.genet.96:319-324(大豆)；datta等人(1990)biotechnology 8:736-740(水稻)；klein等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:4305-4309(玉米)；klein等人1988)biotechnology 6:559-563(玉米)；美国专利号5240855、5322783、和5324646；klein等(1988)plant physiol.91:440-444(玉米)；fromm等(1990)biotechnology 8:833-839(玉米)；hooykaas van slogteren等(1984)nature(london)311:763-764；美国专利号5736369(谷物)；bytebier等(1987)proc.natl.acad.sci.usa 84:5345-5349(百合科)；de wet等人(1985)在胚珠组织的实验操作中，ed.chapman等人(longman，new york)，197-209(花粉)；kaeppler等人(1990)plant cell reports 9:415-418和kaeppler等人(1992)theor.appl.genet.84:560-566(晶须介导的转化)；d'halluin等人(1992)plant cell 4:1495-1505(电穿孔)；li等(1993)plant cell reports 12:250-255和christou and ford(1995)annals of botany 75:407-413(水稻)；osjoda等(1996)nature biotechnology 14:745-750(玉米通过根癌土壤杆菌)；所有这些都通过引用并入本文。
[0091]
在另一些实例中，本文所述的多核苷酸可以通过病毒或病毒核酸的侵染被引入植物中。通常，这些方法主要是将本文中的核苷酸构建体导入一个dna或rna分子中。应该认识到，本发明所述的多核苷酸序列可以被初步合成作为病毒多蛋白的一部分，之后可以在体
内或体外通过蛋白质水解处理以产生所需的重组蛋白。此外，本发明所述启动子也包含利用病毒rna聚合酶进行转录的启动子。向植物引入多核苷酸并表达其编码的涉及dna或rna分子的蛋白质的方法是本领域内已知的。例如，见美国专利号5889191、5889190、5866785、5589367、5316931和porta等，(1996)molecular biotechnology 5:209-221，本文通过引用并入。
[0092]
所述已经转化的细胞可以按照常规方法生长成植物。例如，见mccormick等(1986)plant cell reports 5:81-84.然后，这些植物可以生长，用相同的转化品系或不同的品系进行授粉，并鉴定获得的后代具有所需表型特征的组成型表达。种植两代或更多的子代，以确保所需表型特征的表达能稳定保存和集成，然后收获的种子同样确保所需表型特征的表达能被获得。以这种方式，本文提供了含有本发明的多核苷酸的转化种子(也称为“转基因种子”)，例如，作为表达和的一部分，稳定整合到它们的基因中。
[0093]
包括前文讨论的通过植物转化技术衍生的转化植物细胞，可以培养再生成一整个拥有转化表型(如，本发明的多核苷酸)的植株，以及因此获得期望的表型，例如增加的产量。对于玉米的转化和再生，参见gordon kamm等，the plant cell，2:603-618(1990)。
[0094]
多种方法可以用于在基因位点引入一个基因修饰，进而可以在植物、植物组织、植物细胞、种子和/或籽粒中编码本文所述的多肽。在某些实例中，所述靶向dna修饰通过以下基因修饰技术：多核苷酸引导的内切核酸酶，crispr-cas内切核酸酶，碱基编辑脱氨酶，锌指核酸酶，转录激活物样效应核酸酶(talen)，工程位点特异性大范围核酸酶，或argonaute。
[0095]
在某些实施例中，可以通过在基因组中靠近所需改变的限定位置诱导双链断裂(dsb)或单链断裂来促进所述的基因组修饰。可以使用任何可用的dsb诱导剂诱导dsb，包括但不限于talen，大范围核酸酶，锌指核酸酶，cas9 grna系统(基于细菌crispr-cas系统)，引导的cpf1内切核酸酶系统等。在一些实施方案中，dsb的引入可以与引入多核苷酸修饰模板组合。
[0096]
一个多核苷酸修饰模板可以通过本领域内已知的任何方法被引入细胞中，包括但不限于，瞬时引入方法，转染，电穿孔，显微注射，颗粒介导的递送，局部应用，晶须介导的递送，通过细胞穿透肽的递送或介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)介导的直接递送。
[0097]
所述多核苷酸修饰模板可以作为一个单链多核苷酸分子、一个双链多核苷酸分子或作为环状dna(载体dna)的一部分被引入细胞。所述多核苷酸修饰模板也可以被链接在向导rna和/或cas核酸内切酶上。
[0098]
一个“修饰的核苷酸”或“编辑核苷酸”是指期望的核苷酸序列当和它的非修饰性核苷酸序列比较时，包含有至少一个改变。这种“改变”包括如：(i)至少一个核苷酸的替换；(ii)至少一个核苷酸的删除；(iii)至少一个核苷酸的插入，或(iiii)任意(i)-(iii)的组合。
[0099]
术语“多核苷酸修饰模板”包括，当和被编辑的核苷酸序列比较时，含有至少一个核苷酸修饰的多核苷酸。一个核苷酸修饰可以是至少一个核苷酸的替换、添加或删除。所述多核苷酸修饰模板可以进一步包含有内源核苷酸序列可选择地在至少一个核苷酸修饰的侧边，其中所述侧翼内源核苷酸序列提供充足的同源基因用于编辑所需核苷酸。
[0100]
编辑结合dsb和修饰模板的基因组序列的流程通常包括：提供一个宿主细胞，一个
dsb诱导剂，或一个编码dsb诱导剂的核酸，能够识别在染色体序列中的目标序列并能够诱导基因组序列中的dsb，以及当与被编辑的核苷酸序列相比较时，多核苷酸修饰模板包含有至少一个核苷酸的改变。所述多核苷酸修饰模板进一步包含连接在至少一个核苷酸改变侧翼的核苷酸序列，所述侧翼连接序列可在dsb相对应的染色体区域互相替换。
[0101]
可以通过本领域内已知的任何方法,给细胞提供所述核酸内切酶，包括但不限于瞬时导入方法、转染、显微注射和/或局部应用或间接通过重组构建体。所述核酸内切酶可以作为蛋白质或作为引导多核苷酸复合物直接提供给细胞，或间接通过重组构建。所述核酸内切酶可以瞬时被引入一个细胞，或使用领域内已知的任何方法整合进入宿主细胞的基因组内。在crispr-cas系统的情况下，如2016年5月12日公布的wo2016073433中所述，可以用细胞穿透肽(cpp)促进内切核酸酶和/或引导的多核苷酸摄入细胞。
[0102]
除了通过双链断裂技术进行修饰之外，使用碱基编辑技术实现对没有这种双链断流的一个或多个碱基的修饰，如gaudelli等(2017)可编程碱基编辑基因dna中的a*t至g*c而没有dna切割。nature 551(7681):464-471；komor等(2016)可编程编辑基因组dna靶碱基而无双链dna切割，nature 533(7603):420-425。
[0103]
这些包含有dcas9切口酶和合适的脱氨酶的融合，且它们可以转换如，胞嘧啶转化为尿嘧啶而不诱导靶dna的双键断裂。尿嘧啶通过dna复制或修复随后转换为胸腺嘧啶。具有目标灵活性和特异性的改良碱基编辑器用于编辑内源基因座以产生有目标变异并提高谷物籽粒产量。同样的，腺嘌呤碱基编辑器能使腺嘌呤向肌苷转变，然后通过复制或修复转化为鸟嘌呤。这样，目标碱基的转化，如在使用适当的特定于站点的基本编辑器制作的另一个位置中c
·
g向t
·
a转化和t
·
a向c
·
g转化。
[0104]
在一个实例中，碱基编辑是一种能够直接将目标基因座上一个碱基对转化为另一个碱基对而不需要双链dna断裂(dsb)、同源性定向修复(hdr)过程、或外部供体dna模板的基因组编辑方法。在实例中，碱基编辑包括(i)一个催化受损的crispr-cas9突变体的突变使得它们的一个核酸酶结构域不能产生dsbs；(ii)一个单链特异性胞苷/腺嘌呤脱氨酶，可以在cas9产生的单链dna气泡中的适当的核苷酸窗口内将转化c为u或a为g；(iii)阻碍尿嘧啶切除的尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)和降低碱基编辑效率和产物纯度的下游过程；和(iv)切口酶活性切割未编辑的dna链，然后进行细胞dna修复过程以替换含g的dna链。
[0105]
如本发明所述，“基因组区域”是细胞基因组中染色体的一段，出现在靶位点的任一侧，或者还包含靶位点的一部分。所述基因组区域可以包括至少5-10,5-15,5-20,5-25,5-30,5-35,5-40,5-45,5-50,5-55,5-60,5-65,5-70,5-75,5-80,5-85,5-90,5-95,5-100,5-200,5-300,5-400,5-500,5-600,5-700,5-800,5-900,5-1000,5-1100,5-1200,5-1300,5-1400,5-1500,5-1600,5-1700,5-1800,5-1900,5-2000,5-2100,5-2200,5-2300,5-2400,5-2500,5-2600,5-2700,5-2800.5-2900,5-3000,5-3100或更多碱基，使得基因组区域具有足够的同源性以与相应的同源性区域进行同源重组。
[0106]
tal效应核酸酶(talen)是一类序列特异性核酸酶，可用于在植物或其他生物基因组的特定靶序列上产生双链断裂(miller等(2011)nature biotechnology 29:143-148)。
[0107]
内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。核酸内切酶包括在特定位点切割dna而不破坏碱基的限制性内切酶，以及与限制性内切酶一样在特定识别位点结合和切割的大范围核酸酶(也称为归巢核酸内切酶(hease))，但是大范围核酸酶的识别位点通
常更长，约18bp或更多(专利申请pct/us12/30061，于2012年3月22日提交)。大范围核酸酶根据保守序列基序分为四个家族，这些家族是laglidadg，giy-yig，h-n-h和his-cys-box家族，这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。酶因其长识别位点和耐受某些序列而著称大范围核酸酶的命名约定与其他限制性核酸内切酶的命名约定相似，大范围核酸酶的特征还在于前缀f-，i-或pi-，分别由独立的orf，内含子和内含子编码。重组过程的一步涉及多核苷酸在识别位点处或附近切割。切割活性可用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶及其识别位点的综述，参见sauer(1994)curr op biotechnol 5:521-7；和sadowski(1993)faseb 7:760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶或分解酶家族。
[0108]
锌指核酸酶(zfns)是由锌指dna结合结构域和双链断裂诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，其通常包含两个，三个或四个锌指，例如具有c2h2结构，然而其他锌指结构锌指结构域适用于设计特异性结合所选多核苷酸识别序列的多肽.zfn包括与非特异性内切核酸酶结构域连接的工程化dna结合锌指结构域，例如来自类型的核酸酶结构域iis内切核酸酶，如foki.addi功能性功能可以与锌指结合结构域融合，包括转录激活因子结构域，转录抑制因子结构域和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所必需的。每个锌指识别三个连续的碱基对。目标dna。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，具有核酸酶的二聚化要求，使用两组锌指三联体结合18个核苷酸的识别序列。
[0109]
使用dsb诱导剂(例如cas9-grna复合物)的基因组编辑，例如在2015年3月19日发布的美国专利申请us 2015-0082478 a1，2015年2月26日发布的wo2015/026886 a1，2016年1月14日发布的wo2016007347和2016年2月18日发布的wo201625131，所有这些都是合并的在本发明中作为参考。
[0110]
示例
[0111]
以下是本发明某些方面的具体实施例的实例。这些实施例仅用于说明目的，并不以任何方式限制本发明的范围。
[0112]
示例1
[0113]
耐旱基因的克隆和载体构建
[0114]
使用含有来自花椰菜花叶病毒35s(camv 35s)启动子的四种多聚化增强子元件的双元构建体，并且水稻激活标签群体(atls)由四种粳稻(oryza sativa ssp.japonica)品种(中华11号，潮友1号，台中65号和日本晴)，如lin和zhang((2005)plant cell rep.23:540-547)所述，通过农杆菌介导的转化方法转化。开发产生的转基因品系并收获转基因种子以形成水稻活化标记群体。
[0115]
在重复的田间试验中证实耐旱标签系(atls)并测定它们的t-dna插入基因位点。克隆t-dna左边界和右边界附近的基因，并通过田间筛选重现功能基因。本文仅显示了概括的功能基因。并基于表2中所示这些基因的loc id，设计引物用于克隆水稻抗旱基因osdn-dtp8，oskik1，osrwdd1，osufd1，osppr2，ossaur28-1，oshys1，osfbid1。
[0116]
表2.水稻基因名称,基因ids(来自tigr)和构建体ids
[0117][0118][0119]
琼脂糖凝胶电泳后，使用柱试剂盒提取pcr扩增产物，然后与ta克隆载体连接。通过测序确认这些构建体中的序列和方向。将每个基因克隆到植物双元构建体中。
[0120]
示例2
[0121]
转基因水稻品系的转化和基因表达分析
[0122]
如lin和zhang((2005)plant cell rep.23:540-547)所述，通过农杆菌介导的转化，用实施例1中制备的载体或空载体(dp0158)转化中华11号(oryza sativa l.)。将转化实验室产生的转基因幼苗(t0)移植到田间以获得t1种子。筛选t1和随后的t2种子以确认转化，并将阳性鉴定的转基因种子用于以下性状筛选。
[0123]
通过rt-pcr测定转基因水稻植物叶中的基因表达水平。设计引物用于过表达转基因水稻中osdn-dtp8，osrwdd1，osufd1，ossaur28-1和oshys1基因的rt-pcr。将zh11-tc(组织培养的zh11水稻)中的表达水平设定为1.00，并将dp1130，dp0828，dp0903和dp1121转基因水稻植物中的表达水平与zh11-tc进行比较。将dp0158中的表达水平设定为1.00，并将dp0984转基因水稻植物中的表达水平与dp0158进行比较。基于ef-1αmrna水平对基因表达进行标准化，并且基因表达分析的结果在下表3中提供。
[0124]
表3.转基因水稻植株相对表达水平的增长倍数
[0125][0126][0127]
示例2
[0128]
转基因水稻植株的性状
[0129]
测试来自实施例2的转基因水稻植物和zh11-tc和dp0158水稻植物的：(a)耐旱性，(b)百草枯耐受性。
[0130]
将来自实施例2的植物的t2种子在32℃下用800ppm多菌唑灭菌8小时并洗涤3-5次，在32℃下在水中浸泡16小时，并在35-37℃下发芽18小时。在孵化器里。发芽种子用于每个试验如下：
[0131]
耐旱性-将发芽种子种植在苗床田中。在3叶期，将幼苗移植到试验田中，每个转基因品系重复4次，每次重复10株，并将4个重复种植在同一块中。zh11-tc和dp0158幼苗在同一区块的转基因品系附近，并在统计分析中用作对照。水稻植物通过常规做法使用杀虫剂和肥料进行管理。在穗开始阶段停止浇水，以便根据天气条件(温度和湿度)在开花阶段给予干旱胁迫。使用tdr30(spectrum technologies，inc)以每块约10个位点每4天测量土壤水含量。在实验期间观察并记录植物表型。表型包括抽穗期，卷叶度，干旱敏感性和耐旱性。中午特别注意卷叶度。在生长季节结束时，从每行的中间收获每个转基因品系的6个代表性植物，并测量每株植物的谷粒产量。使用混合线性模型对谷物产量数据进行统计分析。
[0132]
百草枯耐受性-将发芽种子置于底部有孔的管中，在30℃下培养5天直至一片叶和一个末端芽期。选择约3.5～4cm高的均匀幼苗进行百草枯试验。在该实验中使用随机区组设计。有五个区块，每个区块有16x12个孔。将每个转基因品系置于一行(12株植物/系)中，并将zh11-tc和dp0158幼苗随机分成3行(3
×
12株植物)一块。然后将幼苗用0.8μm百草枯溶液在10小时/14小时夜间处理7天，处理的幼苗首先遇到黑暗并吸收每两天更换一次的百草枯溶液。处理7天后，计数绿色幼苗。那些整体保持绿色而不受损害的幼苗被认为是百草枯耐受的幼苗；那些漂白的叶子或茎不被认为是百草枯耐受的幼苗。
[0133]
耐受率用作该性状筛选的参数，其是保持绿色并且在总植物数量上显示耐受表型的植物的百分比。使用“rep”的随机效应，的统计方法的统计模型分析数据。
[0134]
研究结果见表4，表中提供了每种构建体的转基因品系的组合数据。
[0135]
表4.转基因水稻植株的农艺性状
[0136][0137][0138]
dp1130转基因水稻植物在三年内在海南田进行了三次测试。结果表明，与对照相比，大田干旱条件下dp1130转基因水稻单株平均产量增加。如表4所示，测试了12个株系，3个株系在海南田间观察到良好的结实率。8个品系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)，6个株系的产量明显高于zh11-tc对照。这12个株系的单株平均产量分别比zh11-tc和dp0158对照高33％和54％。这些数据表明osdn-dtp8是一种水稻抗旱基因。
[0139]
dp0808转基因水稻植株两年内在海南进行了两次测试。结果表明，与对照相比，大田干旱条件下dp0808转基因水稻单株平均产量增加。如表4所示，在海南田测试了6个株系。4个株系的产量显著高于dp0158和zh11-tc对照(p《0.1)。这6个株系的单株平均产量分别比
zh11-tc和dp0158对照高73％和113％。这些数据表明oskik1是一种水稻抗旱基因。
[0140]
dp0828转基因水稻植株三年内在宁夏和海南进行了三次测试。所有这些都表明，与对照相比，dp0828转基因水稻在田间干旱条件下的单株平均产量增加。如表4所示，在海南田测试了12个株系。8个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)，5个株系的产量明显高于zh11-tc对照。这12个株系的单株平均产量分别比zh11-tc和dp0158对照高52％和68％。dp0828转基因水稻植物也在百草枯测定中测试两次。获得了一致的结果。在第二个实验中，在构建体水平上，所有dp0828转基因株系的百草枯平均耐受率(80％)明显高于zh11-tc(63％)和dp0158(66％)对照。在转基因株系水平上，7个osrwdd1转基因品系具有比zh11-tc对照明显更高的耐受率，并且6个株系具有比dp0158对照明显更高的耐受率(表4)。这些结果表明，与两种对照相比，osrwdd1转基因水稻植物具有增强的耐旱性和百草枯耐受性。osrwdd1在增强转基因植物的耐旱性和百草枯耐受性或抗氧化能力方面起作用。
[0141]
dp0903转基因水稻植株两年内在宁夏和海南进行了三次测试。其中两次表明，与对照相比，dp0903转基因水稻在田间干旱条件下单株平均产量增加。如表4所示，在海南地区测试了8个株系。8个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)，4个株系的产量明显高于zh11-tc对照。这8个株系的单株平均产量分别比zh11-tc和dp0158对照高30％和61％。这些结果表明osufd1转基因水稻植株具有增强的耐旱性。
[0142]
dp0839转基因水稻植株三年内在宁夏和海南进行了三次测试。其中两次表明，与对照相比，dp0839转基因水稻在田间干旱条件下单株平均产量增加。如表4所示，在海南田测试了12个株系。6个株系的产量显著高于dp0158对照(p《0.1)，7个株系的产量明显高于zh11-tc对照。这12个株系的单株平均产量分别比zh11-tc和dp0158对照高87％和46％。dp0839转基因水稻植物也在百草枯测定中测试两次。获得了一致的结果。在第一个实验中，在构建体水平上，所有dp0839转基因株系的平均百草枯耐受率(82％)明显高于zh11-tc(64％)和dp0158(63％)对照。在转基因株系水平上，6个osppr2转基因株系具有比zh11-tc和dp0158对照明显更高的耐受率(表4)。这些结果表明，与两种对照相比，osppr2转基因水稻植物具有增强的耐旱性和百草枯耐受性。osppr2在增强转基因植物的耐旱性和百草枯耐受性或抗氧化能力方面起作用。
[0143]
dp1122转基因水稻植株两年内在宁夏和海南进行了三次测试。所有这些都表明，与对照相比，dp1122转基因水稻在田间干旱条件下单株平均产量增加。如表4所示，在海南田测试了7个株系。4个株系的产量显著高于dp0158和zh11-tc对照(p《0.1)，并且在田间观察到良好的结实率。这7个株系的单株平均产量分别比zh11-tc和dp0158对照高33％和51％。dp1122转基因水稻植株也在百草枯测定中测试两次，获得了一致的结果。在第一次实验中，在构建体水平上，9个dp1122转基因株系(44％)的百草枯平均耐受率明显高于zh11-tc(31％)，并且高于dp0158(39％)。在转基因株系水平上，9个ossaur28-1转基因株系中的3个具有比zh11-tc和dp0158对照明显更高的耐受率(表4)。这些结果表明，与两种对照相比，ossaur28-1转基因水稻植株具有增强的耐旱性和百草枯耐受性。ossaur28-1在增强转基因植物的耐旱性和百草枯耐受性或抗氧化能力方面起作用。
[0144]
dp0984转基因水稻植株三年内在宁夏和海南进行了三次测试。其中两次表明，与对照相比，dp0984转基因水稻在田间干旱条件下单株平均产量增加。如表4所示，测试了12个株系，其中5个在海南田观察到良好的结实率。10个株系的产量显著高于dp0158(p《0.1)，
9个株系的产量明显高于zh11-tc。这12个株系的单株平均产量分别比zh11-tc和dp0158对照高44％和59％。这些结果表明oshys1转基因水稻植物具有增强的耐旱性。
[0145]
dp0893转基因水稻植株三年内在宁夏和海南进行了三次测试。其中两次表明，与对照相比，dp0893转基因水稻在田间干旱条件下单株平均产量增加。如表4所示，在海南田测试了6个株系。6个株系的产量显著高于dp0158(p《0.1)，5个株系的产量明显高于zh11-tc。这6个株系的单株平均产量分别比zh11-tc和dp0158对照高55％和85％。这些结果表明osfbid1转基因水稻植株具有增强的耐旱性。
[0146]
总之，这些结果表明，与对照植物相比，osdn-dtp8，oskik1，osrwdd1，osufd1，osppr2，ossaur28-1，oshys1和osfbid1转基因水稻植株对干旱条件的耐受性增加。
[0147]
示例4
[0148]
具有水稻耐旱性基因的玉米的转化和评估
[0149]
玉米植株将用编码本文所述多肽的多核苷酸之一或来自玉米、拟南芥或其他物种的相应同源基因转化。该基因在玉米转化载体中的表达可以在组成型启动子的控制下，例如玉米遍在蛋白启动子(christensen等人(1989)plant mol.biol.12:619-632和christensen等人(1992)plant mol.biol.18:675-689)或在另一个启动子的控制下，例如应激反应性启动子或组织优选的启动子。基本上如国际专利公开wo 2009/006276中所述，可以通过粒子轰击将重组dna构建体引入玉米细胞中。或者，基于zhao等人在meth中所述，通过农杆菌介导的转化，用重组dna构建体转化玉米植物。mol.biol。318:315-323(2006)和zhao等人，mol.breed。8：323-333(2001)和1999年11月9日发布的美国专利号5981840。
[0150]
再生植物的后代，例如t1植物，可以经受基于土壤的干旱胁迫。使用图像分析，可以在干旱胁迫之前和期间多次测量植物面积、体积、生长速率和颜色。相对于对照，干旱胁迫期间叶片枯萎或叶面积减少、黄色积累减少和/或生长速率增加的显著延迟将被认为是该基因在玉米中起作用以增强耐旱性的证据。
[0151]
示例5
[0152]
拟南芥水稻抗旱基因的实验室干旱筛选
[0153]
为了了解水稻耐旱基因是否能提高双子叶植物的耐旱性或其他性状，本文所述的水稻表达载体可通过农杆菌介导的转化程序，使用花浸法转化到拟南芥(哥伦比亚)，并鉴定转基因植物(clough，s.t.和bent，a.f。(1998)《植物杂志》16735
–
743；张，x.等人(2006)自然协议1:641-646)。
[0154]
再生植株的后代，如t1植株，可能受到基于土壤的干旱胁迫。通过图像分析，可以在干旱胁迫之前和期间多次测量植物的面积、体积、生长速率和颜色。干旱胁迫期间，与对照相比，萎蔫或叶面积减少的显著延迟、黄色积累的减少和/或生长速率的增加将被视为双子叶植物中基因功能增强抗旱性的证据。