一种甾体C14α羟化酶、表达载体和工程菌及其应用的制作方法

一种甾体c14
α
羟化酶、表达载体和工程菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及甾体药物转化领域、生物工程技术和酶工程领域，尤其涉及一株具有高效c14α羟化酶活性的新月弯孢菌株(curvularia lunata)、甾体c14α羟化酶、表达载体和工程菌及其应用。


背景技术：

2.甾体化合物亦称为固醇，是一类以环戊烷多氢菲为母核的化合物。因其具有良好的抗炎、抗感染、抗过敏等药理活性，被称为器官移植、重症感染等许多危重疾病的“刚需药”和“救命药”。目前，全球获准上市的甾体药物约有400余，作为基础卫生体系的必备药物，甾体药物常被作为战略性物资进行储备。
3.甾体骨架特定位点引入官能基团是决定药效的关键，鉴于化学合成法存在选择性差、反应复杂、产物得率低等问题，常需借助生物催化转化，以实现功能化修饰反应。立体选择性羟基化就是当前甾体制药工业具有重要应用价值的生物催化反应，是合成高附加值甾体药物的关键步骤。目前工业上常使用丝状真菌来执行甾体的羟基化反应。
4.c14位羟化的甾体是自然界中分离较多的一类活性甾体天然产物，例如地高辛、洋地黄毒甙、去乙酰毛花甙丙等是一类选择性强心作用的药物。c14位羟化的甾体药物及其衍生物长期以来一直用作合成避孕和抗炎甾体药物的前体，具有较大的市场需求。目前工业上使用丝状真菌p450介导的生物转化研究中，由于p450酶表达量不高且野生菌的酶分离纯化困难，严重阻碍了对其代谢反应的研究。
5.近些年来,研究者开始在真菌中克隆负责甾体羟化的p450基因，并将其在细菌或酿酒酵母中进行异源表达，为其酶学性质研究提供基础。新月弯孢霉(curvularia lunata)报道具备甾体c11β和c14α的双羟化功能，广泛被国内外学者使用。2019年，张学礼课题组首次公布了一条来自cochliobolus lunatus strain atcctm1201甾体14位羟化基因mn061486(p-450lun)和其还原酶基因mn061484(cprlun)，并将其共转入酿酒酵母中，进行功能验证。该酶以rss为底物时，除了可催化产生14α-oh-rss，同时还产生11β-oh-rss，存在选择性差的缺陷。目前尚缺乏具有高区域选择性的甾体14位α羟化酶，因此开发此类酶具有重要的应用价值。
6.因此，本领域的技术人员致力于开发一种具有选择性的高效专一羟化酶，即具有高区域选择性的甾体14位α羟化酶，从而推动c14α羟化甾体药物中间体的开发进程。


技术实现要素：

7.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何获得一种具有高区域选择性的甾体14位α羟化酶，能够实现多种甾体化合物c14α的高效专一羟化，从而解决现有甾体c14位α羟基化的p450酶选择性差的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供了一种甾体c14α羟化酶，其氨基酸序列为(p1)-(p5)中任一所示的氨基酸序列：
9.(p1)氨基酸序列如如序列表seq id no:4所示；
10.(p2)将(p1)的氨基酸序列中2个相关催化残基i111和v124经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列；
11.(p3)与(p1)或(p2)的氨基酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
12.(p4)在(p1)-(p3)中任一氨基酸序列的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白的氨基酸序列；
13.(p5)在(p1)-(p3)中任一所限定的蛋白质的n端的1-100个氨基酸进行截短表达或修饰得到具有相同功能的蛋白质的氨基酸序列。
14.进一步地，该羟化酶的核酸序列为如下(s1)-(s3)中任一所示的核酸序列：
15.(s1)如seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3所示的核酸序列或者经微生物密码子优化过的可以编码(p1)-(p5)中任一所示的氨基酸序列的核酸序列；
16.(s2)在严格条件下与(s1)的核酸分子杂交且编码(p1)-(p5)中任一所示的氨基酸序列的核酸序列；
17.(s3)与(s1)或(s2)的核酸序列具有80％以上同源性且编码(p1)-(p5)中任一所示的氨基酸序列的核酸序列。
18.进一步地，来自于新月弯孢霉(curvularia lunata cgmcc 3.3589)的细胞色素p450酶完整的mrna和dna序列，该酶性能卓越，底物宽泛且具有较强的区域选择性和立体专一性，能够实现对甾体化合物c14α的高效专一羟化,该基因的获得和其异源表达为其产业化生产奠定理论基础。
19.进一步地，一种具有甾体c14α羟化酶的活性菌，该菌株为新月弯孢菌(curvularia lunata)，保藏编号为cgmcc 3.3589，保藏的地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，新月弯孢菌株(curvularia lunata)cgmcc 3.3589可实现甾体化合物c14位α羟基化。
20.进一步的，新月弯孢菌株(curvularia lunata)cgmcc 3.3589与mn061486(p-450lun)相比，其可催化黄体酮产生单一的c14位α羟基化的产物。
21.本发明还提供了一种甾体c14α羟化酶的表达载体，包含编码一种甾体c14α羟化酶的核酸序列，表达载体为原核表达载体或真核表达载体；真核表达载体包括真核表达载体pesc系列。
22.本发明还提供了一种c14α羟化甾体的工程菌，该工程菌为重组微生物，该真核是通过包含甾体c14α羟化酶的核酸序列的表达载体导入原核或真核微生物体内所得到。
23.进一步地，原核微生物包括：大肠杆菌、假单胞菌或耻垢分枝杆菌，真核微生物包括酵母菌或霉菌；酵母菌包括酿酒酵母或毕赤酵母。
24.本发明还提供了一种c14α羟化甾体的工程菌在催化甾体化合物中的应用。
25.进一步地，发酵培c14α羟化甾体的工程菌，收集菌体后用缓冲液重悬，加入甾体化合物作为底物，进行催化反应。
26.进一步地，甾体化合物底物为具有如下结构通式的化合物，
[0027][0028]
其中，r可以为烷基、取代烷基、硅基或酰基。
[0029]
进一步地，甾体化合物底物包括黄体酮(pg)。
[0030]
进一步地，甾类化合物底物为其骨架a、b、c和d环被其他修饰的甾体化合物。
[0031]
进一步地，甾体底物的取代基除烷基、取代烷基、硅基或酰基以外，可以有其他基团取代，也包含其甾体骨架a、b、c和d环同时被其他修饰。
[0032]
进一步地，基因seq id no:1和seq id no:2来源于新月弯孢霉(curvularia lunata)cgmcc 3.3589，其经过酵母密码子优化后的基因序列通过基因合成，命名为seq id no:3。
[0033]
进一步地，本发明未定点突变的氨基酸序列如seq id no:4所示。
[0034]
进一步地，针对目前工业生产菌株p450酶表达量不高且野生菌的酶分离纯化困难的问题，本发明利用基因工程分子操作技术构建重组表达载体，将本发明中的甾体c14α羟化酶在异源宿主酿酒酵母中表达，这为其在其他异源宿主(例如：大肠杆菌等原核生物模式菌株，米曲霉、构巢曲霉、赭曲霉、毕赤酵母等真核生物模式菌株以及昆虫等动物模式菌株)提供有效的参考。
[0035]
进一步地，本发明中新的可催化甾体高效专一c14α羟化的p450酶，具有较宽的底物谱，以酿酒酵母作为异源表达宿主时，其可以转化黄体酮生成相应的c14α羟化产物，且转化效率较高，转化产物较单一，进一步地，其转化率达到60％。这一发现将为甾体化合物的c14α羟化提供新的途径。
[0036]
进一步地，本发明通过生物信息学分析，找到甾体c14α羟化酶的相关催化残基，并通过合理设计，定点突变技术，得到该酶的突变体库。并从中筛选出c14α羟化特异性较好的突变体i111a和v124a，其特征在于，突变体i111a和v124a、转化甾体pg时区域选择性分别提高了7％和10％。
[0037]
进一步地，本发明提供了利用编码c14α羟化酶的基因片段所构建的重组表达质粒或宿主细胞。
[0038]
进一步地，本发明提供了针对编码c14α羟化酶的基因片段定点突变所涉及氨基酸位点。
[0039]
进一步地，本发明经定点突变技术获得的突变基因编码的甾体化合物c14α羟化酶包括但不限于酿酒酵母等宿主细胞内表达，也包含其他异源宿主(例如：大肠杆菌等原核生物模式菌株，米曲霉、构巢曲霉、赭曲霉、毕赤酵母等真核生物模式菌株以及昆虫等动物模式菌株)。
[0040]
进一步地，(p3)的氨基酸序列还包括与(p1)或(p2)所限定的氨基酸序列具有98％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
[0041]
进一步地，(p3)的氨基酸序列还包括与(p1)或(p2)所限定的氨基酸序列具有95％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
[0042]
进一步地，(p3)的氨基酸序列还包括与(p1)或(p2)所限定的氨基酸序列具有93％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
[0043]
进一步地，一种甾体化合物c14α羟化酶的应用，为全细胞催化法；包括如下步骤：将c14α羟化甾体的工程菌进行发酵培养，收集菌体后用缓冲液重悬，加入底物，进行催化反应。
[0044]
在本发明的较佳实施方式1中，详细说明了新月弯胞霉的培养和发酵检测过程；
[0045]
在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明了新月弯胞霉甾体c14α羟基化酶p450的克隆表达；
[0046]
在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明了酿酒酵母重组工程菌sc-clcyp14-wt和sc-cyp450lun的构建过程；
[0047]
在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明了酿酒酵母工程菌sc-clcyp450-wt和sc-cyp450lun催化黄体酮合成c14α羟化产物过程；
[0048]
在本发明的另一较佳实施方式5中，详细说明了酶突变体clcyp14的构建过程；
[0049]
在本发明的另一较佳实施方式6中，详细说明了重组酿酒酵母突变体底物黄体酮转化分析过程。
[0050]
本发明的有益的技术效果如下：
[0051]
本发明设计来源于新月弯孢霉(curvularia lunata)菌中一种新的能对甾体化合物进行c14α羟化的p450酶,包括其完整的mrna和dna序列的克隆、异源表达和生物转化,并利用生物信息学分析、定点突变技术以及酿酒酵母表达平台建立甾体c14α羟化酶的突变体库，筛选具有高效生物催化活性和区域专一性的甾体c14α羟化酶突变体。
[0052]
本发明提供的新月弯孢霉(curvularia lunata)菌cgmcc 3.3589、c14α羟化的p450酶,以及包括其完整的mrna和dna序列的克隆、异源表达和生物转化,用于生产c14α羟化甾体工程菌以及具有高效生物催化活性和区域专一性的甾体c14α羟化酶突变体都能够使甾体化合物c14位α羟基化，与mn061486(p-450lun)相比，其可催化黄体酮产生单一的c14位α羟基化的产物，解决了现有甾体c14位α羟基化的p450酶选择性差的问题。
[0053]
本发明公开了一种新的、能够实现多种甾体化合物c14α的高效专一羟化酶，该酶的成功挖掘以及异源表达和定向进化具有重要的理论研究和工业价值，对推动c14α羟化甾体药物中间体的开发进程具有重大的应用价值。
[0054]
本发明提供了一种性能卓越，底物宽泛且具有较强的区域选择性和立体专一性的甾体c14α羟化酶，构建了结构多样的c14羟化甾体库，为后期天然产物合成提供了丰厚的原料基础。通过重组酵母菌突变体甾体转化实验，获得了c14α羟化酶突变体库，为细胞色素p450的酶学性质研究和工程改造提供了坚实的理论基础，其中突变体i111a和v124a对底物黄体酮的转化特异性显著高于基因野生型菌株，本发明具有较大的应用潜力及经济价值。
[0055]
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
[0056]
图1是本发明的一个较佳实施例1的两株新月弯胞霉转化底物黄体酮的uplc结果图；
[0057]
图2是本发明的一个较佳实施例1的产物14α-oh-pg的
13
c谱图；
[0058]
图3是本发明的一个较佳实施例1的产物14α-oh-pg的1h谱图；
[0059]
图4是本发明的一个较佳实施例1的产物11β-oh-pg的
13
c谱图；
[0060]
图5是本发明的一个较佳实施例1的产物11β-oh-pg的1h谱图；
[0061]
图6是本发明的一个较佳实施例2的p450基因pcr扩增后的琼脂糖凝胶电泳验证图；
[0062]
图7是本发明的一个较佳实施例4的工程菌sc-clcyp450-wt和sc-cyp450lun转化黄体酮的uplc结果图；
[0063]
图8是本发明的一个较佳实施例4的clcyp14蛋白结构及其催化位点示意图；
[0064]
图9是本发明的一个较佳实施例6的基因重组菌突变体i111a和i124a转化黄体酮的uplc结果图。
具体实施方式
[0065]
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
[0066]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到：
[0067]
酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae yph499；
[0068]
新月弯胞霉(curvularia lunata)cgmcc 3.3589：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0069]
新月弯胞霉(curvularia lunata)cgmcc 3.4381：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0070]
实施例1、新月弯胞霉的培养和发酵检测
[0071]
1、新月弯胞霉的培养
[0072]
将新月弯胞霉接种于pda斜面培养基，30℃培养箱恒温培养3～5d，取适量新月弯胞霉(curvularia lunata)cgmcc 3.4381和cgmcc 3.3589菌丝体接种到2个装有100ml发酵培养基(黄豆饼粉5g/l，葡萄糖20g/l,酵母膏5g/l,nacl 5g/l,k2hpo
4 5g/l,ph6.1的三角瓶中，并分别标记1号和2号，28℃，180r/min摇床培养24h后，称取底物黄体酮(pg)，用l助溶剂n-n二甲基酰胺(dmf)溶解底物后，将其分别加入到1号和2号三角瓶中，终浓度250mg/l。
[0073]
2、发酵液进行样品处理，使用uplc检测发酵液成分。
[0074]
将转化48h的菌体发酵液，加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，通过旋转蒸发仪将乙酸乙酯除去，用1ml的甲醇将残余物重新溶解，离心除去沉淀，过0.22μm微孔滤膜后,通过uplc鉴定与标品对比，并进行核磁鉴定，结果如图1所示，新月弯胞霉(curvularia lunata)cgmcc 3.3589可以催化底物pg生成单一的14位α羟基化产物，而新月弯胞霉(curvularia lunata)cgmcc 3.4381催化底物pg生成相应的c14α羟基化和c11β羟基化产物，分别为c14α-oh-pg和c11β-oh-pg。其核磁鉴定结果如下：产物14α-oh-pg的
13
c谱图如图2所示，图中：
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ210.44,199.61,170.49,124.13,85.26,59.54,48.06,46.44,38.75,38.41,35.89,34.07,33.49,32.69,31.58,31.04,27.24,21.47,20.24,17.35；产物14α-oh-pg的1h谱图如图3所示，图中：1h nmr(600mhz,cdcl3)δ5.74(s,
1h),3.23(t,j＝8.8hz,1h),2.48
–
2.26(m,5h),2.13(s,3h),2.03(dd,j＝13.0,4.9hz,2h),1.91(d,j＝3.3hz,1h),1.84
–
1.65(m,6h),1.63
–
1.53(m,3h),1.46(td,j＝13.1,4.4hz,2h),1.20(s,3h),0.79(s,3h).产物11β-oh-pg的
13
c谱图如图4所示，图中：
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ209.19,199.61,172.10,122.53,68.32,63.95,57.59,56.52,48.36,43.07,39.34,35.16,33.96,32.70,32.16,31.44,31.40,24.46,22.77,21.10,16.04；产物11β-oh-pg的1h谱图如图5所示，图中：1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ5.73(s,1h),3.22(t,j＝8.7hz,1h),2.51
–
2.22(m,6h),2.12(s,3h),2.03(m,2h),1.90(td,j＝11.4,11.0,3.3hz,1h),1.82
–
1.71(m,5h),1.66(d,j＝4.1hz,1h),1.60-1.51(m,3h),1.51
–
1.39(m,1h),1.19(s,3h),0.78(s,3h)。
[0075]
实施例2、新月弯胞霉甾体c14α羟基化酶p450(clcyp450-14)的克隆表达基因的克隆表达分为以下三步
[0076]
1)新月弯孢霉(curvularia lunata)总dna的提取
[0077]
菌株在pdb中培养2天，培养温度30℃。离心收集菌体，并用无菌水洗涤2-3次,取适量菌丝于含有磁珠的2ml的ep管中，用高速震荡仪器提取其基因组，震荡程序：8m/s,15s一个循环，共6个循环。将上述震荡过后的菌体高速离心(12000rpm，10min),取上清作为pcr模板。
[0078]
2)基因clcyp450-14完整dna序列的克隆
[0079]
具已报道的甾体14位羟化的基因序列(cyp450lun)为参考,设计3对clcyp450-14基因扩增引物：
[0080]
cyp-f1:atggatccccagactgtcg,cyp-r1:ctacactaccactctcttg,
[0081]
cyp-f2:atggatccccagaccgtcg,cyp-r2:ctacacaaccctattgaac
[0082]
cyp-f3:gagctggtactgcgtgcgc,cyp-r3:cgccagtgtcttggtcggat
[0083]
以两种新月弯孢霉(curvularia lunata)总dna为模板，用以上2对引物进行pcr扩增，将扩增出来的条带进行纯化回收，送上海擎科生物科技公司测序,得到其完整dna序列。扩增序列琼脂糖胶图如图6所示，左图为新月弯孢霉(curvularia lunata)cgmcc 3.3589的扩增结果，右图为新月弯胞霉(curvularia lunata)cgmcc 3.4381的扩增结果。其中，m为dna mark：1和2为引物cyp-f1和cyp-r1的pcr扩增条带；3和4为引物cyp-f2和cyp-r2的pcr扩增条带；5和6为引物cyp-f3和cyp-r3的pcr扩增条带。
[0084]
3)基因seq id no:1的生物信息学分析
[0085]
来自新月弯胞霉(curvularia lunata)cgmcc 3.3589的羟化酶的完整dna序列如序列表中seq id no:1在ncbi中进行同源性比对，发现其与与基因clcyp5103b5的mrna序列具有100％的同源性。而来自新月弯胞霉(curvularia lunata)cgmcc 3.4381的羟化酶的完整dna序列与已报道的cyp450lun的基因序列(mn061486)具有100％的同源性，分析seq id no:1的内含子，其mrna序列，如序列表中seq id no:2。其编码的蛋白质命名为clcyp14,氨基酸序列如序列表中seq id no:4所示。
[0086]
4)合成基因异源表达质粒
[0087]
将氨基酸序列seq id no:4和已报道的酶cyp450lun的氨基酸序列送去金唯智进行酿酒酵母的密码优化，seq id no:4其经过酵母密码子优化过的核酸序列如序列表中seq id no:3所示。同时将其构建在酵母表达载体pesc-ura上，得到表达质粒pesc-clcyp14和
pesc-cyp450lun。质粒pesc-clcup14包含启动子gal1和基因seq id no:3以及终止子clc1，质粒pesc-cyp450lun包含启动子gal1和cyp450lun的基因序列以及终止子clc1，将其分别导入酿酒酵母yph499菌株中进行功能鉴定。
[0088]
实施例3、酿酒酵母重组工程菌sc-clcyp14-wt和sc-cyp450lun的构建
[0089]
工程菌sc-clcyp450-wt和sc-cyp450lun的构建分为以下3步
[0090]
1)酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)yph499感受态的制作
[0091]
酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)yph499于ypd液体培养基中30℃过夜培养。ypd液体培养基配方：yeast extrat,取1ml上述菌液接种到10ml新鲜的ypd培养基中，30℃,220rpm培养3-4h.在无菌条件下收集，1500rpm离心5min,弃上清后用10ml试剂盒frozen-ea yeast transformation iitm kit中的solution 1溶液重悬，1500rpm离心5min弃上清后用1ml solution 2重悬(od约0.6-1.0)分装到1.5ml ep管中，每管30μl，于-80℃中冷冻备用。
[0092]
2)表达质粒的转化
[0093]
取1管上述感受态，分别加入2ul实施例1获得的表达质粒pesc-clcup14和pesc-cyp450lun，同时加入300ul试剂盒(frozen-ea yeast transformation iitm kit)中的溶液solution3，混匀，于30℃孵育40min，将其全部涂布在筛选培养基sd-ura(北京泛基诺科技有限公司)的固体平板上(配方：固体酵母筛选培养基sd-ura，2％葡萄糖，1.5％琼脂，百分号均表示g/100ml)，于30℃，培养36h以上，待长出单克隆菌落。
[0094]
3)工程菌sc-clcyp450-wt和sc-cyp450lun的阳性克隆筛选
[0095]
挑去上述筛选平板上的单菌落于5ml液体筛选培养基中，液体筛选培养基组成如下：(酵母筛选培养基sd-ura，2％葡萄糖)，30℃，培养36h以上，pcr鉴定出正确的阳性克隆。
[0096]
实施例4、酿酒酵母工程菌sc-clcyp450-wt和sc-cyp450
lun
催化黄体酮合成c14α羟化产物
[0097]
具体分为以下3步：
[0098]
1)种子液培养：将实施例2中的酿酒酵母工程菌sc-clcyp450-wt和sc-cyp450lun接种于相应液体选择培养基sd-ura中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量分别转接到含50ml sd-ura液体培养基的250ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养，待od值到1.0，1000rpm，5min离心弃去培养基，收集酵母细胞。
[0099]
2)诱导培养：将上述收集的酵母细胞转移到含50ml sg-ura液体培养基的250ml三角瓶中，sg-ura培养基配方(酵母筛选培养基sd-ura，2％半乳糖)，30℃，250rpm振荡培养24h，1000rpm，5min离心弃去培养基，收集酵母细胞。
[0100]
3)生物转化：将上述收集的酵母细胞用2ml pbs缓冲液(50mm，ph7.2)重悬，分别将其分装到2ml的ep管中，每管200ul，加入终浓度为150mg/l的黄体酮，30℃，250rpm，5h进行催化反应。
[0101]
4)样品处理，hplc检测:将上述反应体系中加入等体积的甲醇，破碎细胞，淬灭反应，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行uplc检测。通过uplc鉴定与标品对比，确认构建的酿酒酵母菌株sc-clcyp450-wt可以催化黄体酮合成相应的14位α羟基化产物，也证明来自新月弯胞霉(curvularia lunata)cgmcc 3.3589的酶clcyp14为催化甾体化合物14位α羟基化的p450酶，而sc-cyp450
lun
催化黄体酮合成相应的c14α羟基化产物的同时还生
成大量的c11β的产物。如图7所示，酿酒酵母菌株sc-clcyp450-wt可以催化黄体酮仅合成相应的14位α羟基化产物，证明来自新月弯胞霉(curvularia lunata)cgmcc 3.3589的酶clcyp14为催化甾体化合物14位α羟基化的p450酶，而sc-cyp450
lun
催化黄体酮合成相应的c14α羟基化产物的同时还生成大量的c11β的产物。
[0102]
实施例5、clcyp14蛋白突变体的构建
[0103]
1)通过网站https://robetta.bakerlab.org/submit_action.php建立本发明蛋白clcyp14的三维模型，进一步在discovery studio4.5中通过分子对接建立蛋白和底物的相互作用模型，分析其相关催化残基，进一步地，其两个关键的氨基酸残基为i111和v124。clcyp14蛋白结构及其催化位点示意图如图8所示。
[0104]
2)定点饱和突变技术扩增目的片段
[0105]
以质粒pesc-clcyp14作为模板，分别以以下引物为pcr引物，进行聚合酶链式反应，引物由北京擎科生物科技公司上海分公司进行合成。
[0106]
clcyp14-i111x-for：gtcttttcctgaagctnnkactgaagatatg
[0107]
clcyp14-i111x-rev：catatcttcagtmnnagcttcaggaaaagac
[0108]
clcyp14-v124x-for：tatacaagattgactnnkgaacatcatact
[0109]
clcyp14-v124x-rev：agtatgatgttcmnnagtcaatcttgtat
[0110]
得到定点突变目标质粒片段，取2μl pcr产物用经琼脂糖凝胶电泳验证条带大小。
[0111]
3)pcr产物经dpn i酶消化3h后，产物经小量纯化试剂盒纯化回收后进行大肠化转，分别挑取转化子经小量lb培养基培养后提取质粒，送去上海擎科生物科技有限公司进行测序鉴定。
[0112]
4)将鉴定正确的突变体质粒按照实例2中酵母转化的方法转入酿酒酵母yph499中，并进行正确转化子的筛选。
[0113]
实施例6.重组酿酒酵母突变体底物黄体酮转化分析
[0114]
1)按照实施例5中的方法，将重组酿酒酵母突变体所有的突变体进行底物黄体酮的转化实验2h(投料量为150mg/l)，将反应液加入等体积的甲醇，破碎细胞，淬灭反应，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行uplc检测，液相条件如下：0min,流动相a：流动相b＝水∶乙腈＝80％∶20％；10min,流动相a：流动相b＝水∶乙腈＝0％∶100％；流速：0.2ml/min；检测波长：254nm；进样时间：10min.
[0115]
由液相结果分析可知：酿酒酵母菌株sc-clcyp450-wt、基因重组菌突变体i111a和i124a转化黄体酮的uplc结果，检测结果如图9所示，三者都基本仅合成相应的14位α羟基化产物c14α-oh-pg,在所有突变株中，其中重组酿酒酵母突变体i111a，v124a与clcyp-wt相比，rt＝6.85处副产物吸收峰积分面积减小。clcyp14-wt催化底物时，区域选择性c14α-oh-pg为82.46％，突变株i111a的c14α-oh-pg为89.6％，突变株v124a的c14α-oh-pg为92.18％。
[0116]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。