一种碱蓬耐盐性相关编码基因及其应用的制作方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种碱蓬耐盐性相关编码基因及其应用。


背景技术：

2.自然界中，高温、高盐、低温、水涝、干旱以及病虫草害等逆境会影响植物的形态结构、生理生化过程进而使其正常生长发育停滞、品质下降、产量降低。其中干旱与盐碱是危害植物生长，对全球农作物产量影响程度最高的胁迫因素。农作物种植在中等盐渍土上时会减产约95％，如黄淮海平原各地由于盐碱导致的减产平均约为25％，严重的甚至达到50％。
3.土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题，据统计全球盐碱土约有10亿公顷，占世界陆地面积近7.6％。我国是一个发展中的农业大国，全国盐碱土约有0.2亿多公顷占全国耕地面积的1/3。盐分胁迫能显著的抑制植物的生长，甚至导致植物的死亡。在长期的进化过程中，不同植物形成了不同的机制来适应盐分的胁迫，同时其抗盐能力也各不相同。大多数农作物都对盐分非常敏感，而盐生植物虽然能在高盐条件下生存，但它们的经济价值往往非常有限，提高作物的抗盐能力已经成为我国农业生产和科研中的重要内容。
4.植物对盐分的抗性是一个多基因控制的复杂性状。盐分对植物的影响涉及到植物体内的各个方面和代谢过程。包括离子毒害，渗透胁迫和氧化胁迫以及光合作用。因此，对抗盐、耐盐相关基因及其蛋白的研究具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术中存在的技术缺陷，发明一种碱蓬耐盐性相关编码基因及其应用。
6.为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
7.一种碱蓬耐盐性相关编码基因，碱蓬耐盐性相关编码基因名称为sgsr2，其dna序列如seq id no.1所示。
8.进一步地：碱蓬耐盐性相关基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
9.进一步地：将seq id no.1所示的碱蓬耐盐性相关编码基因sgsr2构建重组表达载体，经过转基因导入植物中，获得转基因植物。
10.进一步地：重组表达载体为pbi121-sgsr2载体。
11.进一步地：植物为拟南芥。
12.进一步地：碱蓬耐盐性相关编码基因sgsr2在拟南芥中过量表达，表现为耐盐。
13.本发明利用基因工程技术构建pbi121-sgsr2过量表达载体，通过转基因导入植物中，使其在植物中过量表达，植物表现为耐盐。将sgsr2基因构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细
胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，使其具有抗性的抗生素标记物(卡那霉素)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如:水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、拟南芥、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明sgsr2基因的表达载体可通过使用直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
14.其中，转基因植物理解为不仅包含将基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代；对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中；转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
15.本发明的有益效果为：
16.本发明所提供的碱蓬耐盐性相关编码基因，名称为sgsr2，来源于藜科碱蓬属碱蓬(suaedaglauca(bunge)bunge)。本发明利用转录组测序数据，从碱蓬cdna中克隆该基因，并且发现通过转基因技术将其导入植株后，可明显改善转基因植株的耐盐性，而且这些性状可稳定遗传。
附图说明
17.图1为本发明实施例提供的含有碱蓬耐盐性相关编码基因sgsr2的植物表达载体示意图；
18.图2为本发明实施例提供的含有碱蓬耐盐性相关编码基因sgsr2的拟南芥与野生型种子在盐胁迫下种子发芽率比较分析图。
具体实施方式
19.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
20.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
21.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
22.实施例
23.1.全长编码基因的克隆
24.取盐处理后的碱蓬叶片100mg，用植物rna提取试剂盒(购自天根生物)提取总rna。用反转录试剂盒(toyobo公司)对总rna进行反转录，合成cdna第一条链。根据转录组测序结果设计sgsr2全长特异性引物(序列如seq id no:3所示)，pfu酶(transgen biotech公司)进行pcr扩增。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并割胶回收，axyprep dna凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收目的片段连接到peasy-blunt载体(transgen biotech公司)上。连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，iptg和x-gal蓝白斑筛选，挑取白斑接种于5ml lb(含50mg/l氨苄青霉素)培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜。pcr检测阳性克隆送至上海英俊公司测序，所得dna序列如seq id no:1所示；碱蓬耐盐性相关基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
25.2.sgsr2基因的植物表达载体构建
26.将含sgsr2的peasy-blunt质粒和pbi121空载体分别双酶切(saci内切酶 swai内切酶)。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，使用dna凝胶回收试剂盒回收目的条带和pbi121载体片段。然后用t4-dna连接酶将两dna回收片段在室温条件下连接过夜。利用冻融法将重组质粒转入大肠杆菌dh5α中，涂布lb平板(含50mg/l卡那霉素)，37℃培养12-16小时，挑单菌落活化菌液、抽提质粒，经saci和swai双酶切验证后送测序公司测序。测序验证正确后，提取质粒。sgsr2的植物表达载体如图1所示。
27.3.pbi121-sgsr2表达载体转化农杆菌
28.利用冻融法将pbi121-sgsr2转化农杆菌eha105，涂布lb平板(含和50mg/l卡那霉素)，28℃条件下培养形成菌落，挑单菌落活化菌液、抽提质粒、双酶切验证。
29.4.过表达sgsr2的转基因拟南芥植株的获得和筛选
30.将实施3中的含pbi121-sgsr2表达载体的农杆菌以1％的接种量接种于100ml lb液体培养基中(内含卡那霉素50mg/l)，28℃振荡培养至对数生长期(od600＝0.5)。无菌状态下，将培养好的菌液经过4000rpm(4℃)离心10分钟，弃去上清。用20ml的ms液体培养基再次重悬菌体沉淀，然后冰上放置，准备浸染拟南芥花序。利用花序浸染法将碱蓬sgsr2基因转入拟南芥。t0代转基因拟南芥种子在含有筛选剂(卡那霉素50mg/l)的ms培养基上进行筛选，选取抗性苗移栽，pcr检测为阳性的转基因苗温室培养收获t1代种子。t1代种子再次播种筛选获得t2转sgsr2基因的拟南芥种子。
31.5.过表达sgsr2的转基因拟南芥t2代种子的耐盐实验
32.过表达sgsr2的转基因拟南芥t2代种子和野生型对照(ck)分别播种于ms固体培养基和含150mmol/lnacl的ms固体培养基上进行对照组和盐胁迫处理。发现5个转基因株系和野生型对照在ms固体培养基发芽率都接近100％，没有差异，而在盐胁迫下5个转基因株系的发芽率都要显著高于对照，表现出明显的芽期耐盐性。含有碱蓬耐盐性相关编码基因sgsr2的转基因拟南芥与野生型种子在盐胁迫下种子发芽率比较分析如图2所示。这说明sgsr2能提高植物耐盐性。
33.于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
34.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。