一种异养培养小球藻生产虾青素的方法与流程

1.本发明涉及微藻培养技术领域，具体涉及一种异养培养小球藻生产虾青素的方法。


背景技术：

2.虾青素是一种紫红色酮基类胡萝卜素，其抗氧化能力是其它类胡萝卜的10倍，由于其较强的抗氧化功效，近年来在水产养殖、食品、医药、化妆品和保健品等领域被广泛应用。小球藻chlorella zofingiensis是一种单细胞绿藻，它既能进行光合自养又能利用有机碳进行异养同时其细胞内还能积累虾青素，其生产的天然虾青素的结构与雨生红球藻生产的虾青素的构型一样，因此小球藻chlorella zofingiensis成为天然虾青素的生产来源而备受关注。相比于自养型雨生红球藻生产虾青素而言，小球藻chlorella zofingiensis可以利用现有的发酵培养设备在异养条件下实现高密度培养，在诱导条件下可以显著提高虾青素等次生类胡萝卜素的积累量而生产天然虾青素，这对虾青素产业化和商业化具有重要意义，因此小球藻chlorella zofingiensis异养培养生产虾青素技术受到了人们的关注。
3.然而，虽然已经有研究发现，小球藻chlorella zofingiensis在异养条件下培养11天的细胞干重可高达160g
·
l-1
,而发酵后细胞内虾青素含量较低，仅占细胞干重的0.06％。鉴于这一限制，利用异养培养小球藻的方式生产虾青素还面临很大的困难。为了解决该技术问题，有研究者提出采用异养-稀释-光诱导培养法，在该培养方法下小球藻chlorellazofingiensis的最高生物量可达98.4g
·
l-1
，虾青素产量可达73.3mg
·
l-1
。然而该方法存在一些弊端，如方法操作繁琐、培养周期长、成本高等问题。此外，自养条件下，添加一些非生物因素，如缺氮胁迫以提高虾青素生物合成的能力，但这些非生物胁迫会严重地抑制微藻细胞的生长，使细胞密度和数量无法上升，进而导致虾青素生产效率仍然很低。
4.除了常规培养技术中小球藻细胞中虾青素含量低之外，自养条件下微藻细胞生长速度缓慢，细胞密度低，也是限制小球藻生产虾青素的又一大难点。


技术实现要素：

5.(一)要解决的技术问题
6.鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种异养培养小球藻生产虾青素的方法。在异养培养小球藻的条件下，大幅提高小球藻中虾青素的含量，既能兼顾异养培养的细胞生长速度快、细胞密度高、细胞干重大等优点，又能显著提高小球藻chlorella zofingiensis中虾青素的含量，为推动小球藻chlorella zofingiensis高效生产虾青素的产业化和商业化提高技术支持。
7.(二)技术方案
8.为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
9.一种异养培养小球藻生产虾青素的方法，包括：
10.s1、细胞增殖培养
11.采用异养培养方法培养小球藻，使小球藻细胞干重增加到预定值；
12.s2、虾青素诱导培养
13.在保持异养培养的条件下，采用三因素对小球藻进行联合诱导，促使小球藻积累虾青素，提高细胞内虾青素的含量；所述三因素包括：
14.向异养培养基中加入赤霉素，使赤霉素在培养基中的初始浓度为 10mg/l-150mg/l；
15.调整发酵罐内异养培养基中的初始碳氮比，使碳氮比 c/n＝140-280；
16.向异养培养基中加入氯化钠，使氯化钠在培养基中的初始浓度为 0.1m-0.6m。
17.根据本发明的较佳实施例，s2中，向异养培养基中加入赤霉素，使赤霉素在培养基中的初始浓度为10mg/l；调整发酵罐内异养培养基中的初始碳氮比180；向异养培养基中加入氯化钠，使氯化钠在培养基中的初始浓度为0.2m。
18.根据本发明的较佳实施例，在s1-s2中，异养培养过程中，培养基中的氮源为氯化铵和氨水；碳源为葡萄糖。
19.根据本发明的较佳实施例，在s1中，培养基采用流加补料的方式进行异养培养，并实时监控发酵罐中葡萄糖浓度的变化，实时调整补料速度，控制发酵罐中葡萄糖的浓度稳定在5g/l-20g/l；
20.在s2中，培养基采用流加补料的方式进行异养培养，并实时监控发酵罐中葡萄糖浓度的变化，实时调整补料速度，控制发酵罐中葡萄糖的浓度稳定在4.5-5.5g/l(优选为5g/l)。
21.根据本发明的较佳实施例，在s1-s2中异养培养条件为：培养温度为25-28℃(优选26℃)，溶氧设置在15-25％(优选20％)，搅拌速度和溶解氧偶联控制；同时，实时监控发酵罐中培养液的ph，通过流加氨水控制发酵罐中培养液的ph6.5
±
0.2。
22.根据本发明的较佳实施例，s1中，培养基包括基础培养基和补料培养基，基础培养基采用氯化铵为单元，其中葡萄糖浓度为20g/l，初始 c/n为32:1；当基础培养基中的葡萄糖浓度低于5g/l时，启动蠕动泵流加补料培养基，补料培养基的组分与基础培养基相同，但补料培养基中碳氮比为基础培养基碳氮比的1/20。
23.根据本发明的较佳实施例，当s1阶段的异养培养使小球藻细胞干重≥150g/l时，即进行s2的诱导培养过程，s2阶段的培养时间以检测到细胞中虾青素的含量不变或开始下降时，诱导培养结束。s1阶段的培养时间通常为9-11天时，按照本发明s1的异养培养条件，可使小球藻细胞干重达到160g/l左右，此时小球藻已经增殖到相当高的细胞数量，接下来进行诱导积累虾青素的培养过程，使细胞中虾青素含量提高，由此以获得最高虾青素产量。
24.根据本发明的较佳实施例，s2中，进一步地，向发酵罐的异养培养基中添加草酰乙酸、γ-氨基丁酸中的一种或两种。
25.根据本发明的较佳实施例，s2中，使发酵罐的异养培养基中γ-氨基丁酸的初始浓度为0.25mm-1mm，但最优选是0.5mm。
26.根据本发明的较佳实施例，s2中，使发酵罐的异养培养基中草酰乙酸的初始浓度为0.1mm-0.5mm，但最优选是0.2mm。
27.(三)有益效果
28.本发明将小球藻异养培养生产虾青素的工艺分为两个阶段，一个阶段为细胞数量大量增殖阶段，第二个阶段是基于异养培养的条件下的诱导阶段，促使小球藻细胞中积累虾青素。在第二个阶段中，主要是基于三因素诱导法，即向发酵罐的培养基中添加一定初始浓度的赤霉素和氯化钠，并调整发酵罐培养基中的初始c/n为高碳氮比(140-280)；通过诱导培养4天以上，直至连续检测发现细胞中虾青素含量不变或开始呈下降趋势时停止诱导培养，收获此时的小球藻，获得虾青素。实验证明，本发明采用三因素诱导方法，相较于现有技术能够显著提高细胞中虾青素的含量，同时该诱导培养的过程对细胞数量的增长速度几乎无明显负面影响。基于第一阶段已经获得高密度高干重的小球藻细胞和第二阶段诱导获得的高含量的虾青素，从而在两个方面共同提高小球藻制备虾青素的生产效率。
29.在此基础上，本发明还优化了赤霉素和氯化钠的最优初始浓度；进一步地，在第二阶段中，还向发酵罐的培养基中添加一定初始浓度的草酰乙酸和/或γ-氨基丁酸，实验结果证明，相较于单纯的三因素诱导，加入一定初始浓度的草酰乙酸和/或γ-氨基丁酸，有助于进一步诱导小球藻细胞中虾青素的积累速度和积累量。
30.此外，在第一阶段培养过程中，主要是基于异养培养方法，通过控制基础培养基中葡萄糖浓度、氮源、碳氮比，补料培养基中的碳氮比、第一阶段整个过程中发酵罐内葡萄糖浓度在预定范围内、ph控制方法和范围等条件，使小球藻能快速积累到≥150g/l的细胞干重，达到细胞数量的初始积累，为虾青素的生产提供高基数。
附图说明
31.图1为实施例1与对照例1的小球藻在异养培养期间，细胞生长速度和虾青素含量曲线图；(a)为细胞干重曲线、(b)为虾青素含量曲线、 (c)为虾青素产量曲线。
32.图2为实施例1-10与对照例1培养结束后所得虾青素含量的比较折线图(以实施例1为100％计算其他实施例或对照例的相对含量)。
33.图3为对照例1-7与实施例1培养结束后所得虾青素含量的比较折线图(以实施例1为100％计算其他对照例的相对含量)。
34.图4为实施例1、实施例12、实施例13的小球藻在第二阶段的诱导培养期间，细胞生长速度和虾青素含量曲线图；(a)为细胞干重曲线、 (b)为虾青素含量曲线、(c)为虾青素产量曲线。
35.图5为实施例1、实施例11、实施例13-15培养结束后所得虾青素含量的比较柱状图(以实施例11为100％计算其他实施例的相对含量)。
36.图6为实施例1、实施例12、实施例16-18培养结束后所得虾青素含量的比较柱状图(以实施例12为100％计算其他实施例的相对含量)。
具体实施方式
37.为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
38.实施例1
39.本实施例提供一种异养培养小球藻生产虾青素的方法，其包括如下步骤：
40.步骤一：细胞增殖培养
41.藻株：小球藻chlorella zofingiensis
42.小球藻chlorella zofingiensis培养过程中所用的各培养基组成和用量见表1-3。
43.小球藻chlorella zofingiensis整个异养培养过程包括如下步骤：
44.(1)藻种活化及一、二、三级种子培养
45.在无菌环境下，用接种环从已培养好(将小球藻chlorella zofingiensis的藻种涂抹在平板上至长成了菌落)的平板上挑取小球藻chlorellazofingiensis单菌落，于灭菌平板上(培养基组成见表1)进行划线，将划线后的平板置于暗环境下进行培养，培养温度25℃，培养15-20天(形成明显的小球藻chlorella zofingiensis藻单菌落)。平板培养基的组成参见表1。
46.从活化好的新鲜平板上，挑取一环小球藻chlorella zofingiensis (φ2～3mm)于50ml三角瓶中(装液量为15ml)进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpm，培养120-144h(od750＝8)。
47.将培养好的一级种子液以10％(v/v)接种量接种于250ml二级摇瓶(装液量100ml)中进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpm，培养72～84h (od750＝16-20)。
48.将培养好的二级种子液以10％(v/v)接种量接种于1000ml三级摇瓶(装液量300ml)中进行振荡培养，培养温度27℃，转速180rpm，培养72-84 (od750＝20-22)。
49.一级种子培养，二级种子培养、三级种子培养的培养基组分参见表2。
50.(2)发酵罐异养培养
51.使用7.5l发酵罐上进行培养，培养基的组成参见表3。将异养培养好的小球藻chlorella zofingiensis的种子液以10％(v/v)接种量接种于 7.5l发酵罐中，培养过程中使用氨水控制ph6.5
±
0.2(氨水既可作为辅助氮源被藻细胞吸收和利用，又可用于调控ph值)，温度为26℃，溶解氧设定为20％，搅拌速度和溶解氧偶联控制溶。发酵基础培养基采用氯化铵作为氮源，基础培养基中初始碳氮比为32:1，基础培养基中葡萄糖浓度为20g
·
l-1
，当葡萄糖浓度低于5g
·
l-1
时，开始使用速度可调的蠕动泵流加补料培养基，补料培养基与基础培养基的组分相同，但补料培养基中碳氮比为基础培养基碳氮比的1/20，时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节补料速度，控制整个培养过程中的葡萄糖浓度在5 g
·
l-1-20g
·
l-1
范围内。
52.表1：种子活化阶段平板培养基的组成
[0053][0054]
表2：种子一级、二级、三级培养使用的培养基组成
[0055][0056]
表3:在7.5l的发酵罐异养培养的基础培养基和补料培养基组成
[0057][0058]
步骤二、虾青素诱导培养
[0059]
培养至第10天小球藻chlorella zofingiensis的细胞干重达160g
·
l-1
时，切换成异养培养 三因素诱导培养。
[0060]
向发酵罐中加赤霉素和氯化钠，使赤霉素初始浓度为10mg
·
l-1
、使氯化钠的初始
浓度为200mm，调整发酵罐内异养培养基中的初始碳氮比＝180/1，并根据发酵罐内葡萄糖浓度变化适时调控补料速度，控制整个培养过程中的葡萄糖浓度在5g
·
l-1
左右。
[0061]
当取同一时间点的样品连续几天测定虾青素含量，当样品中虾青素含量不变或是开始下降时，诱导过程结束。
[0062]
对照例1
[0063]
按照实施例1中的步骤一的条件进行第一阶段的培养，在步骤二中，不向发酵罐中加赤霉素和氯化钠，也不调整发酵罐内异养培养基中的初始碳氮比至180。其余条件参照实施例1进行。
[0064]
连续抽取发酵罐中的样品，测定和计算实施例1和对照例1中细胞干重(g/l)、虾青素含量(％,dw)、虾青素产量(g/l)并分别作曲线，其结果如图1所示。由图1的(a)可以看出，在第一阶段时的10天培养过程中，实施例1和对照例1的细胞干重曲线、虾青素含量曲线、虾青素产量曲线都几乎重合。虽然在第二阶段的虾青素诱导培养期间，实施例 1中的细胞干重增长速度相比对照例1略有下降(这是由于虾青素的积累，小球藻的生物量虽有增长，但增速略有放缓，这也十分符合客观规律)，但虾青素含量和虾青素产量，尤其是虾青素产量的显著高于对照例1。
[0065]
具体地，采用实施例1的诱导方案，小球藻chlorella zofingiensis的最高生物量可达235g
·
l-1
，虾青素含量最高可占细胞干重的0.144％，虾青素产量可达0.32g
·
l-1
。
[0066]
实施例2-9
[0067]
实施例2-10是在实施例1基础上，仅改变“步骤二、虾青素诱导培养”三个诱导因素的条件，即改变赤霉素、氯化钠的初始浓度、c/n比初始值；其余条件和步骤与实施例1完全相同。具体如下表：
[0068]
组别c/n赤霉素氯化钠实施例214010mg/l0.2m实施例322010mg/l0.2m实施例428010mg/l0.2m实施例518050mg/l0.2m实施例6180100mg/l0.2m实施例7180150mg/l0.2m实施例818010mg/l0.1m实施例918010mg/l0.4m实施例1018010mg/l0.6m
[0069]
在第二阶段培养结束(总共培养16天结束)后，以实施例1中虾青素含量为基准值100％，分别统计对照例1和实施例2-10培养结束后虾青素含量，并计算其相对于基准值的相对含量。统计结果如图2所示。
[0070]
由图2可以看出，实施例2-10的虾青素含量都低于实施例1，但均高于对照例1，说明本发明中在第二阶段采用三因素诱导的条件下产生的虾青素含量高于没有这些诱导条件的情况，但诱导条件“赤霉素初始浓度为10mg
·
l-1
、氯化钠的初始浓度为200mm，异养培养基中的初始碳氮比＝180/1”时诱导效果最优。
[0071]
对照例2-7
[0072]
对照例2-7是在实施例1基础上，改变“步骤二、虾青素诱导培养”三个诱导因素的条件，使其中一个要素或两个要素条件缺失；其余条件和步骤与实施例1完全相同。具体如下表：
[0073][0074][0075]
在第二阶段培养结束(总共培养16天结束)后，以实施例1中虾青素含量为基准值100％，分别统计对照例2-7培养结束后虾青素含量，并计算其相对于基准值的相对含量。统计结果如图3所示。
[0076]
由图3可以看出，对照例2-7的虾青素含量都远远地低于实施例1。说明本发明方法中，在第二个培养阶段的三个诱导要素对于提高细胞内虾青素的含量和虾青素在发酵培养基中的总量有协同作用，三个诱导因素缺少其中一个皆不能实现本发明的技术效果。
[0077]
此外，本发明在其他条件不变的情况下，将第二阶段的三个诱导因子中的赤霉素(ga)替换成吲哚-3-乙酸(iaa)、吲哚-3-丙酸(ipa)、吲哚-3-丁酸(iba)、1-萘乙酸(naa)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(acc)，但在等浓度或更高浓度条件下，诱导培养4天时，虾青素的含量都不及赤霉素。由此可见，赤霉素在异养培养条件下，对小球藻诱导虾青素的功能具有其独特性，并非可由其他激素轻易替换得到。
[0078]
实施例11
[0079]
本实施例是在实施例1的基础上，仅改变“步骤二、虾青素诱导培养”的诱导条件，具体是在实施例1所述的三个诱导因素基础上再向发酵罐培养基中加一定量的γ-氨基丁酸，使γ-氨基丁酸的初始浓度为 0.5mm。其余条件和步骤与实施例1完全相同。
[0080]
实施例12
[0081]
本实施例是在实施例1的基础上，仅改变“步骤二、虾青素诱导培养”的诱导条件，具体是在实施例1所述的三个诱导因素基础上再向发酵罐培养基中加一定量的草酰乙酸，使草酰乙酸的初始浓度为0.2mm。其余条件和步骤与实施例1完全相同。
[0082]
在虾青素诱导培养阶段，连续抽取发酵罐中的样品，测定和计算实施例11-12中细胞干重(g/l)、虾青素含量(％,dw)、虾青素产量(g/l) 并分别作曲线，并以实施例1的曲线作参照，其结果如图4所示。
[0083]
由图4的(a)可以看出，虾青素诱导培养的4天内(day12-16)，实施例1、实施例11-12中的细胞干重增长速度相比对照例1略有下降，但虾青素含量和虾青素产量，尤其是虾青
素产量的显著高于对照例1。具体地，
[0084]
添加200μm草酰乙酸的实施例12，在培养至16天时生物量最高可达 245g/l。实施例11中添加γ-氨基丁酸后小球藻chlorella zofingiensis虾青素的含量和虾青素产量呈先增加后减少的趋势，培养至第15天虾青素含量占细胞干重的0.154％，虾青素产量为0.35g/l。而实施例12中，添加草酰乙酸后小球藻chlorella zofingiensis虾青素的含量和虾青素产量呈增加的趋势，培养至第16天虾青素含量可占细胞干重的0.16％，虾青素产量为0.39g/l。
[0085]
由此可知，诱导培养结束后，实施例12得到的发酵液中虾青素含量和虾青素产量最高，其次实施例11。由此证明，若在实施例1的三因子诱导的基础上，再进一步添加草酰乙酸或γ-氨基丁酸进行联合诱导，小球藻chlorella zofingiensis的生物量和虾青素含量及产量均有显著的提高。
[0086]
实施例13-15
[0087]
实施例13-15是在实施例11的基础上，仅改变“步骤二、虾青素诱导培养”中γ-氨基丁酸的初始浓度。其余条件和步骤与实施例11完全相同。具体地，实施例13将发酵罐培养基中γ-氨基丁酸的初始浓度改为0.1mm；实施例14改为添加0.25mm初始浓度的γ-氨基丁酸；实施例 15改为添加1mm初始浓度的γ-氨基丁酸。
[0088]
统计时，以实施例11中虾青素含量为基准值100％，分别检测实施例13-15培养结束后虾青素含量，并计算其相对于基准值的相对含量，同时实施例1为对照，统计结果如图5所示。
[0089]
从图5可以看出，在实施例1第二阶段诱导培养条件下，若进一步加入一定初始浓度的γ-氨基丁酸，将有利于获得更高的虾青素产量，而尤其是以γ-氨基丁酸的添加初始浓度为0.5mm时，对小球藻的诱导效果最优。
[0090]
实施例16-18
[0091]
实施例16-18是在实施例12的基础上，仅改变“步骤二、虾青素诱导培养”中草酰乙酸的初始浓度。其余条件和步骤与实施例12完全相同。具体地，实施例16将发酵罐培养基中草酰乙酸的初始浓度改为 0.01mm；实施例14改为初始浓度的0.1mm草酰乙酸；实施例15改为 0.5mm初始浓度的草酰乙酸。
[0092]
统计时，以实施例12中虾青素含量为基准值100％，分别检测实施例16-18培养结束后虾青素含量，并计算其相对于基准值的相对含量，同时实施例1为对照，统计结果如图6所示。
[0093]
从图6可以看出，在实施例1第二阶段诱导培养条件下，若进一步加入一定初始浓度的草酰乙酸，将有利于获得更高的虾青素产量，而尤其是以草酰乙酸的添加初始浓度为0.2mm时，对小球藻的诱导效果最优。
[0094]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。