分泌表达PD-1、GM-CSF抗体的CAR-T细胞及其用途的制作方法

7和ccl-17因子，以及分泌中和pd-1和gm-csf的anti-pd-1与anti-gm-csfscfv的cd19-car-t细胞。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于改进肿瘤治疗的方法，例如提供一种具有优良性能的分泌il-7和ccl-17因子，以及分泌中和pd-1和gm-csf的anti-pd-1与anti-gm-csfscfv的cd19-car-t细胞。
7.本发明制得的car-t细胞亦可称为cd19-car-t细胞。
8.针对目前car-t技术实际需求，本发明提供了共表达il-7和ccl17的cd19 car表达质粒的构建，不仅能将il-7分泌到t细胞外，而且使ccl-17最大程度招募外周血免疫细胞，进一步提高car-t的肿瘤细胞杀伤能力。为了增强杀伤效果及降低crs及神经毒性副作用，同时构建分泌中和pd-1、gm-csf的anti-pd-1、anti-gm-csfscfv的质粒。
9.为达到此目的，本发明采用以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，包括：
11.a)作为第一信号的抗原结合结构域、
12.b)跨膜结构域、
13.c)作为第二信号的细胞内传导结构域、以及
14.d)表达il-7和ccl-17细胞因子的第三信号域。
15.根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，其包含序列2所示的氨基酸序列。
16.第二方面，本发明还提供一种重组质粒，其具有如序列1所示的核苷酸序列。
17.第三方面，本发明还提供一种car-t细胞，其能够分泌表达il-7、ccl17因子和/或pd-1、gm-csf抗体。
18.根据本发明第三方面的car-t细胞，其转染了表达了本发明任一项所述的嵌合抗原受体序列。
19.第四方面，本发明进一步提供了制备car-t细胞的方法，其包括以下步骤：
20.(1)质粒合成：
21.使用载体plvx-ef1a-ires-pgk-puro合成car-19-1质粒，该质粒是由cd19单链可变区、cd8a铰链区、cd8a跨膜区、4-1bb信号、cd3ζ的包浆信号、il-7、ccl17序列构成，并且具有序列1所述核苷酸序列；
22.使用载体plvx-ef1a-ires-pgk-puro合成car-19-2质粒，该质粒是由cd19单链可变区、cd8a铰链区、cd8a跨膜区、4-1bb信号、cd3ζ的包浆信号序列构成，并且具有序列3所述核苷酸序列；
23.使用载体plvx-mcherry-c1合成car-19-3质粒，该质粒是由anti-pd-1scfv单链可变区、anti-gm-csf scfv单链可变区序列构成，并且具有序列5所述核苷酸序列；
24.(2)病毒包装：
25.使用invitrogen lipofectamine 3000转染试剂即lip3000进行病毒包装，293t培养基为添加10％fbs的dmem-h培养基，慢病毒包装培养基为添加1％glutamax、1mm丙酮酸钠、5％fbs的opti-memi培养基；
26.将293t细胞以7x106个细胞/孔的密度接种于含12ml的慢病毒包装培养基的10cm
培养皿中，置于37℃、5％co2条件下孵育细胞过夜至293t细胞密度达95％；
27.将孵育过夜的培养皿每皿去除6ml的慢病毒包装培养基，接着向每个皿中加入6ml的a液-b液混合液，轻混使其分布均匀后置于37℃、5％co2条件下孵育进行转染；转染6小时后更换293t培养基继续孵育；
28.至转染24小时后，收集12ml细胞上清液，并加入提前预热的12ml的293t培养基，继续于37℃、5％co2条件下孵育进行转染；
29.至转染54小时后第二次收集细胞上清液，与首次收集上清液混合，得细胞上清液；
30.在室温下，将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀物，再使用0.45μm滤器过滤上清，得病毒上清液；
31.按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合，4℃孵育2h，然后于4℃处离心至离心管底有沉淀(米白色)；
32.小心移去上清，加入适量体积的dmem重悬沉淀，得到慢病毒浓缩液，测定其病毒滴度；
33.(3)t细胞制备：
34.向含有1ml全血的ep管内添加生物素标记cd8抗体，室温混合30分钟；
35.再向上述1ml全血内添加150μl微泡，室温混合20分钟，将微泡和被抗体标记的细胞结合，离心；
36.用200μl移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2ml的ep管内，用500μl微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡，并入ep管内，室温下孵育30min；上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/l、磷酸二氢钾200mg/l、氯化钠8000mg/l、七水磷酸氢二钠2160mg/l、1％人血清白蛋白、2mm edta；
37.用超声波破泡，离心，收集细胞沉淀，制得t细胞为cd8

t细胞，对其进行流式细胞仪鉴定；
38.(4)t细胞激活、转导与扩增：
39.将收集的cd8

t细胞以5x105个细胞/ml接种于24孔板/6孔板中，使用激活培养基刺激24-48小时，接着加入慢病毒浓缩液(moi＝10)以及转导培养基进行病毒转导，24-48小时后换成维持培养基；扩增至6-8天时，收获car-t细胞。
40.根据本发明第四方面的方法，其中所述a液-b液混合液是将a液与b液混匀后置室温孵育15min得到的；a液配置：将opti-memi减血清培养基恢复至室温，使用1.5ml的opti-memi与41μl的lip3000在10cm皿中混匀，得a液；b液配置：将1.5ml的opti-memi、35μl的p3000 enhancer、12μg质粒混合物混合，得b液。(在转导类型为car-1＝(car-19-1) (car-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g：pspax2：(car-19-1/car-19-3)＝1:3:(4/3)，在转导类型为car-2＝(car-19-2) (car-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g：pspax2：(car-19-2/car-19-3)＝1:3:(3.5/3)，在转导类型为car-3＝(car-19-2)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g:pspax2:car-19-2＝1:3:3.5，在转导类型为car-4＝(car-19-1)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g：pspax2：car-19-1＝1:3:4)。
41.根据本发明第四方面的方法，其中激活培养基是包含30ng/ml anti-cd3和20ng/ml cd28的x-vivotm15 medium；转导培养基是包含200u/ml il-2和5μg/ml polybrene的x-vivotm15medium；维持培养基是包含200u/ml il-2的x-vivotm15 medium。
42.根据本发明第四方面的方法，其中t细胞制备时所用的微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/l、磷酸二氢钾200mg/l、氯化钠8000mg/l、七水磷酸氢二钠2160mg/l、1％人血清白蛋白(has)、2mm edta、酒石酸钠25mg/l、脯氨酸120mg/l。如本文所述的，出人意料的发现，使用同时包含酒石酸钠和脯氨酸的微泡缓冲液处理后所得t细胞中cd8

t细胞占分选后总单个核细胞的比例显著高于不加二种试剂的情形。
43.根据本发明第四方面的方法，其具有如实施例1～4所述的操作步骤。
44.第五方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，包括：
45.a)作为第一信号的抗原结合结构域、
46.b)跨膜结构域、
47.c)作为第二信号的细胞内传导结构域、
48.d)表达il-7和ccl-17细胞因子的第三信号域、以及
49.e)分泌中和pd-1、gm-csf的anti-pd-1、anti-gm-csf scfv的第四信号域。
50.根据本发明第五方面的嵌合抗原受体，其包含序列1所示的核苷酸序列。
51.根据本发明第五方面的嵌合抗原受体，其包含序列2所示的氨基酸序列。
52.根据本发明第五方面的嵌合抗原受体，其包含序列5所示的核苷酸序列。
53.根据本发明第五方面的嵌合抗原受体，其包含序列6所示的氨基酸序列。
54.根据本发明第五方面的嵌合抗原受体，其包含序列1和序列5所示的核苷酸序列。
55.根据本发明第五方面的嵌合抗原受体，其包含序列2和序列6所示的氨基酸序列。
56.第六方面，本发明还提供一种重组质粒，其具有如序列1所示的核苷酸序列。
57.本发明第六方面还提供一种重组质粒，其具有如序列5所示的核苷酸序列。
58.本发明第六方面还提供一种重组质粒，其包含序列1和序列5所示的核苷酸序列。
59.第七方面，本发明还提供一种重组质粒，其具有如序列2所示的氨基酸序列。
60.本发明第七方面还提供一种重组质粒，其具有如序列6所示的氨基酸序列。
61.本发明第七方面还提供一种重组质粒，其包含序列2和序列6所示的氨基酸序列。
62.第八方面，本发明还提供一种car-t细胞，其能够分泌表达il-7、ccl17因子和/或pd-1、gm-csf抗体。
63.根据本发明第八方面的car-t细胞，其转染了本发明任一项所述的嵌合抗原受体序列。
64.第九方面，本发明进一步提供了制备car-t细胞例如本发明第八方面的car-t细胞的方法，其包括以下步骤：
65.(1)质粒合成：
66.使用载体plvx-ef1a-ires-pgk-puro合成car-19-1质粒，该质粒是由cd19单链可变区、cd8a铰链区、cd8a跨膜区、4-1bb信号、cd3ζ的包浆信号、il-7、ccl17序列构成，并且具有序列1所述核苷酸序列和序列2所述氨基酸序列；
67.使用载体plvx-ef1a-ires-pgk-puro合成car-19-2质粒，该质粒是由cd19单链可变区、cd8a铰链区、cd8a跨膜区、4-1bb信号、cd3ζ的包浆信号序列构成，并且具有序列3所述核苷酸序列和序列4所述氨基酸序列；
68.使用载体plvx-mcherry-c1合成car-19-3质粒，该质粒是由anti-pd-1scfv单链可变区、anti-gm-csf scfv单链可变区序列构成，并且具有序列5所述核苷酸序列和序列6所
述氨基酸序列；
69.(2)病毒包装：
70.使用invitrogen lipofectamine 3000转染试剂即lip3000进行病毒包装，293t培养基为添加10％fbs的dmem-h培养基，慢病毒包装培养基为添加1％glutamax、1mm丙酮酸钠、5％fbs的opti-memi培养基；
71.将293t细胞以7x106个细胞/孔的密度接种于含12ml的慢病毒包装培养基的10cm培养皿中，置于37℃、5％co2条件下孵育细胞过夜至293t细胞密度达95％；
72.将孵育过夜的培养皿每皿去除6ml的慢病毒包装培养基，接着向每个皿中加入6ml的a液-b液混合液，轻混使其分布均匀后置于37℃、5％co2条件下孵育进行转染；转染6小时后更换293t培养基继续孵育；
73.至转染24小时后，收集12ml细胞上清液，并加入提前预热的12ml的293t培养基，继续于37℃、5％co2条件下孵育进行转染；
74.至转染54小时后第二次收集细胞上清液，与首次收集上清液混合，得细胞上清液；
75.在室温下，将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀物，再使用0.45μm滤器过滤上清，得病毒上清液；
76.按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合，4℃孵育2h，然后于4℃处离心至离心管底有沉淀(米白色)；
77.小心移去上清，加入适量体积的dmem重悬沉淀，得到慢病毒浓缩液，测定其病毒滴度；
78.(3)t细胞制备：
79.向含有1ml全血的ep管内添加生物素标记cd8抗体，室温混合30分钟；
80.再向上述1ml全血内添加150μl微泡，室温混合20分钟，将微泡和被抗体标记的细胞结合，离心；
81.用200μl移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2ml的ep管内，用500μl微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡，并入ep管内，室温下孵育30min；上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/l、磷酸二氢钾200mg/l、氯化钠8000mg/l、七水磷酸氢二钠2160mg/l、1％人血清白蛋白、2mm edta；
82.用超声波破泡，离心，收集细胞沉淀，制得t细胞为cd8

t细胞，对其进行流式细胞仪鉴定；
83.(4)t细胞激活、转导与扩增：
84.将收集的cd8

t细胞以5x105个细胞/ml接种于24孔板/6孔板中，使用激活培养基刺激24-48小时，接着加入慢病毒浓缩液(moi＝10)以及转导培养基进行病毒转导，24-48小时后换成维持培养基；扩增至6-8天时，收获car-t细胞。
85.根据本发明第四方面的方法，其中所述a液-b液混合液是将a液与b液混匀后置室温孵育15min得到的；a液配置：将opti-memi减血清培养基恢复至室温，使用1.5ml的opti-memi与41μl的lip3000在10cm皿中混匀，得a液；b液配置：将1.5ml的opti-memi、35μl的p3000 enhancer、12μg质粒混合物混合，得b液。(在转导类型为car-1＝(car-19-1) (car-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g：pspax2：(car-19-1/car-19-3)＝1:3:(4/3)，在转导类型为car-2＝(car-19-2) (car-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为
pmd2.g：pspax2：(car-19-2/car-19-3)＝1:3:(3.5/3)，在转导类型为car-3＝(car-19-2)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g:pspax2:car-19-2＝1:3:3.5，在转导类型为car-4＝(car-19-1)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g：pspax2：car-19-1＝1:3:4)。
86.根据本发明第九方面的方法，其中激活培养基是包含30ng/ml anti-cd3和20ng/ml cd28的x-vivotm15 medium；转导培养基是包含200u/ml il-2和5μg/ml polybrene的x-vivotm15medium；维持培养基是包含200u/ml il-2的x-vivotm15 medium。
87.根据本发明第九方面的方法，其中t细胞制备时所用的微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/l、磷酸二氢钾200mg/l、氯化钠8000mg/l、七水磷酸氢二钠2160mg/l、1％人血清白蛋白(has)、2mm edta、酒石酸钾25mg/l、脯氨酸120mg/l。如本文所述的，出人意料的发现，使用同时包含酒石酸钾和脯氨酸的微泡缓冲液处理后所得t细胞中cd8

t细胞占分选后总单个核细胞的比例显著高于不加二种试剂的情形。
88.根据本发明第九方面的方法，其具有如实施例1～4所述的操作步骤。
89.本发明第十方面还提供了car-t细胞例如本发明第三方面和/或本发明第八方面所述car-t细胞在制备用于治疗肿瘤的细胞治疗剂中的用途。
90.第十一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，包括：
91.a)作为第一信号的抗原结合结构域、
92.b)跨膜结构域、
93.c)作为第二信号的细胞内传导结构域、以及
94.e)分泌中和pd-1、gm-csf的anti-pd-1、anti-gm-csf scfv的第四信号域。
95.根据本发明第十一方面的嵌合抗原受体，其包含序列3所示的核苷酸序列。
96.根据本发明第十一方面的嵌合抗原受体，其包含序列4所示的氨基酸序列。
97.根据本发明第十一方面的嵌合抗原受体，其包含序列5所示的核苷酸序列。
98.根据本发明第十一方面的嵌合抗原受体，其包含序列6所示的氨基酸序列。
99.根据本发明第十一方面的嵌合抗原受体，其包含序列3所示的核苷酸序列和序列5所示的核苷酸序列。
100.根据本发明第十一方面的嵌合抗原受体，其包含序列4所示的核苷酸序列和序列6所示的氨基酸序列。
101.第十二方面，本发明还提供一种重组质粒，其具有如序列3所示的核苷酸序列。
102.本发明第十二方面还提供一种重组质粒，其具有如序列5所示的核苷酸序列。
103.本发明第十二方面还提供一种重组质粒，其包含序列3和序列5所示的核苷酸序列。
104.第十二方面，本发明还提供一种重组质粒，其具有如序列4所示的氨基酸序列。
105.本发明第十二方面还提供一种重组质粒，其具有如序列6所示的氨基酸序列。
106.本发明第十二方面还提供一种重组质粒，其包含序列4和序列6所示的氨基酸序列。
107.第十三方面，本发明还提供一种car-t细胞，其能够分泌表达il-7、ccl17因子和/或pd-1、gm-csf抗体。
108.根据本发明第十四方面的car-t细胞，其转染了本发明任一项所述的嵌合抗原受体序列。
109.第九方面，本发明进一步提供了制备car-t细胞例如本发明第十四方面的car-t细胞的方法，其包括以下步骤：
110.(1)质粒合成：
111.使用载体plvx-ef1a-ires-pgk-puro合成car-19-1质粒，该质粒是由cd19单链可变区、cd8a铰链区、cd8a跨膜区、4-1bb信号、cd3ζ的包浆信号、il-7、ccl17序列构成，并且具有序列1所述核苷酸序列和序列2所述氨基酸序列；
112.使用载体plvx-ef1a-ires-pgk-puro合成car-19-2质粒，该质粒是由cd19单链可变区、cd8a铰链区、cd8a跨膜区、4-1bb信号、cd3ζ的包浆信号序列构成，并且具有序列3所述核苷酸序列和序列4所述氨基酸序列；
113.使用载体plvx-mcherry-c1合成car-19-3质粒，该质粒是由anti-pd-1scfv单链可变区、anti-gm-csf scfv单链可变区序列构成，并且具有序列5所述核苷酸序列和序列6所述氨基酸序列；
114.(2)病毒包装：
115.使用invitrogen lipofectamine 3000转染试剂即lip3000进行病毒包装，293t培养基为添加10％fbs的dmem-h培养基，慢病毒包装培养基为添加1％glutamax、1mm丙酮酸钠、5％fbs的opti-memi培养基；
116.将293t细胞以7x106个细胞/孔的密度接种于含12ml的慢病毒包装培养基的10cm培养皿中，置于37℃、5％co2条件下孵育细胞过夜至293t细胞密度达95％；
117.将孵育过夜的培养皿每皿去除6ml的慢病毒包装培养基，接着向每个皿中加入6ml的a液-b液混合液，轻混使其分布均匀后置于37℃、5％co2条件下孵育进行转染；转染6小时后更换293t培养基继续孵育；
118.至转染24小时后，收集12ml细胞上清液，并加入提前预热的12ml的293t培养基，继续于37℃、5％co2条件下孵育进行转染；
119.至转染54小时后第二次收集细胞上清液，与首次收集上清液混合，得细胞上清液；
120.在室温下，将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀物，再使用0.45μm滤器过滤上清，得病毒上清液；
121.按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合，4℃孵育2h，然后于4℃处离心至离心管底有沉淀(米白色)；
122.小心移去上清，加入适量体积的dmem重悬沉淀，得到慢病毒浓缩液，测定其病毒滴度；
123.(3)t细胞制备：
124.向含有1ml全血的ep管内添加生物素标记cd8抗体，室温混合30分钟；
125.再向上述1ml全血内添加150μl微泡，室温混合20分钟，将微泡和被抗体标记的细胞结合，离心；
126.用200μl移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2ml的ep管内，用500μl微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡，并入ep管内，室温下孵育30min；上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/l、磷酸二氢钾200mg/l、氯化钠8000mg/l、七水磷酸氢二钠2160mg/l、1％人血清白蛋白、2mm edta；
127.用超声波破泡，离心，收集细胞沉淀，制得t细胞为cd8

t细胞，对其进行流式细胞
仪鉴定；
128.(4)t细胞激活、转导与扩增：
129.将收集的cd8

t细胞以5x105个细胞/ml接种于24孔板/6孔板中，使用激活培养基刺激24-48小时，接着加入慢病毒浓缩液(moi＝10)以及转导培养基进行病毒转导，24-48小时后换成维持培养基；扩增至6-8天时，收获car-t细胞。
130.根据本发明第十四方面的方法，其中所述a液-b液混合液是将a液与b液混匀后置室温孵育15min得到的；a液配置：将opti-memi减血清培养基恢复至室温，使用1.5ml的opti-memi与41μl的lip3000在10cm皿中混匀，得a液；b液配置：将1.5ml的opti-memi、35μl的p3000 enhancer、12μg质粒混合物混合，得b液。(在转导类型为car-2＝(car-19-2) (car-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g：pspax2：(car-19-2/car-19-3)＝1:3:(3.5/3))。
131.根据本发明第十四方面的方法，其中激活培养基是包含30ng/ml anti-cd3和20ng/ml cd28的x-vivotm15 medium；转导培养基是包含200u/ml il-2和5μg/ml polybrene的x-vivotm15medium；维持培养基是包含200u/ml il-2的x-vivotm15 medium。
132.根据本发明第十四方面的方法，其中t细胞制备时所用的微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/l、磷酸二氢钾200mg/l、氯化钠8000mg/l、七水磷酸氢二钠2160mg/l、1％人血清白蛋白(has)、2mm edta、酒石酸钾钠25mg/l、脯氨酸120mg/l。如本文所述的，出人意料的发现，使用同时包含酒石酸钾钠和脯氨酸的微泡缓冲液处理后所得t细胞中cd8

t细胞占分选后总单个核细胞的比例显著高于不加二种试剂的情形。
133.根据本发明第十四方面的方法，其具有如实施例1～4所述的操作步骤。
134.本发明第十五方面还提供了car-t细胞例如本发明第三方面和/或本发明第八方面和/或本发明第十三方面所述car-t细胞在制备用于治疗肿瘤的细胞治疗剂中的用途。
135.本发明的各个方面呈现优良的技术效果。
具体实施方式
136.下列实例将进一步说明发明的具体步骤以及特征，该等实例仅为示例而用，并非对本发明的限制，说涉及到的试剂和材料非特殊说明均为市售。
137.本发明使用的一些主要实验材料包括：endo-free plasmid maxi kit(omega)，nacl、蛋白胨、edta、naoh、酵母粉(上海生工生物工程股份有限公司)，感受态stbl3(全式金生物科技有限公司)，lip3000转染试剂(内含p3000 enhancer)、opti-mem减血清培养基、丙酮酸钠、dmem-h、calcein am(thermofisher)、dii细胞膜荧光探针(meilunbio)，hiv-1p24蛋白快速检测卡、慢病毒滴度(hiv p24)elisa检测试剂(博奥龙)，polybrene(合生基因)、biogeek tm慢病毒浓缩试剂盒(合生基因)，millipore一次性针头滤器0.45μm(millipore)，96孔板、24孔板、6孔板、10cm、t25培养瓶、t75培养瓶、5ml移液管、10ml移液管、25ml移液管(corning-costar)，x-vivotm15 medium(lonza)，ultra-leaf purified anti-mouse cd28、ultra-leaf purified anti-mouse cd3ε(biolegend)，il-2(peprotech)，bd pharmingen
tm
biotin mouse anti-human cd8、percp-cy
tm
5.5mouse anti-human cd8(bd)，慢病毒载体(淼灵生物)，序列合成(通用生物)，gm-csf elisa试剂盒(abcam)。其余常用试剂和材料均为市售可得。
138.实施例1：构建重组质粒
139.1、car-19-1质粒合成：
140.car-19-1序列是由cd19单链可变区、cd8a铰链区、cd8a跨膜区、4-1bb信号、cd3ζ的包浆信号、il-7、ccl17序列构成，所用载体为plvx-ef1a-ires-pgk-puro，由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
141.car-19-1核苷酸序列如下(在本发明中可称为序列1)：
142.atggccctgcccgtgaccgctctgctgctgccactggccctgctgctgcacgccgctagacctgaggtgaagctgcaggagtccggccctggcctggtggctccttcccagtccctgagcgtgacctgtacagtgtccggcgtgtccctgcctgattacggcgtgtcctggatcaggcagcctcccagaaagggcctggagtggctgggcgtgatctggggctccgagacaacctactacaattccgccctgaagtccaggctgacaatcatcaaggacaatagcaagagccaggtgtttctgaagatgaactccctgcagacagacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggctcctacgccatggattactggggccagggcaccagcgtgacagtgtcctccggcggcggcggaagcggaggaggaggatctggcggcggcggttccgatatccagatgacccagacaacaagcagcctgtccgcctccctgggcgacagagtgaccatctcctgcagggcctcccaggacatcagcaagtacctgaactggtaccagcagaagcccgatggcaccgtgaagctgctgatctaccacacctccagactgcactccggcgtgccttccagattttccggctccggcagcggcaccgactacagcctgaccatcagcaacctggagcaggaggacatcgccacctacttttgccagcagggcaataccctgccttacacctttggcggcggcacaaagctggagatcacaagggccgatgccgcccccacagtgagcatctttccccctagctccaacgccaagcccacaacaacccctgcccctagaccccccacacccgctcctaccatcgccagccagcctctgagcctgagacctgaggcctgtaggcccgccgccggaggagctgttcacacaaggggcctggactttgcctgcgacatctacatctgggcccccctggccggcacctgtggagttctgctgctgagcctggtcattaccaagaggggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcctttcatgagacccgtgcagacaacccaggaggaggacggctgcagctgcagattccctgaggaggaggagggcggctgtgagctgagggtgaagttctccaggagcgccgacgcccccgcctaccaacagggacagaatcagctgtacaatgagctgaacctgggcagaagagaggagtacgacgtgctggacaagaggaggggcagggaccctgagatgggcggcaagccccagaggaggaagaatccccaggagggcctgtacaatgaactgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagaggaggagaggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgtccaccgccacaaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagaggaagcggagccaccaatttcagcctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccccggacctatgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatctgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacacggctccggcgaaggcagaggctctttactgacttgtggagacgtggaagagaaccccggtcccatggccccactgaagatgctggccctggtcaccctcctcctgggggcttctctgcagcacatccacgcagctcgagggaccaatgtgggccgggagtgctgcctggagtacttcaagggagccattccccttagaaagctgaagacgtggtaccagacatctgaggactgctccagggatgccatcgtttttgtaactgtgcagggcagggccatctgttcggaccccaacaacaagagagtgaagaatgcagttaaatacctgcaaagccttgagaggtct
143.car-19-1表达的氨基酸序列(在本发明中可称为序列2)：
ser gly gly gly gly ser asp ile gln met thr gln thr thr ser ser leu ser ala ser leu gly asp arg val thr ile ser cys arg ala ser gln asp ile ser lys tyr leu asn trp tyr gln gln lys pro asp gly thr val lys leu leu ile tyr his thr ser arg leu his ser gly val pro ser arg phe ser gly ser gly ser gly thr asp tyr ser leu thr ile ser asn leu glu gln glu asp ile ala thr tyr phe cys gln gln gly asn thr leu pro tyr thr phe gly gly gly thr lys leu glu ile thr arg ala asp ala ala pro thr val ser ile phe pro pro ser ser asn ala lys pro thr thr thr pro ala pro arg pro pro thr pro ala pro thr ile ala ser gln pro leu ser leu arg pro glu ala cys arg pro ala ala gly gly ala val his thr arg gly leu asp phe ala cys asp ile tyr ile trp ala pro leu ala gly thr cys gly val leu leu leu ser leu val ile thr lys arg gly arg lys lys leu leu tyr ile phe lys gln pro phe met arg pro val gln thr thr gln glu glu asp gly cys ser cys arg phe pro glu glu glu glu gly gly cys glu leu arg val lys phe ser arg ser ala asp ala pro ala tyr gln gln gly gln asn gln leu tyr asn glu leu asn leu gly arg arg glu glu tyr asp val leu asp lys arg arg gly arg asp pro glu met gly gly lys pro gln arg arg lys asn pro gln glu gly leu tyr asn glu leu gln lys asp lys met ala glu ala tyr ser glu ile gly met lys gly glu arg arg arg gly lys gly his asp gly leu tyr gln gly leu ser thr ala thr lys asp thr tyr asp ala leu his met gln ala leu pro pro arg
151.3、car-19-3质粒合成：
152.car-19-3序列是由anti-pd-1scfv单链可变区、anti-gm-csf scfv单链可变区序列构成，所用载体为plvx-mcherry-c1，由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
153.car-19-3核苷酸序列如下(在本发明中可称为序列5)：
154.atggccctgcctgtgaccgccctgctgctgccactggccctgctgctccacgccgctagacctcaggtgcagctggtgcagtccggcgtggaggtgaagaagcccggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggcctccggctacacctttacaaattactacatgtactgggtgaggcaggcccccggccagggactggaatggatgggcggcatcaatccctccaatggcggcacaaactttaacgagaagtttaagaacagggtgaccctgaccaccgatagctccaccacaacagcctacatggagctgaagtccctgcagttcgatgataccgccgtgtactactgtgccaggagggactacaggtttgatatgggcttcgattactggggccagggcaccaccgtgaccgtgtcctccggcggaggcggaagcggaggaggaggaagcggcggaggcggtagcgagatcgtgctgacacagagccctgccacactgtccctgtcccctggcgagagagccaccctgagctgcagagcctccaagggcgtgagcacctccggctacagctacctgcactggtaccagcagaagcccggccaggcccccaggctgctgatctacctggcctcctacctggagtccggcgtgcccgctagattctccggctccggcagcggcaccgattttaccctgacaatctccagcctggagcctgaggacttcgccgtgtactattgtcagcactccagggatctgcctctgacctttggcggcggcaccaaggtggagatcaagggctccggcgccacaaactttagcctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccctggcccacaggtgcagctcgtgcagtccggagccgaggtgaagaaacccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctacaccttcaccggctactacatgcactgggtgagacaggcccccggacagggcctggagtggatgggatggatcaatcctaacagcggcggcaccaattacgcccagaagttccagggcagggtgacaatgacaagggatacctccatcagcaccgcctacatggaactgagcaggctgagaagcgacgacacagccgtgtactactgcgtgagaagagataggtttccctactactttgattactggggacagggcaccctggtgaccgtgagctcc
ggcggaggaggctccggaggaggaggtagcggcggaggaggatctgagatcgtgctcacccagtcccccgccaccctgtccgtgtcccctggagagagggccacactgagctgtagagcctcccagagcatcggctccaatctggcctggtaccagcaaaagcctggccaggccccaagggtgctgatctactccacctcctccagggccacaggcatcacagataggtttagcggctccggctccggaaccgatttcaccctgaccatcagcagactggagcccgaggacttcgctgtgtactactgccagcagtttaatagatcccccctgaccttcggcggcggcacaaaggtggagattaag
155.car-19-3表达的氨基酸序列如下(在本发明中可称为序列6)：
156.met ala leu pro val thr ala leu leu leu pro leu ala leu leu leu his ala ala arg pro gln val gln leu val gln ser gly val glu val lys lys pro gly ala ser val lys val ser cys lys ala ser gly tyr thr phe thr asn tyr tyr met tyr trp val arg gln ala pro gly gln gly leu glu trp met gly gly ile asn pro ser asn gly gly thr asn phe asn glu lys phe lys asn arg val thr leu thr thr asp ser ser thr thr thr ala tyr met glu leu lys ser leu gln phe asp asp thr ala val tyr tyr cys ala arg arg asp tyr arg phe asp met gly phe asp tyr trp gly gln gly thr thr val thr val ser ser gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser glu ile val leu thr gln ser pro ala thr leu ser leu ser pro gly glu arg ala thr leu ser cys arg ala ser lys gly val ser thr ser gly tyr ser tyr leu his trp tyr gln gln lys pro gly gln ala pro arg leu leu ile tyr leu ala ser tyr leu glu ser gly val pro ala arg phe ser gly ser gly ser gly thr asp phe thr leu thr ile ser ser leu glu pro glu asp phe ala val tyr tyr cys gln his ser arg asp leu pro leu thr phe gly gly gly thr lys val glu ile lys gly ser gly ala thr asn phe ser leu leu lys gln ala gly asp val glu glu asn pro gly pro gln val gln leu val gln ser gly ala glu val lys lys pro gly ala ser val lys val ser cys lys ala ser gly tyr thr phe thr gly tyr tyr met his trp val arg gln ala pro gly gln gly leu glu trp met gly trp ile asn pro asn ser gly gly thr asn tyr ala gln lys phe gln gly arg val thr met thr arg asp thr ser ile ser thr ala tyr met glu leu ser arg leu arg ser asp asp thr ala val tyr tyr cys val arg arg asp arg phe pro tyr tyr phe asp tyr trp gly gln gly thr leu val thr val ser ser gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser glu ile val leu thr gln ser pro ala thr leu ser val ser pro gly glu arg ala thr leu ser cys arg ala ser gln ser ile gly ser asn leu ala trp tyr gln gln lys pro gly gln ala pro arg val leu ile tyr ser thr ser ser arg ala thr gly ile thr asp arg phe ser gly ser gly ser gly thr asp phe thr leu thr ile ser arg leu glu pro glu asp phe ala val tyr tyr cys gln gln phe asn arg ser pro leu thr phe gly gly gly thr lys val glu ile lys
157.实施例2：病毒包装
158.使用invitrogen lipofectamine 3000转染试剂(lip3000)进行病毒包装，试验操作基本上参照该转染试剂说明书进行。
159.1、293t培养基配置
160.培养基为dmem-h，添加10％fbs。(dmem-h为添加4.5g/l葡萄糖、110mg/l丙酮酸钠
的dmem培养基)。
161.2、慢病毒包装培养基配置：
162.培养基为opti-memi，添加1％的glutamax、添加丙酮酸钠(1mm)、5％fbs。(opti-memi培养基为gibco产品)。
163.3、慢病毒包装：
164.a)将293t细胞以7x106个细胞/孔的密度接种于含12ml的慢病毒包装培养基的10cm培养皿中，置于37℃、5％co2条件下孵育细胞过夜。
165.b)至293t细胞密度达95％时进行转染，转染方法为：
166.a液配置：首先将opti-memi减血清培养基恢复至室温，使用1.5ml的opti-memi与41μl的lip3000在10cm皿中混匀，得a液，备用；
167.b液配置：将1.5ml的opti-memi、35μl的p3000 enhancer、12μg质粒混合物混合，得b液，备用；(在转导类型为car-1＝(car-19-1) (car-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g：pspax2：(car-19-1/car-19-3)＝1:3:(4/3)，在转导类型为car-2＝(car-19-2) (car-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g：pspax2：(car-19-2/car-19-3)＝1:3:(3.5/3)，在转导类型为car-3＝(car-19-2)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g:pspax2:car-19-2＝1:3:3.5，在转导类型为car-4＝(car-19-1)的情况下质粒混合物的质粒比为pmd2.g：pspax2：car-19-1＝1:3:4，pmd2.g、pspax2、plvx-ef1a-ires-pgk-puro和plvx-mcherry-c1均为淼灵生物公司产品)
168.将a液转移至b液中充分混匀，室温孵育15min，得a液-b液混合液；
169.步骤a)孵育过夜的培养皿每皿去除6ml的慢病毒包装培养基，接着向每个皿中加入6ml的a液-b液混合液，轻混使其分布均匀后置于37℃、5％co2条件下孵育进行转染；转染6小时后更换293t培养基继续孵育。
170.c)至转染24小时后，收集12ml细胞上清液，并加入提前预热的12ml的293t培养基，继续于37℃、5％co2条件下孵育进行转染。
171.d)至转染54小时后第二次收集细胞上清液，与首次收集上清液混合，得细胞上清液。
172.4、慢病毒浓缩：
173.a)在室温下，将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀物，再使用0.45μm滤器过滤上清，得病毒上清液。
174.b)按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合，4℃放置2h。
175.c)将孵育好的混合液于4℃以4000g离心30min，离心管底有米白色沉淀。
176.d)小心移去上清，加入适量体积的dmem重悬沉淀，为慢病毒浓缩液，(并按照实验需求)分装病毒，测定病毒滴度，-80℃保存。
177.经本发明方法测定，本实施例所得病毒的滴度为：5.74x106tu/ml。
178.5、病毒滴度测试的方法：
179.本发明可按如下方法测定病毒滴度。
180.a)将ht1080细胞以7000个细胞/孔的密度接种于含有100μl培养基的96孔板中，培养4-5小时后进行转导，ht1080细胞培养基为dmem-h，其中添加10％fbs、1％glutamax、10μg/ml polybrene、200nm丙酮酸钠。
181.b)稀释病毒液：首先将15ml新鲜培养基与12μl的10mg/ml polybrene试剂混合(终浓度为8μg/ml)，涡旋混匀作为稀释液。接着，对每个病毒样本，将上一步制备的135μl培养基即稀释液加入96孔圆底培养板的16个孔中，采用4孔x4孔的模式。将15μl浓缩的慢病毒悬液加至第一排的各孔中，总体积150μl，依次按照1:10稀释剩余三排细胞。
182.c)转导细胞：去除ht1080细胞中的培养基，将100μl制备好的稀释液转移至每个相应孔中，室温下以2000rpm离心培养板30分钟，孵育培养板过夜。
183.d)去除包含病毒上清液的培养基，替换成新鲜的ht1080培养基(不含polybrene试剂)，孵育三天后使用流式细胞仪分析gfp阳性细胞的百分比。
184.e)滴度(tu/ml)计算公式(根据gfp阳性细胞的百分比确定适当的稀释因子)如下：
185.滴度＝(f
×
c/v)
×
d，其中f＝gfp阳性细胞的百分比，c＝转导时的每孔细胞数，v＝菌液体积(ml)，d＝慢病毒稀释因子，选择合适的慢病毒稀释因子进行后续转导实验。
186.实施例3：t细胞制备
187.1、t细胞制备
188.a)向含有1ml全血的ep管内添加抗体(20μl，cd8 biotin antibody，生物素标记cd8抗体，bd产品，货号555365)，在室温下用旋转混悬仪混合30分钟。实验用全血取自8名健康男性志愿者(26～33岁，体重58～71kg)，分别进行t细胞的制备。
189.b)再向上述1ml全血内添加150μl微泡(streptavidin，链霉亲和素标记，thermogenesis产品)，在室温下用旋转混悬仪混合20分钟，将微泡和被抗体标记的细胞结合。
190.c)以400xg的转速将细胞离心5分钟。
191.d)用200μl移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2ml的ep管内。用500μl微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡，并入ep管内，室温下孵育30min。(上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/l、磷酸二氢钾200mg/l、氯化钠8000mg/l、七水磷酸氢二钠2160mg/l、1％人血清白蛋白、2mm edta)。
192.e)用400w功率超声(超声2次，每次1秒)破泡以回收靶细胞。
193.f)以1000rpm离心10min，收集细胞沉淀，制得t细胞，备用。
194.2、流式细胞仪鉴定cd8

t细胞
195.a)pbs清洗分选后的t细胞，并使用pbs稀释t细胞浓度在1.2～1.4x106个细胞/ml范围内。
196.b)取100μl细胞悬液并加入2μl的anti-cd8(percp-cy
tm
5.5mouse anti-human cd8)，并混匀。
197.c)4℃孵育20min，pbs清洗，使用200μl pbs重悬沉淀后上机检测，鉴定cd8

t细胞。
198.补充进行本段落所述如下实施例操作。实施例3a：参照实施例3之“1、t细胞制备”，不同的仅是其中步骤d)所用微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/l、磷酸二氢钾200mg/l、氯化钠8000mg/l、七水磷酸氢二钠2160mg/l、1％人血清白蛋白(has)、2mm edta、酒石酸钠25mg/l、脯氨酸120mg/l，所得t细胞同法鉴定cd8

t细胞。实施例3b：参照实施例3之“1、t细胞制备”，不同的仅是其中步骤d)所用微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/l、磷酸二氢钾200mg/l、氯化钠8000mg/l、七水磷酸氢二钠2160mg/l、1％人血清白蛋白(has)、2mm edta、酒石酸钠25mg/l，所得t细胞同法鉴定cd8

t细胞。实施例
cell receptor-engineered t cells to treat solid tumors：t cell processing toward optimal t cell fitness.hum gene ther methods.2014dec；25(6)：345-57.doi：10.1089/hgtb.2014.051.)进行。简述如下：
204.将实施例3收集的cd8

t细胞以5x105个细胞/ml接种于24孔板中，使用激活培养基(x-vivotm15medium，内含30ng/ml anti-cd3和20ng/ml cd28)刺激24-48小时，接着加入实施例2所得慢病毒浓缩液(moi＝10)以及转导培养基(x-vivotm15 medium，内含200u/ml il-2和5μg/mlpolybrene)进行病毒转导，24-48小时后换成维持培养基(x-vivotm15medium，内含200u/ml il-2)；扩增至6-8天时，收获car-t细胞。另外进行car-t细胞检测及后续杀伤实验。
205.2、car-t细胞转染效率检测：
206.car-19-1和car-19-2为绿色荧光标记，car-19-3为红色荧光标记，利用流式细胞仪fitc通道及pe通道对转染效率进行检测，结果如下表所示。
207.表：不同种类car-t细胞转导效率
208.转导类型转导效率car-1＝(car-19-1) (car-19-3)26％car-2＝(car-19-2) (car-19-3)32％car-3＝(car-19-2)48％car-4＝(car-19-1)41％
209.3、elisa验证car-t细胞是否分泌anti-pd-1、gm-csf、il-7和ccl-17：
210.a)留取car-1、car-2、car-3、car-4细胞及培养上清至无菌离心管中(效靶比为5∶1组)，在4℃条件下1000
×
g离心10min，然后将上清等量分装于小ep管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存)，避免反复冻融，细胞沉淀调整(2-4)x106cells每管，每管样本使用1ml的trizol裂解液10min(4℃)后放入-80保存备用。
211.b)elisa验证car-t细胞是否分泌anti-pd-1、gm-csf、il-7和ccl-17，根据abcam相应elisa kit说明书进行操作(anti-pd-1检测现检现包被：用双抗体夹心elisa方法，使用人源的pd-1重组蛋白包被酶标板，带hrp标记的山羊抗人igg(h&l)的二抗检测，以商品化的pd-1抗体作为标准品，待测样本5倍稀释后定量检测基因修饰后的t细胞分泌pd-1抗体的表达量)。
212.方法简述如下：
213.a)根据说明书准备样本及标准品；
214.b)加50μl标准品及样本到孔板中；
215.c)加50μl antibody cocktai到每孔；
216.d)室温孵育60min；
217.e)每次使用350μl 1xwash buffer清洗三次；
218.f)每孔加入100μl tmb development solutin，孵育10min；
219.g)每孔加入100μl stop solution后使用酶标仪在450nm od值读数；
220.h)根据说明书要求计算anti-pd-1、gm-csf、il-7、ccl-17浓度，结果如下表所示。
221.表：不同car-t细胞的anti-pd-1、gm-csf、il-7、ccl-17分泌量
[0222] car-1car-2car-3car-4t(control)
anti-pd-18800pg/ml9200pg/m115pg/ml30pg/ml40pg/mlgm-csf175pg/ml190pg/m1800pg/ml860pg/m1720pg/mlil-71380pg/ml110pg/ml110pg/ml1450pg/ml105pg/mlccl-171200pg/ml110pg/ml120pg/ml1100pg/ml120pg/ml
[0223]
4、car-t细胞杀伤实验：
[0224]
a)以人急性b淋巴细胞白血病细胞系raji为阳性靶细胞，效应细胞分别为：
[0225]
car-1＝(car-19-1) (car-19-3)；
[0226]
car-2＝(car-19-2) (car-19-3)；
[0227]
car-3＝(car-19-2)；
[0228]
car-4＝(car-19-1)。
[0229]
以2x104细胞/ml的靶细胞浓度(经1μm的calcein-am预染)接种于96孔板，100μl/孔，按照效靶比(5：1)加入各组效应细胞，设3个复孔，于37℃、5％co2共孵育10小时后进行离心(1000rpm/min，5min)，检测；设置最大释放孔加入裂解液(2.5％tritonx-100)，自发释放孔加入pbs，处理后置于酶标仪扫描读取荧光值。根据以下公示计算各组效应细胞的细胞毒性：
[0230]
特异性裂解百分比＝(实验组荧光值-自发释放组荧光值)/(最大释放组荧光值-自发释放组荧光值)x100％。
[0231]
结果如下表所示。
[0232]
表：不同种类car-t细胞杀伤效率(特异性裂解百分比)
[0233][0234]
根据上述结果可见，本发明制备得到的4种car-t细胞均呈现优良的细胞杀伤效果，表明本发明方法制备得到的car-t细胞可用于肿瘤的治疗。
[0235]
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。