一种防治炭疽菌属病原菌的生防菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种防治炭疽菌属病原菌的生防菌及其应用。


背景技术：

2.炭疽菌属colletotrichum真菌，属于一类全球分布的植物病原真菌。1790年，tode初次观察到该属真菌以产生分生孢子器子实体为特征，corda于1831年建立炭疽菌属。炭疽菌性喜高温高湿，该属病害在热带、亚热带地区发生普遍，可引起多种植物根、茎、叶、花、果实炭疽病。该属真菌的寄主范围广，从裸子到被子植物，从单子叶到双子叶植物均被其寄生。该属病原真菌常危害林木、果树、蔬菜、花卉、药用植物和大田作物的根、茎、叶、花、果实和幼苗。农作物上草莓、可可、芒果、香蕉、木瓜、柑橘、苹果、梨、葡萄、辣椒、豌豆、大豆、玉米和高粱等均有炭疽病的发生，导致植株枯萎、果实腐烂、叶片病斑等症状，造成严重经济损失。基于其科学和经济的重要性，炭疽菌属病原菌被列为全球第八大植物病原真菌。
3.炭疽属病原真菌属于半活体营养型寄生微生物，在侵入寄主植物后期，分生孢子萌发产生附着胞，附着胞产生侵入钉，侵入钉侵入寄主细胞，在细胞中首先产生初生菌丝，初生菌丝入侵相邻其他植物组织细胞，临近细胞的初生菌丝产生次生菌丝，并在植物组织细胞内蔓延。炭疽菌侵染植物组织的过程中，产生成分较为复杂的植物毒素，该毒素在病原菌侵染过程中，可改变寄主植物组织细胞膜的通透性，有利于病原菌的侵入。另外，炭疽菌还会分泌果胶裂解酶、天冬氨酰蛋白酶、谷氨酸脱氢酶等一系列与致病相关的酶类，产生氨使环境ph值升高，并激发与致病相关的基因。随着侵染菌丝的蔓延，最终杀死植物，营死体营养寄生
6.。分生孢子产生的附着胞附着力和抗性较强，对干燥、高温、紫外线以及寄主组织表皮微生物的拮抗作用等逆境条件都具有较强的抗逆性。我国大部分地区处在热带、亚热带和温带，作物炭疽病时有爆发。尤其是热带、亚热带谷类、水果、蔬菜等多种作物采收前或采收后炭疽病发生严重，不仅影响农产品产量和外观品质，同时导致价格下降，减少种植者的收入。
4.农作物炭疽病由于其寄主繁多、发病率高、破坏性大和传播迅速，给农业生产带来严重的经济损失，而且还有不断扩大的趋势，对农作物产业的健康发展带来严重挑战。使用传统的化学杀菌剂会造成严重的环境污染，威胁食品安全，果实采后病害的生物防治被认为是一种很有前景的防治策略。
5.在生防微生物中，放线菌可产多种抗生素、胞外酶等活性物质，其孢子抗逆性强，对病害防治方面具有较好的应用前景。且研究表明，抗生素主要由放线菌产生，而其中90％又由链霉菌产生，因此利用生物防治(尤其放线菌)作物炭疽病已成为研究的主要方向。链霉菌作为放线菌中的重要菌种在自然界广泛分布，具有广谱抗菌活性，姚锦爱等发现酒红链霉菌s. vinaceus svfj-07对建兰炭疽病菌胶孢炭疽菌具有良好的拮抗作用。张月凤筛选出2株对香蕉炭疽病有较强拮抗效果的链霉菌cy-14和s-50，其发酵液对香蕉炭疽病的防效分别为49.15％、 70.53％，显著优于对照药剂1000mg/l百菌清的防效。李娟等发现淡紫灰链霉菌s.lavendulaedtj-24对草莓炭疽病菌胶孢炭疽菌具有良好的抑菌作用。姚锦爱
等筛选出一株对草莓炭疽病菌胶孢炭疽菌具有显著拮抗效果的链霉菌zzsp-7，对草莓“甜查理”和“红颜”品种上胶孢炭疽菌的盆栽防效达78.64％和82.81％，与施用1500倍25％吡唑醚菌酯防治效果无显著差异。说明在防治香蕉、草莓等炭疽菌病方面，利用微生物进行防治的效果优于或等同于化学药剂的防效，但无化学药剂对环境的毒副作用。xu bo等分离到一株链霉菌n2，其发酵代谢产物对炭疽病、枯萎病、纹枯病、稻瘟病等病原真菌皆具有较好的抑菌作用，主要是通过分解植物病原真菌的细胞器从而达到抑菌的效果。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种防治炭疽菌属病原菌的生防菌，具有广谱抑菌活性，对多种病菌具有良好的拮抗作用，具有广阔的发展空间和应用前景。
7.本发明的第一个方面是提供一种生防菌，所述生防菌为链霉菌，命名为streptomyceskronopolitis 6g-oa-10，在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为gdmcc no： 61983。
8.本发明的第二个方面是提供如本发明第一个方面所述的生防菌在拮抗草莓炭疽病菌、和/ 或辣椒炭疽病菌、和/或油梨炭疽病菌、和/或香蕉炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或板栗疫病菌、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或番茄枯萎病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或芒果链格孢霉叶斑病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或香蕉长形斑病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或油梨蒂腐病菌中的应用。
9.本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述的生防菌在防治草莓炭疽病菌、和/ 或辣椒炭疽病菌、和/或油梨炭疽病菌、和/或香蕉炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或板栗疫病菌、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或番茄枯萎病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或芒果链格孢霉叶斑病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或香蕉长形斑病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或油梨蒂腐病菌所致病害中的应用。
10.本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的生防菌的发酵液。
11.本发明的第五个方面是提供如本发明第四个方面所述的发酵液在拮抗草莓炭疽病菌、和/ 或辣椒炭疽病菌、和/或油梨炭疽病菌、和/或香蕉炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或板栗疫病菌、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或番茄枯萎病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或芒果链格孢霉叶斑病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或香蕉长形斑病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或油梨蒂腐病菌中的应用。
12.本发明的第六个方面是提供如本发明第四个方面所述的发酵液在防治草莓炭疽病菌、和/ 或辣椒炭疽病菌、和/或油梨炭疽病菌、和/或香蕉炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或板栗疫病菌、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或番茄枯萎病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或芒果链格孢霉叶斑病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或香蕉长形斑病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或油梨蒂腐病菌所致病害中的应用。
13.本发明的第七个方面是提供一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的生防菌。
14.本发明的链霉菌(菌株6g-oa-10)生长ph范围为4.0-9.0，不能生长在nacl含量大于 5％的培养基上，具有广谱抑菌活性，对草莓炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、油梨炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、胶孢炭疽病菌、板栗疫病菌、香蕉枯萎病菌1号生理小种、香蕉枯萎病菌4号生理小种、番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、小麦赤霉病菌、香蕉长形斑病菌、水稻稻瘟病菌、香蕉大灰斑病菌、油梨蒂腐病菌等具有良好的拮抗作用，抑菌率均达到了 48％以上，尤其是对草莓炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、油梨炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、板栗疫病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌，抑菌率都达到了70％以上，是炭疽病害防治的潜在生物制剂，具有广阔的发展空间，具有很好的开发应用前景。
附图说明
15.图1为菌株6g-oa-10在不同培养基上的菌落形态。
16.图2为菌株6g-oa-10的生理生化特征。
17.图3为菌株6g-oa-10的基因组dna电泳结果。
18.图4为菌株6g-oa-10基因组圈图。
19.图5为基于16s rdna序列构建的菌株6g-oa-10与相关菌株的系统发育树。。
20.图6为菌株6g-oa-10广谱抑菌活性检测结果。
具体实施方式
21.下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
22.本发明提供了一种防治炭疽菌属病原菌的生防菌，所述生防菌为链霉菌，所述链霉菌命名为streptomyces kronopolitis 6g-oa-10(下文中又称为：菌株6g-oa-10)，在在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为gdmcc no：61983，保藏日期为2021年10月27日，保藏地址：中国广州。
23.1实验材料
24.1.1菌株
25.菌株6g-oa-10分离自美叶车前蕨(antrophyum callifolium)根部，培养于isp2培养基上。
26.1.2供试病原菌
27.表1植物病原菌
[0028][0029][0030]
1.3供试仪器设备
[0031]
表2仪器设备
[0032][0033]
1.4供试培养基
[0034]
供试培养基主要有形态学观察培养基(表3)和生理生化特性培养基(表4)等。
[0035]
表3培养特征观察培养基及其配方
[0036][0037][0038]
表4生理生化特性观察所需的培养基
[0039][0040][0041]
2拮抗放线菌的分离鉴定
[0042]
2.1菌株分离
[0043]
菌株6g-oa-10分离自美叶车前蕨(antrophyum callifolium)根部。
[0044]
采集美叶车前蕨(antrophyum callifolium)，轻轻把附着在植物根表的土壤去除，放入无菌塑料袋中，样品采集后置于4℃保存，应尽快进行内生放线菌的分离。
[0045]
用自来水轻轻冲洗样品，将表面杂质冲洗干净，然后再用无菌水清洗一遍，利用滤纸吸干其表面水分。称取1g药用植物，依次用70％乙醇浸泡5min；0.9％naclo浸泡10min；10％ nahco3漂洗l0 min；最后用无菌水冲洗5次，滤纸上干燥。取200μl最后一次清洗的无菌水，均匀涂布于分离培养基上，作为表面消毒效果的对照，于28℃培养30d，观察有无菌落长出。采用植物匀浆涂布法，把表面消毒过的样品进行研磨，加入2ml预培养液涡旋振荡，30℃下 250rpm振荡过夜，静置，取匀浆200μl均匀的涂布于分离培养基上，于28℃培养1-3周，试验设3次重复。根据放线菌菌落的颜色和形态不同以及生长时间的差异，采用培养基划线分离法挑取明显分开的单菌落，在ye培养基上进行放线菌的纯化。记录纯化好的放线菌菌落形态后，进行菌种保藏。
[0046]
2.2菌株形态及培养特征
[0047]
于isp 2、isp 3、isp 4、isp 5、isp 6、isp 7、pda和高氏ⅰ号培养基上接种筛选出的拮抗放线菌(具体方法参见“徐丽华,李文均,刘志恒,等.放线菌系统学——原理、方法及实践 [m].北京:科学出版社,2007,40-45”)，28℃培养7d。观察单菌落特征、基内菌丝和气生菌丝颜色以及有无可溶性色素。
滴二苯胺试剂，若呈蓝色，则还原作用为阴性；若不为蓝色，则仍按阳性对待。
[0066]
⑦
单一氮源利用实验
[0067]
试验所选用的氮源：组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、草氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸、苯基丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、精氨酸、缬氨酸、四水合钼酸铵、乙酸铵、硝酸铵、硫酸铵，按0.5％的浓度加入基础培养基中。接入菌种，28℃下恒温培养7～14d，以不添加任何氮源的基础培养基接种的菌株作为空白对照，观察菌株的生长情况。若能生长，则表明该菌种能利用这种氮源；若不能生长，则表明该菌种不能利用此氮源。
[0068]
⑧
ph耐受实验
[0069]
在ph值为4、5、6、7、8、9、10的液体培养基内分别接种待测菌株，保证其他的培养条件一致，在28℃下培养，每隔一周都进行一次观察，一直观察到四周为止。每次观察并记录菌株生长情况，以确定菌株生长的最适ph。
[0070]
⑨
盐耐受性实验
[0071]
将待测菌株分别接种在不同浓度nacl(1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％)培养基上，培养基的其它营养成分均相同，在28℃条件下培养，7天为一个观察周期，观察4 周，记录其是否能生长，以确定该菌株能耐受nacl的上、下限浓度。
[0072]
生理生化检测试验结果见表6、表7和图2。放线菌6g-oa-10菌株的ph值生长范围为 4.0～9.0，最适生长ph值为7.0，最适的生长盐浓度小于或等于5％，对硝酸盐的还原试验、脲酶试验和酯酶试验(吐温40)皆为阳性，能较好地利用蔗糖、山梨糖、甘露糖和蛋氨酸、甘氨酸等碳氮源。
[0073]
表6生理生化特性结果
[0074][0075]
注：在检测项目中，“ ”表示阳性，
“‑”
表示阴性。
[0076]
表7碳氮源的利用情况
[0077][0078]
注：“ ”表示在碳源或氮源中生长良好，“ ”表示在碳源或氮源中生长一般，“ ”表示在碳源或氮源中生长微弱，
“‑”
表示在碳源或氮源中不生长。
[0079]
2.4分子生物学鉴定
[0080]
(1)总基因组的提取
[0081]
将菌株活化于ye平板，于28℃培养3d，挑取单菌落接种至含100ml的ye液体培养基的三角瓶(250ml)中，28℃，150rpm培养5d后收集菌体，进行基因组测序。结果如图3所示，基因组dna的目的条带较清晰，说明基因组dna的纯度较高，可以用作pcr反应的模板。
[0082]
(2)基因组的测序、组装、组分分析
[0083]
利用二代测序仪进行基因组测序和拼接(上海美吉生物制药科技有限公司)。基因组测序于illumina hiseq
×
10平台上进行，采用paired-end技术构建小片段基因组文库，
对质检合格的dna样品构建插入片段为400bp的片段，通过illumina hiseq
×
10平台对基因组进行测序。利用短序列组装软件soapdenovo2(http://soap.genomics.org.cn/)对二代测序后的优化序列进行多个kmer参数的拼接，得到最优的contigs组装结果，然后把reads比对到contig上，根据 reads的paired-end和overlap关系，对组装结果进行局部组装和优化，形成scaffolds(张博阳, 朱天辉,韩珊,等.桑氏链霉菌kj40全基因组测序及分析[j].微生物学通报,2018,45(4): 805-818)。
[0084]
获得基因组数据之后，应用相关软件对基因组进行结构分析(谢露,郭丽琼,林俊芳,等. 植物乳杆菌α-葡萄糖基转移酶基因挖掘及表达研究[j].现代食品科技,2017,33(2):94-98.)。采用glimmer(version 3.02)软件(http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml)对基因组中的编码序列(cds)进行预测。使用tandem repeats finder软件搜寻dna序列中的串联重复序列。利用trnascan-se v2.0软件(http://trna.ucsc.edu/software/)对基因组中包含的trna进行预测，可以获得每个样本基因组中trna的核苷酸序列信息，反密码子信息及二级结构信息。利用barrnap软件(https://github.com/tseemann/barrnap)对基因组中包含的rrna进行预测，获得每个样本基因组中所有rrna的种类、位置、序列信息。
[0085]
菌株6g-oa-10基因组最后得到107个scaffolds和208个contigs，g c％含量平均为 72.44％，n50和n90的长度分别为112,270bp和22,051bp，n碱基含量为0.043％。基因组预测到6893个cds基因，总长度为6,519,492bp，平均长度为945.81bp，占基因组全长的 85.78％。串联重复序列504个，总长为85,971bp，占基因组全长的1.32％。基因组圈图见图4，包含了6,519,492bp的序列，含有69个trna和3个rrna。
[0086]
(3)系统发育树构建
[0087]
将16srdna序列在ezbiocloud数据库中进行同源性比对后，采用mega软件以邻接法构建系统发育树。在ncbi数据库中下载同源性最高的菌株基因组，利用ezbiocloud数据库的比对工具ani calculator进行菌株5-6计算菌株之间的全基因组的平均核苷酸一致性(ani) (richter m,rossell
ó‑mó
ra r.shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition[j].proc natl acad sci usa,2009,106:19126-19131.)。
[0088]
将所得到的菌株16s rdna序列在ezbiocloud数据库中进行同源性的比对，应用mega 软件的相关功能构建邻接距离矩阵法系统发育关系进化树(xu b,chen w,wu zm,et al.anovel and effective streptomyces sp.n2 against various phytopathogenic fungi[j].appl biochembiotechnol,2015,177(6):1338-1347)。结果显示，菌株6g-oa-10与streptomyces kronopolitisneau-ml8序列在同一节点进行聚集，并且具有较近的遗传距离(图5)，并将生理生化等方面与其模式菌进行对比后，可将6g-oa-10菌株归属于链霉菌属。
[0089]
菌株6g-oa-10与菌株同源性最近的streptomyces kronopolitis neau-ml8基因组对比，其 ani值为97.80％(表8)。根据全基因组ani值》96％作为同一菌种判定的依据(richter m, rossell
ó‑mó
ra r.shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition[j].procnatl acad sci usa,2009,106:19126-19131.)，表明菌株6g-oa-10为streptomyces kronopolitis。
[0090]
表8平均核苷酸一致性(ani)对比结果
[0091][0092]
3皿内抗菌谱的测定
[0093]
采用平板对峙培养法(孙建波,王宇光,李伟，等.产几丁质酶香蕉枯萎病拮抗菌的筛选、鉴定及抑菌作用[j].果树学报,2010,27(3):427-430)测定菌株6g-oa-10的拮抗活性。使用直径为5mm的打孔器取长势一致的病原菌的菌饼，接于每个pda平板的中间，分别在距病原菌菌落2.5cm处接种拮抗菌，置于28℃的培养箱中倒置培养5-7d。以只接种供试病原菌作为对照，每个处理三个重复，于28℃下倒置培养7d。采用十字交叉法测量病原真菌菌落的直径，并按照下列公式计算菌丝生长的抑制率。
[0094]
菌落直径(mm)＝测量菌落直径平均值－5.0
[0095][0096]
通过测定菌株6g-oa-10对16种植物真菌病原菌的抑菌活性，发现其对炭疽菌属(草莓炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、油梨炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、胶孢炭疽病菌)、隐从赤壳属(板栗疫病菌)、尖孢镰刀菌属(香蕉枯萎病菌1号生理小种、香蕉枯萎病菌4号生理小种、番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌)、链格孢属(芒果链格孢霉叶斑病菌)、镰孢属(小麦赤霉病菌)、假弯孢属(香蕉长形斑病菌)、梨形孢属(水稻稻瘟病菌)、新月弯孢属(香蕉大灰斑病菌)、可可球二孢属(油梨蒂腐病菌)等9个属的16种供试真菌均有拮抗作用(图6)，抑菌率均达到了48％以上，尤其是对草莓炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、油梨炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、板栗疫病菌菌、芒果链格孢霉叶斑病菌，抑菌率都达到了70％以上，分别为85.22％、79.29％、 78.35％、75.88％、74.12％、72.89％。由此可见，菌株6g-oa-10具有广谱抑菌活性，且对炭疽病菌具有较好抑制活性。因此，链霉菌6g-oa-10菌株是炭疽病害防治的潜在生物制剂。
[0097]
表9菌株6g-oa-10的抑菌试验结果
[0098][0099]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。