一种混合菌剂及其在去除甲烷和硝酸盐中的应用的制作方法

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种混合菌剂及其在去除甲烷和/或硝酸盐中的应用。


背景技术：

2.甲烷是仅次于二氧化碳的第二大温室气体，但其温室效应约为二氧化碳的25-28倍。甲烷是由厌氧环境下的产甲烷菌作用于有机物发酵而产生，并释放到大气中，因此生物技术是削减甲烷排放最为经济、有效的方法。尤其是甲烷在释放的过程中要经历大范围的厌/缺氧区域，因此，开发能在缺氧环境中去除甲烷的微生物菌剂至关重要。
3.此外，氮素污染一直是困扰水环境的污染问题。氮污染在严重破坏水生生态系统的同时，也威胁着人类健康和生态平衡。氮氧化物与雨水结合产生酸雨，进入水体导致酸化；工业和生活废水的排放和氮肥的流失导致过量的氮元素排入环境水体，会造成水体的富营养化，同时会使水体沉积物释放更多的甲烷。因此，控制废水中的氮排放是必须解决的重要问题。
4.硝酸盐是废水中最常见的氮源之一。传统利用反硝化细菌利用有机物作为碳源进行反硝化去除硝酸盐氮的方法会造成碳源浪费，增加废水处理运营成本，而利用甲烷作为碳源，在去除硝酸盐的同时削减了温室气体排放，以废治废，能大大提升经济效益和环境效益。
5.缺/厌氧环境下硝酸盐还原耦合甲烷氧化的发现为同步削减温室气体排放和氮素污染提供了新的技术途径。然而，目前普遍研究的硝酸盐还原耦合厌氧甲烷氧化的功能微生物生长极其缓慢，倍增时间达到2周甚至1个月以上，对目标污染物的去除效率较低，限制了该方法在实际工程领域的应用。因此，制备出能同步去除甲烷和硝酸盐的高效混合菌剂是解决硝酸盐还原耦合甲烷氧化工程化应用的关键瓶颈问题，对其实际应用具有重大意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种可以在缺/厌氧环境下高效同步去除甲烷和/或硝酸盐的混合菌剂，减少甲烷排放量，削减温室效应，同时有效去除水体中的硝酸盐，减轻水体富营养化，为同步削减甲烷和硝酸盐排放提供新的工程技术应用途径。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种混合菌剂，含有甲基孢囊菌菌株m9和生丝微菌菌株l1；
9.所述的甲基孢囊菌(methylocystis sp.)菌株m9是从甲烷厌氧氧化反应器中分离得到，其菌落呈圆形，白色，微隆起，不透明，表面光滑，较湿润，菌落边缘整齐；革兰氏染色为阴性；所述菌株的生理生化鉴定实验结果如下：柠檬酸盐(阳性)、明胶液化(阴性)、h2s产生(阳性)、甲基红试验(阴性)、淀粉水解(阳性)、吲哚实验(阴性)、接触酶(阳性)、硝酸盐还原(阳性)。
10.菌株m9的16s rdna序列如seq id no.1所示，通过进化树分析，其分类位置与甲基孢囊菌(methylocystis sp.)最为接近；
11.综合以上可鉴定菌株m9为甲基孢囊菌(methylocystis sp.)。
12.所述的生丝微菌(hyphomicrobium sp.)菌株l1是从甲烷厌氧氧化反应器中分离得到，其菌落是褐色，杆状细菌，尖端呈椭圆形，出芽繁殖；革兰氏染色为阴性；所述菌株的生理生化鉴定实验结果如下：柠檬酸盐(阳性)、明胶液化(阴性)、h2s产生(阴性)、甲基红试验(阴性)、淀粉水解(阳性)、吲哚实验(阴性)、接触酶(阳性)、硝酸盐还原(阳性)。
13.菌株l1的16s rdna序列如seq id no.2所示，通过进化树分析，其分类位置与生丝微菌(hyphomicrobium sp.)最为接近；
14.综合以上可鉴定菌株l1为生丝微菌(hyphomicrobium sp.)。
15.所述混合菌剂中，甲基孢囊菌菌株m9和生丝微菌菌株l1的活菌含量分别至少达到1.0
×
108cfu/ml；
16.所述混合菌剂中，甲基孢囊菌菌株m9与生丝微菌菌株l1的活菌含量比为1:3～1:15。
17.上述的混合菌剂可用于去除甲烷和/或硝酸盐，尤其适用于在缺/厌氧环境中去除甲烷和硝酸盐；
18.所述混合菌剂的剂型包括粉剂、溶液、悬乳液。
19.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
20.本发明首次将甲基孢囊菌属(methylocystis sp.)和生丝微菌属(hyphomicrobium sp.)结合用于缺/厌氧环境下甲烷及硝酸盐污染控制及修复，混合菌剂比methylocystis sp.单菌剂的甲烷和硝酸盐去除效果更好，更具有工程应用价值。
附图说明
21.图1是methylocystis sp.m9系统发育树。
22.图2是hyphomicrobium sp.l1系统发育树。
具体实施方式
23.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
24.实施列1：菌株的分离与鉴定
25.1、菌株的分离
26.取广东省广州市番禺区南村镇兴业大道东855号暨南大学b102的厌氧反应器里的水泥混合物3ml，离心(4000rpm，10min)，取1ml上清液加到含有20ml灭菌后的ams液体培养基的100ml血清瓶，150rpm，30℃，培养两天，取1ml富集物与ph为7.2的9ml 0.01mol/l pbs缓冲液(灭菌)中，其中pbs缓冲液主要成分为kh2po4、na2hpo4、nacl和kcl，吹洗均匀即为10-2
的浓度菌悬液，依次类推到10-6
，用无菌移液管分别吸取30μl各个稀释倍数的菌悬液与相对应的平板内，用灭菌后冷却的三角涂布器均匀涂布在ams固体培养基上，然后将涂布好的平板倒置放在厌氧箱内，将装有甲烷的气袋开小口后放进厌氧箱，30℃培养14天。待平板上长出单个菌落后挑选单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌并保存在斜面，编号m9。
27.筛选甲基孢囊菌m9的ams培养基成分包含(每升)：0.1g mgso4﹒7h2o，0.5g(nh4)cl，0.56g kh2po4，0.3g na2hpo4，5mg cacl，5mg feso4﹒7h2o，1ml微量元素溶液，琼脂16-18g，ph为7.1。
28.所述微量元素溶液包括(每升)：0.44g znso4﹒7h2o，0.2g cuso4﹒5h2o，0.17g mnso4﹒2h2o，0.06g na2moo4﹒h2o，0.1g h3bo3，0.08g cocl﹒6h2o。
29.取反应器(同上)里的液体样品(同上)3ml，离心(4000rpm，10min)，取1ml上清液与9ml pbs缓冲液(灭菌)中，吹洗均匀即为10-2
的浓度菌悬液，依次类推到10-6
，用无菌移液管分别吸取30μl各个稀释倍数的菌悬液与相对应的平板内，用灭菌后冷却的三角涂布器均匀涂布在筛选固体培养基(“337”培养基)上，然后将涂布好的平板倒置放在厌氧箱内，30℃培养7天。待平板上长出单个菌落后挑选单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌并保存在斜面，编号l1。
30.筛选生丝微菌l1所用“337”培养基成分包括(每升)：1.3g kh2po4，1.13gna2hpo4,0.5g(nh4)2so4，0.2g mgso4﹒7h2o，2.33mg cacl，2.0g feso4﹒7h2o，1.0mg na2moo4﹒2h2o，0.67mg mnso4﹒h2o，10ug cucl2﹒2h2o，0.3％ch3oh，琼脂16-18g，ph为6.8。
31.2、菌株的鉴定
32.(1)菌株的生理生化鉴定结果如表1所示：
33.表1菌株m9和菌株l1的生理生化特性
34.项目m9l1柠檬酸盐 明胶液化
‑‑
h2s产生 -甲基红试验
‑‑
淀粉水解 吲哚试验
‑‑
接触酶 硝酸盐还原
35.注：“ ”表示反应为阳性，
“‑”
表示反应为阴性
36.(2)m9菌株的16s rdna分子鉴定：
37.提取细菌总dna，用16s rdna通用引物(27f/1492r)对该细菌基因组进行pcr扩增。pcr产物经测序(华大基因完成)后，将测序结果(seq id no.1)通过ncbi blast与genbank中已报道的其他菌株的16s rdna序列进行同源性对比，并选取相关菌株做进化树分析，如图1所示，其分类位置与甲基孢囊菌(methylocystis sp.)最为接近；
38.结合其形态特征和生理生化特性，与甲基孢囊菌属(methylocystis sp.)最为相似。因此细菌m9鉴定为methylocystis sp.，并命名为甲基孢囊菌(methylocystis sp.)m9。
39.(3)l1菌株的16s rdna分子鉴定：
40.提取细菌总dna，用16s rdna通用引物(27f/1492r)对该细菌基因组进行pcr扩增。pcr产物经测序(华大基因完成)后，将测序结果(seq id no.2)通过ncbi blast与genbank中已报道的其他菌株的16s rdna序列进行同源性对比，并选取相关菌株做进化树分析，如图2所示，其分类位置与生丝微菌(hyphomicrobium sp.)最为接近；
41.结合其形态特征和生理生化特性，与生丝微菌属(hyphomicrobium sp.)最为相似。因此细菌l1鉴定为hyphomicrobium sp.，并命名为生丝微菌(hyphomicrobium sp.)l1。
42.实施例2
43.混合菌剂及其应用
44.(1)甲基孢囊菌m9菌株接种到含有灭菌后的nms液体培养基的血清瓶中，注入高纯甲烷，使厌氧瓶顶空甲烷浓度为10％(v/v)，在30℃转速为150rpm/min摇床中活化，培养到对数生长期od600＝0.5，然后按体积比5％接种到培养基中30℃培养7天。将富集后的菌液收集再重悬在nms培养基，然后通过稀释平板计数法得到菌落数约为1.4
×
108cfu/ml。
45.(2)生丝微菌l1菌株接种到含有灭菌后的“337”液体培养基的血清瓶中，在种子培养基中30℃培养3天，然后按体积比5％接种到培养基中30℃培养5天。将富集后的菌液收集再重悬“337”培养基，然后通过稀释平板计数法得到菌落数约为1.4
×
108cfu/ml。
46.(3)将重悬后的m9菌液与l1菌液按1:5的比例混合。
47.实施例3
48.混合菌剂及其应用
49.步骤(1)和(2)同实施例2；
50.(3)将重悬后的m9菌液与l1菌液按1:14的比例混合。
51.对比例
52.甲基孢囊菌m9菌株接种到含有灭菌后的nms液体培养基的血清瓶中，注入高纯甲烷，使厌氧瓶顶空甲烷浓度为10％(v/v)，在30℃转速为150rpm/min摇床中活化，培养到对数生长期od600＝0.5，然后按体积比5％接种到培养基中30℃培养5天。将富集后的菌液收集再重悬在nms培养基，然后通过稀释平板计数法得到菌落数约为1.4
×
108cfu/ml。
53.分别取实施例2、3，和对比例最后得到的菌液接种在血清瓶中，血清瓶中的培养液为灭菌后的nms液体培养基，各设置5个平行，密封后，用氩气冲洗除去血清瓶中的氧气，平衡气压后抽取一定体积的气体，再向其中注入相同含量的高纯甲烷，其中甲烷浓度约为220μmol，硝酸盐氮浓度为8.0mg/l，血清瓶置于30℃，转速150rpm/min振荡，培养5天，比较培养期内本产品与对照品对缺氧环境中去除甲烷和硝酸盐的效果。
54.试验结果：
55.使用对比例的m9单独菌液，甲烷平均消耗速率为6.57μmol d-1
和二氧化碳的平均生成速率为0.593μmol d-1
，硝酸盐的去除速率为1.12mg l-1
d-1
。
56.使用实施例2的混合菌液，混合菌剂m9 l1在缺/厌氧环境下同时去除甲烷和硝酸盐的效果明显好于m9，混合菌剂m9 l的甲烷去除速率为8.65μmol d-1
，二氧化碳的生成速率为0.851，硝酸盐的去除速率为1.18mg l-1
d-1
，混合菌剂的甲烷降解效果是对照的1.32倍，硝酸盐的去除效果约为1.05倍。
57.使用实施例3的混合菌液，混合菌剂m9 l1在缺/厌氧环境下同时去除甲烷和硝酸盐的效果明显好于m9，混合菌剂m9 l的甲烷去除速率为13.2μmol d-1
，二氧化碳的生成速率为1.02，硝酸盐的去除速率为1.30mg l-1
d-1
，混合菌剂的甲烷降解效果是对照的2倍，硝酸盐的去除效果约为1.2倍。
58.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。