一种三菌株耦合发酵廉价合成3的制作方法

一种三菌株耦合发酵廉价合成3
′‑
唾液酸乳糖的方法
技术领域
1.本发明涉及一种三菌株耦合发酵廉价合成3
′‑
唾液酸乳糖的方法，属于生物发酵领域。


背景技术：

[0002]3′‑
唾液酸乳糖在母乳中，尤其是初期母乳中以较高的丰度存在，对婴儿的成长具有重要的作用，在食品行业尤其是婴幼儿配方奶粉产业展现出潜在、广阔的市场前景。由于唾液酸乳糖在哺乳动物母乳中的含量很低，通过天然提取法得到的唾液酸乳糖产量低、成本高且操作复杂。化学合成法需要繁琐的保护和去保护过程，而酶的纯化较为昂贵和困难，于是全细胞催化法生产3
′‑
唾液酸乳糖具有一定的优势。
[0003]
母乳是新生儿出生后的最佳营养物，含有婴儿成长和发育所需的所有必需营养素。它所含的成分比牛奶、奶粉更健康有益，这些功能成分的一部分是人乳寡糖(human milkoligosaccharides，hmos)。hmos的高含量和结构多样性是人类独有的，在成熟的牛乳中以及婴儿配方奶粉中仅存在痕量。人乳寡糖作为在人乳中含量仅次于乳糖和脂类的第三大固体成分，浓度在成熟的母乳中以10-15g/l的水平变化，在初乳中甚至达到20-30g/l，对婴幼儿的健康发育具有重要的作用。
[0004]
hmos在防止病原体和毒素粘附于上皮表面上起着重要作用。由于其与细胞聚糖结构的相似性，通过充当可溶性诱饵来防止病毒和细菌粘附到其碳水化合物粘膜受体上，从而有助于抵抗肠道病原体。作为多种细菌和病毒的可溶性受体，hmos可以抑制空肠弯曲杆菌和肺炎链球菌等多种细菌与肠上皮的粘附。此外，还可通过与细胞结合的聚糖受体竞争来防御细菌性肠毒素，例如霍乱毒素。hmos在肠道免疫系统中起促进作用，具有益生元作用。这是因为有益细菌会代谢hmos并利用其降解所产生的代谢产物(例如短链脂肪酸)，从而促进有益菌(例如双歧杆菌)在结肠中的生长，而有害细菌则无法代谢hmos，以此改善婴幼儿的微生物肠道菌群，以保持肠道的生态平衡；或者通过降低肠道ph等机制来抑制病原体的繁殖。 hmos具有促进神经系统和大脑发育的功能。研究证明唾液酸用于婴儿脑组织中神经节苷脂和糖蛋白的合成，hmos末端的唾液酸残基可以提供唾液酸来增加脑神经节苷脂和糖蛋白的浓度，促进婴幼儿大脑成熟。
[0005]
目前，已经有200多种hmos的结构被鉴定出来。hmos由葡萄糖(glucose，glc)、半乳糖(galactose，gal)、岩藻糖(fucose，fuc)、n-乙酰氨基葡萄糖(n-acetyl-glucosamine，glcnac) 和n-乙酰神经氨酸(n-acetylneuraminic acid，neu5ac，也称唾液酸)五种单糖结构单元组成，这五种单糖在糖基转移酶下形成直链或支链的低聚糖。人乳寡糖的还原端通常是乳糖结构，而非还原端通常含有岩藻糖和/或唾液酸部分，所以hmos可以分为三种类型：(1)中性寡糖——岩藻化寡糖和非岩藻化寡糖；(2)酸性寡糖——唾液酸化寡糖；(3)同时具有岩藻化和唾液酸化修饰的寡糖。
[0006]
其中，唾液酸寡糖通过寡糖与碳水化合物在表皮生长因子(egf)受体上的相互作用，抑制肠道上皮细胞增殖并诱导细胞分化，促进肠道成熟。唾液酸乳糖具有抗感染和免疫
调节作用。研究发现，唾液酸乳糖中的唾液酸以糖缀合物形式存在于细菌表面以及宿主细胞膜上，具有多个取代结合位点，通过竞争这些结合位点，唾液酸乳糖可以预防或减少病原体的体外粘附。此外，唾液酸乳糖还具有抗菌和抗炎活性，促进益生菌增殖改善肠道菌群，有助于婴儿免疫系统的发育和成熟，促进婴儿大脑成熟改善学习能力等作用，近年来受到人们越来越多的关注。
[0007]
目前，唾液酸乳糖的制备主要有天然提取、化学合成、酶法合成和生物合成等方法。天然提取是指从低聚乳糖含量较高的山羊乳中提取(低聚乳糖含量是牛乳的4-5倍，是羊乳的 10倍)，利用膜截留原理通过超滤、纳滤从山羊乳中分离纯化得到的寡糖混合物中3
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唾液酸乳糖含量仅为0.03-0.05g/l，要想得到只有3
′‑
唾液酸乳糖的纯物质还需要进一步分离纯化。化学合成法是使用自动固相合成，但是由于构建糖苷键的立体选择性控制和苛刻的反应条件，以及唾液酸寡糖糖环上有很多活性基团，需要反复的保护和脱保护过程，使得操作相当繁琐，且存在能量消耗较大、环境污染严重等缺点，从一定程度上限制了化学法合成唾液酸乳糖的规模化生产。酶法合成是使用与3
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唾液酸乳糖合成相关的酶进行合成，michel gilbert等 (michel gilbert r b a e.the synthesis of sialylated oligosaccharides using a cmp-neu5acsynthetase/sialyltransferase fusion[j].nature biotechnology,1998,16(4).)通过在重组大肠杆菌内构建表达cmp-neuac合成酶和α-2,3-唾液酸转移酶基因的融合蛋白，在以乳糖、n-乙酰神经氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、atp和cmp为起始物的系统中，加入纯化后的融合蛋白，获得了3
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唾液酸乳糖。但是酶法需要将酶纯化后进行利用，增加了酶法合成的成本和难度，严重限制着生产规模。生物法合成分为单细胞合成和多细胞耦合，但是容易导致产物在细胞中积累，产生反馈抑制，限制3
′‑
唾液酸乳糖的产量，或是在发酵过程中需要不断投加底物来确保反应的正常进行，造成生产成本高。
[0008]
因此，在目前的技术中，唾液酸乳糖的操作复杂、生产率低、成产成本高阻碍了3
′‑
唾液酸乳糖大规模的生产与应用。


技术实现要素：

[0009]
本发明采用多菌耦合发酵的方法，通过微生物异源表达了α-2,3-唾液酸转移酶和cmp
‑ꢀ
唾液酸合成酶，构建得到了重组菌，将重组菌加入含有cmp的反应体系中，加上酵母菌的共同作用，能够以廉价的底物反应合成3
′‑
唾液酸乳糖。
[0010]
本发明提供了一种生产3
′‑
唾液酸乳糖的方法，所述方法是采用混菌耦合发酵的方式以 cmp、乳糖和neu5ac为底物来生成3
′‑
唾液酸乳糖；所述混菌耦合发酵是利用酿酒酵母、表达α-2,3-唾液酸转移酶的基因工程菌株和表达cmp-neu5ac合成酶的基因工程菌株。
[0011]
在一种实施方式中，所述表达α-2,3-唾液酸转移酶的基因工程菌株表达来源于n. meningitidis的α-2,3-唾液酸转移酶。
[0012]
在一种实施方式中，所述α-2,3-唾液酸转移酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0013]
在一种实施方式中，所述表达cmp-neu5ac合成酶的基因工程菌株表达来源于n. meningitidis的cmp-neu5ac合成酶，所述cmp-neu5ac合成酶的编码基因的核苷酸序列如 seq id no.1所示。
[0014]
在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌、酵母菌或枯草芽孢杆菌为宿主。
[0015]
在一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主优选为大肠杆菌，更优的，选择敲除了β-半乳糖苷酶的大肠杆菌为宿主。
[0016]
在一种实施方式中，所述cmp-neu5ac是利用表达cmp-neu5ac合成酶的基因工程菌以 ctp和唾液酸为底物发酵产生，或利用表达cmp-neu5ac合成酶的基因工程菌和酿酒酵母以 cmp和唾液酸发酵产生。
[0017]
在一种实施方式中，所述酿酒酵母和基因工程菌以(1～2):(1～2)的质量比加入反应体系中，反应时间2～6小时，唾液酸添加量为50～60mmol/l，mg
2
浓度10～20mm/l。
[0018]
在一种实施方式中，所述酿酒酵母已于2021年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61663。
[0019]
在一种实施方式中，所述酿酒酵母和基因工程菌以2:1的质量比加入反应体系中，反应时间2～6小时，唾液酸添加量为60mmol/l，mg
2
浓度20mm/l。
[0020]
在一种实施方式中，所述酿酒酵母的添加量为100g/l。
[0021]
在一种实施方式中，在以ctp、唾液酸和乳糖为底物时，加入表达cmp-neu5ac合成酶的重组菌和表达α-2,3-唾液酸转移酶的基因工程菌。
[0022]
在一种实施方式中，所述ctp、唾液酸和乳糖的含量分别为60-90mm、50-90mm和 70-90mm。
[0023]
在一种实施方式中，在以cmp、唾液酸和乳糖为底物时，加入酿酒酵母、表达cmp-neu5ac 合成酶的基因工程菌和表达α-2,3-唾液酸转移酶的基因工程菌，三菌的比例为 (1～2):(1～2):(1～2)。
[0024]
在一种实施方式中，三菌以2:1:1的质量比加入反应体系中，所述酿酒酵母的添加量为 100g/l。
[0025]
在一种实施方式中，cmp、唾液酸和乳糖的含量分别为60-90mm、50-90mm和70-90mm。
[0026]
在一种实施方式中，反应25～40h。
[0027]
在一种实施方式中，在25～35℃、150-250r/min条件下反应。
[0028]
本发明的有益效果：
[0029]
本发明通过在微生物异源表达了α-2,3-唾液酸转移酶和cmp-唾液酸合成酶，构建得到了重组菌，将重组菌及酵母菌加入含有低浓度cmp的反应体系中，能够直接以廉价的乳糖、唾液酸和cmp为底物来合成3
′‑
唾液酸乳糖，显著降低了生产成本，且能够应用于工业化的大规模生产。
[0030]
生物材料保藏
[0031]
本发明所提供的酿酒酵母，分类学名称为saccharomyces cerevisiae，于2021年5月12 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61663，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
[0032]
图1为重组质粒pet28a-neua酶切验证图；注：m：10000dna marker；1：经nde i/sali双酶切后的重组质粒。
[0033]
图2为不同标准品的hplc图；(a)cmp；(b)cdp；(c)ctp；(d)cmp-neu5ac。
[0034]
图3为e.coli bl21(de3)/pet28a-neua合成cmp-neu5ac分析图；(a)为破碎上清；(b) 为菌体加底物；(c)为破碎上清不加底物；(d)为菌体不加底物。
[0035]
图4为e.coli bl21(de3)/pet28a-k235nneua表达合成cmp-neu5ac分析图；(a)为破碎上清加底物；(b)为破碎上清不加底物。
[0036]
图5为重组质粒pet28a-nst的酶切验证图。
[0037]
图6为重组质粒pet22b-nst的酶切验证；注：m：10000dna marker；经nco i/bamh i 双酶切后的重组质粒。
[0038]
图7为jm109(de3)/pet28a-neua重组蛋白的sds-page图；m：marker；泳道1为诱导前；泳道2为诱导后。
[0039]
图8为jm109(de3)/pet28a-nst重组蛋白nst的sds-page图；m:marker；1:诱导前；2：诱导后
[0040]
图9为两株基因工程表达目标蛋白酶的sds-page图；m：蛋白marker；1： bl21(de3)/pet22b-nst诱导前全细胞；2：bl21(de3)/pet22b-nst诱导20h的全细胞；3： bl21(de3)/pet28a-nst诱导前全细胞；4：bl21(de3)/pet28a-nst诱导20h的全细胞。
[0041]
图10为单菌合成cmp-neu5ac的hplc检测图；a：cmp-neu5ac标品液相图；b：单菌催化产物(cmp-neu5ac)液相图。
[0042]
图11为不同菌体浓度对jm109(de3)/pet28a-neua(a)和bl21(de3)/pet28a-neua(b) 合成cmp-neu5ac的影响。
[0043]
图12为重组菌jm109(de3)/pet28a-neua的重复使用。
[0044]
图13为cmp-neu5ac的检测图；注：a：tlc检测：1：cmp；2：cdp；3：ctp；4： cmp-neu5ac；5：双菌耦合催化；b：标品cmp；c：标品cmp-neu5ac；d：双菌耦合催化液相图。
[0045]
图14为tlc检测3
′‑
唾液酸乳糖；注：1：乳糖；2：3
′‑
sl；3.：乳糖 cmp-neu5ac；4： bl21(de3)/pet28a-nst菌体 乳糖；5：bl21(de3)/pet28a-nst菌体 乳糖 cmp-neu5ac；6： bl21(de3)/pet28a-nst破碎上清 乳糖 cmp-neu5ac；7：bl21(de3)/pet28a-nst破碎沉淀 乳糖 cmp-neu5ac；8：bl21(de3)/pet22b-nst菌体 乳糖；9：bl21(de3)/pet22b-nst菌体 乳糖 cmp-neu5ac；10：bl21(de3)/pet22b-nst破碎上清 乳糖 cmp-neu5ac。
[0046]
图15为tlc检测3
′‑
唾液酸乳糖；注：1：乳糖；2：唾液酸乳糖；3：纯化前；4：流穿； 5：水洗；6：80％乙腈洗脱。
[0047]
图16为tlc检测3
′‑
唾液酸乳糖；注：1：乳糖；2：3
′‑
sl；3：jm109(de3)/pet28a-nst 菌体；4：jm109(de3)/pet22b-nst菌体。
[0048]
图17为tlc检测3
′‑
唾液酸乳糖；注：1：乳糖；2：3
′‑
sl；3：纯化前；4：流穿；5：水洗；6：80％乙腈洗脱；7：乳糖 唾液酸。
[0049]
图18为tlc检测3
′‑
唾液酸乳糖；注：1：乳糖；2：葡萄糖；3：3
′‑
sl；4：三菌耦合催化产物。
[0050]
图19为3
′‑
唾液酸乳糖的maldi-tof-ms分析图。
具体实施方式
[0051]
1、ctp的分析检测
[0052]
(1)tlc薄层色谱鉴定
[0053]
展开剂的配置：乙醇：1m ph6.5乙酸铵＝6：4，参考herman h.higa j c p.sialylationof glycoprotein oligosaccharides with n-acetyl-,n-glycolyl-,and n-o-diacetylneuraminic acids[j]. the journal of biological chemistry,1985,260(8838-8849)。
[0054]
点样：将cmp、ctp和样品分别点在tlc薄板上，每次点样2μl，少量多次，使其样品点直径不超过2mm。待其烘干后才能放入层析缸中。
[0055]
展层：将tlc薄板倾斜置于装有展开剂的层析缸中，有样品的一端向下，浸在展开剂中 (液面低于点样位置)。展开剂延伸到距离tlc薄板上端1cm时，取出烘干。
[0056]
显色：通过紫外照射显色。
[0057]
(2)hplc分析检测
[0058]
hplc检测cmp、ctp条件如表1所示。
[0059]
表1 hplc检测ctp含量的相关参数
[0060][0061]
cmp、ctp标品检测结果如图2～图3所示，cmp的出峰时间为5.8min，ctp出峰时间为7.0min。
[0062]
2、cmp-neu5ac的分析检测
[0063]
(1)tlc薄层色谱鉴定
[0064]
同ctp的分析检测方法。
[0065]
(2)hplc分析检测
[0066]
hplc检测cmp-neu5ac条件如表2所示。
[0067]
表2 检测cmp-neu5ac的hplc条件
[0068]
[0069][0070]
3、唾液酸乳糖的检测及分离纯化
[0071]
(1)分离纯化
[0072]
反应后的溶液经过10000r/min，离心10min，得到的上清用hypersep hypercarb固相萃取小柱(spe小柱)分离纯化。纯化步骤如下：
[0073]
①
活化：用3ml甲醇活化spe小柱。
[0074]
②
平衡：加入3ml去离子水平衡spe小柱。
[0075]
③
上样：加入样品500μl，流下的液体记为流穿。
[0076]
④
水洗：使用3ml去离子水淋洗spe小柱，得到的液体记为水洗。
[0077]
⑤
洗脱：用3ml 80％乙腈洗脱spe小柱，得到的溶液记为纯化后。
[0078]
(2)tlc薄层色谱鉴定
[0079]
展开剂的配置：正丙醇：水：25％氨水＝7.5:3:2(体积比)。
[0080]
苯胺-二苯胺-磷酸显色剂的配置：4g二苯胺、4ml苯胺与20ml 85％磷酸共溶于200ml 丙酮中。
[0081]
显色：将干燥的tlc薄板均匀浸没于显色剂中，待烘干后于105℃加热5min。
[0082]
实施例1：异源表达neua重组菌的构建
[0083]
以n.meningitidis中neua基因序列为模板，设计引物neuaf(5
′‑ꢀ
ttccatatggaaaaacaaaatattgcggttatac-3
′
，下划线为nde i酶切位点)和neuar (5
′‑
gacgtcgacttagctttccttgtgattaagaatgttt-3
′
，下划线为sal i酶切位点)，来扩增neua基因，pcr获得大小为687bp的cmp-neu5ac合成酶基因(核苷酸序列如seq idno.1所示)，pcr产物纯化回收后，用nde i和sal i双酶切，纯化回收酶切片段。然后将pet28a 空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的片段连接，连接产物转化e.coli jm109 取适量转化液涂布在含kan的lb培养基平板上，37℃过夜培养，菌落pcr正确后挑取单菌落摇瓶培养、提取质粒并酶切验证得到两条片段大约为5310bp和687bp(结果如图1所示)。将获得的重组表达质粒pet28a-neua，经进一步测序验证正确后，得到重组质粒pet28a-neua，将pet28a-neua转化到e.coli bl21(de3)和敲除了编码β-半乳糖苷酶的lacz基因的菌株 e.coli jm109(de3)
△
lacz，在含kan的lb培养基平板上筛选，筛选出的含有重组质粒 pet28a-neua的转化子即为重组菌
jm109(de3)/pet28a-neua和e.coli bl21(de3) /pet28a-neua。
[0084]
实施例2：异源表达nst的工程菌株构建
[0085]
以n.meningitidis中α-2,3-唾液酸转移酶基因nst基因序列为模板，设计引物nstf(5
′‑ꢀ
atgccatggggtctgaaaaaggtctgtct-3
′
，酶切位点：nco i)和nstr (5
′‑
cgggatccttatttggatttaccatgagattggtttttgt-3
′
，酶切位点：bamh i)，来扩增nst基因，pcr获得大小为1137bp的唾液酸乳糖转移酶基因(核苷酸序列如seq id no.2 所示)，pcr产物纯化回收后，用nco i和bamh i双酶切，纯化回收酶切片段片段。然后将 pet28a空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的片段连接，连接产物转化到e.colijm109(de3)。取适量转化液涂布在含kan的lb培养基平板上，37℃过夜培养至长出单菌落，挑取单菌落摇瓶培养、提取质粒并酶切验证，对重组pet28a-nst进行了nco i和bamh i 双酶切验证，电泳结果如图5所示。将获得的重组表达质粒pet28a-nst，测序结果与目的基因一致，表明重组质粒pet28a-nst构建成功，含有pet28a-nst的重组菌为jm109(de3) /pet28a-nst。将pet28a-nst转化到e.coli bl21(de3)和菌株e.coli jm109(de3)，在含 kan的lb培养基平板上筛选，筛选出的含有重组质粒pet28a-neua的转化子即为重组菌 jm109(de3)/pet28a-nst和e.coli bl21(de3)/pet28a-nst。
[0086]
按照上述方式，将nst基因构建至pet22b载体，获得重组质粒pet22b-nst。对该质粒进行nco i和bamh i双酶切验证，电泳结果如图6所示。从图6可以看出，重组质粒pet28a-nst 酶切后，电泳得到两条片段分别大约为5400bp(pet28a酶切后为5471bp)和1100bp左右 (nst基因由1137bp碱基编码)。将重组质粒送去测序，测序结果与目的基因一致，表明重组质粒pet22b-nst构建成功。将pet22b-nst转化到e.coli bl21(de3)和菌株e.coli jm109 (de3)，在含kan的lb培养基平板上筛选，筛选出的含有重组质粒pet22b-nst的转化子即为重组菌jm109(de3)/pet22b-nst和e.coli bl21(de3)/pet22b-nst。
[0087]
实施例3：重组菌蛋白的诱导表达与检测
[0088]
(1)异源表达neua重组菌的蛋白诱导与检测
[0089]
将实施例1中构建的重组菌jm109(de3)
△
lacz/pet28a-neua接种至含20μg/ml kan的 10ml lb液体培养基中，在37℃、200r/min摇瓶培养12h，再按2％(2ml/100ml)的接种量转接到含20μg/ml kan的100ml lb液体培养基中，37℃、200r/min摇瓶培养至od
600
约为0.6后，加入终浓度为0.1mmol/l的iptg进行诱导，200r/min摇瓶培养20h。4℃、8 000 r/min离心10min收集菌体。将诱导前及诱导20h的菌液分别与sds-page loading缓冲液混匀，100℃加热10min，得到诱导前、后样品，sds-page检测目的蛋白的表达。
[0090]
从图7可以看出，与对照组(未诱导的重组菌)相比，诱导组在25kd-35kd之间有明显的表达条带，与现有报道的条带大小一致(30.4kda)，说明neua酶在工程菌株jm109(de3) /pet28a-neua中成功表达。
[0091]
(2)异源表达nst重组菌的蛋白诱导与检测
[0092]
按照步骤1的方式，将实施例2中构建得到的重组菌jm109(de3)/pet28a-nst、 bl21(de3)/pet28a-nst和e.coli bl21(de3)/pet22b-nst分别诱导表达目的蛋白。
[0093]
图8为菌株jm109(de3)/pet28a-nst诱导前和诱导后的蛋白表达图，从图8可以看出，与对照组(未诱导的重组菌)相比，其在35kd-45kd之间新增一条明显的蛋白条带，该数值与目标蛋白(43.3kda)一致。这表明工程菌株jm109(de3)/pet28a-nst中的nst酶在大肠
杆菌中成功实现表达。
[0094]
图9为菌株bl21(de3)/pet28a-nst和e.coli bl21(de3)/pet22b-nst诱导前和诱导前的蛋白表达图，从图中可以看出bl21(de3)/pet28a-nst诱导20h的蛋白条带(泳道4)与对照组(泳道3)相比，其在35kd～45kd之间新增一条明显的蛋白条带，该数值与目标蛋白 (43.3kd)一致。bl21(de3)/pet22b-nst(泳道2)也能实现目的蛋白的表达。
[0095]
实施例4：cmp-neu5ac的合成
[0096]
1、单菌转化合成cmp-neu5ac
[0097]
转化条件：20mm mgcl2、1mm dtt、150mm tris，60mm ctp、60mm neu5ac和 50g/l jm109(de3)/pet28a-neua菌体(湿重)，30℃，200r/min条件下反应4h。即可得到 cmp-neu5ac(图10)，表明通过重组菌jm109(de3)/pet28a-neua可实现cmp-neu5ac的生产。
[0098]
(1)对工程菌菌体浓度对合成cmp-neu5ac的影响进行了分析，将上述步骤中的菌体量分别设置为50g/l、100g/l、150g/l、200g/l，分别利用工程菌jm109(de3)/pet28a-neua和 bl21(de3)/pet28a-neua进行发酵，相应的产量结果如图11所示。从图11可以看出，菌浓为 200g/l时，jm109(de3)/pet28a-neua和bl21(de3)/pet28a-neua合成的cmp-neu5ac在3h时达到最大值，随着发酵时间的增加，cmp-neu5ac被逐渐降解；当菌浓为100g/l和150g/l时，jm109(de3)/pet28a-neua和bl21(de3)/pet28a-neua的cmp-neu5ac的合成量在3、4h时达到最大数值，尤其是100g/l菌浓生成的cmp-neu5ac浓度最高，高达29g/l左右，然后随着时间的增加，cmp-neu5ac迅速降解；当菌浓为50g/l时，jm109(de3)/pet28a-neua和 bl21(de3)/pet28a-neua的cmp-neu5ac的合成量先随着时间的增加而增加，反应4h时 cmp-neu5ac达到最大值，为26g/l左右，转化率为72％左右，然后随着时间的增加，合成的 cmp-neu5ac浓度基本保持稳定，维持在22g/l左右。因此，选择50g/l的工程菌株菌浓作为最 jm109(de3)/pet28a-neua和bl21(de3)/pet28a-neua合成cmp-neu5ac的最优菌浓。
[0099]
(2)工程菌株jm109(de3)/pet28a-neua的重复利用次数
[0100]
在确定了最佳菌体浓度为50g/l的条件基础上，研究工程菌株jm109(de3)/pet28a-neua 重复利用对于催化合成cmp-neu5ac的影响。结果如图12所示。将第一次的转化率设定为100％，经过4次重复利用后，工程菌的转化率仍可达到第一次的40％，因而工程菌株 jm109(de3)/pet28a-neua对于补料和分批发酵都是适用的。
[0101]
2、双菌耦合发酵合成cmp-neu5ac
[0102]
发酵条件：以80mm cmp、80mm neu5ac为底物，在300mm葡萄糖、248.3mm kh2po4、 1mm dtt、150mm tris、10ml/l甘油、6ml/l乙醛、一定浓度的mgcl2、50g/l jm109(de3) /pet28a-neua和100g/l酿酒酵母(酿酒酵母gdmcc no:61663)的溶液中，在30℃、200r/min 条件下反应。
[0103]
tlc检测结果如图13所示。从图中可以看出，经耦合催化系统催化后，成功在发酵液中检测到cmp-neu5ac。为进一步确定产物，通过hplc对cmp、cmp-neu5ac标品和啤酒酵母与jm109(de3)/pet28a-neua耦合催化产物进行了分析，双菌耦合催化产物的出峰时间与标准cmp-neu5ac相同(图13c和图13d)。
[0104]
实施例5：酶法合成3
′‑
唾液酸乳糖
[0105]
利用工程菌株的破碎液酶法合成3
′‑
唾液酸乳糖。
[0106]
酶法合成条件：将工程菌株bl21(de3)/pet28a-nst和bl21(de3)/pet22b-nst分别
接种至 lb培养基(加卡那霉素)，iptg诱导20h后离心收集菌体，将菌体用适量缓冲液(150mmol
·
l-1 tris-hcl、20mmol
·
l-1
mgcl2、1mmol
·
l-1
dtt，ph8.0)重悬超声破碎，4℃，8000r
·
min-1
，离心20min，得到破碎上清部分和破碎沉淀部分。破碎沉淀用等量的缓冲液重悬。取250μl 破碎上清溶液、250μl破碎沉淀重悬液、终浓度为50g/l的湿菌体(作为全细胞合成的细胞) 分别加入80mm cmp-neu5ac，并加入80mmol
·
l-1
乳糖、20ml
·
l-1
甘油、10ml
·
l-1
二甲苯、 248.3mmol
·
l-1
kh2po4、5g
·
l-1
mgcl2、4g
·
l-1
nymeen s-215，组成500μl体系，在30℃、200r
·
min-1
的条件下反应30h，探究工程菌bl21(de3)/pet28a-nst(或bl21(de3)/pet22b-nst) 菌体、破碎上清、破碎沉淀三部分催化合成3
′‑
唾液酸乳糖的情况。将反应后的催化液8000 r
·
min-1
离心5min，保留上清液。
[0107]
通过tlc检测3
′‑
唾液酸乳糖的生成。tlc检测结果如图14所示。bl21(de3)/pet28a-nst 和bl21(de3)/pet22b-nst两种工程菌破碎上清的催化液(泳道6、泳道10)和破碎后沉淀的催化液(泳道7、泳道11)都有与标准品3
′‑
唾液酸乳糖(l2)rf值相同的寡糖部分，而全细胞的催化液(泳道5、泳道9)都没有相同的物质生成，且可以看到泳道5和泳道9中几乎没有与标准品乳糖(泳道1)rf值相同的物质。
[0108]
为进一步确认泳道6(工程菌bl21(de3)/pet28a-nst破碎上清的催化液)与标准品3
′‑ꢀ
唾液酸乳糖(泳道2)的rf值相同的部分是否为3
′‑
唾液酸乳糖。将反应30h的破碎上清催化液，8000r
·
min-1
离心5min，得到的上清经过spe小柱纯化，利用tlc进行分析检测，结果如图15所示。从图中可以看出80％乙腈洗脱部分(泳道6)与标准品3
′‑
唾液酸乳糖(泳道2)的rf值相同，因此可以确定产物为3
′‑
唾液酸乳糖。这表明：构建的重组质粒pet28a-nst 和pet22b-nst均有唾液酸转移酶活性，可以利用乳糖和cmp-neu5ac合成3
′‑
唾液酸乳糖。
[0109]
实施例6：多菌耦合发酵生产3
′‑
唾液酸乳糖
[0110]
(1)单细胞发酵选择工程菌宿主和表达载体
[0111]
①
利用工程菌jm109(de3)/pet28a-nst或jm109(de3)/pet22b-nst为发酵菌株生产3
′‑ꢀ
唾液酸乳糖
[0112]
发酵条件：2ml体系中包含1ml按照实施例4所示方法合成的cmp-neu5ac溶液和1 ml 80mm乳糖、20ml/l甘油、10ml/l二甲苯、248.3mm kh2po4、5g/l mgcl2、4g/l nymeens-215、50g/l jm109(de3)/pet28a-nst(或jm109(de3)/pet22b-nst)组成的溶液，在30℃、 200r/min的条件下反应30h。反应液经过spe小柱纯化，利用tlc进行分析检测。结果如图14。
[0113]
②
利用工程菌bl21(de3)/pet22b-nst为发酵菌株生产3
′‑
唾液酸乳糖
[0114]
按照上述的实施例方式，利用菌株bl21(de3)/pet22b-nst发酵合成唾液酸酸乳糖，结果如图14所示，从图14中可以看出，工程菌bl21(de3)/pet22b-nst细胞破碎后的上清和沉淀都有唾液酸转移酶活性，可以合成3
′‑
唾液酸乳糖，但是菌株bl21(de3)/pet28a-nst的全细胞反应却没有3
′‑
唾液酸乳糖的生成，并且外源添加的乳糖底物被消耗殆尽。造成该现象的主要原因应该是大肠杆菌bl21(de3)菌株含有β-半乳糖苷酶，外源乳糖被内源β-半乳糖苷酶(lacz) 水解，用于自身的生长或内源性代谢，而不是用于3
′‑
唾液酸乳糖的合成；破碎后的上清和沉淀部分由于细胞破碎后虽然有β-半乳糖苷酶，但是由于细胞的代谢活动被终止，因此乳糖被降解成葡萄糖和半乳糖的需求大大降低，而是主要用于合成3
′‑
唾液酸乳糖。考虑到编码β
‑ꢀ
半乳糖苷酶的lacz基因部分缺失的大肠杆菌菌株(例如dh5α和jm系列)无法同化乳糖或利用乳糖，这些大肠杆菌菌株可用于3
′‑
唾液酸乳糖的生产。因此，选择
能够在t7启动子控制下过表达蛋白质的大肠杆菌jm109(de3)作为3
′‑
sl生产的替代宿主。
[0115]
因此，选择能够在t7启动子控制下过表达蛋白质的大肠杆菌jm109(de3)作为3
′‑
唾液酸乳糖生产的替代宿主。
[0116]
将上述制备得到的重组菌jm109(de3)/pet28a-nst和jm109(de3)/pet22b-nst，接种至含 20μg/ml kan的10ml lb液体培养基中，在37℃、200r/min摇瓶培养12h，再按2％的接种量转接到含20μg/ml kan的100ml lb液体培养基中，37℃、200r/min摇瓶培养至od
600
约为0.6后，加入终浓度为0.1mmol/l的iptg进行诱导，200r/min摇瓶培养20h，4℃、8 000 r/min离心10min收集菌体，并按照实施例5条件进行发酵。结果如图16所示。从图中可以看出，利用jm109(de3)/pet28a-nst和jm109(de3)/pet22b-nst全细胞催化都可以合成3
′‑
唾液酸乳糖，且jm109(de3)/pet28a-nst全细胞催化得到的3
′‑
唾液酸乳糖比 jm109(de3)/pet22b-nst多；l4(jm109(de3)/pet22b-nst菌体)有与标准品乳糖(泳道1) rf值相同的物质，但是含量低于jm109(de3)/pet28a-nst细胞的发酵产物浓度。因此选择转化率更高的jm109(de3)/pet28a-nst菌株作为发酵菌株。
[0117]
(2)双菌耦合催化条件
[0118]
转化条件：反应体系2ml，以60mm ctp、60mm neu5ac、80mm乳糖为底物，在20 mm mgcl2、1mm dtt、150mm tris、20ml/l甘油、10ml/l二甲苯、4g/l nymeen s-215、 248.3mm kh2po4、50g/l jm109(de3)/pet28a-neua、50g/l jm109(de3)/pet28a-nst溶液中， 30℃、200r/min条件下反应30h。反应液经过spe小柱纯化，利用tlc进行分析检测。
[0119]
结果如图17所示。在图中，标准品3
′‑
唾液酸乳糖(泳道2)和发酵液(泳道3)可以看出：泳道3中有与标准品rf相同的寡糖存在，对发酵液用spe柱纯化后的不同组份依次为泳道4， l5和泳道6，其中l6的rf值与标准品纯3
′‑
唾液酸乳糖完全相同，但同时有乳糖的存在，这是因为80％乙腈不仅能洗脱酸性寡糖，还能把中性寡糖洗脱下来。这表明：以ctp、唾液酸和乳糖为底物，jm109(de3)/pet28a-neua和jm109(de3)/pet28a-nst耦合发酵的条件下，成功合成了3
′‑
唾液酸乳糖。
[0120]
(3)三菌耦合催化条件
[0121]
转化条件：反应体系2ml，以70mm cmp、60mm neu5ac、80mm乳糖为底物，在含300mm葡萄糖、20mm mgcl2、248.3mm kh2po4、1mm dtt、150mm tris、20ml/l甘油、6ml/l乙醛，10ml/l二甲苯、4g/l nymeen s-215、100g/l啤酒酵母(酿酒酵母gdmccno:61663)、50g/l jm109(de3)/pet28a-neua、50g/l jm109(de3)/pet28a-nst溶液中，30℃、 200r/min条件下反应30h。反应液经过spe小柱纯化，利用tlc进行分析检测。
[0122]
结果如图18所示，发酵液中(l3)含有与标准品3
′‑
唾液酸乳糖相同rf值的组份，用质谱进一步进行表征(图19)，分子量为m/z 632([m-h]-)，分子量正确。这表明：利用“三菌株耦合发酵体系”成功实现了3
′‑
唾液酸乳糖的合成。
[0123]
对比例1：不同来源neua片段的工程菌构建、表达与转化cmp-neu5ac活性
[0124]
来自于大肠杆菌k235的neua酶n端序列(hind iii和bamh i酶切位点)通过酶切、连接步骤，连接pet28a载体，获得表达载体pet28a-k235neua，转入e.coli bl21(de3) 感受态细胞，获得e.coli bl21(de3)/pet28a-k235nneua转化子。然后按照体系转化条件： 20mmol
·
l-1
mgcl2、1mmol
·
l-1
dtt、150mmol
·
l-1
tris，60mmol
·
l-1
ctp、60mmol
·
l-1
neu5ac 和50g
·
l-1
工程菌菌体(湿重)，在30℃，200r
·
min-1
条件下反应2h。用hplc分析结果。与标
品相比(图2d)，e.coli bl21(de3)/pet28a-neua合成cmp-neu5ac(图3)和e.colibl21(de3)/pet28a-k235nneua合成cmp-neu5ac的分析图中(图4)，仅e.colibl21(de3)/pet28a-neua表达的酶具有催化合成cmp-neu5ac的能力。
[0125]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。