一种高效絮凝菌及其在污水处理中的应用的制作方法

1.本技术涉及污水处理技术领域，尤其涉及一种高效絮凝菌及其在污水处理中的应用。


背景技术：

2.当前用于污水处理的絮凝剂主要有无机、有机絮凝剂和生物絮凝剂三类。无机絮凝剂如氯化铝、聚合硫酸铁等，这类物质虽然价格低廉，但易引入一些金属离子而影响水质。有机絮凝剂则大多具有毒性或者致癌等风险。
3.微生物絮凝剂是一类由细菌、真菌等微生物通过发酵获得的，具有絮凝效果的高效、无毒、无二次污染的水处理剂，这些微生物被称为絮凝菌。相比于无机和有机絮凝剂，微生物絮凝剂具有以下优势：使用方便、絮凝范围广、活性高、安全无毒、不污染环境。微生物絮凝剂，不仅在养殖污水的处理环节，在村湾污水、生活污水、工业污水处理方面均具有广泛的应用前景。
4.筛选出一种絮凝菌，并能使其在污水处理中具备简易高效、絮凝率高等优势，成为目前日益需解决的技术难点。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术的目的在于提供一种高效絮凝菌及其在污水处理中的应用，以至少一定程度上解决上述技术问题之一。
6.第一方面，本技术提供了一种高效絮凝菌，该菌株为谷关假单胞菌，命名为peseudomonas guguanensis 2021xni14，保藏单位为中国典型培养物培养中心，地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no:m 20211455，保藏日期为2021年11月22日。
7.第二方面，本技术公开了用于保存上述絮凝菌粉冻干管及其制作方法，具体的实施例中，其步骤包括：
8.第一步，絮凝菌株的培养，离心，收集菌体；
9.第二步，制备含有保护剂的菌体混悬液；
10.第三步，将菌体混悬液在无菌环境中分装到已灭菌的冷冻管中，用液氮或干冰进行预冻；
11.第四步，将预冻好的菌体，放入真空冷冻干燥设备中进行冻干；
12.第五步，冻干管抽真空后，保存于4℃冰箱。
13.第三方面，本技术公开了所述高效絮凝剂的制备方法，所述的方法包括：
14.第一步，絮凝菌peseudomonas guguanensis 2021xni14，保藏编号为cctcc no:m 20211455接种于液体培养基中，放置30℃160rpm/min的恒温震荡培养箱中培养72h；
15.第二步，将发酵液离心除去菌体后，加入冷乙醇使微生物絮凝剂粗品变性，形成沉淀；
16.第三步，离心使絮凝剂粗品沉淀与乙醇分离，将获得的絮凝剂粗品进行干燥，获得絮凝剂粗制品；
17.第四步，将絮凝剂粗品溶解于无菌水中，加入无水冷乙醇再次沉淀絮凝剂，离心，收集沉淀，干燥后得絮凝剂纯品。
18.第四方面，本技术公开了所述高效絮凝菌的筛选方法，所述的方法包括：
19.第一步，菌株的分离与纯化：从污水厂污泥中采集活性污泥样品，按照10-1
、10-2
、10-3
三个梯度稀释，取稀释好的样品涂布至固体培养基平板，将平板倒置放置于30℃恒温培养箱中培养24h后挑取形态差异较大的菌株，将其放置装有5ml的液体培养基试管中，放置30℃160rpm/min的恒温震荡培养箱中培养72h以上，将菌液划线培养后挑取单菌落得到纯化的单菌落；
20.第二步，初筛：培养分离纯化的单菌落，利用高岭土体系进行筛选，筛选出具有絮凝活性的微生物作菌株。
21.进一步的，高岭土悬浊液浓度为5g/l，cacl2溶液浓度为5％。
22.更具体的，称取0.5g用5000目筛网筛出的高岭土，加入含有50ml的纯水的试管内，向试管内依次加入0.5ml5％的cacl2溶液、2～10ml分离纯化所得的菌株发酵液，ph为6～8，在200r/min转速快速搅拌10min，然后100r/min，慢速搅拌5min使其均匀，静置30min，测上清液在550nm处的吸光度，计算絮凝率来筛选出具有絮凝活性的微生物菌株。
23.第五方面，本技术公开了上述絮凝菌在污水处理中的应用，具体的实施例中，其方法为：
24.将培养至对数生长期的上述絮凝菌液加入到污水中，置于恒温摇床48小时后，测其氨氮清除率、总氮清除率、絮凝率。
25.进一步的实施例中，污水为自配的模拟养殖污水，其组分及浓度为磷酸氢二钾84mg/l、磷酸二氢钾132mg/l、硫酸铵248mg/l、氯化钠100mg/l、葡萄糖310mg/l、酵母200mg/l、碳酸氢钠100mg/l。
26.优选的实施例中，絮凝菌液加入到污水中所形成的溶液环境为30-35℃，ph为6-8。
27.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：
28.本技术中涉及一种高效絮凝菌及其在污水处理中的应用，其絮凝菌处理污水简易高效，絮凝率高。
附图说明
29.图1为本技术实施例提供的高岭土絮凝实验筛选絮凝菌。
30.图2为本技术实施例提供的絮凝菌平板培养基划线培养。
31.图3为本技术实施例提供的絮凝菌鉴定-vp实验。
32.图4为本技术实施例提供的絮凝菌鉴定-靛基质实验。
33.图5为本技术实施例提供的絮凝菌鉴定-明胶液化实验。
34.图6为本技术实施例提供的絮凝菌鉴定-硝酸盐还原实验。
具体实施方式
35.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术
进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
36.实施例1
37.具有絮凝效果的菌种的分离与筛选
38.1.培养基：
39.液体培养基：尿素1.5g/l、葡萄糖20g/l
40.固体培养基：尿素1.5g/l、葡萄糖20g/l、琼脂20g/l
41.2.实验步骤：
42.(1)称取10g从污水厂污泥中采集活性污泥样品，加入至装有100ml纯水的试管中，磁力搅拌器搅拌均匀；
43.(2)按照10-1
、10-2
、10-3
三个梯度稀释，取0.2ml稀释好的样品涂布至固体培养基平板；
44.(3)将平板倒置放置于30℃恒温培养箱中培养24h后挑取形态差异较大的菌株，将其放置装有5ml的液体培养基试管中，放置30℃160rpm/min的恒温震荡培养箱中培养72h以上；
45.(4)将菌液划线培养后挑取单菌落得到纯化的单菌落，如图2所示；
46.(5)称取0.5g用5000目筛网筛出的高岭土，加入含有50ml的纯水的试管内，向试管内依次加入0.5ml 5％的cacl2溶液、2ml分离纯化所得的菌株发酵液，所得混合液的菌浓度2
×
107cfu/ml，ph为6，在200r/min转速快速搅拌5min，然后100r/min，慢速搅拌5min使其均匀，静置30min，用紫外可见分光光度计在550nm处分别测定待测样品上清液吸光度和空白溶液上清吸光度，计算絮凝率来筛选出具有絮凝活性的微生物菌株。
[0047][0048]
其中，a-代测样品上清液吸光度；b-空白溶液上清吸光度
[0049]
经过测定，从该菌株的絮凝效果很好，见图1，其絮凝率能达到91.8％。
[0050]
实施例2
[0051]
絮凝菌株的鉴定
[0052]
(1)生理生化测试
[0053]
通过革兰氏染色、vp实验、明胶液化实验、淀粉酶实验、硝酸盐还原实验和靛基质实验来对菌种进行了鉴定，结果如图3～6所示。并对其经统计如下表1所示，表1中“ ”表示该实验结果成阳性，“－”表示该实验结果成阴性。
[0054]
表1
[0055][0056]
(2)16s rdna基因序列鉴定
[0057]
取1ml实施例1中培养过后的菌液,置于离心管进行离心，收集菌体收集菌体，采用dna提取试剂盒提取dna，电泳检测后，采用通用引物27f(5'-agagtttgatcmtggctcag-3'，如
seq id no.1所示)和引物1492r(5'-ttggytaccttgttacacact-3'，如seq id no.2所示)进行扩增。
[0058]
测序结果：在genbank中经ncbiblast检索比对，本技术筛选的絮凝菌株与peseudomonas guguanensis的相似度达到99％；测定其16srdna基因序列，如seq id no.3所示。根据菌株的形态特征和生理生化特征及16s rdna基因序列，鉴定该絮凝菌株即为为谷关假单胞菌，拉丁文名为peseudomonas guguanensis 2021xni14。
[0059]
实施例3
[0060]
通过模拟养殖污水的絮凝实验评价所筛絮凝菌的絮凝效果，其具体实施方法为：
[0061]
(1)配置模拟养殖污水，其主要组成成分见表1
[0062]
表1.人工模拟养殖污水组成
[0063][0064]
(2)取配置的模拟养殖污水50ml，向其缓慢加入2ml实施例1中经分离纯化的絮凝菌株发酵液，所得混合液菌浓度为2
×
107cfu/ml，ph为6，在200r/min转速快速搅拌5min，然后100r/min，慢速搅拌5min使其均匀，静置30min，用紫外可见分光光度计在550nm处分别测定待测样品上清液吸光度和空白溶液上清吸光度，计算絮凝率。
[0065]
(3)对比前后氨氮浓度，计算氮去除率。实验结果：实施例1所筛絮凝菌在处理模拟养殖污水的实验中，其絮凝率为90.3％，氨氮去除率93％。
[0066]
本技术中还公开了以下对比例：
[0067]
对比例1
[0068]
相对于实施例1，加入分离纯化所得的菌株发酵液为1.9ml,所得混合液菌浓度为1.9
×
107cfu/ml，其它操作均相同，计算絮凝菌株的絮凝率。
[0069]
经过测定，其絮凝率为87.6％，与实施例结果相比，有所下降。
[0070]
对比例2
[0071]
相对于实施例1，加入分离纯化所得的菌株发酵液为5ml,所得混合液菌浓度为5
×
107cfu/ml，其它操作均相同，计算絮凝菌株的絮凝率。
[0072]
经过测定，其絮凝率为90.8，与实施例1结果相比，絮凝效果相差无几。
[0073]
对比例3
[0074]
相对于实施例1来说，调节ph为7，其它操作均相同，计算絮凝菌株的絮凝计。
[0075]
经过测定，其絮凝计为88.5％，与实施例1结果相比，絮凝结果略有下降。
[0076]
对比例4
[0077]
相对于实施例1来说，调节ph为8，其它操作均相同，计算絮凝菌株的絮凝计。
[0078]
经过测定，其絮凝计为82.1％，与实施例1结果相比，絮凝结果有所下降。
[0079]
综上所述，本技术提供的谷关假单胞菌(peseudomonas guguanensis 2021xni14)是一种能用于处理污水，且絮凝率高的高效絮凝菌。另外，在具体的处理污水应用中，加入絮凝剂后形成的混合液中的菌浓度在不低于2
×
107cfu/ml、ph在6的环境下，污水处理的效果最佳。
[0080]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。