一株耐寒芽胞杆菌FJW2及在制备植物病原菌抑菌剂中的应用的制作方法

一株耐寒芽胞杆菌fjw2及在制备植物病原菌抑菌剂中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株耐寒芽胞杆菌fjw2及在制备抑菌剂中的应用。


背景技术：

2.大多数植物的病害都是由于受到真菌和细菌的感染使植物细胞或组织受到破坏，从而导致植物的根茎或者器官坏死或腐烂。比如镰刀菌能在植物体内产生番茄枯萎素和镰刀菌酸，一些真菌和细菌产生不饱和的酮类毒物等等。目前，对植物致病菌的防治主要还是化学防治，而化学药剂的不合理使用会造成环境污染，土壤化学试剂的残留以及病原菌抗药性的产生等问题。随着人们环保意识的提高，绿色防治越来越被重视，植物抑菌剂是一种绿色环保、清洁有效的药剂，受阳光或微生物的作用容易分解、半衰期短、降解快，有利于农业的可持续发展。
3.耐寒芽孢杆菌在环境病原防御和非生物应激反应中具有重要作用，能在盐碱地和干旱的胁迫条件下中产生大量蛋白质，对提高农作物的耐盐性和耐旱性有着重要作用。另外，耐寒芽孢杆菌具有生物修复甲胺磷的潜力,能在极高硒水平下生长，对双翅虫、夜蛾等昆虫的幼虫具有致死性，并且死亡率达到89％。耐寒芽胞杆菌还可用来产低温蛋白酶在较低温度环境中具有顽强的生命力。
4.本发明筛选出了一株耐盐的耐寒芽胞杆菌，该菌株不但对多种致病菌均有广谱性抑制效果，且抑菌率也非常高；同时该菌株对高盐浓度也具有良好的耐受性且在较低的温度下也能生长，可对植物病害起到一定的防治作用，具有极大的开发成生防菌的潜力。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一株耐盐碱的耐寒芽胞杆菌fjw2，该细菌保藏在中国典型培养物保藏中心，分类命名为耐寒芽胞杆菌(bacillus frigoritolerans)fjw2，保藏编号为：cctcc no:m 2020146。
6.本发明的另一个目的在于提供一株耐盐碱耐寒芽胞杆菌fjw2的在制备成植物病原菌抑菌剂中的应用。
7.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
8.申请人自陕西渭南市蒲城县土样中分离出一株耐盐、对多种病原菌具有抑菌作用且抑菌率高的细菌，经鉴定为耐寒芽胞杆菌。该细菌已于2020年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名：耐寒芽胞杆菌(bacillus frigoritolerans)fjw2，保藏编号为：cctcc no:m 2020146。
9.分离得到的耐盐碱的耐寒芽胞杆菌(bacillus frigoritolerans)fjw2，在lb固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落形态呈浅黄色光滑的圆形，菌落饱满不透明。生理生化表现为革兰氏染色显示呈阴性，不可水解淀粉，能与硝酸盐反应产生还原反应，甲基红试验为阴性，过氧化氢酶阳性，不产生硫化氢，具备分解明胶的能力。
10.一株耐盐的耐寒芽胞杆菌fjw2在制备成植物病原菌抑菌剂中的应用，所述的植物病原菌为香蕉枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cubense)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(fusariumsolani)、茄病镰刀菌(fusariumsolani)、厚垣镰刀菌(fusariumchlamydosporum)、青霉菌(penicilliumglaucum)和毛霉菌(rhizomucorvariabilis)。
11.与现有技术相比，本发明具有以下特点：
12.本发明中的耐寒芽胞杆菌生长迅速，耐盐能力强，耐低温，环境适应能力强。
13.申请人首次筛选到一株可对多种植物致病真菌具有抑制作用的耐寒芽胞杆菌，抑菌谱广，适用于开发成微生物菌剂。
附图说明
14.图1为耐寒芽胞杆菌fjw2的培养性状图。
15.图2为腐皮镰刀菌的抑制作用示意图。
16.图3为尖孢镰刀菌的抑制作用示意图。
17.图4为茄病镰刀菌的抑制作用示意图。
18.图5为对青霉的抑制作用示意图。
19.图6为对香蕉枯萎病病原菌的抑制作用示意图。
20.图7为对厚垣镰刀菌的抑制作用示意图。
21.图8为对毛霉的抑制作用示意图。
具体实施方式
22.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
23.实施例1：
24.耐寒芽胞杆菌(bacillus frigoritolerans)fjw2的分离及鉴定：
25.来自于陕西渭南市蒲城县土样2.5g置于50ml的无菌水中，30℃250rpm摇1h，之后取500μl土壤悬液在装有4.5ml无菌水的pa瓶中进行梯度稀释。取10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
这几个稀释度的土壤悬液分别加在培养基中进行涂布，培养24h、48h、72h、96h后观察平板菌落生长情况，将所有长出来的菌落分别挑出来，进行抑菌活性实验；选择抑菌率高且抑菌谱广的细菌，再进一步进行耐盐碱的筛选；最终筛选出了耐寒芽胞杆菌fjw2。
26.(1)形态特征
27.分离得到的耐盐碱的耐寒芽胞杆菌fjw2，在lb固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落呈浅黄色光滑的圆形，菌落饱满不透明。
28.(2)生理生化实验
29.生理生化表现为革兰氏染色显示呈阴性，不可水解淀粉，能与硝酸盐反应产生还原反应，甲基红试验为阴性，过氧化氢酶阳性，不产生硫化氢，具备分解明胶的能力。
30.(3)耐寒芽胞杆菌fjw2的基因鉴定
31.用细菌dna抽提试剂盒提取待测菌株的基因组dna，具体操作步骤参照说明书。以提取的细菌基组dna作为模板，对细菌进行扩增，扩增16s rrna的引物：
32.27f:5＇-gtttgatcctggctcag-3＇
33.1492r:5＇-tacggctaccttgttacgactt-3＇；
34.序列经blast16srdna序列进行同源性比对分析，结果分析表明其与菌株发现其与菌株bacillus frigoritolerans的16srdna基因序列相似性最高，属于一株耐寒芽胞杆菌，该菌株已于2020年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名：耐寒芽胞杆菌(bacillus frigoritolerans)fjw2，保藏编号为：cctcc no：m 2020146。
35.实施例2：
36.耐寒芽胞杆菌fjw2的耐受性测试：
37.(1)耐ph范围实验：
38.将耐寒芽胞杆菌种子液按照2％的接种量分别接种于初始ph不同的lb培养基中，在37℃、200r/min条件下培养，培养10h后取样测od
600
。培养基的初始ph梯度设置为3、4、5、6、7、8、9、10。
39.lb培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，nacl 10g，蒸馏水1000ml，ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
40.初始的od600值以零计。
41.ph345678910od60000.0120.2741.4782.8582.2360.9740.048
42.(2)耐盐浓度试验：
43.将耐寒芽胞杆菌种子液按照2％的量分别接种于盐浓度不同的lb培养基中，在37℃、200r/min条件下培养，培养10h后取样测od
600
。培养基的盐浓度梯度设置为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％。(1％盐浓度：1gnacl/100g水，以此类推)
44.lb培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，nacl 10g，蒸馏水1000ml，ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
45.初始的od600值以零计。
46.盐浓度(％)12345678od
600
5.444.723.272.322.212.041.521.206
47.(3)生长温度实验：
48.将耐寒芽胞杆菌种子液(od
600
＝4.68)按照2％的量接种于lb培养基中，在不同温度条件下200r/min摇床培养，培养10h后取样测od
600
。培养基的温度梯度设置为10℃、15℃、20℃、28℃、37℃、40℃、45℃。
49.初始的od600值以零计。
50.温度(℃)10152028374045od
600
0.972.182.472.795.703.231.21
51.实施例3：
52.耐寒芽胞杆菌fjw2对植物病原菌的抑制作用：
53.采用抑菌圈法测定耐寒芽胞杆菌对病原菌的抑制能力。用lb活化耐寒芽胞杆菌，将种子液适当稀释后涂布到pda平板上，以涂布无菌水作为对照试验组。在长满病原真菌的
pda平板上用枪头(枪头直径＝7.5mm)进行打孔，挑取真菌菌块倒置接种在涂有耐寒芽胞杆菌的pda平板上，将平板置于37℃培养4d，测量真菌菌落直径，计算抑菌率，从而分析抑菌的效果。
54.本实验选取的植物病原菌有香蕉枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cubense)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(fusariumsolani)、茄病镰刀菌(fusariumsolani)、厚垣镰刀菌(fusariumchlamydosporum)、青霉菌(penicilliumglaucum)和毛霉菌(rhizomucorvariabilis)。
55.pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1 000ml，ph为自然ph，115℃高压蒸汽灭菌30min。
[0056][0057]
注：d，对照平板菌落直径(mm)；d，实验平板菌落直径(mm)。
[0058]
耐寒芽胞杆菌fjw2对常见的香蕉枯萎病菌、腐皮镰刀菌、茄病镰刀菌有非常好的防治效果，对引起这三种植物病害的致病菌的抑制率均能达到95％以上。
[0059]
因霉菌孢子容易散落，不易测量其菌落直径，但对毛酶(图8)、青霉(图5)、厚垣镰刀菌(图7)的孢子具有较强的抑制作用。
[0060]
综上看出耐寒芽胞杆菌fjw2对多种植物治病菌都有良好的抑制率，具有广谱抑制性。
[0061]
对各菌的抑菌率如下表所示。
[0062]
序号病原菌dd抑菌率(％)1香蕉枯萎病菌81.9610.6598.312腐皮镰刀菌88.1314.8197.183茄病镰刀菌84.7915.1196.824尖孢镰刀菌89.3141.7078.205青霉74.2664.5324.496毛霉67.7559.8621.93
[0063]
由以上实施例可知，本发明提供了一株耐寒芽胞杆菌fjw2，该菌株耐盐浓度高，对于防治香蕉枯萎病菌以及镰刀菌引起的植物枯萎病具有良好的防治效果。
[0064]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术邻域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。