植物耐盐性相关蛋白及其相关生物材料与应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域中植物耐盐性相关蛋白及其相关生物材料与应用。


背景技术：

2.土地盐渍化的问题在世界范围内逐年增加，给农业生产造成大量的损失，是可持续发展农业的重大阻碍(tester and davenport 2003)。而土壤中的盐碱主要来自于灌溉水以及地震海啸等引发的海水倒灌，这其中包含了大量的nacl，对作物的生长造成严重的威胁(deinlein et al.2014；takagi et al.2015)。根据作物对盐胁迫耐受程度的不同将植物分为耐受型和敏感型两种，耐受型作物可在盐浓度超过200m不哭m的土地中生存，而敏感型作物难以在盐浓度在100mm-200mm的土地中生存。研究发现水稻是对盐胁迫最敏感的作物，研究水稻耐盐机制具有重要价值(munns and tester 2008)。
3.盐胁迫主要是由土壤中包含的过量nacl引起，其对植物的危害形式主要有三种：渗透胁迫、离子胁迫和次级胁迫(yang and guo 2018)。这三种危害从盐胁迫的时间来看，第一阶段是由外界渗透压的改变和离子浓度改变引起的植物对盐胁迫的快速响应，第二阶段是植物老叶中有害离子的大量积累引起的次级响应，40mm nacl可以激活大部分植物的盐胁迫响应途径，而水稻的响应浓度更低(munns and tester 2008)。这三种胁迫的危害如下：(1)渗透胁迫主要是通过改变土壤中的水势，导致根部可利用水的减少，导致植物缺水后引起一系列的响应包括气孔关闭等，这也进一步引起植物生长的停滞(munns and tester 2008；yang and guo 2018)。(2)离子毒害主要是由于高浓度的na

和cl-引起，钠钾离子平衡对于植物的代谢是非常重要的，高浓度的nacl引起植物根部离子吸收的紊乱，其中包括k

吸收的减少，代谢紊乱同时会引起光合效率的降低(deinlein et al.2014；yang and guo 2018)。(3)由于渗透胁迫和离子毒害引起的次级胁迫，其中包括ros累积、na

大量累积以及营养吸收的紊乱。活性氧(ros)包括o
2-、h2o2、oh等，ros的累积导致细胞内dna的破坏以及代谢系统的紊乱(miller et al.2010)。
4.盐胁迫对水稻的生长发育有严重的危害，那么研究水稻应对盐胁迫的响应机制尤为重要，而谷物对盐胁迫的耐受性主要是由离子胁迫的耐受性、渗透胁迫的耐受性以及组织器官盐胁迫耐受性几部分综合组成(roy et al.2014)。综合几方面将对培育优良耐盐抗碱的水稻有重要意义。目前对水稻的抗盐的分子机制研究主要从以下几方面展开(1)盐胁迫的感应，根据目前的研究发现细胞受体gipc是na

的受体，盐可以诱导细胞表明的电位去极化，而gipc对细胞表面电势的改变是必须的，na

直接结合gipc从而引起ca

的内流，开启盐胁迫信号的转导(jiang et al.2019)。ca

内流后，钙离子感受蛋白scapb8被激活，scapb8和sos2互作激活sos(salts overly sensitive pathway)途径，另外盐胁迫条件下，atnn4可以促进sos2的磷酸化，进而促进scapb8和sos2的互作(quan et al.2007；ma et al.2019)。植物受到盐胁迫引发体内的sos途径，盐胁迫激活sos2和sos3，sos2与sos3互作磷酸化sos1，sos1是重要的钠离子逆向转运蛋白，将钠离子从细胞质运输到外质体，sos1的跨膜结构域与胞浆结构域会形成自我功能抑制的结构，sos2磷酸化sos1解除了这种自我抑
制，达到激活sos1功能的作用(lin et al.2009；nunez-ramirez et al.2012)。(2)离子转运，细胞内离子稳态的维持对于植物抗盐是非常重要的，盐处理后细胞中na

浓度提高，减少细胞的伤害，将有害的na

外排，细胞主要通过三种方式维持细胞内钠钾离子平衡：1、通过na

反向转运蛋白sos1将na

外排，生物钟gi参与水稻抗盐，gi和sos2互作抑制sos2与sos3互作，从而抑制sos2对sos1的磷酸化，而盐处理后gi蛋白会被降解，从而sos2与sos3互作磷酸化sos1，sos1作为逆向转运蛋白降低细胞内na

含量(kim et al.2013)；2、通过钠钾转运蛋白减少钠离子的摄入，增加钾离子的摄入，hkts家族基因参与了钠钾离子的转运，最近研究发现水稻中oshkt1.5(skc1)参与了水稻抗盐，盐胁迫条件下oshkt1.5可以有效的将茎上na 转运到根部，提高水稻的耐盐性(ren et al.2005)；3、通过nhx等钠钾转运蛋白将钠离子区隔化(yang and guo 2018)，之前的研究发现nhx1可以有效地将na 在液泡中区隔化，但是最近的研究发现nhx参与了钠钾双重运输，其突变体并不能很好的抗盐(bassil et al.2011)。(3)信号转导，随着盐胁迫时间的延长，植物体启动体内的转录调控，通过调控激素如aba、br和乙烯等激素的产生调控水稻抗盐。同时nac类及myc类转录因子的表达被激活参与水稻的抗盐。
5.以上研究成果阐述了植物感受盐胁迫，应对盐胁迫的基本过程，为培育优良的耐盐新型水稻品种奠定了基础。然而水稻品质提高同时耐盐性提高并不是单一基因决定，而是多组基因组合的表现。这就要求我们发觉更多的发育盐胁迫响应的基因，将其应用于实际水稻生产中。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于是提出一种与植物耐盐性相关的蛋白及其相关生物材料和应用，进而调控植物的耐盐性。
7.为了解决以上技术问题，本发明提供了一种来源于水稻的耐盐性相关蛋白，名称为oself4a，来源于水稻日本晴，是如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：
8.a1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
9.a2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与植物耐盐性相关的蛋白质；
10.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
11.上述蛋白质中，序列表中的序列2由117个氨基酸残基组成。
12.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
13.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
14.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可
获得同一性的值(％)。
15.上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
16.上述蛋白质中，所述oself4a可来源于水稻。
17.与oself4a相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
18.本发明所提供的与oself4a相关的生物材料，为下述b1)至b7)中的任一种：
19.b1)编码oself4a的核酸分子；
20.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
21.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
22.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
23.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官；
24.b6)降低oself4a表达的核酸分子；
25.b7)含有b6)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
26.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
27.上述生物材料中，b1)所述核酸分子具体可为如下1)或2)所示的基因：
28.1)编码序列(cds)是序列表中序列1的第1-354位核苷酸的dna分子；
29.2)核苷酸序列是序列表中序列1的dna分子。
30.上述生物材料中，b6)所述核酸分子具体可为与序列表中序列1的第1-354位核苷酸所示的dna分子中任一片段反向互补的dna分子。
31.上述生物材料中，b7)所述重组载体可以为针对oself4a编码序列(cds)设计的crispr/cas9重组表达载体。
32.其中，序列表中的序列1由354个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列1中的第1-354位，编码序列表中的序列2所示的蛋白质。
33.上述生物材料中，b2)所述的含有编码oself4a的核酸分子的表达盒(oself4a基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达oself4a的dna，该dna不但可包括启动oself4a基因转录的启动子，还可包括终止oself4a转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053))。它们可单独
使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i
985
)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。
34.可用现有的植物表达载体构建含有所述oself4a基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pwmb123、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
35.上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
36.为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物耐盐剂。
37.本发明所提供的植物耐盐剂含有所述蛋白质或/和所述蛋白质相关的生物材料。
38.上述植物耐盐剂的活性成分可为所述蛋白质或所述蛋白质相关的生物材料，上述植物耐盐剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的耐盐效果确定。
39.上述蛋白质、或上述生物材料的下述p1-p4中的任一种应用也属于本发明的保护范围：
40.p1、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在调控植物耐盐性中的应用；
41.p2、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在培育耐盐/不耐盐植物中的应用；
42.p3、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在制备提高/降低植物
耐盐性的产品中的应用；
43.p4、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在植物育种中的应用。
44.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐盐植物的方法。
45.本发明所提供的培育耐盐物的方法，包括提高目的植物中所述蛋白质或其编码基因的表达量，得到耐盐植物；所述耐盐植物的耐盐性高于所述目的种子植物的耐盐性。
46.上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质或其编码基因的表达量可通过将所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的。
47.上述方法中，其中所述蛋白质的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：
48.1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
49.2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
50.3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于camv的tml，来源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
51.4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于tmv,mcmv和amv)。
52.所述蛋白质的编码基因可通过使用ti质粒，植物病毒栽体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998，method for plant molecular biology viii,academy press,new york,pp.411-463；geiserson and corey,1998,plant molecular biology(2nd edition)。
53.上述方法中，所述耐盐植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。
54.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐盐性降低的转基因植物的方法。
55.本发明所提供的培育耐盐性降低的转基因植物的方法，包括降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达，得到耐盐性低于所述目的植物的转基因植物。
56.上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达是通过利用crispr/cas9基因编辑系统抑制目的植物中所述的蛋白质的含量和/或活性实现的。
57.上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
58.上文中，所述植物和所述目的植物均为单子叶植物或双子叶植物。所述植物具体
可以为水稻。
59.通过利用crispr/cas9基因编辑系统抑制目的植物中所述的蛋白质的含量的实验表明，与日本晴野生型水稻相比，oself4a功能丧失的oself4a-1水稻在高盐胁胁迫培养后的存活率为30％，远远低于日本晴水稻的70％的存活率，也就是说，丧失oself4a功能会降低水稻的耐盐性，说明oself4a是与水稻耐性相关的蛋白，具体为，丧失oself4a功能的水稻的耐盐性会降低。
附图说明
60.图1为载体pcrispr-oself4a的结构示意图。
61.图2为crispr-oself4a转基因材料的测序结果。
62.图3crispr-oself4a转基因材料盐处理表型，其中a为处理前和处理后照片；b为存活率统计。
63.图4为日本晴和oself4a转基因材料叶绿素含量和离子泄漏率测定结果。
具体实施方式
64.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
65.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
66.日本晴是一种水稻品种，日本晴为一水稻品种，公众可从中国科学院植物研究所获得，以重复本实验。日本晴以下简写为nip。
67.下述实施例中的crispr/cas9载体系统记载于如下文献中(ma x,zhang q,zhu q,liu w,chen y,qiu r,wang b,yang z,li h,lin y,xie y,shen r,chen s,wang z,chen y,guo j,chen l,zhao x,dong z,liu y-g(2015)a robust crispr/cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants.mol plant 8:1274-1284)由华南农业大学刘耀光实验室惠赠，公众可以从华南农业大学获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。
68.下述实施例中的农杆菌eha105感受态细胞，北京兰博利德商贸公司。
69.n6大量储备液(10x)：kno
3 28.3g、kh2po
4 4g、(nh4)2so
4 4.63g、mgso4·
7h2o 1.85g、cacl2·
2h2o 1.68g逐个溶解定容到1l，室温保存。
70.n6微量储备液(100x)：mnso4·
4h2o 0.44g、znso4·
7h2o 0.15g、h3bo30.16g、ki 0.08g逐个溶解定容到1l，室温保存。
71.ms大量储备液(10x)：nh4no
3 16.5g、kh2po
4 1.7g、kno
3 19g、mgso4·
7h2o 3.7g、cacl2·
2h2o 4.4g，逐个溶解定容到1l。
72.ms微量储备液(100x)：mnso4·
4h2o 2.23g、znso4·
7h2o 0.86g、h3bo36.2g、ki 0.083g、na2moo4·
2h2o 0.025g、cocl2·
6h2o 0.0025g、cuso4·
5h2o 0.0025g溶于1l水中室温保存。
73.fe
2 -edta储备液(1000x)：首先溶解5.57g feso4.7h2o于200ml蒸馏水中，然后加热溶解7.45gna2edta于200ml蒸馏水中，将feso4.7h2o溶液与na2edta溶液不断搅拌混合，冷却后定容至1l。
74.维生素储备液(100x)：烟酸0.1g、肌醇10g、vb10.1g、vb60.1g、甘氨酸0.2g，加水定容到1l，4度保存。
75.n6固体培养基：将n6大量储备液100ml、n6微量储备液10ml、fe
2 -edta储备液10ml、维生素储备液10ml、脯氨酸0.6g、酵母水解络蛋白0.8g和蔗糖30g混合后加入琼脂，使琼脂的终浓度为8g/l。
76.n6s1培养基：含25mg/l潮霉素和600mg/l头孢霉素的n6培养基。
77.n6s2培养基：含50mg/l潮霉素和300mg/l头孢霉素的n6培养基。
78.ms固体培养基：ms大量储备液100ml和ms微量储备液10ml，用koh调节ph到5.8，然后加琼脂8g/l。
79.分化培养基(1)：含300mg/l水解酪蛋白、50mg/l潮霉素、1mg/l 6-ba、0.5mg/l kt、0.2mg/l zt、0.25mg/l naa、30g/l蔗糖和30g/l山梨醇的ms培养基。
80.分化培养基(2)：含300mg/l水解酪蛋白、50mg/l潮霉素、1mg/l 6-ba、0.5mg/l kt、0.2mg/l zt、0.5mg/l naa、30g/l蔗糖和20g/l山梨醇的ms培养基。
81.本发明中水稻材料处理方法：将t3代oself4a突变体和日本晴野生型37度浸泡两天，第三天催芽后将出芽一致的种子点在96孔板中，放置于木村b培养液中培养，培养条件为12h light/12h dark，白天30度，夜晚23度。
82.木村b培养液记载于如下文献中：ma jf，goto s，tamai k，ichii m.role ofroot hairs and lateral roots in silicon uptake by rice.plant physiol.2001；127：1773-1780)，其配方详见表1，ph值为5.8。
83.表1
b,yang z,li h,lin y,xie y,shen r,chen s,wang z,chen y,guo j,chen l,zhao x,dong z,liu y-g(2015)a robust crispr/cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants.mol plant 8:1274-1284)中载体构建方法，将其中的靶点序列和引物序列替换为本实施例中的靶点序列和引物oself4a-osu3t1f和oself4a-osu3t1r，进行构建载体，得到载体pcrispr/cas9-oself4a。将载体pcrispr/cas9-oself4a导入农杆菌eha105的感受态细胞，得到重组农杆菌-pcrispr/cas9-oself4a。
94.2)pcrispr/cas9-oself4a转化水稻愈伤及阳性愈伤筛选
95.a.愈伤诱导
96.选取成熟饱满的日本晴水稻种子，去除外壳；用75％酒精消毒3～5min，倒去酒精；用灭菌后的蒸馏水冲洗3次；加入10％的naclo(含有0.1％的吐温20)浸泡15～30min；倒掉naclo，用灭菌后的蒸馏水冲洗5次。将消毒后的种子接入诱导愈伤培养基，26摄氏度培养20d，得到nip水稻愈伤。
97.b.农杆菌的悬浮、侵染及共培养
98.侵染前，将活化的重组农杆菌-pcrispr/cas9-oself4a刮入液体nb培养基中，28度，200rpm震荡培养3～3.5h，然后用nb液体培养基调节菌液浓度至od600＝0.3。将诱导20d愈伤组织放入农杆菌悬浮液中，侵染10min。倒掉菌液，用灭菌滤纸吸干愈伤表面的菌液。愈伤表面覆盖灭菌滤纸，在超净台吹干30min。吹干后将愈伤转入表面覆盖有一层灭菌滤纸的共培养培养基，先在20度暗培养过夜，然后转入25度培养箱继续暗培养2d。
99.c、清菌
100.暗处共培养完成后，将侵染完毕的愈伤组织转移到灭菌三角瓶中。用灭菌后的蒸馏水反复清洗愈伤7～8次，每次3-5min。最后用含有500mg/l头孢的灭菌蒸馏水浸泡愈伤30min。倒掉头孢溶液，用灭菌滤纸尽量吸干愈伤表面的水分，愈伤表面覆盖一层灭菌滤纸，超净台吹干1h左右。
101.d、筛选，分化阳性植株
102.将步骤c经过清菌后的愈伤摆放到n6s1筛选培养基上，放在于32度培养室中培养14天，然后将阳性愈伤转移到n6s2培养基上，在32度培养箱中继续培养两周。将阳性愈伤转移到分化培养基上。28度光照培养14天。得到水稻oself4a突变体t0代。
103.2、转基因水稻oself4a突变体t0代植株鉴定
104.提取水稻oself4a突变体t0代植株的叶片dna，按照上述方法提取dna为模板，用oself4a的特异性引物，进行pcr扩增，引物序列分别为oself4a鉴定f:atggaaggtgatagcttctcag；oself4a鉴定r:ctagccgggccggacacgcttc。pcr反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。将pcr产物进行sanger测序，检查靶点位置是否发生突变。最终鉴定得到oself4a基因发生突变的2个独立转基因植株，将两株突变体分别命名为oself4a-1和oself4a-2，比对dna序列，其突变位点如图2所示，从图2中可以看出，其中突变株oself4a-1缺失了11个碱基，使oself4a移码突变，导致无法编码出蛋白oself4a，使其功能完全缺失；突变株oself4a-2缺失了1个碱基，同样导致无法编码出蛋白oself4a，使功能完全丧失。
105.水稻的叶片dna的提取方法具体为：将水稻叶片放入2ml离心管，加入钢珠用研磨
器研磨成粉末。在离心管中加入300μlte buffer，震荡混匀。加入等体积的氯仿和苯酚(1：1)混合液，震荡混匀，12000rpm离心10min。取200μl上清，加入等体积的氯仿，剧烈震荡混匀，12000rpm离心10min。取上清100μl，加入两倍体积的无水乙醇在-20℃沉淀30min。4℃，12000rpm，离心10min。倒掉上清，用500μl的75％乙醇清洗两遍，37度烘箱吹干后加入50μl ddh2o溶解。
106.3.水稻突变体oself4a-1的耐盐性鉴定
107.将水稻突变体oself4a-1的t0代植株的种子进行3次自交传代得到t3代种子，通过一代测序的方法筛选t3代种子中的纯合子种子。
108.将水稻突变体oself4a-1的t3代纯合种子和日本晴种子在光照周期12h light/12h dark，温度30℃，光照强度10000μmol/m2/s的培养条件下进行耐盐性测试。实验重复3次取平均值，每次重复的步骤如下：分别取日本晴和水稻突变体oself4a-1的t3代纯合种子各32粒于牛皮纸袋，37℃浸种48h；浸种后的种子37℃催芽12小时，将种子分别点在96孔板中，胚芽向上，培根向下；将种子置于盛有木村b培养液的塑料盒上并使已催芽的种子浸于木村b培养液，温室培养3周，得到生长至三叶期阶段的水稻幼苗。每隔一周需更换木村b培养液。(4)将所述96孔板(其上有生长至三叶期阶段的水稻幼苗)置于盛有含200mm nacl的木村b培养液的塑料盒上并使根部完全浸于含200mm nacl的木村b培养液，光暗交替培养下高盐胁迫14d(盐胁迫阶段，每隔3d更换一次含200mm nacl的木村b培养液)。将所述96孔板(其上有水稻幼苗)置于盛有木村b培养液的塑料盒上并使根部完全浸于木村b培养液，恢复培养14d。
109.结果如图3所示，其中，水稻幼苗的生长状态见图3中a所示。存活率统计结果见图3中b所示。其中，nip表示日本晴水稻，oself4a-1表示水稻突变体oself4a-1。显示值为平均值
±
标准差，n＝3。差异显著，p<0.05；**，差异极显著，p<0.01，统计分析方法为单因素方差分析。
110.从图3中可以看出，与日本晴野生型水稻相比，oself4a功能丧失的oself4a-1水稻在高盐胁胁迫培养后的存活率为30％，远远低于日本晴水稻的70％的存活率，也就是说，丧失oself4a功能会降低水稻的耐盐性，说明oself4a是与水稻耐性相关的蛋白，具体为，丧失oself4a功能的水稻的耐盐性会降低。
111.为了进一步验证oself4a参与水稻耐盐的调控，检测了盐处理后野生型日本晴(nip)与突变体(oself4a-1)之间叶绿素含量以及离子泄漏率的差别，检测结果如图4所示，其中，图4a为离子泄漏率比对结果图，图4b为叶绿素含量比对结果图。
112.其中，叶绿素含量测定方法如下，野生型和突变体在200mm nacl与0mm nacl处理一周，然后取处理后的叶片，记录离体的重量作为鲜重(w)。将叶片浸泡于3ml浓度为80％丙酮(v/v)中，在黑暗条件下于室温孵育48小时，并将记录其体积为v。取上清，用分光光度计在波长为od645和od663nm时测量吸光值，并记录。然后根据公式(8.02a663 20.21a645)*v/w计算叶绿素含量。
113.离子泄露率测定方法为：取180mm nacl处理7天和未处理的叶片在无菌的去离子水中轻轻摇晃过夜。用电导率仪测量电导率，记录为c1。然后将样品煮沸10-20分钟之后，冷却至室温，用电导率仪测量电导率，记录为c2。c1∶c2的比值为离子泄漏率。
114.从图4a中可以看出，在正常条件下nip和oself4a-1突变体的离子泄露率均很低，
且二者没有明显变化；然而nacl胁迫导致oself4a-1突变体中离子泄露率明显偏高,高于nip，说明oself4a在盐胁迫响应中的确发挥正调控作用。从图4b中可以看出，在在盐胁迫处理7天后，野生型的叶绿素含量要高于oself4a-1突变体，该结果说明，oself4a-1突变体对盐胁迫更加敏感，其受盐胁迫危害的程度明显强于nip。
115.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。