可共价交联CD25的白细胞介素-2及其在自身免疫病治疗中的应用的制作方法

可共价交联cd25的白细胞介素-2及其在自身免疫病治疗中的应用
技术领域
1.本发明属于生物制药领域，具体涉及定点插入非天然氨基酸的白细胞介素-2,使其可以在接触cd25受体后，与其产生共价交联，从而具有特异性激活调节t细胞的作用。本发明进一步涉及上述定点修饰的白介素-2在治疗自身免疫病的用途，如作为安全、有效的系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、移植物抗宿主排斥反应病等的用途。


背景技术：

2.白细胞介素-2(interleukin-2)是一种多效性细胞因子，同时具有激活调节t细胞(treg)和效应细胞的活性，是免疫调控重要的细胞因子之一。il-2通过与细胞膜上的il-2受体(il-2r)结合发挥生物作用，il-2r是由α、β、γ三分子亚基组成，其中α链(cd25)不具备信号传递功能，仅能与β和γ链一起，作为三分子复合物与il-2形成高亲和力结合(kd＝10pm)；而β链(cd122)和γ(cd132)链都属于i型细胞因子受体超家族，两者可以在缺失α链的前提下，与il-2形成中亲和力结合(kd＝1nm，进而传导下游信号(r.spolski et al.,2018).三种受体亚基在不同的细胞亚群中表达量各不相同，cd25在调节t细胞(treg)表面持续长效表达；自然杀伤细胞(nk)和cd8 t杀伤细胞则在一般状态下低表达cd25而常规表达il-2rβ和γ。因此treg细胞在机体无外来抗原刺激情况下，对il-2的敏感性大于nk，cd8 t等效应细胞(boyman et al.,2006).已有的研究表明，低剂量il-2通过偏向性激活treg细胞，抑制自身免疫，起到治疗自身免疫病的效果。然而，由于高剂量的il-2可以激活免疫，因此低剂量il-2疗法有着加重免疫病的风险。如何使il-2偏向性激活treg细胞，是此领域关键的科学问题之一。
3.已有的研究表明，il-2在结合il-2rαβγ三受体复合物后，会快速进行内吞，并在初级内体中进行分离。其中，il-2rβγ会进入次级内体和溶酶体，进而被降解；而il-2rα(cd25)会在初级内体中被循环到细胞膜表面，重新发挥生物学作用。il-2的胞内转运模式取决于它与三受体亚基的亲和力，一部分可随cd25循环到细胞表面继续发挥生物学作用，而大部分随il-2rβγ进入溶酶体进行降解。此机理为提高il-2的效果带来了重要的研究方向。例如，一系列的高亲和cd25突变体已经被研发，用于提高il-2在细胞膜表面的存在时间(rao et al.,protein engineering 16(12),1081-1087,2003)。我们前期的研究也发现，il-2上不同位点定点修饰聚乙二醇可以不同程度影响修饰产物的再循环途径，从而显著影响il-2的细胞膜存在时长。尽管如此，由于il-2与cd25的结合依然是非共价的可逆结合，而且突变体依然存在半衰期短问题，因此单纯用突变的方式增强il-2与cd25亲和力，并不能有效获得偏向激活treg的il-2激动剂。
4.如果能使il-2与cd25产生不可逆的共价结合，则有望大幅度提高il-2随cd25的再循环利用率，从而提高il-2在cd25高表达细胞，例如treg细胞的持续性作用，从而增强il-2激活treg细胞的偏向性和有效性，可用于多种自身免疫病的治疗。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供可以与cd25产生共价交联的il-2突变体，及其在治疗自身免疫病中的应用。
6.首先，本发明提供可使人白介素-2于cd25产生共价结合的位点，所选修饰位点选自：示于seq id no：1的第r38位、l72位或他们的组合。本发明选择在il-2的特定位点插入具有临近反应活性的非天然氨基酸fluorosulfate-l-tyrosine(fsy)，其在自然状态下保持惰性，而在与组氨酸上咪唑环侧链相离足够接近的时候，可与其发生共价结合反应，进而产生稳定不可逆的共价交联。所选位点从il-2与cd25结合的空间结构上，距离cd25的第h120位足够接近，可以促进共价交联反应的发生。
7.本发明还提供定点突变的人白介素-2，其在所述的特定位点的一个氨基酸或多个氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为所示的非天然氨基酸fsy，所述特定位点选自：示于seq id no：1的第r38，第l72位，或两个位点的组合。
8.定点突变的人白介素-2，其与示于seq id no：1的序列的区别在于：在seq id no：1所示的序列的第n位的氨基酸被突变为fsy，所述突变氨基酸与seq id no：1所示的序列的连接方式如下式(ii)所示：
[0009][0010]
由r1到r2的方向为氨基酸序列的n末端到c末端方向，其中第n位的氨基酸选自第r38位、l72位位氨基酸中的一个或两个，
[0011]
r1为seq id no：1所示序列的第1至第n-1位氨基酸残基，
[0012]
r2为seq id no：1所示序列的第n 1位至c末端的氨基酸残基，
[0013]
本发明还提供经peg修饰的所述的特定位点突变的人白细胞介素-2，其在修饰位置引入的修饰剂分子量范围为5kda，10kda，20kda或40kda。
[0014]
具体地，经peg修饰的特定位点突变的人白细胞介素-2是r38位点突变为fsy的突变体r38-fsy；l72突变为fsy的突变体l72-fsy；r38和l72双突变的突变体r38/l72-fsy；5kda-peg修饰的r38-fsy，5k-peg-r38fsy；10kda-peg修饰的r38-fsy，10k-peg-r38fsy；20kda-peg修饰的r38-fsy，20k-peg-r38fsy；40kda-peg修饰的r38-fsy，40k-peg-r38fsy；5kda-peg修饰的l72-fsy，5k-peg-l72fsy；10kda-peg修饰的l72-fsy，10k-peg-l72fsy；
20kda-peg修饰的l72-fsy，20k-peg-l72fsy；40kda-peg修饰的l72-fsy，40k-peg-l72fsy。
[0015]
本发明还提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的所述人白细胞介素-2或者所述的经修饰的白细胞介素-2，以及药学上可以接受的载体。
[0016]
本发明还提供所述的白细胞介素-2或者所述的经修饰的白细胞介素-2在制备用于免疫调节和多种自身免疫病药物中的用途。
[0017]
本发明还提供白细胞介素-2或者所述的经修饰的白细胞介素-2在制备用于移植物抗宿主病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫病性糖尿病、皮肌炎、硬皮病、多发性硬化、重症肌无力、脱髓鞘疾病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血与萎缩性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症、自身免疫性脱发的药物中的用途。
[0018]
基于本发明得到的il-2类衍生物与现有研究药物相比，具有的技术效果和优势主要体现在如下的一个或几个：
[0019]
本发明得到的il-2类衍生物具有更强的治疗有效性和安全性：本发明获得的il-2突变体在与cd25结合后，可以产生不可逆的共价交联，大幅度增强内化后il-2随cd25的再循环效率，从而增加il-2在treg细胞上的存在时间和作用效率。而效应细胞，比如cd8 t细胞，传统cd4 t细胞，因其上缺少cd25表达，因此对此类il-2突变体的效应不响应。这种偏向性作用极大的增强了此类il-2类衍生物对treg的偏向作用和活性，从而增强其在自身免疫病治疗中的有效性和安全性。
[0020]
本发明得到的il-2类衍生物兼具长效性和持久性：基于共价交联活性，本发明得到的il-2类衍生物可以和细胞表面的cd25产生稳定的共价交联，进而延长其在体内的存在时间，使其作用具有长效性和持久性。
附图说明
[0021]
图1所示为fsy氨基酸插入位点的设计和交联效率验证。将选择位点的对应位置突变为tag终止密码子，制备突变型表达载体，将突变型表达载体与辅助质粒pevol-fsy共转入大肠杆菌origamib(de3)中，在培养基中添加非天然氨基酸，通过诱导表达，得到该位点插非天然氨基酸的il-2供修饰使用。ail-2与cd25复合物的晶体结构图(pdb 2erj)。所选位点离cd25的h120位点在空间具有足够接近的距离。b体外水平的交联活性验证。将不同位点突变为fsy的突变体与等量cd25蛋白体外孵育，加入具有还原剂的上样缓冲液进行加热，将变性后的样品进行考马斯亮蓝染色和western blot检测。结果表明，在体外水平，r38位点突变为fsy的突变体(r38-fsy)和l72位点突变为fsy的突变体(l72-fsy)可以产生cd25交联活性，而f42位点未产生交联活性。c质谱验证。将b中所述交联条带进行质谱鉴定，确认fsy氨基酸与cd25中h120位点产生了共价交联。其中x指示为fsy氨基酸。d细胞水平交联效率验证。将l72-fsy与表达有cd25的yt细胞进行孵育培养，将变性后细胞裂解物进行western blot检测。l72-fsy的交联活性呈现剂量和时间依赖性。
[0022]
图2所示为l72-fsy的体外活性验证。(左)l72-fsy对比野生型il-2(wt-il-2)的cd25结合活性。展示为生物薄膜干涉结合折线图。(中)l72-fsy对比野生型il-2(wt-il-2)的pstat5检测。(右)体外活性的亲和力常数及半数有效性浓度展示。结果表示il-2上l72位
点突变为fsy氨基酸，略微降低与cd25亲和活性，对细胞活性影响不显著。
[0023]
图3所示为具有交联活性的il-2显著延长了其在treg细胞上的存在时间。a将l72-fsy或wt-il-2与分离纯的treg细胞或cd8 t细胞共同孵育1.5小时，用偏酸的缓冲液清洗细胞三次，继续进行孵育。用anti-il-2抗体直接孵育细胞表面，检测treg细胞及cd8 t细胞表面的il-2残留。b将cd25-yt细胞与标记有af555荧光分子的wt-il-2或l72-fsy共同孵育，进行荧光共聚焦检测。可以观察到孵育过后，l72-fsy有部分循环到细胞表面，量高于wt-il-2，并与cd25产生共聚焦。c同a所示处理treg细胞及cd8 t细胞，可观察到l72-fsy较wt-il-2在细胞进行清洗后，可产生更持久和较高水平的pstat5激活信号。
[0024]
图4所示为l72-fsy具有持久且强效的体外treg偏向性激活效果。将l72-fsy或wt-il-2与分离纯的treg细胞或cd8 t细胞共同孵育过夜，酸洗，在没有细胞因子的情况下继续培养3天。al72-fsy较wt-il-2更多扩增了treg细胞的数量及treg细胞所占总细胞百分比，而对cd8 t细胞无明显影响。b l72-fsy较wt-il-2更多激活了treg上表面标记物的表达，包括cd25和foxp3，而只同等程度激活了cd8 t上cd26和cd49d的表达。
[0025]
图5所示为l72-fsy具有持久且强效的体内treg偏向性激活效果。将人pbmc静脉注射免疫缺陷鼠nsg体内，制备人源化小鼠模型。分别皮下注射wt-il-2，l72-fsy及pbs，一天一次，总共10天。最后一次注射后的第五天分离小鼠的脾细胞进行流式细胞术检测。a各组处理后的treg细胞占cd4 t细胞比例统计。b treg，cd8 t，tconv细胞数量统计及treg/cd8 t和treg/tconv计算。结果表明l72-fsy偏向性显著扩增了小鼠体内cd4 t细胞，而较少影响cd8 t和tconv细胞。c激活标志物检测。包括cd8 t上cd25和treg中foxp3。
[0026]
图6所示为使用cd25人源化的b-hil-2rα小鼠验证l72-fsy具有持久且强效的体内treg偏向性激活效果。b-hil-2rα小鼠从转基因水平，cd25的胞外段是人源化，cd25的胞内段仍为鼠源，保证了l72-fsy可在小鼠体内进行评价。将b-hil-2rα小鼠分别皮下注射wt-il-2，l72-fsy及pbs，一天一次，总共10天。最后一次注射后的第五天分离小鼠的脾细胞进行流式细胞术检测。a各组处理后的脾细胞中treg细胞占cd4 t细胞比例统计，以及脾细胞中treg，cd8 t,tconv，nk,th1和th17细胞数量统计。b treg/cd8 t,treg/tconv，treg/th1，treg/th17的比例计算。
[0027]
图7所示为对l72-fsy进行定点peg偶联。a使用20kda丙醛-peg(ald-20k-peg)对l72-fsy进行偶联示意图。b偶联产物的sds-page分析。可见ald-20k-peg成功偶联到l72-fsy，呈现单一均匀条带。且偶联后产物依然具有cd25的共价交联活性。
[0028]
图8所示为20k-peg修饰的l72-fsy(peg-l72fsy)体外活性表征。将不同浓度的peg-l72fsy与人pbmc共同孵育刺激，检测peg-l72fsy对其中treg细胞和cd8 t细胞pstat5激活作用。an端的peg修饰轻微、且同等程度降低了il-2对treg细胞和cd8 t细胞的影响，对其偏向性和活性影响不显著。b所示为各样品对il-2rα和il-2rβ的亲和力检测。
[0029]
图9所示为药代动力学评价。将各样品各5ug，分别一次性皮下注射c57bl/6小鼠和b-hil-2ra小鼠。a所示为药物浓度和时间曲线。b所示为计算的体内清除半衰期和平均保留时间。
[0030]
图10所示为使用cd25人源化的b-hil-2rα小鼠验证peg-l72fsy具有持久且强效的体内treg偏向性激活效果。将等量样品皮下注射b-hil-2rα体内，未修饰peg的每天一次，修饰peg的样品隔天一次。最后一次注射后的第五天分离小鼠的脾细胞进行流式细胞术检测。
统计并计算各处理组treg与效应细胞的扩增数量比例。
[0031]
图11所示为展示含有共价交联活性的il-2在自身免疫病模型，包括姥鲛烷诱导的系统性红斑狼疮和移植物抗宿主排斥反应疾病模型中的治疗效果。
具体实施方式
[0032]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0033]
实施例1可产生共价交联位点的选择及含有fsy氨基酸的il-2的制备
[0034]
根据fsy氨基酸反应特点，其在天然条件下保持惰性，只有当其与反应氨基酸相距足够近的时候，才能发生共价交联反应。根据il-2与其受体的结合晶体结构图，本发明选择了几个潜在的位点进行fsy氨基酸的插入，具体包括r38,f42和l72，其在空间结构上，当il-2与cd25发生结合时，其距离cd25上第120位组氨酸可能足够接近，进而可能引发交联反应(图1a)。针对每个位点，发明人分别设计能够使编码所述氨基酸的密码子突变为琥珀密码子的引物，然后利用定点突变试剂盒(lightning site-directed mutagenesis kits，catalog#210518)，按说明书操作，并以野生型il-2表达载体pet21a-il-2(wt)为模板，将il-2的相应位置突变为琥珀终止密码子，得到突变型il-2的表达质粒。将上述带有氨苄青霉素抗性的表达质粒和带有壮观霉素抗性的辅助质粒同时转化大肠杆菌origamib(de3)，经氯霉素和壮观霉素双抗性平板筛选出共转化的阳性菌株，即得到同时转化有两个质粒的表达菌株。将上述步骤获得的表达菌株在2*yt培养基中37℃培养12-16小时后，再经二级扩增至菌液od值到0.6-1.0时，加入fsy至终浓度0.5mm，37℃继续扩增30分钟，加入iptg至终浓度0.5mm，24℃诱导表达12小时后收集菌体。将收集的菌体用ni-nta-bind-buffer平衡重悬，经超高压匀质破碎机1200bar，2循环破碎后，高速离心去除细胞碎片，经过ni-nta金属螯合亲和层析，用ni-nta-wash-buffer充分洗涤，最后用ni-nta-elute-buffer洗脱，得到初步纯化的白细胞介素-2样品，纯度约为90％。产物经sds-page、考马斯亮蓝和质谱检测，确认特定位点插入了该非天然氨基酸。
[0035]
实施例2il-2突变体共价交联活性的体外验证
[0036]
将上述不同位点插入fsy的il-2突变体在生理条件下，与cd25胞外段等量孵育，将孵育后的样品加入带有还原剂的上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，将还原后的样品进行sds-page分析。考马斯亮蓝染色和western blot结果表明，还原后的样品中，r38和l72位点插入有fsy的il-2突变体，即r38-fsy和l72-fsy，产生了明显的共价交联条带，交联条带分子量大小等于两蛋白分子量之和，其中l72-fsy的交联效率高于r38-fsy(图1b)。将l72-fsy与cd25的交联条带进行质谱分析，结果表明72位的fsy氨基酸确实与cd25的h120位产生了共价交联，检索出了共价交联片段(图1c)。另一方面，将l72-fsy与表达有cd25的yt细胞进行孵育培养，将变性后细胞裂解物进行western blot检测。与分子水平检测的结果一致，可以发现l72-fsy可以与cd25在细胞水平成功产生共价交联，其交联活性呈现明显的剂量和时间依赖性(图1d)。
[0037]
实施例3l72-fsy的体外活性表征
[0038]
为了评价l72-fsy对treg细胞激活的偏向性和有效性，我们首先评价了这种突变对il-2活性的影响。我们通过亲和力检测和yt-cd25的磷酸化5(pstat5)指标，评价72位点插入fsy对il-2活性的影响。结果表明，较wt-il-2而言，l72-fsy略微降低了对cd25的结合
力(约3倍)。由于l72部分参与il-2于cd25的结合，此结果与文献报道一致。然而，此种降低并不影响l72-fsy对cd25-yt细胞的激活作用，表现为l72-fsy与wt-il-2具有同等程度的pstat5激活作用，亲和力及细胞检测的ec50如表1及图2所示。
[0039]
表1、wt-il-2对比l72-fsy在cd25亲和力和cd25-yt细胞体外活性
[0040]
样品wt-il-2l72-fsykon(1/ms)3.89e 061.39e 06kdis(1/s)1.30e-021.42e-02kd(m)3.33e-091.03e-08ec50(μg/ml)4.82e-059.47e-05
[0041]
实施例4共价交联增强了il-2在treg细胞上的存在时间及作用强度
[0042]
基于实施例2中展示的共价交联活性，我们继而验证与cd25产生共价交联，是否可以增强il-2随cd25的再循环过程及其对treg作用的特异性。基于已有的文献调研(su at al.,sci transl med.2015oct 28；7(311):311ra170)，我们选择了脉冲孵育细胞模型对此进行验证。我们将wt-il-2或l72-fsy分别于分离纯的treg细胞和cd8 t细胞共同孵育1.5小时，随后将细胞进行酸性缓冲液的洗涤以去除细胞表面及培养基中的细胞因子，继续将细胞进行培养，检测上边的il-2残留量。结果表明，在继续培养过程中，l72-fsy处理组细胞表面il-2高于wt-il-2组，此效果在缺少cd25表达的cd8 t细胞中没有表现，提示l72-fsy处理组发生了更为有效的il-2再循环，增强了il-2在treg细胞上存在时间(图3a)。荧光共聚焦分析和此结果一致，将荧光标记的wt-il-2或l72-fsy与cd25-yt细胞共孵育，检测胞内和表面il-2与cd25和溶酶体的共定位。结果表明，共孵育后，l72-fsy组在细胞表面存在明显的il-2残留，并与cd25产生共定位；而wt-il-2组标记的荧光分子较多的出现在胞内，与溶酶体共定位(图3b)。进一步的，我们检测了延长孵育后，treg细胞和cd8 t细胞的pstat5信号强度。结果表明，l72-fsy处理的treg细胞在孵育过程中，较wt-il-2组，保留有较强的pstat5信号强度，此强度呈现cd25依赖性(图3c)。这些结果表明，交联活性确实增强了il-2的再循环，进而增强了其在细胞上的存在时间和作用活性。更重要的，此效果具有treg细胞选择性。
[0043]
实施例5l72-fsy体外靶向扩增treg细胞的细胞数量及激活标志物检测
[0044]
如实施例4所述的，l72-fsy或wt-il-2与分离纯的treg细胞或cd8 t细胞共同孵育过夜，酸洗，在没有细胞因子的情况下继续培养3天，通过流式细胞术检测treg和cd8 t细胞的扩增和细胞表面标记物的表达，其结果与pstat5形成互补。结果表明，在去除细胞因子共培养的过程中，l72-fsy处理组较wt-il-2更多扩增了treg细胞，表现为treg所占cd4 t细胞比例及treg细胞绝对数的增加，而对cd8 t细胞占cd3 t细胞的比例和cd8 t细胞的绝对数没有明显影响(图4a)。细胞表面的激活标志物和细胞扩增的结果一致：l72-fsy处理组较wt-il-2增强了treg上cd25和foxp3表达，而对cd8 t细胞上cd26和cd49d表达无明显影响(图4b)。此结果表明，l72-fsy可以比wt-il-2更有效的激活treg细胞，且激活效果具有选择性。
[0045]
实施例6l72-fsy体内靶向扩增treg细胞
[0046]
我们进一步应用体内模型评价l72-fsy对treg细胞靶向激活作用。根据文献报道，我们建立了人细胞在小鼠体内的评价模型(trotta et al.,nat med.2018jul；24(7):
1005-1014)。简要的，我们将新鲜分离的人pbmc细胞静脉注射免疫缺nsg小鼠体内，同时皮下注射wt-il-2或l72-fsy一天一次，共10天。最后一次注射后的第五天取小鼠脾，检测其中的各免疫细胞数量。结果表明，较wt-il-2组合和pbs对照组，l72-fsy偏向性扩增了小鼠体内的treg细胞，表现为treg细胞占cd4 t细胞比例上升，数量上升，而cd8 t细胞和tconv细胞的数量较wt-il-2反而较低，从而导致l72-fsy处理组的treg/cd8 t和treg/tconv显著上升(图5a和5b)。体内的细胞激活标记物与扩增结果一致，l72-fsy显著激活了treg细胞中的foxp3表达，而较少影响cd8 t细胞上的cd25表达(图5c)。
[0047]
另一方面，我们应用cd25人源化小鼠(b-hil-2rα)，即cd25胞外段被转基因为人源化，cd25胞内段仍为鼠源，评价了l72-fsy在体内对treg细胞的激活效果。如上所述的，将b-hil-2rα小鼠分别皮下注射wt-il-2，l72-fsy及pbs，一天一次，总共10天。最后一次注射后的第五天分离小鼠的脾细胞进行流式细胞术检测。结果表明，l72-fsy在b-hil-2rα体内显著靶向性扩增了treg细胞，而较少影响其它细胞，具体表现为较pbs和wt-il-2处理组而言，l72-fsy处理组的小鼠treg细胞的比例和数量上升，cd8 t,tconv和nk的数量增加较wt-il-2组低，th1和th17细胞的数量降低的比wt-il-2组高。这些结果导致l72-fsy处理组的小鼠中treg与这些细胞的比例上升(图6a和6b)。总体的，与体外结果一致，在pbmc建立的人源化小鼠和cd25人源化小鼠的体内模型检测中，l72-fsy在体内较wt-il-2有更高的treg激活偏向性。
[0048]
实施例7聚乙二醇修饰的l72-fsy
[0049]
上述实施例验证了共价交联cd25活性，以l72-fsy为例，可以有效的偏向性激活treg细胞。考虑到il-2较低的分子量和体内的快速清除，为了增强il-2突变体与cd25在体内产生共价交联的时机，我们对il-2进行生物大分子的修饰，以提高其在体内的半衰期和稳定性。以聚乙二醇修饰为例(peg)，我们对l72-fsy进行了20kda的n端peg修饰。如图7所示的结果表明，20kda的peg成功偶联到了l72-fsy上，结果呈现单一修饰条带，而修饰后的peg化l72-fsy(peg-l72fs7)依然保留有cd25共价交联活性(图7)。
[0050]
我们进一步对这种修饰后的产物进行活性和选择性的评价。将不同浓度的peg-l72fsy与人pbmc共同孵育刺激，检测peg-l72fsy对其中treg细胞和cd8 t细胞pstat5激活作用。结果表明，较wt-il-2而言，peg修饰轻微、并同等程度降低了l72-fsy对treg细胞和cd8 t细胞的激活作用，较低程度影响选择性(图8a)。受体亲和力检测和细胞活性检测结果一致，peg修饰同等程度降低了修饰后产物对il-2rα和il-2rβ的结合力，对偏向性影响不明显(图8b)。亲和力检测有关数据集如下表所示。
[0051]
表2 n端20kda-peg修饰对l72-fsy与il-2rα和il-2rβ亲和力的影响
[0052][0053][0054]
实施例8共价交联和/或peg修饰对il-2体内半衰期的影响
[0055]
peg的修饰可以提高蛋白分子体积，降低肾小球滤过，屏蔽抗原位点，进而提高修饰后il-2在体内的稳定性，延长半衰期。另一方面，延长半衰期，可以增强具有共价结合能力il-2衍生物在体内与cd25的反应时间，进一步增强共价交联效果。为此，我们评价了wt-il-2，l72-fsy，20kda-peg修饰的wt-il-2(peg-wt)，以及20kda-peg修饰的l72-fsy(peg-l72fsy)在c57bl/6和b-hil-2ra小鼠体内的药代动力学。结果表明，20kda-peg修饰可以显著提高il-2在小鼠体内的药代动力学。特别地，相比于不具备交联活性的wt-il-2和peg-wt，含有fsy的样品具有更强的药代动力学性质。这种差异在c57bl/6的对照组里没有体现，证明了确实是由共价交联引起(图9)。药代动力学数据总结如表3所示。
[0056]
表3在两种小鼠体内检测的药代动力学参数总结
[0057][0058]
1.auc:area under drug concentration versus time curve；2.tmax：time of maximal drug concentration；3.mrt:mean residence time；4.t
1/2
:half-life of clearance；5.cl/f:apparent total plasma clearance.
[0059]
实施例9peg-l72fsy体内靶向扩增treg细胞
[0060]
我们应用体内模型评价peg-l72fsy对treg细胞靶向激活作用。简要的，我们应用b-hil-2rα小鼠，分别皮下注射peg-wt-il-2或peg-l72fsy隔天一次，共5此。wt-il-2和l72-fsy作为对照。结果表明，较l72-fsy，peg-l72fsy可以更有效偏向性激活treg细胞，反应为更高的treg/cd8 t,treg/tconv和treg/nk(图10)。
[0061]
实施例10共价交联活性的il-2在自身免疫病模型中具有更强的治疗有效性和安全性
[0062]
我们应用姥鲛烷诱导的狼疮模型，在b-hil-2rα小鼠中评价具有共价交联活性的il-2在狼疮内的治疗效果。结果表明，相对于野生型il-2和pbs处理组，l72-fsy和peg-l72fsy处理组显著降低了狼疮的疾病进展，表现在降低了抗核抗体，抗rrnp抗体和抗sm抗体；并且明显改善了肾脏和脾脏的炎症作用，表现在降低了肾脏的igg和igm沉积，降低了脾脏的生发中心形成。另一方面，肺的炎症性损伤是姥鲛烷诱导的狼疮的重要疾病进展之一，我们发现，l72-fsy和peg-l72fsy处理组显著改善了狼疮小鼠的肺部炎症反应，表明具有共价交联活性的il-2对在改善以狼疮为代表的自身免疫病中具有明显的免疫抑制作用(图11a)。
[0063]
另一方面，我们检测了具有共价交联活性的il-2在另一种炎症性疾病，移植物抗宿主病中的应用。我们发现，较pbs组，l72-fsy处理的小鼠在高剂量及低剂量下，都可以显著延长小鼠的生存期及体重保留；而野生型il-2组仅在低剂量有较弱的保护作用。这些结果进一步证明，具有共价交联活性的il-2在改善炎症性疾病的进展中，具有比野生型il-2更理想的有效性和稳定性(图11b)。
[0064]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。