一种蓝莓天然酵母Bob1及其筛选方法和应用与流程

一种蓝莓天然酵母bob1及其筛选方法和应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种蓝莓天然酵母bob1及其筛选方法和应用。


背景技术：

2.蓝莓因为其营养物质丰富，口感酸甜，外形小巧独特，主要作为新鲜水果食用。近年来，将蓝莓加工为果脯、果酱也同样深受广大人民的喜爱。但是由于蓝莓果皮较薄，没有坚硬果皮包裹，极不易储存。虽然蓝莓的优点有很多，但是由于每年蓝莓的上市时间集中，产量大，且蓝莓的贮运性很差，导致每年蓝莓由于无法及时食用完而造成了很大的浪费。这不仅使我国蓝莓果业的发展受影响严重，同时也造成了巨大的经济损失。要想很好地解决这个问题，传统的水果消费观念就必须被改变，而蓝莓酒正是蓝莓理想的消费转换方式之一。为避免果酒风味的同质化，生产独具特色的蓝莓果酒，筛选适合蓝莓果酒的天然酵母显得尤为重要。同时，由天然酵母发酵蓝莓可产生酒精。


技术实现要素：

3.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种蓝莓天然酵母bob1 及其筛选方法和应用。本发明蓝莓天然酵母bob1能够产生酒精，所酿造的蓝莓果酒酸甜适中，香气馥郁，品质优良，酒精度为3.2％，ph为3.12，残糖量为13.06g/l，总酸为3.07g/l。
4.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
5.本发明提供了一种蓝莓天然酵母bob1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.23757，分类命名：pichia bruneiensis，保藏日期为：2021 年11月8日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
6.还提供了一种蓝莓天然酵母bob1的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
7.(1)取新鲜蓝莓无菌破碎处理后密闭，置于生化培养箱中培养，待有co2产生后，取发酵液用无菌水稀释，得到稀释液。蓝莓成熟饱满，每颗果实都经过认真筛选，清洗，但不能过度清洗。
8.(2)将上述步骤(1)得到的稀释液涂布于含有氯霉素的沙保罗下层培养基中，在通风条件下恒温培养后，置于沙保罗上层培养基中，在密闭环境中避光倒置培养1-3h；观察培养基颜色的变化，ttc试剂与酒精会发生颜色变化生成红色的化合物；ttc下层培养基中添加氯霉素，以抑制杂菌生长；避光倒置培养，以观察显色状况；产酒精能力强的菌株，在培养基上显出的颜色越深。同时，这一过程可初步筛选出优良、发酵性能较好的菌株。
9.(3)挑取显深红色的菌株，接种于酵母固体培养基上，在通风条件下恒温培养，选取具有典型酵母特征的单菌落，进行3-4次平板划线，保证尽量获得纯菌，得到单个菌落接种至酵母固体培养基中培养，稀释后接种至鉴别培养基上纯化培养，挑取纯菌株，并对纯菌株进行镜检。
10.(4)采用试剂盒提取法提取上述步骤(3)得到的纯菌株的基因组dna，以its1和its4为引物，pcr扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，得到基因序列；以引物its1和its4扩增其26s rdna 的d1/d2区域。
11.(5)进行生长性能分析和理化性质分析，筛选得到蓝莓天然酵母bob1。
12.所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(1)中培养的条件为：培养温度28-30℃，培养时间1-3d，所述发酵液与无菌水的稀释比例为1-2:1-2，优选1:1。保证部分果实表面暴露在空气中。
13.所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中恒温培养条件为：培养温度28-30℃，培养时间24-28h，所述稀释液的浓度为10-4-10-6
。保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。
14.所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(3)中恒温培养条件为：培养温度28-30℃，培养时间1-3d，所述稀释后菌种的浓度为10-4-10-6
。保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。
15.所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(3)中镜检的具体操作为：将挑取的纯菌种经草酸铵结晶紫染色，再置于显微镜下观察细胞形状，大小及繁殖方式。
16.所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(4)中pcr扩增的体系为：总体积20μl，顺序加入primestarmax 10μl，引物its1和its4各0.5μl，基因组dna0.3μl，无菌水8.7μl。
17.所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(4)中pcr扩增的过程为：98℃预变性5min， 98℃变性30s，56℃退火20s，72℃延伸30s，共31次循环，最后10℃充分延伸5min。
18.一种蓝莓果酒，其特征在于所述蓝莓果酒由如权利要求1所述的蓝莓天然酵母bob1发酵酿造得到的。
19.所述的蓝莓天然酵母bob1在蓝莓果酒发酵中的应用。
20.本发明蓝莓天然酵母bob1是从江苏省连云港市赣榆区黑林镇莱克西蓝莓上分离的天然酵母，与所认知的pichia bruneiensis相似度最高，同源性99.88％。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.本发明通过对酵母的形态、生理生化特征等方面进行研究，筛选出一种能产酒精的蓝莓天然酵母。由该酵母菌所得的蓝莓果酒产酒精，酸甜适中，香气馥郁，品质优良，酒精度为3.2％，ph为3.12，残糖量为13.06g/l，总酸为3.07g/l。发酵得到的蓝莓酒含有丰富的vc、花青素等营养物质，具有典型的蓝莓风味，酸甜可口，适宜饮用，为蓝莓产业提供一种加工方法延长蓝莓的供应周期，增加其经济效益。
附图说明
23.图1为蓝莓天然酵母bob1的菌落形态图，其中，a为bob1在ypd培养基菌落形态，b 为bob1在wl培养基菌落形态，c为bob1的细胞形态(1000x)；
24.图2为蓝莓天然酵母bob1的pcr扩增产物电泳图；
25.图3为蓝莓天然酵母bob1的26s rdna d1/d2结构域序列的系统发育树；
26.图4为蓝莓天然酵母bob1的生长曲线。
具体实施方式
27.以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
28.实施例1：
29.本发明筛选出的天然酵母的方法，包括以下步骤：
30.(1)取连云港本土新鲜的蓝莓，略微除去污渍泥土等杂质。将蓝莓在无菌条件下破碎处理，称取100g分别装入500ml无菌三角瓶中，用透气封口膜封住瓶口，放入28℃生化培养箱中培养2d。待观察到有气泡(co2)产生后，取出发酵液用无菌水稀释，得到稀释液。
31.(2)将步骤1所述稀释液均匀涂布于含有氯霉素的ttc下层培养基中，在28℃恒温培养箱中生长24h后，倒入ttc上层培养基，避光倒置培养2h。观察培养基颜色的变化，ttc 试剂与酒精会发生颜色变化生成红色的化合物。产酒精能力强的菌株，在培养基上显出的颜色越深。同时，这一过程可初步筛选出优良、发酵性能较好的菌株。
32.(3)挑取步骤2所得显深红色的菌株划线接种到ypd固体培养基上，在28℃的恒温培养箱中生长2d，观察菌落表观特性，选取出具有典型酵母特征的单菌落，进行3次平板化线，得到单个菌落接种到ypd液体培养基中培养。根据菌液的浓度对菌液做出稀释，将菌液划线接种到wl培养基上对酵母做进一步纯化(根据分离效果纯3次)，观察酵母的生长状态。同时挑取ypd固体平板上纯的单克隆菌株，置于显微镜下观察细胞形态。
33.(4)采用试剂盒提取法提取纯菌株的基因组dna。以引物its1和its4扩增其26s rdna 的d1/d2区域。取5μlpcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。pcr产物送武汉天一生物工程股份有限公司测序，测序结果在ncbi上进行blast同源序列搜索比对。真菌通用引物 its1:5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’和its4:5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’。
34.(5)对分离的酵母菌进行生长性能分析、理化性质分析，筛选出所述酿酒用的酵母菌株。
35.在步骤(1)中，蓝莓成熟饱满，每颗果实都经过认真筛选，清洗，但不能过度清洗。果实破碎过程要在超净工作台中进行，避免实验结果受到杂菌的污染。果实与无菌水的质量比是1:1，保证部分果实表面暴露在空气中。
36.步骤(2)中，稀释过程应稀释至10-4-10-6
，保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。培养温度为28℃，通风条件下进行。ttc下层培养基中添加适量氯霉素，以抑制杂菌生长。倒入ttc上层培养基后，避光倒置培养，以观察显色状况。
37.步骤(3)中，稀释过程应稀释至10-4-10-6
，保证酵母在固体培养基中生长不过分密集，避免生长过程中形成干扰，影响观察。培养温度为28℃，通风条件下进行。运用平板划线法对菌株进行纯化，次数达3次，保证尽量获得纯菌。菌株镜检前需将挑取的菌株经草酸铵结晶紫简单染色，再置于显微镜下观察细胞形态。结果如图1所示，菌株bob1在ypd培养基上呈白色、圆润、凸起、易挑起，在wl培养基上显黄色，在显微镜下观察菌株bob1呈椭圆形，大小为5-6μm，繁殖方式为出芽繁殖。
38.所述步骤(4)中，pcr反应体系总体积为20μl。每个pcr管中加入顺序及体积分别为：prime star max 10μl，引物its1和its4各0.5μl，基因组dna0.3μl，无菌水8.7μl。
39.所述步骤(4)中，pcr循环为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火20s，72℃延伸30s，共31次循环，最后10℃充分延伸5min。取5μl pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结
果如图2所示，得到约600bp的片段，清晰可见，无杂带，可用于26s rdna its测序。将测序结果用blast进行序列同源性比对，用相邻法的系统发育方法构建酵母菌bob1 的系统发育树，结果如图3所示，菌株bob1与两株毕赤酵母聚在一起，根据比对结果将该菌株鉴定为pichia bruneiensis，其相似度为99.88％。
40.步骤(5)中，生长性能分析通过全自动生长曲线分析仪测定，菌株以106cfu/ml接种于ypd液体培养基中，在28℃的条件下生长24h，以ypd液体培养基作为空白对照，在 600nm处测定菌悬液od值，平行重复3次，测定出菌株的生长曲线。结果如图4所示，菌株bob1生长性能良好。理化性质分析主要包括：酒精度、ph值、残糖量、和总酸。
41.实施例2：
42.蓝莓酒酿造：
43.(1)蓝莓采摘后，选择成熟、香气浓郁的蓝莓作为原料；
44.(2)在清洗机中用喷淋的方式进行清洗；
45.(3)将蓝莓去梗破碎，添加50mg/l果汁的pms杀菌，然后经压榨过滤得到蓝莓汁，添加糖调节蓝莓发酵后的酒精度；
46.(4)用酒石酸调节蓝莓汁ph值为3.2；
47.(5)蓝莓汁倒入发酵罐，并在此发酵罐中充入co2，然后接入bob1酵母，控温环境条件下发酵，得到蓝莓酒原液，并对整个发酵过程中的酒精度、残糖量、ph值、进行监控；
48.(6)蓝莓酒原液在4℃温度下进行12d陈酿；
49.(7)蓝莓酒理化性质分析包括：酒精度、残糖量、ph和总酸。
50.对比例1：
51.蓝莓酒酿造：
52.(1)蓝莓采摘后，选择成熟、香气浓郁的蓝莓作为原料；
53.(2)在清洗机中用喷淋的方式进行清洗；
54.(3)将蓝莓去梗破碎，添加50mg/l果汁的pms杀菌，然后经压榨过滤得到蓝莓汁，添加糖调节蓝莓发酵后的酒精度；
55.(4)用酒石酸调节蓝莓汁ph值为3.2；
56.(5)蓝莓汁倒入发酵罐，并在此发酵罐中充入co2，然后接入rb2酵母，控温环境条件下发酵，得到蓝莓酒原液，并对整个发酵过程中的酒精度、残糖量、ph值进行监控；
57.(6)蓝莓酒原液在4℃温度下进行12d陈酿；
58.(7)蓝莓酒理化性质分析包括：酒精度、残糖量、ph和总酸。
59.实施案例2采用bob1单独发酵蓝莓果酒，对比例1采用商业酵母rb2单独发酵蓝莓果酒。在其他发酵条件相同的情况下，果酒的理化指标见表1。
60.表1蓝莓果酒主要参数对比
[0061][0062]
由表1可知，本发明方法制备得到的蓝莓酒酒精度较低、总酸含量少，但具有典型的蓝莓风味，酸甜可口，适宜饮用。
[0063]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明保护的内容主要包括从蓝莓上筛选的酵母bob1。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。