一种生产PHB的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应用与流程

一种生产phb的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种生产phb的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应用。


背景技术：

2.石油工业生产的塑料具有良好的柔韧性和轻盈等特性，已成为人们生活中不可缺少的商品。然而，石油来源的塑料生物降解性低、回收和分类复杂，存在严重的环境污染，尤其是对海洋生态系统。聚-β-羟丁酸(poly-β-hydroxybutyric,phb)是一类由微生物合成的高分子聚酯，具有生物可降解性和生物相容性，因而被认为是环境友好型材料，广泛应用于农业、环保、生物化工、医药、医用材料等领域。
3.phb的生物合成主要是通过微生物自身代谢，其中最主要的是微生物发酵法，也是研究最为广泛的方法。但是现阶段，大多数的微生物发酵过程是需氧的，需要耗费大量的能量供氧。运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)作为一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，具有许多独特的生理特点和优异的工业生产特性，是目前已知唯一能够在厌氧条件下利用2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(entner-doudoroff，ed)途径的微生物，具有较高的糖吸收率、乙醇收率和乙醇耐受性等优良特性。作为一种兼性厌氧生物，运动发酵单胞菌可以在厌氧条件下发酵，且相较于有氧条件表现更好，从而可以解决微生物发酵过程面临的供氧难题，如搅拌、通气以及空气灭菌等。目前已经在运动发酵单胞菌中实现了乳酸、2-3丁二醇，异丁醇等产品的生产。因此，通过基因工程，代谢工程等手段得到运动发酵单胞菌的phb生产菌株，并结合过程工程手段如絮凝和发酵条件优化等方法进一步提高phb产量，使运动发酵单胞菌成为乙醇和phb生产的高效细胞工厂具有重要意义。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种生产phb的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
5.本发明是这样实现的，一种生产phb的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法，将序列分别如seq id no.1-seq id no.3所示的phac、phaa和phab，3个外源基因序列按照ptet-phac-rbs-phaa-rbs-phab的顺序串联得到ptet-phacab操纵子，序列如seq id no.4所示；利用基因编辑手段，将zm4基因组上的zmo0038基因用ptet-phacab替换，得到菌株zmpt；删除菌株zmpt中zmo1082基因第181位的核苷酸胸腺嘧啶，得到絮凝菌株zmpt-flo。
6.发明人实验发现phacab操纵子位于染色体上比位于质粒中具有更好的生产效果。位于质粒中时，phb的产量为0.24％dcw，而位于染色体上的zmpt的phb的产量为2.07％dcw，产量提高了8.6倍。
7.进一步地，用引物zwf-phac-f与phab-r扩增ptet-phacab操纵子上的phacab片段；将基因zwf片段与phacab片段连接，得到zwf-phacab片段；将zwf-phacab片段与pgap启动子
连接形成pgap-zwf-phacab操纵子；将pgap-zwf-phacab操纵子与pez-15a反扩载体片段组装得到pez-pg
n2
；将pez-pg
n2
转入zmpt-flo中，得到zmpt-flo
n2
；
8.zwf-phac-f：aaagaggagaaaggatctcccatggccaccggcaaagg
9.phab-r：ggccgctactagtttaacccatatgcaagccaccattc
10.进一步地，通过将pez15a中的复制子，替换成zm4中39-032内源质粒中的复制子得到穿梭载体pez39p；39-032内源质粒中的复制子序列如seq id no.7所示。
11.进一步地，将ada、adh2基因构建到穿梭载体pez39p中，ada、adh2基因中间用rbs序列atcacagggtctagaaggaggtcgaa连接，得到质粒pe39p-pe
eup
，将pe39p-pe
eup
转入zmpt-flo
n2
中，得到zmpt-flo
n2-eup
。
12.进一步地，ada、adh2基因序列分别如seq id no.8和seq id no.9所示。
13.本发明还提供了如上述的一种生产phb的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法在构建能够实现乙醇和phb共同生产的工程菌及其应用。
14.本发明还提供了利用上述的方法构建的工程菌在同时生产乙醇和phb中的应用。
15.进一步地，利用四环素诱导工程菌生产乙醇和phb。
16.进一步地，发酵生产所用培养基为mg5培养基，培养基中碳氮比为5:1或10:1。
17.进一步地，zmpt-flo
n2-eup
菌株进行循环发酵，以同时产生乙醇和phb。
18.综上所述，本发明的优点及积极效果为：
19.本发明构建了生产phb的运动发酵单胞菌重组菌株，并公开了其构建过程和方法。该菌株有以下的优势：
20.(1)抗噬菌体污染，运动发酵单胞菌自身有强大的限制修饰系统，较大肠杆菌等常用工程菌株有更强的抗噬菌体能力。
21.(2)降低生产成本，由于运动发酵单胞菌为兼性厌氧微生物，在发酵过程中不需要额外的溶氧控制设备，可以有效降低生产的成本。
22.(3)本研究所得的运动发酵单胞菌phb生产菌株，能够在积累phb的同时积累乙醇，并且乙醇的积累不受phb影响。
23.(4)本发明构建了自絮凝菌株，能够进行自我絮凝沉降，减少了发酵结束后离心分离的步骤，可大大减少下游过程中产物分离的成本。
24.(5)phb高产自絮凝菌株zmpt-flo
n2-eup
能够进行多次循环发酵，无需多次添加菌种，仅需补充培养基，能够保证稳定的乙醇产率和phb积累。
附图说明
25.图1是菌株关系图
26.图2是基因编辑整合原理图；
27.图3是样品处理方法图；
28.图4是质粒构建图；
29.图5是运动发酵单胞菌自絮凝phb高产菌株的phb产量及酒精产量图；
30.图6是phb絮凝菌株的构建与工艺优化，乙醇连续发酵与phb生产的操作流程图；
31.图7是循环发酵流程图。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
33.本发明披露了一种生产phb的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应用。本发明的目的是以运动发酵单胞菌zm4为出发菌株，通过基因工程的手段对菌株进行改造，引入特定的外源基因，实现phb在运动发酵单胞菌中的生产，然后通过一系列基因工程和代谢工程改造提高phb产量，最终实现乙醇和phb的共同生产。
34.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：以运动发酵单胞菌zm4为出发菌株，首先利用基因工程的手段改造菌株，引入密码子优化后的外源phb合成的三个必需基因phaa，phab，phac与四环素诱导型启动子(ptet)一起构成操纵子整合zm4基因组上得到zmpt菌株，再敲除zmpt菌株基因组zmo1082基因上特定核苷酸胸腺嘧啶(t)得到絮凝菌株zmpt-flo，然后引入质粒pez-pg
n2
得到菌株zmpt-flo
n2
，最后将pe39p-pe
eup
质粒引入菌株zmpt-flo
n2
得到最终菌株zmpt-flo
n2-eup
。
35.本发明中运动发酵单胞菌的基因工程、工艺优化及连续循环发酵共产phb和乙醇的操作流程如图a所示，运动发酵单胞菌phb生产菌株的构建流程如图1所示。
36.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
37.实施例1运动发酵单胞菌生产phb菌株的构建
38.本实施例中首先将来源于真氧产碱杆菌(ralstonia eutrophah16)的phb合成酶(phac)、3-酮硫代酶(phaa)、乙酰乙酰辅酶a还原酶(phab)三个酶的基因串联得到phacab操纵子，利用运动发酵单胞菌内源crispr-cas技术将ptet-phacab操纵子片段整合到运动发酵单胞菌zm4基因组上zmo0038基因的位置得到菌株zmpt。
39.1、质粒构建
40.phb的三个必须基因序列如下，ptet-phacab操纵子序列如下：
41.phac(seq id no.1)，phaa(seq id no.2)，phab(seq id no.3)。
42.将以上seq id no.1-seq id no.3所示的phac、phaa和phab，3个外源基因序列按照ptet-phac-rbs-phaa-rbs-phab的顺序串联得到ptet-phacab操纵子，详细序列如下(序列顺序为5’到3’，第1-624位为ptet序列，第2395-2418以及第3601-3624位为rbs序列)(seq id no.4)。
43.本发明中，首先在zm4中建立phb合成途径，利用诱导型启动子ptet驱动phac、phaa、phab 3个基因串联，得到以上ptet-phacab操纵子。以南京金斯瑞公司合成的phac、phaa、phab(保菌于通用puc质粒载体)为dna扩增模板，设计引物扩增得到目的片段(划线部分为同源臂)。
44.构建操纵子所用的扩增引物如下：
45.ptet-f:cggccgcttctagagttaagacccactttcacatttaagttg
46.ptet-r:gggagatcctttctcctctttagatc
47.ptet-cab-f:gatctcccggatccatggccaccggcaaag
48.phac-r:cttactttctctagattatggttaggctttagctttaacataacgaccag
49.phaa-f:ccataatctagagaaagtaagcacatgaccgatgttgtcattgtctctg
50.phaa-r:gtgcttactttctctagattatggttatttgcgttcaacggccaaag
51.phab-f:ctagagaaagtaagcacatgacccaacgtattgcctatc
52.phab-r:ggccgctactagtttaacccatatgcaagccaccattc
53.利用运动发酵单胞菌内源crispr-cas技术将ptet-phacab操纵子片段整合到运动发酵单胞菌zm4基因组上zmo0038基因的位置，整合原理如图2。内源crispr-cas技术需要构建编辑质粒，以执行接下来的基因编辑工作。
54.编辑质粒所用的扩增引物如下：
55.0038-gr1-f:gaaagcgtccagcaaaatacgccttctattgatgaa
56.0038-gr1-r:gaacttcatcaatagaaggcgtattttgctggacgc
57.0038-up-f:caccagctcaccgtctgctttttgccgacaaagcg
58.0038-up-r:tcacgcccgacgccagacgggattagaaattttgtcg
59.0038-up-ptet-f:ggcgtcgggcgtgattaagacccactttcacatttaagttgtttttctaatc
60.phab-down-r:cgtctatctgaatatttaacgattaacccatatgcaagccacc
61.0038-down-f:tcgttaaatattcagatagacggagataataaacgggagagaggtcg
62.0038-down-r:gctcgagatctgatatcactcaacagatcaacc
63.0038-up-pgap-f:ggcgtcgggcgtgagttcgatcaacaacccgaatcctatc
64.crispr-反扩-f:gtgatatcagatctcgagctcggtacccgggtttgac
65.crispr-反扩-r:gacggtgagctggtgacctgccttatctctttcccc
66.测-0038-f:tgccagcttctgttggagaaaacagg
67.测-0038-r:cgcaagccaagctgcgt
68.①
ptet-phacab操纵子的构建
69.利用overlap pcr将ptet启动子、phac、phaa、phab三个dna片段连接成一个长片段，得到ptet-phacab操纵子。经设计，ptet启动子的3’端与phac基因的5’端拥有同源序列；phac基因的3’端与phaa基因的5’端拥有同源序列；phaa基因的3’端与phab的5’端拥有同源序列；phab基因的3’端与pez15a载体拥有同源序列。根据overlap pcr利用同源序列两两连接的原理，将ptet-phac-phaa-phab连接在一起(其中phac与phaa，phaa与phab之间的rbs序列带到phac、phaa、phab基因的同源序列中)。overlap pcr体系如下：
[0070][0071]
第一步以以上体系进行。pcr条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，47℃退火10s，72℃延伸40s，共10个循环。第二步将第一步完成的混合物取出，加上所需引物ptet-cab-f和phab-r各1.5μl进行扩增，pcr条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸40s，共26个循环。pcr完成后进行dna电泳验证，验证正确后进行dna回收得到片段
phacab。将phacab与ptet启动子利用overlap pcr相连，pcr体系如下。
[0072][0073]
第一步以以上体系进行。pcr条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，47℃退火10s，72℃延伸45s，共10个循环。第二步将第一步完成的混合物取出，加上所需引物ptet-f和phab-r各1.5μl进行扩增，pcr条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸45s，共26个循环。pcr完成后进行dna电泳验证，验证正确后进行dna回收得到ptet-phacab操纵子。
[0074]
②
编辑质粒的构建
[0075]
菌株的稳定性是工业发酵生产应用的关键，而质粒往往容易从菌株中丢失，因此这里进一步将生产phb的途径整合在基因组。将操纵子ptet-phacab整合到zm4菌株染色体zmo0038位置(该位置的变化对菌株生长没有影响)，编辑质粒构建原理如图2。
[0076]
将空载编辑质粒pl2r(该质粒构建参考zheng et al.,nucleic acids research 47：11461-11475)在37℃处进行过夜酶切。酶切体系如下：
[0077][0078]
过夜酶切，将酶切产物进行dna回收。基因编辑工作所构建的编辑质粒，由一个间隔区间spacer引导cas蛋白靶向目的基因处进行编辑工作。该间隔区包含一个5
’‑
ccc-3’pam位点的整个32bp序列。将间隔区设计为两条正反引物用于退火(0038-gr1-f,0038-gr1-r)，将反应混合物加热到95℃，退火5min，然后逐渐冷却到室温。退火体系如下：
[0079][0080]
退火后的间隔区spacer取2μl，在18℃与线性酶切后的pl2r载体与t4连接酶进行过夜酶连，以插入将替换片段与zm4基因组连接的donor(供体dna)片段。酶连体系如下：
[0081][0082]
过夜酶连，将酶连产物进行dna回收。得到的回收产物转化到大肠杆菌dh5α菌株感受态细胞中，涂平板于lb加壮观霉素的固体培养基中，隔天挑取单菌落进行菌落pcr验证寻找正确的转化子称之为grna。验证引物为(0038-gr1-f，pez15a-r)。
[0083]
donor的设置由所替换的zmo0038上下游500bp(分别称之为up stream和down stream端)，序列如下：
[0084]
0038-up stream：
[0085]
tcacgcccgacgccagacgggattagaaattttgtcgataaacgcgccgtgacgcaataattcttgtgggctggcctcgtggggtcttggttgtcttttgacctttttattacgaggtagaccggaaaccgtgttcggggcagacaagcgtccatcggatgggccgttattgtcatccaaggccataccgatttgccgtccgcctgtcagttcaacataaagctgtgccagcaattcggcatcgagcaaggcgccatgtttgacgcgatggctgcggtcaataccgtagcgggtacataatgcgtcaagggtatgtttggcaccgggatgtttgccgcgcgcaatcgccaaggtatcgaccattcgggtcatacaaatggtcggaaggccgcatttatccaattcgtaattcaaaaagccgaaatcgaaggccgcattatgggcgaccaaaggcgacaatttgataaaggaaagcagttcttgcgctttgtcggcaaaaag
[0086]
0038-down stream：
[0087]
caacagatcaaccggcaatttatccacggcatcaaattcgatcggttctttcaggcggacaaaaaagccggagacttttttcaggctgtcgagcttgccatgtggtatcgcaataccatgaccaaaacctgtcgaaccgagcgtttctctttcatgtaaccgttcggcgataaccttggggttaattagaaattctcgcccagcccattgggcaacctgctggaagagtgtttttttgttagaaggattgaaattcacctcaatcctgtccggcgcgattatatcggccagttcattcatgttttttcgcctttatatgcccacgattgcaaagatcgcagcatcagacattttctgaaagacacagcctttcagaaaataaagtcaaaattctagcaatattccttccggaaacgggggagaggggtcgataattctcttgaaaagagggagcgacctctctcccgtttattatctccgtctatctgaatatttaacga
[0088]
在其中间插上替换片段ptet-phacab，将三个片段通过overlap pcr连接成donor(up stream-ptet cab-down stream)。然后将该donor与grna质粒的反向扩增片段(以crispr-反扩-f，crispr-反扩-r为引物进行扩增)构建成质粒。构建过程如下：
[0089]
反向扩增grna质粒
[0090][0091]
将得到的grna反向扩增产物按试剂盒步骤进行dna胶回收
[0092]
吉布森组装构建质粒：
[0093]
将donor(up stream-ptet cab-down stream)与grna质粒的反向扩增片段(含壮观霉素筛选抗性基因)按照3:1的摩尔比例进行吉布森组装，具体比例参照下表。该体系在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌dh5α感受态细胞，进行化学转化。利用壮观霉素抗性(100μg/ml)平板进行筛选，挑取单菌落，进行pcr验证，用pez15a载体上的一对引物pez15a-f和pez5a-r对单菌落进行菌落pcr检测。pcr扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。验证引物如下：
[0094]
pez15a-f：ggcaaagccaccctatttttag
[0095]
pez5a-r：cacttcactgacaccctcat
[0096][0097]
得到正确转化子后养起来提取所得编辑质粒。将该编辑质粒电转化进zm4菌株，通过菌落pcr验证寻找到正确的转化子。
[0098]
2、将编辑质粒构建到目的运动发酵单胞菌中
[0099]
①
目的运动发酵单胞菌菌株感受态的制备
[0100]
用接种环挑取适量运动发酵单胞菌zm4甘油菌在rmg5固体培养基(rmg5:50g/l葡萄糖，10g/l酵母提取物，2g/l kh2po4，3g/l琼脂)平板上划线，30℃倒置培养2～3天活化；挑取活化的单菌落转接至含有10ml左右的rmg5(rmg5:50g/l葡萄糖,10g/l酵母提取物,2g/l kh2po4)液体培养基中，于30℃静置培养至对数中期用作种子液；转接种子液至含有200ml rmg5液体培养基的250ml蓝盖瓶中，控制初始od在0.025～0.03之间。30℃静置培养至od＝0.4～0.6；将装有菌液的蓝盖瓶放至冰上冷却30min后，用预冷的50ml离心管于4000rpm，离心10min收集菌体，弃上清；向离心管中加入30ml预冷的无菌水重悬洗涤菌体，混合均匀后，4000rpm离心10min弃上清；向离心管中加入30ml预冷的10％甘油重悬洗涤菌体，混合均匀后，4000rpm离心10min弃上清，并重复该步骤一次；加入1％(体积比)的预冷的10％甘油重
悬菌体，缓慢混合均匀后于冰上进行分装，每50μl分装至无菌的1.5ml离心管中，置于液氮中速冻后于-80℃保存。
[0101]
②
将编辑质粒转入目的运动发酵单胞菌感受态细胞中
[0102]
取运动发酵单胞菌zm4感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后取50μl加入电转杯中，并在电转杯中加入1μg质粒。电转条件为1600v，25μf，200ω。电转完毕后于rmg5液体培养基中于30℃培养箱复苏。复苏4-6小时的培养物于6000rpm，1min离心，除去部分上清。悬浮菌体取100μl涂布于100μg/ml壮观霉素抗性平板，30℃培养2天。待有菌落生长出来之后，以zmo0038的前后500bp外围引物(测-0038-f，测-0038-r)进行菌落pcr，若所得pcr产物通过dna凝胶电泳验证出大小为ptet-phacab将zmo0038成功替换的大小，则认为是编辑成功，将pcr原液送给公司测序。若得到已经编辑成功的菌株(ptet-phacab成功替换zm4基因组上zmo0038基因)，将该菌株在rmg5培养基中传代至菌株能在rmg5生长但不能在rmg5添加壮观霉素的环境下生长，以丢掉编辑质粒。最终得到zmpt菌株。
[0103]
3、菌株发酵测试
[0104]
将所得到的的目的菌株zmpt在rmg5中进行发酵测试。首先取一定量甘油菌接种到含有1ml rmg5(加有1μl壮观霉素)的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，倒入含有适量培养基的容器中作为发酵种子液于30℃培养箱静置培养至对数中后期，接种到rmg5以80％装瓶量于100ml三角瓶的培养基中，以不同四环素浓度(0，0.2，0.8，1.2μg/ml)进行诱导发酵。在od
600nm
处控制初始od为0.1。在发酵过程中，用紫外分光光度计测量od
600nm
处的光密度，测定不同时间点的细胞生长，并将不同时间点取得的发酵液收集，后用于hplc(高效液相色谱仪)中检测葡萄糖和乙醇的含量。采用岛津商贸有限公司agilent 1100系列高效液相色谱仪(lc-20ad)；检测器为示差折光检测器(rid-10a)；色谱柱为有机酸色谱柱(bio-rad aminex hpx-87h，300mm
×
7.8mm)；池温度为40℃，柱温箱温度为60℃；流动相为5mm的硫酸，流速为0.5ml/min，仪器运行时初始流速设置为0.2ml/min，待柱压稳定后以0.1ml/min的流速逐渐增加至0.5ml/min；进样量为20μl。
[0105]
流动相的配置：取1.41ml色谱级浓硫酸至5l的蓝盖瓶中，用超纯水定容至5l后混合均匀，使用0.45μm孔径的水相滤膜进行过滤。将过滤后的流动相分装至1l流动相蓝盖瓶中进行超声脱气20～30min。等恢复至室温后即可使用。
[0106]
4、phb样品的处理及测定
[0107]
①
phb样品的处理
[0108]
phb定量是基于用热浓硫酸将phb聚合物转化为巴豆酸的方法。将发酵终点的培养物用50ml离心管于冷冻离心机在25℃，4000rpm，离心8-10min收集菌体。去掉上清液，将收集完的菌体用纯水洗两次，每次洗菌后同样于冷冻离心机在25℃，4000rpm，离心8-10min。将最后得到的去除上清的菌体放于65℃烘箱过夜烘干菌体。得到的干菌体研磨成粉，取20mg粉状菌体倒入25ml玻璃具塞比色管中，加入5ml浓硫酸，置于90℃下加热1h。取出冷却后在室温下，将混合物用5mm2％硫酸稀释100倍，通过0.22μm过滤器(默克米勒孔，ma，美国)过滤，取400μl到hplc进样瓶中。样品处理方法示意如图3。
[0109]
③
phb的测定
[0110]
phb不能直接用于hplc测量，需要将其用热浓硫酸转化为巴豆酸，检测巴豆酸的含量间接得到phb的产量，由于phb标准曲线的制作也是同样的处理方法，所以此检测方法能
够直接得到phb的产量。巴豆酸的测试使用aminexhpx-87h离子交换柱(bio-rad，ca，usa)进行分离，利用spd-20a，紫外检测器检测。在25℃下进行，5mm硫酸为流动相，流速为0.6ml/min。每个样品中进行了三次重复分析。
[0111]
经测试在四环素1.2μg/ml的浓度下phb产量最高，为2.07％dcw。
[0112]
实施例2构建自絮凝菌株
[0113]
1、菌株构建
[0114]
前期研究发现运动发酵单胞菌zm4突变株zm401能够自絮凝，进一步的研究表明，在zmo1082中，一个核苷酸胸腺嘧啶的缺失导致的移码突变将zmo1082与zmo1083整合成融合基因bcsa_401，该基因编码纤维素合成酶的催化亚基，能够帮助纤维素合成，从而促进絮凝。
[0115]
本实施例中通过删除菌株zmpt中zmo1082位置的特定核苷酸胸腺嘧啶，与zmo1083形成融合基因，具体质粒构建所需扩增引物及zmo1082序列如下：
[0116]
flo-gr-f：gaaagctcttatggtggttgctgttccgctaccgct
[0117]
flo-gr-r：gaacagcggtagcggaacagcaaccaccataagagc
[0118]
flo-up-f：accagctcaccgtctttaactttcatatcggcgtacaagaagaag
[0119]
flo-up-r：agcaaccaccataagagctgcaacggtaatcaagcaaagcaatg
[0120]
flo-down-f：gctcttatggtggttgctgttccg
[0121]
flo-down-r：gctcgagatctgatatcactgtcacagtcaaaaatgcagactaattcacc
[0122]
测-flo-f:gcgcccatcagcttttaaga
[0123]
测-flo-r:gcgcccatcagcttttaaga
[0124]
zmo1082:
[0125]
atgcttcataaaagccgtataaaaattaaaaacacgctttctgaagctaaatatattttagagcatttgtgggattctgctctgcaatggccattgctttgcttgattaccgttgccgctcttatggtggttgctgttccgctaccgctttattatcaatgggtctatggcatttttttttatgggattgacgctgctgattga
[0126]
(带下划线的第181位t为删除的特定核苷酸胸腺嘧啶)
[0127]
将空载编辑质粒pl2r(zheng et al.,nucleic acids research 47：11461-11475)在37℃处进行过夜酶切。酶切体系如下：
[0128][0129]
过夜酶切，将酶连产物进行dna回收。基因编辑工作所构建的编辑质粒，由一个间隔区间spacer引导cas蛋白靶向目的基因处进行编辑工作。该间隔区包含一个5
‘‑
ccc-3’pam位点的整个32bp序列。将间隔区设计为两条正反引物用于退火(flo-gr-f，flo-gr-r)，将反应混合物加热到95℃，退火5min，然后逐渐冷却到室温。退火体系如下。
[0130][0131]
退火后的间隔区spacer取2μl，在18℃与线性酶切后的pl2r载体与t4连接酶进行过夜酶连，以插入将替换片段与zm4基因组连接的donor(供体dna)片段。酶连体系如下。
[0132][0133]
过夜酶连，将酶连产物进行dna回收。得到的回收产物转化到大肠杆菌dh5α菌株感受态细胞中，涂平板于lb加壮观霉素的固体培养基中，隔天挑取单菌落进行菌落pcr验证寻找正确的转化子称之为grna。验证引物为(flo-gr-f，pez15a-r)。
[0134]
pez15a-r：cacttcactgacaccctcat。
[0135]
donor的设置由zmo1081到zmo1082到bsca三段基因中间的前后600bp构成(分别称之为upstream和downstream端)，序列如下：
[0136]
flo-up stream:
[0137]
ttaactttcatatcggcgtacaagaagaagaaatcccctttttgtctgtcgaaacgatggatgaattatatcaggcttcgcaggatttttcagggattactcttgcggatctaggaacggaaatccctaaatccagcatagcccaagaaaacattcttcatatttccattttgtctcccaatgcaggatgtatggctctgtttcccgaagcctttgacaagcagcattactacatcatcaataatgaaaatgaccgctataattttcctcgtgcggcctctcaatttgtgcaggacatggttcaagacaatttaatcggcatcatccgtcaggatgaagcggtgaatgaagccttggggaaattacagcctttacatctttatgcgccgacctctgtcgccttaaaagattttgataactgcgcccatcagcttttaagaatgatagaaatgaatatttcgcgtcatgcggaggtatccgccgatgcttcataaaagccgtataaaaattaaaaacacgctttctgaagctaaatatattttagagcatttgtgggattctgctctgcaatggccattgctttgcttgattaccgttgcc
[0138]
flo-down stream:
[0139]
gctcttatggtggttgctgttccgctaccgctttattatcaatgggtctatggcattttttttatgggattgacgctgctgattgatcgcagcccaagccattttgcctctattgttatctgtctttcctctattctgacttcaacccgatatatcttttggcgcattacgcaaacattgcgttttgaccacatcatggacgccgtttttggtggggttctgtttatggcagagctttatgcatgggctattcttatattagggttgttccagattttatggccgatgcagcgtcctgttgtcccgttatcaggcgaggatgaagagttacctacagttgatgtctttattccgacttataacgaaagcatggaaatcgttcaaaataccgttttcgcggctttgggaatggattatccaaaagaccgctttaacgtttatctgttgg
atgatggtcatcgagaagaattccgcctttttgcagaagaggcgggatgccattatttaacccgtaatgataatctgaatgccaaggcgggtaacctaaatgcggccttgaaaaagaccaaaggtgaattagtctgcatttttgactgtgac
[0140]
分别通过引物(flo-up-f和flo-up-r；flo-down-f和flo-down-r)扩增。upstream和downstream两个片段通过overlap pcr连接成donor(upstream-downstream)。然后将该donor与grna质粒的反向扩增片段(以crispr-反扩-f，crispr-反扩-r为引物进行扩增)构建成质粒。构建步骤如下：
[0141]
将donor与grna质粒的反向扩增片段(含卡纳霉素筛选抗性基因)按照3:1的比例进行吉布森组装，具体比例参照下表。该体系在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌dh5α感受态细胞，进行化学转化。利用卡纳霉素抗性(200μg/ml)平板进行筛选，挑取单菌落，进行pcr验证，用pez15a载体上的一对引物pez15a-f和pez5a-r对单菌落进行菌落pcr检测。pcr扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
[0142]
验证引物如下：
[0143]
pez15a-f：ggcaaagccaccctatttttag
[0144]
pez5a-r：cacttcactgacaccctcat
[0145][0146]
得到所得正确转化子后养起来提取所得编辑质粒。将该编辑质粒转化进zmpt菌株，由于无法通过pcr跑胶的凝胶电泳条带判断是否编辑成功。直接用验证引物(测-flo-f,测-flo-r)进行菌落pcr，将pcr产物送给擎科公司测序。若得到已经编辑成功的菌株，将该菌株在rmg5培养基中传代至菌株能在rmg5生长但不能在rmg5添加壮观霉素的环境下生长，以丢掉编辑质粒。得到絮凝菌株zmpt-flo。
[0147]
实施例3过表达辅因子供给相关基因
[0148]
基因的表达与启动子强度有关，这里本发明将构建以强启动子驱动过表达辅因子供给相关基因与phacab片段串联的基因片段，得到pgap-zwf-phacab操纵子，在zmpt-flo菌株中表达。
[0149]
1、pgap-zwf-phacab操纵子的构建
[0150]
由于phb积累过程的乙酰乙酰辅酶a还原酶phab催化的步骤依赖于nadph的消耗。因此通过过表达运动发酵单胞菌内源葡萄糖6磷酸脱氢酶(zwf，zmo0367)增强nadph供应，帮助提高phb产量。
[0151]
本发明构建以pgap启动子驱动的pgap-zwf-phacab操纵子，得到重组质粒pez-pg
n2
(pgap-zwf-phacab)，然后转入zmpt-flo细胞感受态得到菌株zmpt-flo
n2
，发酵检测phb和乙
醇产量。pez-pg
n2
质粒构建如图4。
[0152]
相关引物如下：
[0153]
zwf-f：atgacaaataccgtttcgacgatg
[0154]
zwf-r：gagatcctttctcctcttttcagtcataccaagttactccatcac
[0155]
zwf-phac-f：aaagaggagaaaggatctcccatggccaccggcaaagg
[0156]
phab-r：ggccgctactagtttaacccatatgcaagccaccattc
[0157]
以zwf-f和zwf-r为一对引物，分别用zm4为模板扩增50μl zwf基因片段后进行dna回收(按试剂盒的方法进行)。然后zwf-phac-f与phab-r扩增50μl ptet-phacab操纵子上的phacab片段，进行dna回收。pcr体系如下。
[0158][0159]
将所得zwf片段与phacab片段通过overlap pcr连接后进行dna胶回收得到zwf-phacab片段。将zwf-phacab片段与pgap启动子进行overlap pcr连接后形成pgap-zwf-phacab操纵子，操作方法如上，pgap启动子从zm4基因组中扩增而来，序列与所用引物序列如下：
[0160]
ptet启动子(seq id no.5)，pgap启动子(seq id no.6)。
[0161]
以下列引物进行dna扩增：
[0162]
pgap-f:gttcgatcaacaacccgaatcc
[0163]
pgap-r:aacggtatttgtcatgtttattctcctaacttattaagtagctac
[0164]
用pgap-f和pgap-r为一对引物，以zm4基因组为dna模板进行扩增，得到pgap启动子。将pgap启动子与zwf-phacab片段进行overlap pcr连接得到pgap-zwf-phacab操纵子。方法如上。
[0165]
2、zmpt-flo
n2
菌株的构建
[0166]
将pgap-zwf-phacab操纵子与pez-15a反扩载体片段通过吉布森组装构建质粒pez-pg
n2
。pez-15a反扩载体片段的获取是通过利用pez pgap反扩-f和pez15a pgap反扩-r引物以pez-pt为dna扩增模板反向扩增得到。pcr扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸40s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。扩增体系如下：
[0167][0168]
pez pgap反扩-f：ccatagatctcgagctcggt
[0169]
pez15a pgap反扩-r：aacggtatttgtcatgtttattctcctaacttattaagtagctac
[0170]
将所得pcr产物进行dna胶回收。得到的pez-15a反扩载体片段与pgap-zwf-phacab操纵子进行吉布森组装得到质粒pez-pg
n2
。
[0171]
吉布森组装构建质粒：
[0172]
将pgap-zwf-phacab操纵子与pez-15a反扩载体片段(含壮观霉素筛选抗性基因)按照3:1的比例进行吉布森组装，具体比例参照下表。该体系在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌dh5α感受态细胞，进行化学转化。利用壮观霉素抗性(100μg/ml)平板进行筛选，挑取单菌落，进行pcr验证，用pez15a载体上的一对引物pez15a-f和pez5a-r对单菌落进行菌落pcr检测。pcr扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸60s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。验证引物如下：
[0173]
pez15a-f：ggcaaagccaccctatttttag
[0174]
pez5a-r：cacttcactgacaccctcat
[0175][0176]
得到正确转化子后养起来提取所得质粒。将该质粒电转化进zmpt-flo菌株，通过菌落pcr验证寻找到正确的转化子。
[0177]
实施例4引入外源乙醇利用途径
[0178]
外源乙醇利用途径(eup)是一种由来自酿酒酵母的adh2和ada基因编码的利用乙醇的途径。它可以将1分子乙醇转化为乙酰辅酶a并产生2个nadh，而不用消耗atp来提供乙酰辅酶a依赖的生物化学物质。pez39p是将pez15a中的复制子，替换成zm4中39-032内源质粒中的复制子。通过t5外切酶依赖的dna组装(teda)方法，将39-032复制子片段克隆到pez15asp载体得到pez39p。
[0179]
39-032复制子序列如下(seq id no.7)：
[0180]
pez39p质粒的构建如下：
[0181]
①
扩增zm4内源质粒上39-032复制子片段
[0182]
以zm4菌株为dna扩增模板，体系如下：
[0183][0184]
将所得pcr原液进行dna溶液回收
[0185]
②
反向扩增pez15a质粒上的载体片段
[0186]
以pez15a质粒为dna扩增模板，体系如下：
[0187][0188]
将所得rcr原液进行dna胶回收
[0189]
③
将回收的39-032复制子片段与pez15a质粒上的载体片段利用吉布森组装构建质粒
[0190]
将39-032复制子片段与pez15a质粒上的载体片段(含壮观霉素筛选抗性基因)按照3:1的比例进行吉布森组装，具体比例参照下表。该体系在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌dh5α感受态细胞，进行化学转化。利用壮观霉素抗性(100μg/ml)平板进行筛选，挑取单菌落，进行pcr验证，用pez15a载体上的一对引物39-032-seq-f和pez5a-r对单菌落进行菌落pcr检测。pcr扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，5℃退火10s，7℃延伸1s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
[0191][0192]
所用的引物序列如下：
[0193]
39-032-p-spe-f：ttccgtagtgagtactgaatctatcgaaaggcaaatttctttctcg
[0194]
39-032-p-spe-r：agaagcggccgcgaattcagtcagaaccggcgccc
[0195]
pez-dp-反扩-f:ctgaattcgcggccgc
[0196]
pez-反扩-r:attcagtactcactacggaattgc
[0197]
39-032-seq-f:cggctctaaccgaccag
[0198]
pez5a-r：cacttcactgacaccctcat
[0199]
本技术中首先将eup途径的ada-adh2串联基因(以peno启动子驱动)构建到运动发酵单胞菌质粒pez39p中得到质粒pe39p-peeup。构建过程如下：
[0200]
由于构建的eup途径的质粒需转入带有壮观霉素抗性质粒的菌株中，因此需要把构建好的pez39p质粒载体中间的壮观霉素抗性基因换成卡纳霉素抗性基因。质粒pe39p-peeup的构建由pez39p质粒的反扩载体片段(抗性基因前端，抗性基因后端)、卡纳霉素抗性基因、peno-ada-adh2操纵子构成。
[0201]
①
pez39p质粒的反扩载体片段(抗性基因前端)的扩增：以pez39p质粒为dna扩增模板反向扩增
[0202][0203]
pez39p质粒的反扩载体片段(抗性基因后端)的扩增：以pez39p质粒为dna扩增模板反向扩增
[0204][0205]
卡纳霉素抗性基因的扩增：以zm4菌株为dna扩增模板
[0206]
[0207]
所得pcr原液均进行dna溶液回收
[0208]
②
将得到的pez39p质粒的反扩载体片段(抗性基因前端，抗性基因后端)、卡纳霉素抗性基因三个片段通过overlap pcr连接成一个片段。经设计，pez39p质粒的反扩载体片段(抗性基因前端)的3’端与卡纳霉素基因的5’端拥有同源序列；卡纳霉素基因的3’端与pez39p质粒的反扩载体片段(抗性基因后端)的5’端拥有同源序列。根据overlap pcr利用同源序列两两连接的原理，将pez39p质粒的反扩载体片段(抗性基因前端)-卡纳霉素-pez39p质粒的反扩载体片段(抗性基因后端)连接在一起。overlap pcr体系如下：
[0209][0210]
第一步以以上体系进行。pcr条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，47℃退火10s，72℃延伸40s，共10个循环。第二步将第一步完成的混合物取出，加上所需引物39质粒反扩-f和39p反扩后端-r各1.5μl进行扩增，pcr条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸40s，共26个循环。pcr完成后进行dna电泳验证，验证正确后进行dna回收得到pez39p质粒(带卡纳霉素抗性基因)的反扩载体片段。
[0211]
③
peno-ada-adh2操纵子的构建
[0212]
ada-adh2串联基因由zm4基因组上的peno启动子驱动，首先需要以zm4菌株为dna扩增模板扩增出peno启动子：
[0213][0214][0215]
所得pcr原液进行dna溶液回收得到peno启动子，将peno启动子与所得ada-adh2串联基因进行overlap pcr连接成peno-ada-adh2操纵子：
[0216]
将得到的peno启动子、ada-adh2串联基因通过overlap pcr连接成一个片段。经设计，peno启动子的3’端与ada-adh2串联基因的5’端拥有同源序列。根据overlap pcr利用同源序列两两连接的原理，将peno-ada-adh2连接在一起。overlap pcr体系如下：
[0217][0218]
第一步以以上体系进行。pcr条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，47℃退火10s，72℃延伸20s，共10个循环。第二步将第一步完成的混合物取出，加上所需引物39质粒反扩-f和39p反扩后端-r各1.5μl进行扩增，pcr条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，共26个循环。pcr完成后进行dna电泳验证，验证正确后进行dna回收得到peno-ada-adh2操纵子。
[0219]
③
pe39p-peeup质粒的构建
[0220]
将peno-ada-adh2操纵子片段与pez39p质粒(带卡纳霉素抗性基因)的反扩载体片段按照3:1的摩尔比例进行吉布森组装，具体比例参照下表。该体系在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌dh5α感受态细胞，进行化学转化。利用卡纳霉素抗性(200μg/ml)平板进行筛选，挑取单菌落，进行pcr验证，用pez15a载体上的一对引物测39-f和pez5a-r对单菌落进行菌落pcr检测。pcr扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸25s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
[0221][0222]
所用引物如下：
[0223]
39质粒反扩-f：cgtcccatagatctcgagc
[0224]
39质粒反扩-r：gatgtttaactcctgaattaagccgc
[0225]
39p反扩后端-f：tgtctaacaattcgttcaagccgacgc
[0226]
39p反扩后端-r：ctcgagagatctgatatcactctag
[0227]
kana-f：gcttaattcaggagttaaacatcatgagccatattcaacgggaaacg
[0228]
kana-r：ttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgc
[0229]
peno-f：tgtctatactccagttactcaatacgtaacaataatcagtttatcctaac
[0230]
peno-r：atcgaaacctttcttaaaatcttttagacgag
[0231]
测39-f：ggctctaaagaaaagacagaggc
[0232]
pez5a-r：cacttcactgacaccctcat
[0233]
本技术中首先将eup途径的ada-adh2串联基因构建到运动发酵单胞菌质粒pez39p
中得到质粒pe39p-pe
eup
。然后将质粒转入zmpt-flo
n2
，得到菌株zmpt-flo
n2-eup
。所得菌株在100ml三角瓶中以80％的rmg5培养基进行装瓶量，四环素诱导剂浓度为1.2μg/ml，控制初始od
600nm
为0.1，在30℃，100rpm摇床进行发酵测试。得到phb产量为40.57％dcw。
[0234]
我们将由南京金斯瑞公司合成的adh2和ada基因引入phb菌株。基因序列如下：
[0235]
ada(seq id no.8)，adh2(seq id no.9)。
[0236]
将上述ada和adh2基因通过rbs序列(第1381-1406位)连接，得到如下序列片段(seq id no.10)。
[0237]
实施例5发酵条件的优化
[0238]
较多研究已经发现，在较高的碳氮比例或者氮限制情况下，微生物中的phb会大量积累。本发明以葡萄糖为碳源，酵母提取物为氮源，控制碳源和氮源的比例，来优化最佳的碳氮源比例，以前期构建的zmpt
n2-eup
与zmpt-flo
n2-eup
两个菌株在碳氮(无水葡萄糖，酵母提取物)比10:1(50g/l无水葡萄糖：5g/l酵母提取物、20g/l无水葡萄糖：2g/l酵母提取物)，与5:1(50g/l无水葡萄糖：10g/l酵母提取物、2 0g/l无水葡萄糖：4g/l酵母提取物)的rm培养基条件下测试菌株生长，phb和乙醇积累情况。将菌株接种到80％装瓶量于100-ml三角瓶，分别装有10：1(50/5、20/2)，与5：1(50/10、20/4)培养基中，每个条件设置三个平行试验进行发酵测试。控制初始od
600nm
为0.1。在发酵过程中每隔一定时间取1ml样品暂储存于-80℃，待发酵液葡萄糖耗完，收集菌体测量phb的含量以及发酵过程中葡萄糖与乙醇的变化情况。本发明中的zmpt-flo
n2-eup
菌株在c/n比为20/2的条件下，能够积累74.03
±
1.81％的phb，如图5。
[0239]
本技术中的运动发酵单胞菌自絮凝phb高产菌株的构建及连续循环发酵共生产phb和乙醇的操作流程如图6。
[0240]
发酵测试phb，葡萄糖，乙醇的含量。在rmg5培养基中摇瓶发酵所得phb产量为40.57％dcw。在调整培养基碳源氮源比例之后，经测试在葡萄糖20g/l，酵母提取物2g/l的培养基条件下，phb的产量为74.03％dcw。
[0241]
实施例7循环发酵测试
[0242]
以phb的自絮凝菌株zmpt-flo
n2-eup
为对象，在150g/l葡萄糖中进行循环发酵。将zmpt-flo
n2-eup
接种到rmg15培养基(无水葡萄糖150g/l，酵母提取物10g/l，磷酸二氢钾2g/l)中，控制第一代初始od
600nm
为0.3，放入30℃，100rpm摇床发酵。以生物传感器检测中途糖耗情况，待葡萄糖耗完时，在超净工作台中将培养基倒掉，留絮凝菌体在三角瓶中，注入新鲜rmg15培养基，每次换培养基都加壮观霉素(100μg/ml)，卡纳霉素(100μg/ml)以及1.2μg/ml的四环素。本发明中连续循环培养8次(图7)，每次倒出培养基测量乙醇含量，留存絮凝沉底的菌株接入新鲜培养基进入下一轮发酵，检测出每一代的酒精产生情况维持在(90％)，在最终收集到的菌体用以检测phb，本发明实现在乙醇不断产生的情况下额外带来phb的受益。
[0243]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。