导管插入装置的制作方法

导管插入装置
1.相关申请的交叉引用本技术要求2019年6月10日提交的美国临时申请序列号62/859,515的的权益，其内容通过引用整体并入本文。
2.关于联邦赞助的研究或开发的声明这项发明是在美国国家卫生研究院授予的hl128337的政府支持下完成的。政府对这项发明有一定的权利。


背景技术：

3.导管是可以例如经由体腔、管道或血管插入人体中的医疗装置。导管可用于各种医疗应用中，因为它们具有广泛的功能。其中可以使用导管的示例应用包括心血管、泌尿、胃肠、神经血管和眼科应用。导管功能范围从流体引流到流体或气体给药、到实现手术器械的接近、再到根据导管类型实现其他任务。导管可以设计和制造为临时导管或永久导管。急性导管是临时导管的一个示例，因为它们适合于短期使用（例如，长达7天）。急性导管常常用于手术室、急诊室和重症监护室中。慢性导管是临时导管的另一种示例，因为它们适合于相对短期的使用（例如，7至30天）。慢性导管常常用于肠外营养、药物输注和透析。永久导管用于长期使用（例如，数月至数年），并且可以用于例如长期营养和起搏器引线。
附图说明
4.通过参考以下详细描述和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，在附图中，相似的附图标记对应于相似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有前述功能的附图标记或特征可以结合其中出现它们的其他附图来描述，也可以不结合其中出现它们的其他附图来描述。
5.图1是导管插入装置的示例的透视示意图，其相对端部没有被完全密封；图2是插入患者体内的导管和插入导管中的导管插入装置的示意图，其中小图是导管内的插入装置的放大图；图3是导管的毂适配器内的导管插入装置的示意图；图4a至4d是曲线图，其针对插入填充有磷酸盐缓冲盐水（pbs）中的导管的第1天（图4a和4b）、第2天（图4c）和第4天（图4d）的导管插入装置的示例，在左y轴上描绘了一氧化氮（no）释放曲线（用no表面通量（x10-10 mol min-1
cm-2
）对时间（小时，h）来表示），并且在右y轴上描绘了一氧化氮生成的调制（用no ppb水平对时间（小时）来表示），该导管插入装置的示例包括80 wt%的s-亚硝基-n-乙酰基-青霉胺（snap）、20 wt%的聚（乙二醇）和不锈钢丝；图5a至5c是描绘例如在23℃下储存初始储存时段、1个月储存时段、2个月储存时段和3个月储存时段的导管插入装置的一氧化氮（no）释放曲线（用储存时段特定一天下的no通量（x10-10 mol min-1
cm-2
）表示）的曲线图，其中在储存时段的第1天（图5a）、储存时段的第2天（图5b）和储存时段的第4天（图5c）测量每个样品；
图6a和图6b是描绘在cdc生物反应器中为期3天生物膜测试中，在用含有snap-peg （80/20 wt%）的不锈钢导管插入装置（n=3个测试导管）处理的聚氨酯导管的外表面上和用含有peg （100 wt%，惰性，无snap）的不锈钢插入装置处理的聚氨酯导管（n=3个对照导管）的外表面上对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性（菌落形成单位（cfu/cm2）的曲线图；图7a和7b是描绘对照导管中的一个（图7a）和测试导管中的一个（图7b）的铜绿假单胞菌3天生物膜测试的结果的原始彩色共聚焦图像的黑白再现，其中绿色染色描绘了活细菌，并且红色（不容易看到）描绘了死细菌；图8a和8b是描绘对照导管中的一个（图8a）和测试导管中的一个（图8b）的金黄色葡萄球菌3天生物膜测试的结果的原始彩色共聚焦图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活了细菌，并且红色（不容易看到）描绘了死细菌；图9是描绘在cdc生物反应器中为期5天的生物膜测试中，用含有snap-peg（80/20 wt%）的不锈钢导管插入装置处理的聚氨酯导管（n=3个测试导管）的外表面上和用含有peg（100 wt%，惰性，无snap）的不锈钢插入装置处理的聚氨酯导管（n=3个对照导管）的外表面上对金黄色葡萄球菌的抗菌活性（cfu/cm2）的曲线图；图10a和10b是描绘对照导管中的一个（图10a）和测试导管中的一个（图10b）的金黄色葡萄球菌的5天生物膜测试的结果的原始彩色共聚焦图像的黑白再现，其中绿色染色描绘了活细菌，并且红色（不容易看到）描绘了死细菌；图11a和11b是描绘在cdc生物反应器中在为期4天的分散测试中，用含snap-peg （80/20 wt%）的不锈钢导管插入装置（n=3个测试导管）和含peg （100 wt%，惰性，无snap）的不锈钢插入装置（n=3个对照导管）处理的聚氨酯导管的外表面上对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性（cfu/ cm2）的曲线图（其中生物膜在外表面上生长3天，然后用含snap或对照（无snap）插入装置处理的聚氨酯导管1天）。
6.图12a和12b是描绘对照导管中的一个（图12a）和测试导管中的一个（图12b）的铜绿假单胞菌的4天扩散测试的结果的原始彩色共聚焦图像的黑白再现，其其中绿色染色描绘了活细菌，并且红色（不容易看到）描绘了死细菌；图13a和13b是描绘了对照导管中的一个（图13a）和测试导管中的一个（图13b）的金黄色葡萄球菌的4天扩散测试的结果的原始彩色共聚焦图像的黑白再现，其其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看到）描绘了死细菌；图14a和14b是描绘了在流动池系统中在为期5天生物膜测试中，用含snap-peg （80/20 wt%）不锈钢的导管插入装置（n=3个测试导管）和含有peg （100 wt%，惰性，无snap）不锈钢的插入装置（n=3个对照导管）处理的聚氨酯导管的内表面上对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性（cfu/ cm2）的曲线图；图15是描绘三个示例导管插入装置（包括s-亚硝基谷氨酰胺硫酮（gsno）和30 μm氧化锌颗粒或30 μm氧化锌颗粒和聚乙二醇（peg))和对照插入装置（包括75 wt % s-亚硝基谷氨酰胺硫酮（gsno）和25 wt%惰性煅制二氧化硅颗粒）的一氧化氮（no）释放曲线（用no表面通量（x10-10 mol min-1
cm-2
）对时间（小时））表示的曲线图（数据代表平均值
±
标准偏差，n = 3）；图16是描绘对照插入装置和三个示例导管插入装置的活细胞（cfu/ml）的条形图
（数据表示平均值
±
标准偏差，n = 3）；图17a至17d是在暴露于无插入装置和三个示例导管插入装置之后、粘附到模拟毂的内腔壁的金黄色葡萄球菌细菌/生物膜的荧光显微镜图像；图18是描绘过氧化氢灭菌之后不同日（1日、7日和56日）的来自未灭菌插入装置和来自释放no的插入装置的gsno回收率%（y轴）的曲线图（数据代表平均值
±
标准偏差，n = 3）；图19是描绘暴露于不同浸泡条件的对照插入装置和两个示例插入装置的zn泄漏（ppb，y轴）的曲线图；图20是导管和针对细菌/生物膜形成所测试的不同区域的示意图；图21是描绘对照插入装置和实验导管插入装置的活细胞（cfu/ml）的条形图（数据代表平均值
±
标准偏差，n = 4）；图22a和22b是描绘了未用插入装置处理的对照导管（在对比绵羊1中）（图22a）和用插入装置处理的示例导管（在示例绵羊2中）（图22b）的毂区域的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看到）描绘死细菌；图23a和23b是描绘了未用插入装置处理的对照导管（在对比绵羊1中）（图23a）和用插入装置处理的示例导管（在示例绵羊2中）（图23b）的隧道区域的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看到）描绘死细菌；图24a和24b是描绘未用插入装置处理的对照导管（在对比绵羊1中）（图24a）和用插入装置处理的示例导管（在示例绵羊2中）（图24b）的远侧尖端的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看见）描绘死细菌；图25是描绘对照插入装置帽（在对比绵羊3中）和和实验插入装置帽（在示例绵羊4中）的活细胞（cfu/ml）的条形图（数据代表平均值
±
标准偏差，n在天数上变化）；图26是描绘对照插入装置帽（在对比绵羊3中）和实验插入装置帽（在示例绵羊4中）的不同区域的活细胞（cfu/段）（数据代表平均值
±
标准偏差，n随每个段而变化）的条形图；图27a和27b是描绘未用插入装置处理的对照导管（在对比绵羊3中）和用插入装置处理的示例导管（在示例绵羊4中）（图27b）的毂区域的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看见）描绘死细菌；图28a和28b是描绘未用插入装置处理的对照导管（在对比绵羊3中）（图28a）和用插入装置处理的示例导管（在示例绵羊4中）（图28b）的隧道区域的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘了活细菌，并且红色（不容易看到）描绘了死细菌；图29a和28b是描绘未用插入装置处理的对照导管（在对比绵羊3中）（图29a）和用插入装置处理的示例导管（在示例绵羊4中）（图29b）的远侧血管内区域的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看到）描绘死细菌；图30a和30b是描绘未用插入装置处理的对照导管（在对比绵羊3中）和用插入装置处理的示例导管（在示例绵羊4中）（图30b）的远侧尖端的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看到）描绘死细菌；图31是描绘对比装置帽（使用氯己定）和实验插入装置帽（使用no释放配方）的不同区域的活细胞（cfu/段）的条形图（数据代表平均值
±
标准偏差，n针对每个段而变化）；
图32a和32b是描绘用比较装置帽处理的比较导管（图32a）和用示例插入装置处理的示例导管的毂区域（图32b）的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看到）描绘死细菌；图33a和33b是描绘用比较装置帽处理的比较导管的隧道区域（图33a）和用示例插入装置处理的示例导管的隧道区域（图33b）的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看到）描绘死细菌；图34a和35b是描绘用比较装置帽处理的比较导管（图34a）和用示例插入装置处理的示例导管（图34b）的远侧血管内区域的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看到）描绘死细菌；和图35a和35b是描绘了用比较装置帽处理的比较导管（图35a）和用示例插入装置处理的示例导管（图35b）的远侧尖端的原始彩色荧光显微图像的黑白再现，其中绿色染色描绘活细菌，并且红色（不容易看到）描绘死细菌。
具体实施方式
7.本文公开了一种导管插入装置，该导管插入装置能够在至少部分地插入包含锁定溶液的导管时选择性地生成一氧化氮（no）。当导管不用于其指定的医疗应用（例如，治疗性输注、流体提取等）时，将锁定溶液引入导管中。锁定溶液主要用于确保血液-溶液界面存在于导管的远侧尖端处，并且在某些情况下，也用于防止凝血。
8.本文公开的导管插入装置包括至少固相一氧化氮供体。供体被完全密封在无孔外壳的内腔内，使得固相成分不能从插入装置浸出（泄漏、扩散等）。然而，无孔外壳对水蒸气和no两者也都是可渗透的。当插入装置与锁定溶液接触时，水蒸气可以通过外壳渗透到内腔中，在那里它水合其中包含的固相一氧化氮供体。这引发了固相一氧化氮供体的分解，固相一氧化氮供体释放出no。no可以通过插入物外壳渗透到导管中。因此，在本文公开的示例中，导管插入装置不包含待递送至导管的治疗剂，而是当其被插入到包含锁定溶液的导管中时、在延长的时间段内生成治疗剂（一氧化氮）。这与其他导管消毒装置不同，其他导管消毒装置直接将抗微生物剂或抗生素或其他治疗剂递送到导管中。
9.no具有若干种重要的生理功能，包括抗菌/抗病毒活性。产生并释放到导管中的no可以减少导管内壁上的细菌负荷，并且因此可以充当消毒剂。no还可能够防止细菌粘附和在内部导管壁上形成生物膜。此外，产生的no水平可能足以使得no能够扩散通过导管外壁。导管外部的no可以具有抗微生物和/或治疗效果，例如，以控制感染、最小化炎症和纤维化、抑制局部血小板活性、凝血和/或血栓形成、以帮助杀死细菌和病毒、破坏细菌生物膜形成、以及分散或防止微生物生物膜形成（例如，分散抗生素抗性生物膜）。这些效果可以显著降低常常与导管相关联的感染风险。
10.导管插入装置的示例如图1所示。导管插入装置10包括粉末组合物12，粉末组合物12包括固相s-亚硝基二醇（rsno）；外壳16，包括聚合物壁18，其i）可渗透一氧化氮，ii）无孔，和iii）可渗透水蒸气；和至少部分由聚合物壁18限定的内腔20，其中粉末组合物12完全密封在外壳16的内腔20内。
11.在一些示例中，装置10还包括固相添加剂14，以加速在暴露于水蒸气之后从固相rsno释放一氧化氮的速率，其中固相添加剂14也完全密封在外壳的内腔内。通常，固相添加
剂14选自包括以下各者的组：氧化锌纳米颗粒、铜（ii/i）配体络合物、金属丝、金属纳米颗粒、抗坏血酸、硫醇、氢离子前体、硒种类、有机硒分子、有机碲分子、涂覆有或具有固定形式的有机促进剂种类的二氧化硅或聚合物颗粒及其组合。如本文将进一步详细描述的，固相添加剂14可以是粉末组合物12的组分，或者可以作为单独的组分（例如，金属丝14’）结合到装置10中。
12.粉末组合物12至少包括固相一氧化氮供体。在本文公开的示例中，固相一氧化氮供体是固相s-亚硝基二醇（rsno）。这意味着rsno呈固体形式，例如粉末、纳米颗粒等。s-亚硝基硫醇的一些具体示例选自包括以下各者的组：s-亚硝基谷氨酰胺硫酮（gsno，天然存在于人体内）、s-亚硝基半胱氨酸（cysno，天然存在于人体内）、s-亚硝基-n-乙酰青霉胺（snap，分解成药物青霉胺）、s-亚硝基青霉胺、s-亚硝基人血清白蛋白（天然存在于人体内）及其组合。
13.在一些情况下，粉末组合物12包括100%（以重量计）的固相rsno。在这些示例中，粉末组合物12由固相rsno组成，没有其它组分。
14.在其他情况下，粉末组合物12包括固相s-亚硝基二醇和固相添加剂14（在本文中也称为固相促进剂）。在这些示例中，固相添加剂14是粉末组合物12的一部分；固相添加剂14选自包括以下各者的组：氧化锌纳米颗粒、铜（ii/i）配体络合物、铜纳米颗粒、抗坏血酸、硫醇、氢离子前体、硒种类、有机硒分子、有机碲分子、不锈钢纳米颗粒、金纳米颗粒、涂覆有或具有固定形式的有机促进剂种类的二氧化硅或聚合物颗粒及其组合。在这些示例中，粉末组合物12包括从约15 wt%至约95 wt%的固相rsno和从约5 wt%至约85 wt%的固相添加剂14（或由它们组成）。在其它示例中，粉末组合物12包括从约75 wt%至约95 wt%的固相rsno和从约5 wt%至约30 wt%的固相添加剂14（或由它们组成）。作为一个示例，粉末组合物12包括约75 wt%的gsno和25 wt%的zno纳米颗粒。与具有较高量固相rsno的粉末组合物12的示例相比，具有较低量固相rsno的粉末组合物12的示例释放较少的no，并且释放no的时间段较短。例如，当插入装置10频繁更换时，可能需要较低量的固相rsno。
15.可用作固相添加剂14的任何纳米颗粒可具有范围为从约1 nm至约900 nm的粒径（例如，体积重量平均直径）。例如，氧化锌、铜、不锈钢或金纳米颗粒可以具有范围为从约5 nm至约800 nm的粒径。
16.铜（ii）-配体络合物或铜（i）-配体络合物可用作固相添加剂14。可用作固相添加剂14的合适的铜（ii/i）-配体络合物的示例包括选自由以下各者组成的组：cu(ii)-三（2-吡啶基甲基）胺（cutpma）、cu(ii)-三[2-(二甲氨基）乙基]胺（cume6tran）、cu(ii)-三（2-吡啶基甲基）膦（cutpmp）、cu(ii)-1,4,7-三甲基-1,4-7-三氮杂环壬烷（cu(me3tacn)）、cu(ii)-1,4,7-三乙基-1，4-7-三氮杂环壬烷（cu(et3tacn)）、cu(ii)-1,4,7-三丙基-1,4-7-三氮杂环壬烷（cu(pr3tacn)）、cu(ii)-1,4,7-三异丙基-1,4-7-三氮杂环壬烷（cu(ipr3tacn)）、cu(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基甲基）胺-n-乙基化物）（cu(bmpa-et)）、cu(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基甲基）胺-n-丙酸酯）（cu(bmpa-pr)）、cu(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基甲基）胺-n-丁基化物）（cu(bmpa-bu)）、cu(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基乙基）胺-n-乙基酯）（cu(bepa-et)）、cu(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基乙基）胺-n-丙酸酯）（cu(bepa-pr)）、cu(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基乙基）胺-n-丁酸酯）（cu(bepa-bu)）、cu(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基甲基）胺-n-甲基-苯酚酯）（cu(bmpa-mepho)）、cu(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基甲基）胺-n-丙基苯酚酯）
（cu(bmpa-etpho)）、铜(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基甲基)胺-正丙基酚盐)（cu(bmpa-prpho)）、铜(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基乙基)胺-n-甲基酚盐)(cu(bepa-mepho)）、cu(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基乙基）胺-n-乙基苯酚酯）（cu(bepa-etpho)）、cu(ii)-(n,n-双-(2-吡啶基乙基）胺-n-丙基苯酚酯）（cu(bepa-prpho)）、cu(ii)-3-((2-(吡啶-2-基）乙基）（吡啶-2-基甲基）氨基）乙基酯（cu(pema-et)）、cu(ii)-3-((2-(吡啶-2-基）乙基）（吡啶-2-基甲基）氨基）丁酸酯（cu(pema-pr)）、铜(ii)-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)(吡啶-2-基甲基)氨基)丁酯（cu(pema-bu)）、cu(ii)-2-(吡啶-2-基）-n,n-双（吡啶-2-基甲基）乙烷-1-胺（cu(pmea)）、cu(ii)-2,2
”‑
(2-(吡啶-2-基）乙基）丁烷-1,4-二基）二吡啶（cu(pmap)）、以及其组合。在特定示例中，cu(ii)-配体络合物可以选自cu(ii)-三(2-吡啶基甲基)胺（cutpma）、cu(ii)-三[2-(二甲氨基)乙基]胺（cume6tren）、cu(ii)-三(2-吡啶基甲基)膦（cutpmp）及其组合。虽然本文提供了铜（ii）-配体络合物的几个示例，但是应当理解，也可以使用其他水溶性铜（ii）-络合物或铜（i）络合物。铜（i）络合物应当是稳定的，这样它就不会立即与氧反应并形成铜（ii）。
[0017]
可用作固相添加剂14的合适硫醇的示例包括谷胱甘肽和半胱氨酸。
[0018]
可以用作固相添加剂14的氢离子前体的示例包括能够生成氢离子（质子）的任何酸，诸如聚（乳酸-羟基乙酸共聚物）。
[0019]
可用作固相添加剂14的合适硒种类的示例包括硒代半胱氨酸。另一种合适的有机硒分子包括谷胱甘肽过氧化物酶，其在其结构内含有硒代半胱氨酸。合适的有机碲分子的示例包括5,5
’‑
二碲-2,2
’‑
二噻吩羧酸和其他类似的二碲种类。
[0020]
不锈钢纳米颗粒可以是任何合适的等级，诸如不锈钢类型316、316l、317等。虽然列举了一些金属纳米颗粒，但是应当理解，可以使用其他金属纳米颗粒，只要它们充当用于rsno分解的触发剂和/或催化剂。
[0021]
任何有机促进剂种类（例如，铜（ii/i）-配体络合物、有机硒分子、有机碲分子等）也可以固定或涂覆在固相颗粒的表面上，所述固相颗粒诸如是二氧化硅、金、聚苯乙烯或其他或聚合物颗粒（例如聚氨酯颗粒）。这些经涂覆的颗粒可以用作固相促进剂/添加剂14（例如，在粉末组合物12中）。
[0022]
在本文公开的示例中，固相促进剂/添加剂14可以触发和/或催化一氧化氮供体分解成一氧化氮。以下是固相促进剂/添加剂14可以如何控制或加速一氧化氮释放、特别是从gsno释放速率的一些示例。在一个示例中，当氧化锌纳米颗粒被加热到生理温度时，极化密度降低（δps《 0），从而导致表面上的电荷（正和负两者）未得到补偿。据信，负电荷减少gsno产生no和gsh（即谷胱甘肽）。gsh产生之后，氧化锌表面的正电荷能够氧化gsh形成gs
·
。然后，两个gs
·
可以结合形成二硫化物gssg。在另一个示例中，谷胱甘肽可以经由形成初始的n-羟基亚磺酰胺种类（例如，gs-n(oh)-sg）来增加从gsno释放no的速率，然后将其转化为能够与另一个gsno分子反应释放no并形成gssg二硫化种类的自由基gs
·
。在另一个示例中，抗坏血酸或抗坏血酸盐可以容易地氧化形成更小的苏糖结构（3碳糖）。抗坏血酸的自发氧化可以与gsno的还原耦合，以释放no加gsh。此外，抗坏血酸盐的氧化产物（即较小的苏糖结构）也是能向gsno提供电子的还原剂并且因此也可有助于将gsno直接还原为no。在示例中，抗坏血酸或抗坏血酸盐可以被允许在溶液中氧化长达5天、干燥、并且然后作为固相嵌入粉末组合物12的一部分结合。有机硒种类可以催化从gsno的no生成。铜离子（来自铜
颗粒、铜层或铜（ii/i）络合物）可被配方中存在的任何微量游离硫醇还原为 1氧化态，并且然后cu（i）离子可将gsno还原为no和gsh。在这些示例中的任何一个中，来自rsno的产物和副产物保留在密封外壳16中，除了一氧化氮之外，其可以渗透通过聚合物壁18。
[0023]
在其他情况下，粉末组合物12包括固相s-亚硝基二醇和吸水材料。吸水材料能够增强到插入装置10的内腔20中的吸水。吸水材料的添加会增加在吸湿时的内部粘度，其在与gsno一起使用时会对噻吩基和no自由基对产生笼状效应，使得它们重新结合形成gsno并减缓no释放的速率。吸水材料可以是吸水量至少为0.5 wt%的任何聚合物或化学品。可通过以下等式计算吸水量：吸水量（ wt%）=（w
湿
–w干
）/w
干
×
100（等式1）其中w
湿
和w
干
分别是湿吸水材料和干吸水材料的重量。合适的吸水材料的示例选自包括以下各者的组：聚乙二醇（peg）、聚乙烯醇（pva）、多肽、多离子种类、单糖、多糖、二氧化硅颗粒和盐。蛋白质也可以用作吸水材料。合适的多离子种类的示例包括肝素、硫酸软骨素、聚磷酸盐、多季铵种类等。聚乙二醇（peg）可以具有范围为从约1000 g/mol至约50,000 g/mol的重均分子量。在示例中，聚（乙二醇）具有约4,000 g/mol（或道尔顿）的重均分子量。合适单糖的示例是葡萄糖。合适的多糖的示例包括蔗糖、直链淀粉等。合适的盐的示例包括能够增加插入装置10的渗透压以吸收水的任何盐，诸如氯化钠（nacl）、氯化钾（kcl）等。
[0024]
在这些实施例中，固相rsno与吸水材料的重量比范围为从1∶1至19∶1。在一些示例中，粉末组合物12包括从约50 wt%至约90 wt%的固相rsno和从约9 wt%至约50 wt%的吸水材料。在其他示例中，粉末组合物12包括从约70 wt%至约95 wt%的固相rsno和从约5 wt%至约30 wt%的吸水材料。作为示例，粉末组合物12包括约80 wt%的snap和20 wt%的固体peg颗粒（mw= 4,000 g/mol）（重量比= 4∶1）。
[0025]
在其他示例中，粉末组合物12包括固相rsno、固相添加剂14和吸水材料。在这些实施例中，固相rsno与吸水材料的重量比范围为从1∶1至10∶1。在这些示例中的一些示例中，粉末组合物12由包括约40 wt%至约85.5 wt%的固相rsno、从约5 wt%至约20 wt%的固相添加剂14以及从约8 wt%至约47.5 wt%的吸水材料。
[0026]
当粉末组合物12包括单独的固相rsno或与吸水材料结合时，装置10可以进一步包括完全密封在外壳内腔内的固相添加剂，其中固相添加剂是金属丝14’。在一个示例中，单独的固相添加剂，即金属丝14’，是不锈钢丝或铜丝。虽然列举了一些金属丝，但是应当理解，可以使用能够触发和/或催化一氧化氮供体（固相rsno）分解成一氧化氮的其他金属丝。
[0027]
金属丝14’的长度可以部分取决于外壳16的内腔20的尺寸。在一些示例中，金属丝14’可以延伸穿过内腔20的整个长度，并且在其他示例中，金属丝14’可以部分延伸穿过内腔20的长度。金属丝14’的宽度或直径小于内腔20的宽度或直径，使得内腔20可以容纳金属丝14’和粉末组合物12两者。在示例中，金属丝14’的直径（外径）约为0.3 mm。
[0028]
金属丝14’可以与粉末组合物12（其包括固相rsno，并且可以包括或不包括另一种固相添加剂14和/或吸水材料）一起被引入外壳16中。图1中所示的示例包括位于外壳16中并被粉末组合物12包围的一根金属丝14’。
[0029]
应当理解，单独的固相添加剂（例如，金属丝14’）也可以与本文公开的粉末组合物12的任何示例一起使用。例如，粉末组合物12可以包括固相rsno、任选的吸水材料和任选地另一种固相添加剂14（例如，本文公开的任何颗粒形式）。
[0030]
外壳16包括聚合物壁18和至少部分由聚合物壁18限定的内腔20，聚合物壁18i）可渗透一氧化氮，ii）无孔，以及iii）可渗透水蒸气。聚合物壁可以是具有这些特性的任何聚合物管道材料。对水蒸气的渗透性可能相对地低，例如，吸水率可能低至0.9 wt%。可用于外壳16的聚合物壁18的无孔、no可渗透和水蒸气可渗透的聚合物材料的示例可以选自包括以下各者的组：硅树脂橡胶、聚氨酯、聚乙烯、增塑聚氯乙烯（pvc）、硅氧烷基聚氨酯弹性体和热塑性硅氧烷-聚碳酸酯-聚氨酯。在一个示例中，硅树脂橡胶管道可能是合期望的，因为与其他生物医学级聚合物相比的no通过硅树脂橡胶的高扩散率，并且因为硅树脂橡胶的相对低的硬度允许水分通过其壁以引发no从固相rsno释放。
[0031]
外壳16可以由填充有粉末组合物12并通过粘合剂或其他密封机构密封的单件聚合材料形成。外壳16也可以是用防漏密封构件在相对端部处密封的管（如图1所示）。例如，聚合物壁18是插入管，并且外壳16还包括附接到插入管的相对端部的相应密封机构。示例密封机构包括聚乙烯或聚丙烯或一些其他硬塑料塞，或由与插入管道相同的塑料制成的塞。塞可以在端部处用溶剂密封在适当位置。其他密封机构可以包括常规的硅酮填缝型材料。
[0032]
外壳16的尺寸可取决于导管或导管插入装置10将插入其中的导管部分（见图2中的附图标记26）。在一些示例中，导管插入装置10可以被配置成经过患者的皮肤线穿透到导管管道22中，并穿透到导管管道22的在患者血管内的部分中（例如，如图2所示）。在这些示例中，外壳16的长度短于导管26的长度，并且外壳16的直径小于导管管道22的内径。在一些示例中，导管插入装置10经过患者皮肤线穿透若干厘米，并进入导管管道22的在患者血管内的部分中。在其他示例中（例如，如图3所示），导管插入装置10可以被配置成穿透到适配器24（例如，毂）中，该适配器24附接到导管管道22的近端并且与导管管道22流体连通。在这些示例中，导管插入装置10不穿透经过患者的皮肤线或穿透到导管管道22中。同样在这些示例中，外壳16的长度短于适配器24的长度，并且外壳16的直径小于适配器24的内径。作为示例，外壳16的外径（以及因此导管插入装置10的外径）的范围为从大约0.5 mm到大约3 mm，并且外壳16的内径（以及因此内腔20的直径）范围可以为从大约0.1 mm到大约2.5 mm。当外壳16要穿透到导管管道22中时，长度的范围可以在从大约2 cm到大约20 cm，并且当外壳16要穿透到适配器24中时，长度的范围可以在从大约1 cm到大约5 cm。在适合于与适配器24一起使用的导管插入装置10的一个示例中，长度约为2 cm。
[0033]
在用于制造导管插入装置10的方法中，可以制备粉末组合物12并将其引入外壳16中。然后将密封外壳16，以防止粉末组合物12从外壳16浸出。
[0034]
粉末组合物12可以作为粉末配方（例如，干燥状态）或以溶液的形式引入外壳16中。作为一个示例，固相添加剂14可以与固相rsno混合，并且然后可以添加吸水材料，并且可以进一步混合混合物。作为另一个示例，固相添加剂14或吸水材料可以与固相rsno混合。任何干粉示例都可以使用任何合适的技术装载到外壳16中。
[0035]
当使用单独的固相添加剂14，诸如金属丝14’时，可以将它被插入到存在于外壳16中的粉末组合物12中，或者可以在添加粉末组合物12之前将它引入到外壳16中。
[0036]
作为另一个示例，粉末组合物12可以溶解在合适的溶剂中，以便产生均匀的溶液，并使其更容易填充外壳16。溶剂可以取决于粉末组合物12的组分。在示例中，四氢呋喃（thf）是合适的溶剂。其他合适的溶剂可以包括乙醇和丙酮。当使用溶剂时，应当理解，在密
封外壳16之前，去除溶剂（例如，允许完全蒸发）。虽然溶剂对于实现均匀性和简化填充过程可能是合期望的，但是干粉组合物允许rsno更稳定。
[0037]
然后可以密封外壳16。密封可以包括粘合剂或机械密封构件（例如，帽、塞等）。
[0038]
本文公开的导管插入装置10的任何示例都可以是套件的一部分。图2示出了该套件的一个示例。在示例中，该套件包括导管插入装置10，其包括：包含固相s-亚硝基二醇（rsno）的粉末组合物12，包括聚合物壁18和至少部分由聚合物壁18限定的内腔20的插入物外壳16，该聚合物壁18 i）可渗透一氧化氮，ii）无孔，和iii）可渗透水蒸气，其中粉末组合物12完全密封在外壳16的内腔20内；以及导管26，其包括导管管道22和适配器24，导管管道22可渗透一氧化碳并具有至少一个内腔28，适配器24附接到导管管道22的近端并具有可操作地连接到导管管道22的所述至少一个内腔28的开口；以及将导管插入装置10锁定在所述至少一个内腔28内或适配器22内的适当位置的机构。
[0039]
粉末组合物12的任何示例都可以用于套件中。
[0040]
导管26可以是急性导管或慢性导管。在示例中，急性导管选自包括血管内导管和导尿管的组；或者慢性导管选自包括隧道式透析导管、胃肠外营养导管和药物输注导管的组。
[0041]
导管管道22可以由适合于用于其中使用聚合物材料的应用的任何聚合物材料形成。可以使用一系列聚合物，包括硅树脂橡胶（sr）、尼龙（聚酰胺）、聚氨酯（pu）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（pet）、乳胶和热塑性弹性体。当导管管道22的壁可渗透一氧化氮时（如图2所示），no也可有利地从内腔28和导管管道壁中分离出来。可用于导管管道22的no可渗透材料的示例包括硅树脂橡胶、聚氨酯、sr和pu的共聚物、pu和聚碳酸酯的共聚物以及其它no可渗透材料。当导管管道22可渗透一氧化氮时，no可在导管26的整个外表面上散发，这至少基本上防止了细菌在外导管表面上的粘附、生物膜形成和凝结。例如，生成的增加的no水平将是治疗性的，并且将足以帮助杀死细菌和病毒，破坏细菌生物膜的形成，并且分散或防止微生物生物膜的形成（例如，分散抗生素抗性生物膜）。同时，在导管26的腔28内的锁定溶液中将存在更高水平的no，并且如果导管26是多腔导管，这将防止该腔和其他腔内的感染。
[0042]
在一个示例中，适配器24是博斯特（thouy-borst）适配器。在另一个示例中，适配器24可以是隧道式透析导管（tdc）的毂区域。适配器24可以永久地固定到导管管道22，或者可以是可从导管管道22移除的。适配器24足够宽以接收导管插入装置10，无论装置10是否延伸到适配器24中但没有延伸到导管管道22中，或者无论装置10是否延伸穿过适配器24并延伸到导管管道22中。适配器24可以使得插入装置10能够插入到存在于导管26中的锁定溶液中，而不会引发血液回流到导管26中。
[0043]
锁定机构可以是能够将插入装置10锁定到适配器24的任何合适的装置。锁定机构可以附接在插入装置10的一个端部处。作为一个示例，锁定机构可以是位于插入装置10近端处的螺钉状帽，并且可以附接到适配器24的近端。作为一个示例，锁定机构可以包括具有阳螺纹的帽，该阳螺纹与限定在适配器24近端处的阴螺纹互锁。锁定机构的其他示例包括夹子状机构。该机构可以被推动，使得夹子在导管壁上施加压力并密封内腔。这可以防止材料进入或流出。夹子还可以对插入装置10施加压力，以将其锁定在适当位置。
[0044]
使用导管插入装置10的方法包括将导管插入装置10锁定在导管26的内腔28内或可操作地连接到导管26的适配器24内的适当位置，由此将导管插入装置10放置成与内腔28
内或适配器24内的锁定溶液接触。该方法中可以使用导管插入装置10的任何示例。如图2所示，导管插入装置10可以插入适配器24的开口中。然后，导管插入装置10可以滑动到适当位置中并经由锁定机构锁定。
[0045]
在插入导管插入装置10之前，该方法可以进一步包括将导管锁定溶液引入导管26的腔28中。注射器（或其他合适的仪器）可用于（从容器）吸取导管锁定溶液并将导管锁定溶液引入腔28中。
[0046]
在干燥状态下，粉末组合物12中的rsno相对稳定（例如，持续至少3个月）。一旦导管插入装置10与导管锁定溶液接触，水蒸气将会渗透通过外壳16的聚合物壁18，并引发s-亚硝基二醇的分解，其生成一氧化氮。一氧化氮渗透通过聚合物壁18进入导管26的内腔28中。当导管26的壁可渗透一氧化氮时，no也可渗透通过到导管26的外部。固相添加剂14、14’的存在可以加速在暴露于水蒸气之后从rsno释放一氧化氮的速率，并且吸水材料的存在可以增加水蒸气的量和/或水蒸气被吸入插入导管装置10中的速率。
[0047]
装置10可以相对快速地开始释放no，例如在5分钟内，并且然后可以以相对高的水平持续释放no一段延长的时间段（例如至少24小时，或至少48小时，或至少72小时）。
[0048]
生成的no的量可以通过改变s-亚硝基二醇的重量百分比、固相促进剂/添加剂14的重量百分比、插入物壁18的厚度、插入物壁18的渗透性等来精确控制。
[0049]
取决于导管26的类型，导管插入装置10可以在导管26中保持预定的时间。例如，导管插入装置10可以在导管26中保持范围为从1小时至约3天（72小时）的任何时间。在一个示例中，可能期望在每次透析工作段之后在隧道式透析导管中使用导管插入装置10。在这个示例中，no释放持续大约2到3天将是合期望的。
[0050]
为了进一步说明本公开，本文给出了示例。应当理解的是，这些示例是为了说明的目的而提供的，并且不应被解释为限制本公开的范围。
[0051]
示例示例1释放no的插入装置制备了示例导管插入装置。粉末组合物包含80 wt%的snap（作为固相s-亚硝基二醇）和20 wt%的聚乙二醇（mw= 4,000 g/mol）（作为吸水材料）。将粉末组合物溶解在thf中以获得均匀的溶液。将该溶液添加到0.94 mm外径/ 0.51 mm内径的硅树脂橡胶管道中。0.3 mm不锈钢丝（316l）（作为固相添加剂）也添加到每个管道件中。通过允许被填充的管道在室温下在通风橱下放置至少24小时以允许完全蒸发，从而蒸发掉thf，使得内部组分干燥并呈固体形式。然后用dowsil
™ꢀ
3140 rtv透明硅树脂橡胶涂层mil-a-46146密封管道，并允许其固化/完全密封。
[0052]
no释放曲线测试一个示例导管插入装置在磷酸盐缓冲盐水中浸泡四天，并且由基于化学发光的一氧化氮分析仪检测释放的一氧化氮。前8小时的no释放曲线（左y轴）如图4a所示，第一天（24小时）如图4b所示，第二天的1.25小时如图4c所示，并且第四天的1.25小时如图4c所示。这些曲线图还描绘了一氧化氮水平（ppb）（右y轴）。由于snap的“no-爆发”效应，第1天具有高的no释放量，这发生在snap最初水合时。不锈钢进一步催化了这种效应。第2天和第4天的结果表明，no释放随时间逐渐增加。
[0053]
稳定性测试在三个不同的稳定性时间段处，测试三个插入装置在23℃下的稳定性。稳定性时间段包括储存1个月之后、储存2个月之后和储存3个月之后。在每个稳定性时间段的第1、2和4天进行稳定性测量。初始稳定性测量（在图5a至图5c中称为“初始”）也在制备装置的当天（第1天）、制备装置之后的的一天（第2天）和制备装置之后的第三天（第4天）进行。用基于化学发光的一氧化氮分析仪进行稳定性测量。初始时间段和每个稳定性时间段的第一天的结果如图5a所示；初始时间段和每个稳定性时间段的第2天的结果如图5b所示；并且在初始时间段和每个稳定性时间段的第4天取得的结果在图5c中示出。注意，对于第一天的初始测量，仅测试了两个装置。在第1天的图5a中，由于snap最初暴露于水，插入物释放了非常大量的no。snap的初始水合导致no爆发效应。另外，由于硅树脂管道的壁非常薄，所以最初暴露在水中导致最接近硅树脂外径/周长的snap晶体水合。这导致no的大量爆发和释放。然后，随着水继续被朝向插入物的中心吸收，随着时间的推移，更多的snap被水合，且一氧化氮被释放。结果说明插入物在至少3个月内是稳定的。
[0054]
示例2释放no的插入装置和对照插入装置制备如示例1所述的示例性插入装置。
[0055]
还准备了对照导管插入装置。粉末组合物包括100 wt%的peg和不锈钢丝（不包括snap）。将粉末组合物溶解在thf中以获得均匀的溶液。将该溶液添加到0.94 mm外径/ 0.51 mm内径的硅树脂橡胶管道中。每个管道中还添加了0.3 mm不锈钢丝（316l）。通过允许填充的管道在室温下在通风橱下放置至少24小时以允许完全蒸发，从而蒸发掉thf，使得内部组分干燥并呈固体形式。然后用dowsil
™ꢀ
3140 rtv透明硅树脂涂层mil-a-46146密封管道，并允许其固化/完全密封。
[0056]
生物膜测试使用cdc生物膜反应器，包括10% lb（溶源性肉汤）培养基。使用具有1.96 mm外径、1.14 mm内径和0.41 mm壁厚的聚氨酯（pu）导管。在cdc生物膜反应器中，pu管道一端用环氧密封剂密封，且另一端对培养基开放。
[0057]
进行了为期三天的生物膜测试。pu导管的开放端暴露于铜绿假单胞菌抑或金黄色葡萄球菌。每24小时，将示例插入装置或对照插入装置插入pu导管中。确定pu导管外（外部）表面的细菌完整计数。
[0058]
在图6a中示出了在3天的生物膜测试中、pu导管中的示例插入装置（n=3）和pu导管中的对照插入装置（n=3）对铜绿假单胞菌的抗菌活性。在图6b中示出了在3天的生物膜测试中、pu导管中的示例插入装置（n=3）和pu导管中的对照插入装置（n=3）对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。这些结果清楚地表明释放no的示例插入装置减少了生物膜形成。
[0059]
图7a和7b分别示出了对照插入装置中的一个和示例插入装置中的一个的铜绿假单胞菌3天生物膜测试的原始彩色共聚焦图像的黑白再现。具有对照插入装置的pu导管上的活细菌（图7a）比具有示例插入装置的pu导管上的活细菌（图7b）更多。
[0060]
图8a和8b分别示出了对照插入装置中的一个和示例插入装置中的一个的金黄色葡萄球菌3天生物膜测试的原始彩色共聚焦图像的黑白再现。具有对照插入装置的pu导管上的活细菌（图8a）比具有示例插入装置的pu导管上的活细菌（图8b）更多。
[0061]
用金黄色葡萄球菌进行为期五天的生物膜测试。pu导管的开放端暴露于金黄色葡萄球菌。每24小时，将示例插入装置或对照插入装置插入pu导管中。确定pu导管外（外部）表面的细菌完整计数。
[0062]
在图9中示出了在5天的生物膜测试中、pu导管中的示例插入装置（n=3）和pu导管中的对照插入装置（n=3）对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。这些结果清楚地表明，当与对照插入装置相比时，释放no的示例插入装置减少了生物膜形成。
[0063]
图10a和10b分别示出了对照插入装置中的一个和示例插入装置中的一个的金黄色葡萄球菌的5天生物膜测试的原始彩色共聚焦图像的黑白再现。具有对照插入装置的pu导管上的活细菌（图10a）比具有示例插入装置的pu导管上的活细菌（图10b）更多。
[0064]
分散测试使用cdc生物膜反应器，包括10% lb培养基。使用具有1.96 mm外径、1.14 mm内径和0.41 mm壁厚的聚氨酯（pu）导管。在cdc生物膜反应器中，pu导管管道一端用环氧密封剂密封，并且另一端对培养基开放。铜绿假单胞菌抑或金黄色葡萄球菌被允许在pu导管管道的外表面生长3天时段。然后，在第4天将示例插入装置或对照插入装置放置在pu导管管道中，并在其中保持1天（24小时）。在第5天确定pu导管外表面上的细菌完整计数。
[0065]
在图11a中示出了在3天的扩散测试中、pu导管中的示例插入装置（n=3）和pu导管中的对照插入装置（n=3）对铜绿假单胞菌的抗菌活性。在图11b中示出了在3天的扩散测试中、pu导管中的示例插入装置（n=3）和pu导管中的对照插入装置（n=3）对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。这些结果清楚地表明，释放no的示例插入装置比对照插入装置更好地分散生物膜。
[0066]
图12a和12b分别示出了对照插入装置中的一个和示例插入装置中的一个的铜绿假单胞菌3天扩散测试的原始彩色共聚焦图像的黑白再现。具有对照插入装置的pu导管上的活细菌（图12a）比具有示例插入装置的pu导管上的活细菌（图12b）更多。
[0067]
图13a和13b分别示出了对照插入装置中的一个和示例插入装置中的一个的金黄色葡萄球菌3天扩散测试的原始彩色共聚焦图像的黑白再现。具有对照插入装置的pu导管上的活细菌（图13a）比具有示例插入装置的pu导管上的活细菌（图13b）更多。
[0068]
内腔抗菌测试在这个为期5天的测试中，使用了流动池系统。pu导管的内腔接种有细菌（铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌）。新鲜培养基流动每天发生3次，持续1小时，并且在一天的剩余时间内，停止流动。释放no的示例插入装置或对照插入装置被放置在内腔内。当插入物放置在内腔中时，培养基保留在内腔中，部分原因是在没有污染的情况下很难冲洗出来。导管的一端对空气开放；并且另一端连接到培养基流连接器系统的移液管尖端。每天使用新鲜的插入物。
[0069]
在图14a中示出了在5天的内腔生物膜测试中、pu导管中的示例插入装置（n=4）和pu导管中的对照插入装置（n=4）对铜绿假单胞菌的抗菌活性。在图14b中示出了在5天的内腔生物膜测试中、pu导管中的示例插入装置（n=4）和pu导管中的对照插入装置（n=4）对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。这些结果清楚地表明，当与对照插入装置相比，释放no的示例插入装置减少了生物膜形成。
[0070]
示例2的所有结果表明，不锈钢丝作为固相添加剂的存在显著增强了一氧化氮的
效果。
[0071]
示例3释放no的插入装置和对照插入装置释放no的插入物的尺寸是基于常用的血液透析导管的毂尺寸设计的。
[0072]
所有导管插入装置都是在没有直射光的情况下制备的。
[0073]
将硅树脂橡胶管道（内径（id）0.058"，外径（od）0.077”）切成约3 cm的段，每段在一端用粘合胶（dowsil
™ꢀ
3140 rtv透明硅树脂涂层mil-a-46146）密封，然后允许其干燥约24小时。然后，使用玻璃漏斗移液管将12
ꢀ±ꢀ
0.2 mg所需的干粉配方分配到相应的管道段中。使用的干粉配方包括（示例a） 75 wt% gsno ： 25 wt% 30 nm尺寸的zno纳米颗粒；（示例b） 25 wt% gsno ： 75 wt% 30 nm尺寸的zno纳米颗粒；（示例c） 60 wt% gsno ： 20 wt% 30 nm尺寸zno纳米颗粒：20 wt%固体聚乙二醇（mw= 3,350）（聚乙二醇）；（对比示例d） 75 wt% gsno ： 25 wt%锻制二氧化硅。在使用之前，使用研钵和研杵将gsno粉碎成细粉，并通过涡旋约1分钟将其与其它组分混合，以实现均匀的干粉混合物。在用所需的粉末配方（约12 mg ≈ 1.8 cm填充长度）填充管道后，用于填充管道段的端部被切割，以在填充粉末上方获得约0.2 cm的顶部空间。粘合胶用于密封开放端，并允许其干燥约24小时。每个插入物的最终长度约为2.0 cm。
[0074]
no释放曲线测试一氧化氮从释放no的插入物中释放（示例a-c，对比示例d）是使用基于化学发光的一氧化氮分析仪（noa）测量的。noa首先经由两点校准穿过noa零空气过滤器且n2气体中的标准一氧化氮含量为44.3 ppm的n2气体进行校准。
[0075]
使用18.2 mω去离子水制备盐溶液（0.9%氯化钠）。noa样品池填充有11 ml盐溶液，并且释放no的插入物置于漂浮聚丙烯屏障下方，以保持插入物始终完全浸没。用n2气体以50 ml/min的速率使盐溶液贮存器中鼓泡，以使从gsno生成的no从溶液中逸出，并由n2吹扫气体运载到noa中。所有noa样品池都包裹在铝箔中，以屏蔽样品免受光暴露。室温（24℃）下持续no释放72小时。
[0076]
选择该测试的条件来模拟血液透析导管毂的真实条件。选择在72小时时段内测量，因为血液透析治疗通常每2到3天进行一次，从而使得释放no的插入物能够在每次透析工作段处改变。之所以选择其他条件，是因为导管毂位于体外、不透明并用盐水锁定溶液锁定。
[0077]
结果如图15所示。示例a在最初24小时内产生大爆发的no，并逐渐减少，直到达到72小时标记。对于示例b，与示例a相比，gsno和zno的百分比是相反的。示例b与示例a相比表现出相似的no释放曲线，然而，初始爆发仅持续12小时，并且由于初始存在的gsno量较低而随后显著减弱。示例b的结果说明，长期释放需要更多的rsno。
[0078]
为了试图使示例a的no释放曲线变平/平滑，用聚乙二醇（mw=3,350）（peg）制备示例c。添加peg是为了增加插入物内部组分（gsno和zno）的粘度。如图15所示，实现了变平/平滑效果，这导致在72小时时段内no释放速率更加一致。
[0079]
为了证明示例a、b和c中的每一者中zno都增强了no释放，在对比示例d中用锻制二氧化硅颗粒代替了zno。锻制二氧化硅颗粒是不与gsno反应的惰性试剂。对比示例d的no释放曲线示出了72小时内no释放最少。这些数据说明zno增强了从包含在硅树脂橡胶管道内
的gsno的一氧化氮释放。
[0080]
体外模拟导管毂测试示例a、b和c显示了在72小时内的独特的no释放曲线。因此，使用模拟毂抗微生物实验针对每一者测试了它们的杀菌效果。该实验被设计成模拟真实血液透析导管毂的条件。
[0081]
为了模拟导管的毂区域，采用了3 cm的硅树脂管道（id 0.125”，od 0.250”）。将体积为0.3ml的在10% lb肉汤中过夜生长的细菌培养物（1
×
108 cfu/ml）转移到一端夹紧的模拟毂中。然后，释放no的插入物被放入模拟轮毂内部，且另一端被夹紧关闭。对于对照样品，没有添加释放no的插入物。每种样品在室温（24℃）下于黑暗中在摇床上低速孵育72小时。在孵育72小时后，从每个模拟毂回收20
µ
l细菌培养液，并连续稀释10倍。将50
µ
l各稀释物铺在lb琼脂板上，并在37℃下孵育过夜，以用于菌落形成单位（cfu）计数。模拟毂也被切成小片，并且内部用baclight活/死染色试剂盒在黑暗中染色15分钟，以评估生物膜的程度。显微图像是通过使用带有适当滤光片组的荧光显微镜获得的（对于syto-9为488/520 nm，对于碘化丙锭为493/636 nm）。
[0082]
每种释放no的插入物配方（示例a-c）杀死了存在于每种模拟毂的液体肉汤中的所有细菌，从而导致与对照（没有释放no的插入物）相比细菌减少了6.4对数。这些结果如图16所示。该数据表明示例a-c能够杀死模拟导管毂区域的液体肉汤中的金黄色葡萄球菌细菌细胞。
[0083]
对每个模拟毂的内腔壁拍摄荧光显微图像，并且在图17a至图17d中描绘了原始彩色图像的代表性黑白再现。对照（图17a）以及示例b（图17c）和c（图17d）显示了粘附到模拟毂内腔壁的金黄色葡萄球菌细菌/生物膜证据。相比之下，示例a（图17b）没有显示明显的金黄色葡萄球菌细菌/生物膜粘附的证据。
[0084]
来自示例a的数据表明，在最初24小时内no的大量爆发对于防止生物膜形成是合期望的。因此，示例a的配方（75% gsno ：25% 30 nmzno纳米颗粒）用于附加测试。
[0085]
灭菌和稳定性测试在动物测试之前，对释放no的插入物执行灭菌。在光、热、金属离子和水的存在下，gsno自然地反应以释放no。因此，测试了不同的灭菌方法，来看看它们是否对gsno稳定性有任何负面影响。
[0086]
对于这些测试，类似于示例a制备附加的释放no的插入物。这些插入物中的三个在本文中统称为示例e，并且另外三个统称为示例f。插入物被单独包装到单独的袋中，并被送到密歇根大学医院灭菌设施进行环氧乙烷（eo）或过氧化氢（h2o2）处理。
[0087]
对于eo处理，将释放no的插入物（示例e）暴露于1小时预处理和加湿过程（54℃，40-80%湿度），然后在相同温度和湿度下暴露于环氧乙烷气体3小时。然后，执行2小时的环氧乙烷气体排空过程，接着进行12小时的空气洗涤。
[0088]
h2o2处理（使用sterrad
®
系统）总共耗时近似45分钟。在真空下，59%（标称）的h2o2水溶液被蒸发以覆盖释放no的插入物。当压力降低时，气态h2o2发生扩散，其在施加射频能量之后形成低温h2o2气体等离子体。生成的h2o2气体等离子体对释放no的插入物进行灭菌（示例f）。
[0089]
类似于对比示例d制备三个对照释放no的插入物（统称为对比示例g），但没有灭
菌。
[0090]
对对照插入物（对比示例g）测量第0天的gsno量。同样在第0天，使用eo处理（示例e）或h2o2处理（示例f）对剩余的释放no的插入物进行灭菌。
[0091]
通过使用紫外（uv）光和noa检测/量化释放的no总量来测量每个插入物内gsno的量/稳定性。具体而言，将2 ml纯化水添加到noa样品池。在实现稳定的基线之后，切开释放no的插入物中的一个，并且使用另外2 ml纯化水将粉末填充物转移到样品池中。使用另外1 ml纯化水冲洗noa样品池壁上的所有剩余粉末，直至进入大体积溶液（总共5 ml纯化水）。用n2气体以50 ml/min的速率使含gsno/zno的溶液鼓泡，以从溶液中逸出，并由n2吹扫气体带入noa中。使用uv光辐照样品，直到从gsno释放的no耗尽，标志为回到原始基线。因为摩尔比为1∶1，所以从每个释放no的插入物释放的no量被直接转换成gsno。从三种no释放对照插入物（未灭菌）测得的最高gsno量被假定为gsno的100%回收率；因此，所有其他样品（无菌和非无菌）都归一化为该值。因此，》 100%的gsno回收率是可能的。表1示出了示例e、示例f和对比示例g（对于每一者，n=3）。
[0092]
基于这些结果（较低的标准偏差和较快的周转），选择h2o2处理进行进一步测试。
[0093]
表1。
[0094]
然后分析释放no的插入物内部gsno的长期稳定性。类似于示例a制备附加的释放no的插入物，并使用h2o2方法灭菌（统称为示例h）。这些附加的插入物中有三个没有灭菌，并且被用作对照（统称为对比示例i）。使用本文描述的方法在第0天测定每个对照插入物中的gsno量。在第0天对剩余的插入物（示例h）完成h2o2灭菌之后，它们保留在其各个的灭菌袋中，并在室温（24℃）下于黑暗中储存在装有干燥剂的密封玻璃罐中，直到进一步使用。在第一天测量了三个插入物中的gsno。在第7天测量了另外三个插入物中的gsno。在第56天测量了又另外三个插入物中的gsno。结果如图18所示。在近2个月的储存（第56天）之后，发现插入物内部的gsno平均降解4.3%。因此，当在室温下与zno纳米颗粒一起储存在硅树脂插入装置内部时，gsno相对稳定。
[0095]
浸出测试执行测试以确定当浸泡在溶液中时，是否有任何粉末组成物成分从插入装置中泄漏。如本文所述制备类似于示例a的插入装置，包括通过开放端填充粉末，并且然后密封开放端。三个插入装置的密封端被固定到相应测试瓶的相应帽。
[0096]
对于这些测试，三个对照插入装置仅包括硅树脂橡胶管道和粘合胶，而没有gsno或zno存在。
[0097]
使用纯化的去离子水作为浸泡溶液，因为盐溶液中的高盐浓度会破坏电感耦合等离子体质谱（icp-ms），电感耦合等离子体质谱用于检测浸泡预定时段之后浸出液中的锌。
[0098]
采用两种不同的浸泡条件进行浸出测试。将所有插入装置放入测试瓶内限定体积（10 ml）的纯化去离子水中。三个对照插入装置和三个包括粉末组合物的插入装置（统称为
示例j）被完全浸没，使得插入装置的两个端部都浸泡在测试瓶内的溶液中。包括粉末组合物的另外三个插入装置（统称为示例k）部分浸没在溶液中。对于部分浸没，使用其上固定有插入装置的帽。因为这些插入装置由相应测试瓶的帽保持，所以在粉末组合物引入之后密封的端部不暴露于测试瓶内的溶液。
[0099]
浸泡24小时（1天）之后，移除插入装置、彻底清洗、干燥，并再次完全或部分浸没在新鲜的纯化去离子水中。在第2天和第3天重复该过程。在收集相应溶液之后，使用icp-ms测量各溶液中锌含量的浓度。结果在图19中示出。
[0100]
如图19所示，在最初的24小时浸泡时段之后，对于两种不同浸泡条件，溶液中检测到的锌浓度差异极大（示例j（完全浸没）为1394.3 ppb对示例k（部分浸没）为76.8 ppb）。如上所述，两种浸泡方法的区别在于，在完全浸没的情况下，填充有gsno/zno粉末之后密封的硅树脂橡胶管道的端部直接暴露于溶液；然而，在部分浸没的情况下，该端部在帽的内部，且不暴露于溶液。因此，可以得出这样的结论：zno能够从密封在第二端部上的硅树脂管道的端部中蔓延出来，因为在密封之前（例如，在填充期间），该管道的端部直接暴露于氧zno，而硅树脂管的另一端部在暴露于氧化锌之前被预密封和干燥（从而产生更牢固的密封）。此外，示例k（完全浸没的插入装置）的大误差条间接证明了这种现象，因为可以接近第二密封端部边缘的zno的量可能变化很大，因为插入物是手工制造的。
[0101]
总的来说，图19中的数据表明锌没有从释放no的插入装置的硅树脂管道壁浸出。
[0102]
体外导管毂测试以与示例a相同的方式制备释放no的插入物，并通过h2o2灭菌方法进行预灭菌。这些no插入装置在实际血液透析导管毂中的抗菌效果分别针对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株、即金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行了测试。
[0103]
用于该测试的导管为28 cm长的permcath
™
小儿硅树脂慢性双腔椭圆形导管（来自covidien/medtronic）。将导管毂区域上的夹子夹紧关闭，并且添加0.3 ml在10% lb肉汤中过夜生长的细菌培养物（1
×
108 cfu/ml）。将释放no的插入物插入导管毂内部，并用帽密封。
[0104]
对于对照样品，没有添加释放no的插入物。
[0105]
每根导管在室温（24℃）下于黑暗中在摇床上低速孵育72小时。在72小时孵育之后，从每个毂区域回收20
ꢀµ
l细菌培养液，并连续稀释10倍。将50
ꢀµ
l各稀释物铺在lb琼脂板上，并在37℃下孵育过夜，用于菌落形成单位（cfu）计数。与对照插入物相比，示例插入物对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别减少6.6和6.7对数。该数据表明，含有示例a配方（75% gsno / 25% zno纳米颗粒）的释放no的插入物在杀死革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株两者方面极其有效。
[0106]
体内-绵羊测试大致程序这些测试中的每一项都涉及动物处理和手术程序，这些程序由密歇根大学动物使用和护理委员会根据大学和联邦法规批准（使用芬太尼透皮贴剂100 g/h进行24小时禁食和手术前镇痛）。
[0107]
使用体重45-50 kg的成年绵羊。在全身麻醉下，使用塞尔丁格丝技术将28 cm长（13 cm袖带至近侧尖端）的permcath
™
小儿硅树脂慢性双腔椭圆形导管放置在左右颈静脉
（锁骨下静脉上方约3 cm至约5 cm）中，旨在将近侧尖端置于ra-svc接头处。小心不要暴露或操纵血管。导管固定到皮肤，并用无菌敷料覆盖。在导管放置之后，绵羊从麻醉中恢复，并被安置在畜舍中（非无菌条件）。
[0108]
所有导管均加帽，并经由内腔远端注入2,000 u肝素化盐水溶液（2 ml）。用于绵羊测试的释放no的插入物是使用示例a中的配方制备的：75% gsno ： 25% 30 nm尺寸的zno纳米颗粒。使用dowsil
ꢀ®
粘合胶将释放no的插入物附接到公鲁尔锁注射位点帽（qosina），并允许其干燥24小时。每个释放no的插入物帽被单独包装，并使用本文所述的h2o2灭菌法进行灭菌。无菌释放no的插入物帽储存在室温（24℃）下，并且被屏蔽而不受光影响、直到它们被使用。
[0109]
尸检前（每次测试的第14天），经由头静脉血管导管注射10,000 u肝素团剂，然后是fatalplus iv注射。每根导管都是使用无菌技术获得的。每个导管的外表面都通过用70%乙醇溶液擦拭消毒。从导管的每个区段切下一 厘米长的区段。使用均化器（omni th，omni国际，肯尼索，ga）在15 ml管中将每个区段在2 ml 1
ꢀ×ꢀ
pbs （10 mm，ph 7.2）中全速均化，以去除粘附到内腔壁的所有细菌/生物膜，并将指定量（例如20
µ
l）的所得溶液连续稀释10倍。将指定量的每种稀释液（例如5
µ
l）铺在lb琼脂板上，并在37℃下孵育过夜以进行cfu计数。
[0110]
另外，从导管的每个区段切下》 0.5 cm长度的区段，并且在黑暗中用baclight活/死染色试剂盒对内腔表面染色15分钟。显微图像是通过使用带有适当滤光片组的荧光显微镜获得的（对于syto-9为488/520 nm，并且对于碘化丙锭为493/636 nm）。
[0111]
图20是绵羊测试中使用的导管以及被检查的各个区域的示意图。这些区域包括毂区域、隧道区域、远侧血管内区域和近侧尖端。
[0112]
绵羊测试#1在绵羊测试#1期间，研究了两只成年绵羊。一只绵羊（对比示例绵羊1）被指定为对照组（总共n = 4个导管毂，没有释放no的插入物），并且另一只绵羊（示例绵羊2）被指定为实验组（总共n = 4个导管毂，使用释放no的插入物帽）。在术后第0、2、4、7、9、11和14天，帽被更换。对于该程序，从每个腔抽取3.5 ml血液，然后用2000 u肝素化盐水溶液（2 ml）锁定腔，并用新的帽分别替换释放no的插入物帽和对照帽。在术后第14天，从每个导管腔的毂区域取50
ꢀµ
l液体，并铺在lb琼脂板上。板在37℃下孵育过夜，用于菌落形成单位（cfu）计数。结果如图21所示。如所描绘的，用插入装置处理的示例绵羊2的导管在与对比绵羊1的导管相比时活细胞减少》 3对数单位，对比绵羊1没有用任何插入装置处理。
[0113]
使用活/死染料染色，对导管的毂内腔壁、隧道和远侧区域拍摄荧光显微图像。在原始彩色图像中，绿色染色描绘活细菌，并且红色描绘死细菌。
[0114]
图22a和22b分别描绘了来自对比示例绵阳1的导管中的一个的毂区域和来自示例绵阳2的导管中的一个的毂区域的荧光显微图像（呈黑色和白色）。来自对比示例绵羊1的导管的毂区域具有活细菌生物膜，而来自示例绵羊2的导管的毂区域具有最少的单细胞（死的或活的）。
[0115]
图23a和23b分别描绘了来自对比示例绵羊1的导管中的一个的隧道区域和来自示例绵羊2的导管中的一个的隧道毂区域的荧光显微图像（呈黑色和白色）。来自对比示例绵羊1的导管的隧道区域具有多个活细菌的单细胞，而来自示例绵羊2的导管的隧道区域具有
最少的单细胞（死的或活的）。
[0116]
图24a和24b分别描绘了来自对比示例绵羊1的导管中的一个的远侧尖端和来自示例绵羊2的导管中的一个的远侧尖端的荧光显微图像（呈黑色和白色）。来自对比示例绵羊1的导管的远侧尖端具有活细菌和死细菌的生物膜。图24b的彩色版本（来自示例绵羊1的导管的远侧尖端）显示出一些红色和绿色。然而，从更高放大的图像中可以确定，这些红色和绿色条纹来自表面纹理，而不是来自细菌。事实上，来自示例绵羊2的导管远侧尖端具有最少的单细胞（死的或活的）。
[0117]
绵羊测试#2在绵羊测试#2期间，研究了两只成年绵羊。一只绵羊（对比示例绵羊3）被指定为对照（总共n = 4个导管毂，没有释放no的插入物），并且另一只绵羊（示例绵羊4）被指定为实验组（总共n = 4个导管毂，使用释放no的插入物帽）。在术后第0天、第2天、第4天、第7天、第9天、第11天和第14天，从每个导管腔的毂区域取50
ꢀµ
l液体用于cfu计数。然后，从每个腔抽取3.5 ml血液，然后用2000 u肝素化盐水溶液（2 ml）锁定腔，并且用新的帽分别替换释放no的插入物帽和对照帽两者。每2至3天更换一次对照和实验帽，并通过每个腔抽取血液，以模拟透析治疗和血液暴露之间的平均时间。在14天之后，终止测试，并评估每个血液透析导管在导管四个独立区域内壁上存在的细菌/生物膜的量（图20）。
[0118]
对于cfu计数，用pbs缓冲液连续稀释（50
ꢀµ
l中的）20
ꢀµ
l 10倍。将每种稀释液5
ꢀµ
l转移到lb琼脂板上，并将板孵育过夜以进行菌落计数。图25总结了每2-3天从毂区域内的液体中获取的细菌计数的结果。在特定的日子，诸如第7天和第11天，一些不可预见的情况阻止了从每个毂区域获得合适的液体样品。然而，数据保持一致。其中对比绵羊3（导管中没有释放no的插入物帽）在第4天之后显示出显著的细菌计数，并且示例绵羊4（导管中具有释放no的插入物帽）在任何一天都没有显示出细菌，因此在每天的测试之后达到检测极限（220 cfu/ml，由图25中的虚线表示）。例如示例绵羊4对对比示例绵羊3，在第4天已经观察到3.88的对数减少，并且在第14天增加到5.42。该数据表明，在真实世界条件下，释放no的插入物帽对毂区域液体中存在的细菌具有显著的抗菌效果。
[0119]
在完成14天的研究后，对每个导管的四个区域（如图20所示）进行粘附到内腔壁的细菌/生物膜测试。该测试通过首先对导管外部进行消毒、切掉特定区段、并使用均化器从内腔壁去除所有粘附的细菌/生物膜以进行细菌计数（如上所述）来进行。在图26中总结了该测试的结果。对于来自对比绵羊3的导管，导管的所有四个区域都具有大量细菌/生物膜存在。对于来自示例绵羊4（具有实验组释放no的插入物帽）的导管，在四个区域中的任何一个中都没有检测到细菌。有趣的是，在导管的所有区域中并且不仅仅是毂区域（no在那里局部释放）都观察到了细菌/生物膜预防。该数据定量地表明，细菌可以从毂区域迁移到导管的近侧区域，并且在真实世界的情况期间，释放no的插入物帽在导管的所有区域都具有显著的抗菌/抗生物膜潜力。
[0120]
使用活/死染料染色对导管每个区域的内腔壁拍摄荧光显微图像。在原始彩色图像中，绿色染色描绘活细菌，且红色描绘死细菌。
[0121]
图27a和27b分别描绘了来自对比示例绵羊3的导管中的一个的毂区域和来自示例绵羊4的导管中的一个的毂区域的荧光显微图像（呈黑色和白色）。来自对比示例绵羊3的导管的毂区域具有活细菌生物膜，而来自示例绵羊4的导管的毂区域具有最少的单细胞（死的
或活的）。
[0122]
图28a和28b分别描绘了来自对比示例绵羊3的导管中的一个的隧道区域和来自示例绵羊4的导管中的一个的隧道毂区域的荧光显微图像（呈黑色和白色）。来自示例绵羊3的导管的隧道区域具有活细菌生物膜，而来自示例绵羊4的导管的隧道区域具有最少的单细胞（死的或活的）。
[0123]
图29a和29b分别描绘了来自对比示例绵羊3的导管中的一个的远侧血管内区域和来自示例绵羊4的导管中的一个的远侧血管内区域的荧光显微图像（呈黑色和白色）。来自对比示例绵羊3的导管的远侧血管内区域具有活细菌和死细菌的生物膜。来自示例绵羊4的导管的远侧血管内区域具有最少的单细胞（死的或活的）。
[0124]
图30a和30b分别描绘了来自对比示例绵羊3的导管中的一个的远侧尖端和来自示例绵羊4的导管中的一个的远侧尖端的荧光显微图像（呈黑色和白色）。来自示例绵羊3的导管的远侧尖端具有活细菌和死细菌的生物膜。来自示例绵羊4的导管的远侧尖端具有最少的单细胞（死的或活的）。
[0125]
该数据定性地表明，在真实世界条件下，释放no的插入物帽防止每个导管区域中细菌/生物膜的形成。
[0126]
绵羊测试#3在绵羊测试#3期间，研究了两只成年绵羊。在该测试中，使用市售的以氯己定为抗菌剂的抗菌帽进行比较。
[0127]
对于绵羊5，植入右颈静脉的导管被指定用于商业氯己定帽，并且植入左颈静脉的导管被指定用于释放no的插入物帽。对于绵羊6，颠倒该指定，使得将右颈静脉指定为释放no的插入物帽，并且将植入左颈静脉的导管指定为氯己定帽。总的来说，对于氯己定帽存在n = 4个导管毂，并且对于释放no的插入物帽也存在n = 4个导管毂。术后第0天、第2天、第3天、第6天、第8天、第10天、第12天和第14天，从每个导管腔的毂区域取50
ꢀµ
l液体用于cfu计数。然后，从每个腔抽取3.5 ml血液，用2000 u肝素化盐水溶液（2 ml）锁定，并且用新的帽分别替换no插入物帽和氯己定帽两者。
[0128]
在14天之后，终止测试，并且评估每个血液透析导管在导管四个独立区域内壁上存在的细菌/生物膜的量（图20）。该测试通过首先对导管外部进行消毒、切掉特定区段、并使用均化器从内腔壁去除所有粘附的细菌/生物膜以进行细菌计数（如上所述）来进行。在图31中总结了该测试的结果。对于实验导管，在毂和隧道区域中检测到最少的细菌，并且在远侧血管内区域和近侧尖端中没有检测到细菌。对于氯己定导管，在所有四个区域中都检测到细菌/生物膜。与氯己定导管相比，实验组导管的隧道区域细菌对数减少最大（3.82）。总的来说，这些数据表明，与市售的氯己定帽相比，释放no的插入物帽能够好得多地防止血液透析导管所有四个区域中的细菌/生物膜形成。
[0129]
使用活/死染料染色对导管每个区域的内腔壁拍摄荧光显微图像。在原始彩色图像中，绿色染色描绘活细菌，且红色描绘死细菌。
[0130]
图32a和32b分别描绘了（以黑色和白色）氯己定导管中的一个的毂区域和实验导管中的一个的毂区域的荧光显微图像。毂区域两者都有最少的单细胞（死的或活的）。
[0131]
图33a和33b分别描绘了（以黑色和白色）氯己定导管中的一个的隧道区域和实验导管中的一个的隧道区域的荧光显微图像。氯已定导管的隧道区具有活细菌生物膜，而实
验导管的隧道区域具有最少的单细胞（死的或活的）。
[0132]
图34a和34b分别描绘了（以黑色和白色）氯己定导管中的一个的远侧血管内区域和实验导管中的一个的远侧血管内区域的荧光显微图像。氯已定导管的远侧血管内区域有活菌和死菌生物膜。实验导管的远侧血管内区域具有最少的单细胞（死的或活的）。
[0133]
图35a和35b分别描绘了（以黑色和白色）氯己定导管中的一个的远侧尖端和实验导管中的一个的远侧尖端的荧光显微图像。氯已定导管和实验导管的远侧尖端各自具有最少的单细胞（死的或活的）。
[0134]
氯己定导管显示粘附到隧道区域的内腔壁的显著的细菌/生物膜，这对应于从隧道区域获得的升高的细菌/生物膜计数。实验导管（释放no的插入物帽）显示粘附到所有四个区域的内腔壁的细菌很少或没有。该数据表明，与市售氯己定帽相比，释放no的插入物帽防止每个导管区域中形成更多细菌/生物膜。
[0135]
应当理解，本文提供的范围包括所述范围和所述范围内的任何值或子范围，就好像明确列举了所述范围内的值或子范围一样。例如，从约1 nm到约900 nm的范围应被解释为不仅包括明确列举的从约1 nm到约900 nm的极限，还包括单个值，诸如约3.7 nm、约45 nm、约100 nm、约520.5 nm、650 nm、799 nm等、以及子范围，诸如从约395 nm到约595 nm等。此外，当使用“约”来描述一个值时，这意味着涵盖从所述值的微小变化（高达 /
‑ꢀ
10%）。
[0136]
在整个说明书中对“一个示例”、“另一个示例”、“示例”等的引用意味着结合该示例描述的特定元素（例如，特征、结构和/或特性）被包括在本文描述的至少一个示例中，并且可以存在于或不存在于其他示例中。另外，应当理解，用于任何示例的所描述的元素可以以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确指示。
[0137]
在描述和要求保护本文公开的示例时，单数形式“一个”、“一”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。
[0138]
虽然已经详细描述了几个示例，但是应当理解，可以修改所公开的示例。因此，前面的描述被认为是非限制性的。