一种提高大球盖菇木质纤维素酶活性的方法与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，具体的说，涉及一种提高大球盖菇木质纤维素酶活性的方法。


背景技术：

2.食用真菌属于丝状真菌中的一种，主要利用农林废弃资源（例如：农作物秸秆和林下枯枝落叶）为基质进行生长，并且是通过分泌木质纤维素酶类将生物界中复杂的木质纤维素进行分解、吸收和利用。利用微生物对农业废弃资源进行生物降解是绿色循环的方式之一，而食用真菌不仅能够转化农业废弃资源，还能够产生具有经济价值的蘑菇子实体，所以更是具有广阔应用前景的微生物之一。
3.在食用菌中，大球盖菇以其较强的环境适应能力，能够在田间和林下进行栽培，并且近年来推广栽培的面积也在不断的扩大。然而粗犷的栽培模式对农作物秸秆的降解效率仍然有限，一方面需要我们不断的优化栽培工艺，另一方面采用基因工程手段进行分子育种，也是未来微生物发展的方向。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种提高大球盖菇木质纤维素酶活性的方法。本发明通过利用碳代谢转录因子(crea)基因的沉默解除碳代谢阻遏效应，使大球盖菇纤维素酶和半纤维素酶活性显著提高，从而增强秸秆的降解效率。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种大球盖菇碳代谢转录因子crea基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示，编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。
6.一种用于沉默大球盖菇碳代谢转录因子crea基因的crea基因特异性片断，其核苷酸序列如seqidno.3所示，该序列长度为332bp。
7.一种大球盖菇碳代谢转录因子crea基因的沉默体系，其具有如seqidno.3所示的序列长度为332bp的crea基因特异性片段。
8.上述大球盖菇碳代谢转录因子crea基因的沉默体系的构建方法，包括以下步骤：1）设计特征引物crea-1f和crea-1r：crea-1f：attaggtaccatgggctccgaccagcagcrea-1r:attactagtggcgtcgtaggcagtcccga2)提取大球盖菇rna，反转录成cdna作为模板，采用特征引物crea-1f和crea-1r进行pcr扩增，获得扩增的crea基因片段，再利用kpnⅰ和speⅰ对扩增的crea基因片段进行双酶切，获得seqidno.3所示的332bp的crea基因特异性片段；3)利用内切酶kpnⅰ和speⅰ对改造后的包含rnai干扰序列的pan7-1沉默载体质粒进行双酶切，回收获得pan7-1空载体片段；
4)将步骤2）获得的crea基因特异性片段和步骤3）获得的pan7-1空载体片段进行连接，获得连接成功的crea沉默载体；5)将获得的crea沉默载体热激转入大肠杆菌top10感受态细胞中，在含有氨苄青霉素amp的lb培养基中培养，进行阳性单菌落检测和测序验证，构建得到载体质粒；6)将步骤5）构建好的载体质粒转入大球盖菇原生质体中，获得沉默转化子；7）将转化子进行大球盖菇碳代谢转录因子crea基因表达量检测验证，构建得到大球盖菇碳代谢转录因子crea基因的沉默菌株。
9.进一步的，本发明还提供一种提高大球盖菇木质纤维素酶活性的方法，其利用大球盖菇碳代谢转录因子crea基因的沉默体系解除碳代谢阻遏效应，使大球盖菇纤维素酶和半纤维素酶活性提高。
10.和现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明通过基因沉默技术对大球盖菇碳代谢转录抑制因子crea的功能进行研究，将为进一步通过分子手段操纵crea的表达来调控大球盖菇纤维素酶的活性提供理论依据，从而为提高农业废弃物的降解效率和缩短大球盖菇的栽培周期提供了广阔的应用前景。
附图说明
11.图1为大球盖菇碳代谢阻遏因子crea基因沉默菌株的构建图；a构建大球盖菇crea沉默载体示意图，通过大球盖菇自身3-磷酸甘油脱氢酶启动子和35s启动子共同驱动的crea干扰序列，amp为质粒携带抗性标记；b将在转化后生长的转化子进一步在130ul50mg/mlhyg培养基上进一步筛选；c提取转化子dna进行潮霉素基因pcr验证；dwt，crea-3i和crea-7i菌株在培养基上生长情况；e对wt，crea-3i和crea-7i菌株的crea基因进行qrt-pcr相对表达量的验证。
12.图2大球盖菇碳代谢阻遏因子crea沉默菌株木质纤维素酶活性的变化；a以纤维素和水稻秸秆为底物处理的内切-β-1,4葡聚糖酶活性变化；b以纤维素和水稻秸秆为底物处理的外切-β-1,4葡聚糖酶活性变化；c以纤维素和水稻秸秆为底物处理的β-1,3葡萄糖苷酶活性变化；d以纤维素和水稻秸秆为底物处理的木聚糖酶活性变化。
具体实施方式
13.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细介绍。
14.实施例中，大球盖菇菌种是“沪球3号”，为上海市农业科学院食用菌所选育品种。
15.实施例1图1为大球盖菇碳代谢阻遏因子crea基因沉默菌株的构建图示。
16.（1）在大球盖菇基因组中获得碳代谢转录因子(crea)核苷酸序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示,选择332bp基因片段作为沉默序列如seqidno.3，并设计引物包括：crea-1f：attatgggctccgaccagcagccccgtcccta（seqidno.4）crea-1r:attactagtggcgtcgtaggcagtcccga（seqidno.5）
（2）提取大球盖菇rna，反转录成cdna作为模板，并根据基因沉默序列设计的引物crea
ꢀ‑
1f/1r进行pcr扩增，pcr扩增体系为：2
×
primer star 25μl；ec2-1f 1μl；ec2-1r 1μl；cdna 1μl；补水至50μl，反应条件为：94℃ 3min；94℃ 30s；58℃ 30s；72℃ 60s 循环35次；72℃ 5min，并使用上海生物工程胶回收试剂盒进行回收目的片段。并使用kpnⅰ和speⅰ对扩增的crea基因片段进行双酶切，并使用上海生物工程胶回收试剂盒进行目的片段回收。具体酶切体系为：目的片段 10μl；10
×
qc buffer 3μl；酶
ⅰꢀ
1μl；酶
ⅱꢀ
1μl；补水至30μl，酶切条件：37℃，1-2小时。
17.（3）同时使用的内切酶kpnⅰ和speⅰ对pan7-1沉默载体质粒（其具体构建方法参照文献: zhang j , hui c , chen m , et al. construction and application of a gene silencing system using a dual promoter silencing vector in hypsizygus marmoreus[j]. journal of basic microbiology, 2017, 57(1):78.）行双酶切，并使用上海生物工程胶回收试剂盒进行空载体片段回收。将碳代谢转录因子基因片段和pan7-1空载体片段进行连接（图1a），连接体系为：slution
ⅰꢀ
5μl；pan7-1空载体片段 3μl；目的片段2μl。连接条件为：4℃ 16小时，最后将连接产物转化至大肠杆菌中，挑选阳性转化子。pan7-1沉默载体质粒载体中具有双启动子：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子序列，花椰菜病毒 35s rna基因启动子序列；筛选标记基因：乳清酸核苷-5
‘‑
单磷酸脱接酶基因和氨苄霉素基因等序列，在将携带目的基因的载体转入大球盖菇体内能够引起rnai机制，从而干扰相应目的基因表达的载体。
[0018]
（4）将培养7天的大球盖菇平板打孔接种到pdb液体培养基中，25 ℃静置培养4 d，期间间或摇匀，用漏斗过滤菌丝，用 0.6 m 甘露醇溶液洗涤 2 次，用灭菌后的吸水纸将甘露醇吸干，每 300 mg 湿菌丝加入 1 ml2%溶壁酶酶液。在摇床上32℃、 60 rpm轻摇3h，将分解液用灭菌的砂芯漏斗过滤以除去细胞碎片，过滤液以 3000 rpm 离心 10min；收集沉淀，用渗透压稳定剂洗涤一次，得到纯化原生质体。
[0019]
（5）将构建好的载体质粒与脂质体1:1混合（每个平板需要5μl质粒 5μl脂质体），4 ℃孵育30 min；将孵育好的原生质体（10 μl）加入100μl原生质体，4 ℃孵育30 min；涂布平板（含100mg/l amp, 50mg/l kan和2.5mg/l 潮霉素），28 ℃培养大约两周，生长出转化子。
[0020]
（6）将大球盖菇转化子转至50mg/ml潮霉素培养基上继续培养，筛选具有抗性的菌株（图1b），并抽提转化子dna进行潮霉素基因pcr验证，验证潮霉素基因是否整合到大球盖菇基因组中，潮霉素基因引物为：hyg-f: gtcgtggcgatcctgcaagc; hyg-r: cctgcgggt aaa tagctgcgc，如图1c所示。
[0021]
挑选图1c所示的第3个菌株和第7个菌株命名为crea-3i和crea-7i，接种带有玻璃纸的培养基上，培养7天收集菌丝（图1d），然后进行qrt-pcr进行相对表达量的验证，实时荧光定量 pcr 内参基因是大球盖菇的 18s rrna 基因，荧光定量 pcr 的扩增体系 20μl，包括 0.4μl（ 10μmol/l）引物， 10μl sybr qpcr mix（takara），2.0μl cdna和补水至20μl。qrt-pcr 扩增条件：95℃ 5min 变性，随后 30 个循环包括 95℃ 5s 预变性， 60℃ 15s 延伸和 72℃ 20s 延长；基因的相对表达量根据2-δδct
方法进行计算(图1e)。结果表明通过本发明获得大球盖菇的沉默转化子crea基因表达量下调了60-80%。
[0022]
进一步将野生型菌株（wt）和大球盖菇转化子crea-3i和crea-7i转至液体培养基（葡萄糖2%；豆粕粉0.3%; 酵母提取物0.2%; 蛋白胨0.3%; 0.1% mgso4; 0.15% kh2po4）培
养5天；然后转移至单一碳源（0.5%纤维素和0.5%秸秆）的mm培养基中，培养2天后测定发酵液中的内切-β-1,4葡聚糖酶、外切-β-1,4葡聚糖酶、β-1,3葡萄糖苷酶和木聚糖酶活性，具体方法参照文献: zhang j, zhang g, wang w, et al. enhanced cellulase production in trichoderma reesei rut c30 via constitution of minimal transcriptional activators[j]. microbial cell factories, 2018, 17。图2为大球盖菇碳代谢阻遏因子crea沉默菌株木质纤维素酶活性的变化，结果表明，相比于野生型大球盖菇菌株，转化子在降解纤维素和秸秆过程中的纤维素酶、葡萄糖苷酶和木聚糖酶都显著提高。