一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法及其应用。


背景技术：

2.亚硝酸盐作为一种食品添加剂在食品中广泛应用，尤其是各类高盐食品。过量的亚硝酸盐摄入会导致慢性致癌和急性中毒，将亚硝酸盐控制在安全限量内是目前国内外的研究热点。利用亚硝酸盐还原酶降解亚硝酸盐具有高效、健康等特点，是目前最常用的方法。目前亚硝酸盐还原酶大多来源于乳酸菌，对盐的耐受性不强，限制了在高盐食品工业中的应用。
3.嗜盐古菌是一类依赖于高盐环境的极端微生物，是耐盐亚硝酸盐还原酶的良好微生物来源。目前关于嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的研究非常有限，主要受限于纯酶的制备步骤繁琐且得率低。


技术实现要素：

4.本发明目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一个新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的基因及嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法。
5.本发明基于一株嗜盐古菌haloterrigena sp.kzca68-1的基因组获得一条新型的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的基因命名为nirk
htg
，其核苷酸序列如seq id no.1所示，其氨基酸序列如seq id no.2所示；基于nirk
htg
编码的新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶命名为nirk
htg
。
6.为了实现以上目的，本发明包括以下步骤：
7.(1)构建pta04-nirk
htg
重组表达质粒：
8.首先基于嗜盐古菌haloterrigena sp.kzca68-1的基因组获得一条新型的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的基因nirk
htg
，进一步设计含有酶切位点ecori和bamhi的目的片段引物，利用常规pcr技术扩增目的片段nirk
htg
；通过分子克隆技术将nirk
htg
连接到pta04载体上构建重组质粒；
9.(2)转化嗜盐古菌haloferax volcanii：
10.将步骤(1)成功构建的重组质粒转化嗜盐古菌宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述宿主为菌株haloferax volcanii；
11.将转化后的重组宿主细胞接种于hv-ypc液体培养基中进行活化培养，培养后得到培养液；再取培养液接种至hv-ypc液体培养基中摇瓶培养至稳定期，进一步离心收集菌体，低温保存备用；
12.(3)重组亚硝酸盐还原酶的纯化：
13.收集步骤(2)保存的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心后收集上清液，即粗酶液，将粗酶液用于重组蛋白纯化；首先采用镍柱亲和层析纯化获得含有
咪唑的目的蛋白；最后利用凝胶过滤层析去除咪唑，获得高纯度的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶，记为nirk
htg
。
14.优选的，步骤(1)中所述嗜盐古菌(haloterrigena sp.)kzca68-1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种保藏号为cgmcc 22195，保藏日期：2021年4月16日。
15.优选的，步骤(2)中所述haloferax volcanii购自日本微生物菌种保藏中心(jcm)，菌种保藏号为：jcm 8879。
16.优选的，步骤(2)中所述hv-ypc培养基成分为(每升)：酵母提取物5.0g，大豆蛋白胨1.0g，酸水解酪素1.0g，kcl 4.2g，mgso4·
7h2o 33.0g，mgcl2·
6h2o 30.0g，nacl 144.0g，1m tris-hcl(ph 8.0)12.0ml，cacl
2 0.33g(先预溶于水中，溶解后添加)，上述组分定容于1l蒸馏水中，调节ph至7.5，115℃灭菌30min。
17.优选的，步骤(2)中所述活化培养的条件为：37℃，180rpm培养3～4天。
18.优选的，步骤(2)中所述的低温保存的温度为-20℃。
19.优选的，步骤(3)中所述的镍柱亲和层析纯化的具体操作为：首先20倍柱床体积的lysis buffer用于平衡镍柱；将离心后的上清液上样；然后使用缓冲液i洗脱杂蛋白；缓冲液ii洗脱目的蛋白，获得含有咪唑的目的蛋白。
20.优选的，所述lysis buffer成分为2m nacl，20mm tris-hcl，ph 8.0。
21.优选的，所述缓冲液i成分为2m nacl，20mm tris-hcl，40mm咪唑，ph 8.0。
22.优选的，所述缓冲液ii成分为2m nacl，20mm tris-hcl，250mm咪唑，ph 8.0。
23.优选的，所述步骤(3)中所述凝胶过滤层析为利用pure蛋白分离纯化系统，hitrap
tm desalting(5ml)层析柱去除咪唑，以lysis buffer为流动相，通过凝胶过滤层析获得高纯度的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶，即nirk
htg
。
24.本发明制备的新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶nirk
htg
可用于高盐腌制食品、废水处理等过程中降解亚硝酸盐的用途。
25.本发明还提供了nirk
htg
的酶学性质表征，具体包括最适温度及温度稳定性；最适nacl浓度及nacl浓度稳定性；最适ph及ph稳定性；全波长扫描；有机溶剂耐受性；金属离子耐受性和酶动力学参数的测定。
26.以nano2为底物，nirk
htg
的最适反应条件为35℃、1.5m nacl和ph 6.0；在30℃和60℃均具有良好的热稳定性，对低盐环境和高盐环境均具有较好的耐受性，在ph 6.0和ph7.5均具有较好的ph稳定性；甲醇、乙醇、吐温80、吐温20、甘油和dmf(二甲基甲酰胺)能够不同程度上促进nirk
htg
的酶活；对mg
2
、ca
2
、sr
2
、mn
2
和cu
2
具有良好的耐受性。全波长扫描结果显示在460、586、952nm处均有吸收峰，其中586nm处的吸收值最大，故nirk
htg
是蓝色的铜型亚硝酸盐还原酶。以nano2为底物nirk
htg
的最大反应速率v
max
为74970μg/min/mg，动力学常数km为1.285mm。
27.本发明的优点和技术效果是：
28.(1)本发明发现了一条新型的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶基因，表达出一种新型的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶，提出了一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法。相比传统的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶纯化方法，该方法纯化步骤更简单，获得的亚硝酸盐还原酶纯度高。
29.(2)nirk
htg
具有良好的酶学特性，对温度、ph和盐度都具有较好的广适性，且可以
耐受多种金属离子和有机溶剂，具有优良性状的新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶nirk
htg
可应用于高盐腌制食品、废水处理等过程中降解亚硝酸盐。
附图说明
30.图1为成功构建质粒的酶切验证图。
31.图2为镍柱纯化后的nirk
htg
的sds-page图。
32.图3为nirk
htg
凝胶过滤层析图。
33.图4为反应温度对nirk
htg
活性的影响。
34.图5为nacl浓度对nirk
htg
活性的影响。
35.图6为ph对nirk
htg
活性的影响。
36.图7为nirk
htg
在不同温度下的稳定性。
37.图8为nirk
htg
在不同ph条件下的稳定性。
38.图9为nirk
htg
在不同nacl浓度下的稳定性。
39.图10为金属离子对nirk
htg
活性的影响。
40.图11为有机溶剂对nirk
htg
活性的影响。
41.图12为nirk
htg
的全波长扫描图。
具体实施方式
42.下面结合说明书附图和具体实施实例对本发明做进一步说明。
43.嗜盐古菌haloterrigena sp.kzca68-1为发明人自行筛选，分离自西藏自治区昆仲错盐湖分离时间2018年9月9日；其中昆仲错盐湖位于西藏自治区，湖面海拔4347米，经纬度33
°
08'n，80
°
39'1e。
44.实施例1：
45.嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶nirk
htg
的异源表达；
46.(1)利用pcr技术扩增目的基因
47.取haloterrigena sp.kzca68-1少量菌体至30μl无菌双蒸水中，煮沸10min，以此作为dna扩增模板。特异性引物正向引物f序列为(5
’‑
atagaattcaccctaactacagccaac-3’)，反向引物r序列为(5’ataggatcccgcgtcctcgtcgtagag-3’)，酶切位点为ecori和bamhi。
48.pcr扩增体系(25μl)：
[0049][0050]
pcr扩增程序：
[0051][0052]
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下进行检测，并切下目的片段，使用dna凝胶回收试剂盒进行dna回收。
[0053]
(2)目的基因和载体双酶切和纯化
[0054]
将回收后的目的基因和pta04载体分别于37℃水浴锅使用ecori和bamhi限制性内切酶(购自takara公司)双酶切30min。酶切产物再使用dna凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的目的基因。
[0055]
(3)连接和转化大肠杆菌dh5α
[0056]
将纯化后的目的基因和pta04载体用t4 dna连接酶(购自takara公司)16℃连接1h。
[0057]
连接体系(10μl)：
[0058][0059][0060]
将10μl连接体系全部加入100μl大肠杆菌dh5α感受态；冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入500μl lb液体培养基，37℃180rpm复苏45min～1h，6000rpm离心3min，弃500μl上清，剩余菌液吹散，涂布于含有氨苄青霉素的lb平板，37℃培养过夜。
[0061]
(4)质粒提取
[0062]
挑取转化子于含有氨苄青霉素的lb平板上扩大培养，通过pcr技术验证。将验证正确的阳性转化子于含有氨苄青霉素的lb液体培养基内扩大培养，利用质粒dna小量提取试剂盒提取质粒酶切验证。反应条件为将：质粒于37℃水浴锅使用ecori和bamhi限制性内切酶(购自takara公司)双酶切30min，酶切体系如下：
[0063]
酶切体系(10μl):
[0064]
[0065]
进行琼脂糖凝胶电泳进行验证，如图1，图中泳道1-2表示提取的质粒，泳道m代表dna marker；泳道3-4表示质粒双酶切结果。构建成功的质粒于-20℃保存，用于后续转化。
[0066]
实施例2：
[0067]
转化嗜盐古菌haloferax volcanii；
[0068]
菌株haloferax volcanii接种于hv-ypc液体培养基(培养基中添加胸腺嘧啶使其终浓度为40μg/ml)，以生长至对数中期的菌体制备原生质体，然后用peg介导转化法将重组质粒转化haloferax volcanii，挑取红色转化子，并进行pcr验证；经pcr验证后，获得的阳性转化子即为转化后的重组宿主细胞；
[0069]
将获得的阳性转化子接种于hv-ypc液体培养基中(接种量1％，m/v)，于37℃，180rpm培养3天，得到培养液，并以1％(v/v)接种量接种至200ml hv-ypc液体培养基中摇瓶培养至稳定期，随后离心收集菌体，于-20℃保存。
[0070]
实施例3：
[0071]
镍柱亲和层析纯化nirk
htg
；
[0072]
(1)将实施例2收集的菌体重悬于30ml lysis buffer中，超声破胞处理，离心收集上清即为粗酶液；
[0073]
(2)流尽层析柱中的保存液体(20％乙醇)，用10倍柱床体积的ddh2o洗柱，再用10倍柱床体积的lysis buffer平衡柱子；
[0074]
(3)将粗酶液样品过三遍层析柱；
[0075]
(4)然后用25ml的缓冲液i洗柱，去除非特异结合的杂蛋白。
[0076]
(5)再用10ml的缓冲液ii洗柱，分管收集洗脱液(每管1ml)，即含有咪唑的目的蛋白，于4℃保存，并对洗脱液进行sds-page分析和酶活测定。
[0077]
如图2所示，图中泳道分别表示为泳道m：蛋白预染marker；泳道1：过镍柱前的胞内上清液；泳道2：过镍柱后流出液；泳道3：40mm咪唑洗脱的杂蛋白；泳道4：100mm咪唑洗脱的第2管；泳道5：250mm咪唑洗脱的第2管样液；泳道6：250mm咪唑洗脱的第9管样液；泳道7：500mm咪唑洗脱的第2管样液；泳道8：500mm咪唑洗脱的第9管样液；泳道9：1m咪唑洗脱样液。
[0078]
实施例4：
[0079]
凝胶过滤层析去除咪唑；
[0080]
(1)样品预处理
[0081]
将实施例3中的含有咪唑的目的蛋白使用截留分子量为10kda的millipore超滤管浓缩至600μl，浓缩后采用0.22μm的滤膜过滤样品，10000rpm离心5min，取上清液待用。
[0082]
(2)凝胶过滤层析
[0083]
将上述上清液通过凝胶过滤层析去除咪唑。凝胶过滤层析利用akta pure蛋白分离纯化系统，hitrap
tm desalting(5ml)层析柱，采用固定体积收集洗脱液(1ml/管)，即nirk
htg
，用于后续酶学性质表征(图3)。
[0084]
实施例5：(性能测试)：
[0085]
nirk
htg
酶活测定；
[0086]
(1)测定方法
[0087]
反应体系(250μl)：
[0088][0089]
实验组和对照组分别设置三组平行；对照组不加酶。
[0090]
40℃水浴反应10min后，用振荡器剧烈震荡直至深蓝色褪去以终止反应。反应物200倍稀释至10ml。加入200μl试剂1，混匀，反应4min；再加入200μl试剂2，混匀，避光反应30min。在540nm处测定吸光值。
[0091]
(2)酶活力单位定义：
[0092]
每分钟还原1μg亚硝酸盐所需的酶量为一个酶活力单位(u)。
[0093]
(3)酶活计算公式：
[0094][0095]
y：酶活力(u)
[0096]
x1：酶反应前亚硝酸盐含量(mm)
[0097]
x2：酶反应后亚硝酸盐含量(mm)
[0098]
比酶活(u/mg)定义为单位重量(mg)蛋白质具有的酶活力单位数。
[0099]
结果表明，在2m nacl、40℃和ph 8.0条件下测得的比酶活为1012.79u/mg。
[0100]
实施例6：
[0101]
nirk
htg
最适反应条件的确定；
[0102]
反应体系同实施例5；最适反应温度具体操作为：反应温度为30～85℃，在nacl终浓度为2m，ph 7.5的缓冲液中，测定不同温度下的亚硝酸盐还原酶的酶活。结果表明nirk
htg
的最适反应温度为35℃(图4)。
[0103]
最适nacl浓度具体操作为：反应体系的nacl终浓度分别为0m、0.5m、1.0m、1.5m、2.0m、2.5m、3.0m、3.5m、4.0m，在最适温度、ph 7.5的条件下进行反应。测定在不同nacl浓度的体系中亚硝酸盐还原酶的酶活。结果表明nirk
htg
的最适nacl浓度是1.5m(图5)。
[0104]
最适ph具体操作为：反应体系的缓冲液为不同ph的高盐缓冲液，分别是以最适nacl浓度配置0.1m柠檬酸-柠檬酸三钠高盐缓冲液(ph 3.0、ph 4.0、ph 5.0、ph 6.0)、0.1m三水合磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(ph 6.0、ph 6.5、ph 7.0、ph 7.5)、0.1m tris-hcl缓冲液(ph 7.5、ph 8.0、ph 8.5、ph 9.0)和50mm ches-naoh缓冲液(ph 9.0、ph 9.5、ph 10.0、ph 10.5)。在最适温度、最适nacl浓度条件下测定酶活。结果表明nirk
htg
最适ph为6.0(图6，图中a和b在ph 6.0处重合，c和d在ph 9.0处重合)。
[0105]
nirk
htg
的最适反应条件为35℃、1.5m nacl和ph 6.0。
[0106]
实施例7：
[0107]
nirk
htg
稳定性分析；
[0108]
热稳定性具体操作为：将酶液分别在30℃、60℃、80℃孵育0min、30min、60min、90min，然后加入反应体系，在最适温度、最适nacl浓度和ph 7.5的磷酸盐缓冲液中反应，测
定亚硝酸盐还原酶的酶活。结果表明nirk
htg
在30℃、60℃下放置90min以内，酶活无明显降低。在80℃放置30min、60min后，酶活略微降低，但是随着时间延长至90min时，酶活降至50％左右(图7)。
[0109]
ph稳定性具体操作为：将酶液分别加入最适nacl浓度下的ph 6.0(0.1m三水合磷酸氢二钾-磷酸二氢钾)、ph 7.5(0.1m三水合磷酸氢二钾-磷酸二氢钾)、ph 9.5(50mm ches-naoh)的缓冲液中孵育，孵育0min、30min、60min、90min后，在最适温度下反应，测定亚硝酸盐还原酶酶活。结果表明nirk
htg
在ph 6.0和ph 7.5下放置0～90min，酶活具有较好的稳定性。在ph 9.5放置30min和60min后，酶活仍保留了80％，随着时间延长至90min时，酶活降到60％左右(图8)。
[0110]
nacl稳定性具体操作为：将酶液加入到含有0m nacl、2m nacl和3.5m nacl的ph 7.5的磷酸盐缓冲液中孵育，孵育0min、30min、60min、90min后，在最适温度下反应，测定亚硝酸盐还原酶酶活。nirk
htg
在nacl浓度为0m、2m和3.5m下放置0～90min后，均具有较高的稳定性，基本保持在80％以上(图9)。
[0111]
实施例8：
[0112]
nirk
htg
对金属离子和有机溶剂的耐受性；
[0113]
反应体系同实施例5；金属离子耐受性具体操作为：在反应体系中添加终浓度为5mm的fe
3
、k

、ca
2
、cu
2
、mg
2
、mn
2
、zn
2
、sr
2
、ni
2
、co
2
，在最适温度、最适nacl浓度和ph 7.5的磷酸盐缓冲液中，测定亚硝酸盐还原酶的酶活；其中con.是指对照组(不添加酶)。结果表明mg
2
、ca
2
、sr
2
对nirk
htg
酶活几乎没有影响，mn
2
、cu
2
能够促进酶活，fe
3
、k

、zn
2
、ni
2
、co
2
对酶活有抑制作用，其中fe
3
对酶活的抑制作用最强(图10)。
[0114]
有机溶剂耐受性具体操作为：在反应体系中添加15％(v/v)的甲醇、乙醇、甘油、丙酮、乙腈、dmso、dmf、异丙醇、吐温20、吐温80、triton x-100，在最适温度、最适nacl浓度和ph 7.5的磷酸盐缓冲液中，测定亚硝酸盐还原酶酶活，其中con.是指对照组(不添加酶)。结果表明：dmso、tritonx-100和丙酮对nirk
htg
酶活有明显的抑制作用；甲醇、乙醇、吐温80、吐温20、甘油、dmf(二甲基甲酰胺)能够不同程度上促进nirk
htg
酶活，其中甘油的促进作用最为明显(图11)。
[0115]
实施例9：
[0116]
酶动力学参数的测定；
[0117]
反应体系同实施例5；具体操作为：在250μl的反应体系中，设置底物nano2的浓度为0mm、0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、4mm、5mm；在最适温度、最适nacl浓度和ph 7.5的缓冲液中进行反应，测定不同底物浓度下的酶活。利用graphpad prism7构建酶动力学曲线，计算km和v
max
值。结果显示nirk
htg
的最大反应速率v
max
为74970μg/min/mg，动力学常数km为1.285mm。
[0118]
实施例10：
[0119]
nirk
htg
全波长扫描；
[0120]
具体操作为用du800
tm
核酸蛋白分析仪进行全波长扫描。结果表明nirk
htg
在460、586、952nm处均有吸收峰，其中586nm处的吸收值最大，故nirk
htg
是蓝色的铜型亚硝酸盐还原酶(图12)。
[0121]
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，
尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
[0122]
核苷酸序列：seq id no.1
[0123]
atgaccctaactacagccaaccgacggcggttcatgcagacgatcggtgcggccggcgccgttgcggtcgccggctgtctcggcggcgacgcgccccaggcggacagtgcggcgaacgaaacggacgccgccgagcagggactgccggcggcgaaggctgtcgacgtcgaccggatcgcccgcgatccgaccgacatccccgcgccggtcgactggaccgagccccgcgaacacgatatcacgatccgggcccaggacgtgaccgccgagatcgaacccggcgtcacgttcacctacatgaccttcgaggggcaggttcccggtccgatggtccgcgtgcgccgcggcgaccgcgtcaacctcaccttcgaggtccccgaagcggagaacttcgcgagccacaacatggacttccacgcggtctacggccccggcggcggcgccgaagcgacgacgatcgggcccggcgacgacgccgcccgaatcagcttcaccgccgactacgccggcgcgttcgtctaccactgcgcgatcccggacatggactaccacatcagcgccggcatgttcggcacgatcctcgtcgaacccgaagagggcctccccgaggtcgacaacgagtactacctcggccaacacgagatctacaccgacggccaagtcggcgcggaaggccaccacaccttcgacttcgacgcgatgctggccgaacggcccacctacgtcgtcttcaacggccaggcctacggcttcaccgaagacggcgccatgcaggccaaaaccggcgagaccgcccgcgtgtacttcgccaacggcggccccaacctgctgagctcgctccaccccatcggtaacgtcttcagccgctactaccgcgacggcgacctcgtcagcgaccccgatcgcaacgtcgagaccgcccccgtcgcccccgggacgacgaccgtcggcgagatggagttccccgtccccggccccgtcaaaatcgtcgaccacgcgctcacccgcgccgcgcgacgcggcgccctcgccgtgatcgacgtccagggcgaacccacccgcgacctctacgacgaggacgcgtga
[0124]
氨基酸序列：seq id no.2
[0125]
mtlttanrrrfmqtigaagavavagclggdapqadsaanetdaaeqglpaakavdvdriardptdipapvdwteprehditiraqdvtaeiepgvtftymtfegqvpgpmvrvrrgdrvnltfevpeaenfashnmdfhavygpgggaeattigpgddaarisftadyagafvyhcaipdmdyhisagmfgtilvepeeglpevdneyylgqheiytdgqvgaeghhtfdfdamlaerptyvvfngqaygftedgamqaktgetarvyfanggpnllsslhpignvfsryyrdgdlvsdpdrnvetapvapgtttvgemefpvpgpvkivdhaltraarrgalavidvqgeptrdlydeda*。