一种重组蛋白酶K工业化纯化及冻干方法与流程

一种重组蛋白酶k工业化纯化及冻干方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组蛋白酶k工业化纯化及冻干的方法。


背景技术：

2.蛋白酶k是一种丝氨酸蛋白酶，于1974年首次在林伯氏白色念球菌(tritirachium album limber)的提取物纯化获得。主要切割位点为脂族或芳香族等厌水性氨基酸的羧基端的肽键。研究表明，该酶在ph 4～12、20℃～60℃的条件下均有活性，在sds、尿素、螯合剂(如edta)及巯基试剂(如胰蛋白酶抑制剂或糜蛋白酶抑制剂)中也具有切割蛋白质的能力。因而它的应用十分广泛，包括制备脉冲电泳的染色体dna、蛋白质印迹以及去除dna和rna制备中的核酸酶。
3.蛋白酶k的应用并不仅仅局限在医疗诊断及科研领域，在工业制革、造纸、饲料等领域中也可以替代传统的可能存在污染的化学方法处理原材料。因此，利用基因工程技术和蛋白质工程技术，获得活性高、成本低的蛋白酶k具有较大的社会价值和经济价值。
4.目前，工业化生产的基因重组蛋白酶k是以原核细胞(如大肠杆菌)和真核细胞(酵母)为宿主。利用大肠杆菌为宿主其优点是简便、经济。然而，该系统表达得到的蛋白酶k活性不高、产量过低，难以满足市场需求。利用酵母为宿主在重组蛋白酶k的c端添加的六聚组氨酸标签，发酵液需经过离心、金属螯合柱层析和弱阳离子交换柱层析分离、大孔脱色胶脱色处理等步骤，工艺步骤较复杂。鉴于蛋白酶k的应用价值，需要开发快速，经济适宜于工业规模化和连续化生产的分离纯化技术。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种重组蛋白酶k工业化纯化及冻干方法。
6.为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
7.一种从毕赤酵母中分离纯化重组蛋白酶k的层析方法，依次包括以下步骤：
8.1)将毕赤酵母表达的重组蛋白酶k发酵液上清进行澄清处理，然后加入等体积的稀释液稀释后混匀。采用超滤膜包对稀释后发酵上清进行浓缩，浓缩至终点后，加入等体积透析液进行多次透析，得到含有微量金属离子和色素的蛋白酶k透析液。其中超滤膜包可选择millipore 5kd、10kd或者sartorius 5kd、10kd。优选的膜包截留孔径为5kd。
9.2)将含有少量金属离子和色素的重组蛋白酶k的透析液，调节ph和电导后经阳离子交换层析，得到含有较高浓度的蛋白酶k洗脱液。其中阳离子交换层析的填料选自nanogel 30/50sp、unigel 30/80sp、sp bestarose ff、sp bestarose hp、bestarose diomond mmc、uniphere s、macroprep s、poros xs、sp-6ff、sp-6hp、sp sepharose
tm fast flow。在一种实施方式中，阳离子交换层析的填料优选为sp bestarose ff。阳离子交换层析可选择ph或盐度梯度洗脱，优选氯化钠梯度洗脱。
10.3)将得到的蛋白酶k洗脱液，在室温下进行结晶沉淀，在进行结晶沉淀前，优选将所述蛋白酶k洗脱液调节为蛋白浓度在40～50mg/ml范围内。沉淀结束后，采用正压过滤装
置获得蛋白酶k沉淀滤饼。其中过滤纸板为沈阳长城过滤纸板，滤板孔径为0.2～5μm，优选为2.5～5μm。
11.4)将得到的蛋白酶k沉淀滤饼加入复溶缓冲液复溶，一种实施方式中，复溶缓冲液为10～50mm tris、0～5mm cacl2，ph 7.5～9.0或10～50mm naac、0～5mm cacl2，ph 4.5～5.5。采用优选的冻干配方混匀后，按照优选的冻干工艺进行冻干。将得到的冻干粉进行分包装，最终得到蛋白酶k冻干粉成品。
12.其中所述重组蛋白酶k发酵液上清的蛋白酶k活性为30～40u/mgp。
13.本发明还公开了一种具体实施方式，该实施方式经工艺放大，所得蛋白酶k冻干粉的蛋白纯化收率不小于70％，活性为30～40u/mgp。具体实施步骤为：
14.1)毕赤酵母表达的重组蛋白酶k发酵液上清进行澄清处理，测定澄清上清的ph和电导，然后加入等体积的稀释液稀释后混匀；所述稀释液为：10～50mm tris、0～5mm cacl2，ph 7.5～9.0；
15.将超滤膜包安装在超滤系统上，控制进口压力和回流压力，调节跨膜压并测定水通量，安装好膜包后进行超滤浓缩；所述超滤膜包截留孔径为5～10kd，所述跨膜压为1～1.25bar或者14.5～18psi或者0.1～0.125mpa。
16.将浓缩至终点的浓缩液，加入等体积的透析液进行多次透析，直至透析终点；所述透析液为：10～50mm tris、0～5mm cacl2，ph 7.5～9.0；所述透析终点的透出液颜色为无色，电导为0.5～2ms/cm，ph为7.5～9.0。
17.2)采用阳离子交换层析介质为博格隆sp bestarose ff阳离子交换填料，层析步骤为：
18.采用5～15倍柱体积的组分为10～50mm tris、0～5mm cacl2，ph 7.5～9.0的平衡缓冲液，以50～200cm/小时的流速平衡层析柱；
19.以步骤1)的蛋白酶k透析液作为上样样品，以50～200cm/小时的流速上样；其中上样样品电导为0.5～2ms/cm，ph为7.5～9.0，上样载量为56～90mg蛋白/ml填料；
20.10～50mm tris、0～5mm cacl2，ph 7.5～9.0的平衡缓冲液，以50～200cm/小时的流速对层析柱进行再平衡；
21.采用组分为10～50mm tris、0～5mm cacl2，0～100mm nacl，ph 7.5～9.0的洗脱缓冲液，以50-200cm/小时的流速对层析柱进行洗脱，最终获得蛋白酶k洗脱液；
22.所述阳离子层析逐级放大层析的蛋白回收均大于70％。
23.3)裁剪大小合适的过滤纸板，装入正压过滤器中，采用组分为10～50mm tris、0～5mm cacl2，0～100mm nacl，ph 7.5～9.0的洗脱缓冲液润洗正压过滤装置和滤纸板；
24.将步骤2)的蛋白酶k洗脱液调节至ph在7.5～9.0，cond在0～10ms/cm，蛋白浓度在40～50mg/ml范围内，倒入不锈钢桶中，控制环境温度为20～25℃，静置4h以上，直到蛋白酶k结晶沉淀完全；
25.将沉淀完全的蛋白酶k分次倒入正压过滤罐中，将压缩空气接入压滤罐，控制压滤罐压力表为0～0.15mpa开始压滤，最终获得蛋白酶k滤饼；
26.所述蛋白酶k滤饼中蛋白回收大于90％。
27.4)将由步骤3)获得的含重组蛋白酶k的滤饼加入10～50mm tris、0～5mm cacl2，ph 7.5～9.0或10～50mm naac、0～5mm cacl2，ph 4.5～5.5复溶，按照w/v＝1:20比例加入
甘露醇混合均匀得到混合液；
28.将所述混合液倒入冻干盘中，设置预冻温度为-40～-45℃，降温时间为30min，维持3～6h；
29.设置一次干燥第一段温度为-35～-40℃，升温时间为30min，维持1～2h，真空度设置为10～20pa；第二段温度为0～10℃，升温时间4～6h，维持40～45h。
30.本发明采用超滤-阳离子交换-压滤等工业化工艺步骤，使批次生产时间缩短至1-2天，纯化后制得的冻干制剂中蛋白酶k总收率高达70％以上，从而实现了规模化和连续化生产。
附图说明
31.图1：蛋白酶k发酵液超滤前后溶液颜色变化。
32.图2：ge deae阴离子交换层析图谱。
33.图3：sp bestarose ff阳离子交换层析1ml层析柱线性洗脱层析图谱。
34.图4：sp bestarose ff阳离子交换层析84ml层析柱梯度洗脱层析图谱。
35.图5：蛋白酶k结晶沉淀与分层对比。
36.图6：蛋白酶k冻干后形态变化。
37.图7：蛋白酶k在不同ph的乙酸钠-乙酸缓冲液中的溶解情况。
38.图8：l-酪氨酸标准曲线。
具体实施方式
39.下文将通过实施例和附图以详细说明本发明的技术方案，从而更好地阐述本发明的特点和优势。所提供的实施例应被解释为对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的技术方案。
40.以下实施例中使用的试剂和仪器，除特别说明以外，均为普通市售。
41.实施例1：蛋白酶k纯化及冻干工艺优化
42.1.1实验试剂及仪器
43.蛋白酶k发酵液，购于济南百斯杰生物工程有限公司；
44.超滤系统，购于默克密理博，型号为cuf 100；
45.超滤膜包，购于赛多利斯；
46.层析填料，sp bestarose ff，购于上海博格隆；deae阴离子交换填料，购于通用电气公司；
47.其他化学试剂均为市售产品。
48.1.切向流超滤
49.1.1超滤工艺摸索
50.酵母发酵液为深红棕色，含有大量的色素，根据蛋白酶k分子量大小，本发明采用合适的超滤膜包对酵母发酵液进行除色素处理，超滤后溶液颜色相对于发酵液和超滤前变浅，表明色素被大量去除。超滤前后的发酵液颜色变化见附图1。
51.本发明选择不同截留孔径及膜面积的超滤膜包进行对比实验，结果如表1所示，不同截留孔径及膜面积的超滤膜包，蛋白回收均大于90％，两种膜包均可满足放大生产的需
求。另外，对比实验膜面积放大至33倍后，超滤后蛋白回收比较稳定，表明工艺可稳定放大。
52.表1不同截留孔径及膜面积的超滤膜包超滤结果
[0053][0054]
1.2超滤工艺优化
[0055]
为适应更大规模的发酵液处理量，需对超滤工艺参数进行优化。取500ml发酵液，向其中边搅拌边加入等体积超纯水进行稀释后备用。
[0056]
采用sartorius 0.1m
2 5kd超滤膜包进行超滤浓缩，该膜包产品的正常水通量为42l/h/m2，pin(max)＝4bar。经过优化后，最终控制pin(进口压力)＝2bar，pret(回流压力)＝0.5bar，pout(透过压力)＝0bar。计算膜包的tmp(跨膜压)＝(pin pret)/2-pout＝1.25bar＝18psi。
[0057]
按照上述跨膜压进行超滤浓缩和透析步骤的工艺参数优化。结果如表2和表3所示。根据优化后浓缩和超滤步骤的平均水通量计算批次处理量及实际膜包使用面积。最终结果为：250l/批次投料，8h超滤完所需膜面积＝{(250l/17lmh) (250l*7/28lmh}/8h＝9.65m2，所需膜包数量＝9.65m2/0.66m2≈15块。
[0058]
表2浓缩步骤工艺参数控制表
[0059][0060]
浓缩步骤平均通量＝0.5l/(18/60)h/0.1m2≈17lmh
[0061]
表3透析步骤工艺参数控制表
[0062][0063]
透析步骤平均通量＝3.5l/(74/60)h/0.1m2≈28lmh
[0064]
2.离子交换层析
[0065]
根据蛋白酶k等电点，可采用阴离子穿透模式或阳离子结合模式两种纯化方式对蛋白酶k的分离纯化。
[0066]
2.1阴离子交换层析
[0067]
采用ge deae层析柱进行阴离子交换层析条件摸索，取超滤处理的蛋白酶k发酵液，调节ph为7.6，电导为0.9ms/cm后上样。以10mm tris-hcl，1mm cacl2，ph 7.5为平衡液；10mm tris-hcl，1m nacl，1mm cacl2，ph 7.5为洗脱液进行层析。结果显示蛋白酶k仅穿透69.3％，因此放弃阴离子穿透模式纯化蛋白酶k。层析图谱见附图2。
[0068]
2.2阳离子交换层析
[0069]
2.2.1阳离子层析条件摸索
[0070]
采用博格隆sp bestarose ff层析柱进行阳离子交换层析条件摸索，取超滤处理的蛋白酶k发酵液，调节ph为7.5，电导为0.8ms/cm后上样。以10mm tris-hcl，1mm cacl2，ph 7.5为平衡液；10mm tris-hcl，0～1m nacl，1mm cacl2，ph 7.5为洗脱液进行层析。结果显示蛋白酶k主要在0～100mm nacl梯度下被洗脱，蛋白回收为92.7％，活性大于30u/mg。层析图谱见附图3。
[0071]
2.2.2阳离子层析逐级放大
[0072]
在阳离子层析条件摸索的基础上，优化并确认sp bestarose ff各项层析参数。其中上样电导为0.5～2ms/cm，上样载量为56～90mg蛋白/ml填料，洗脱条件为10mm tris-hcl，0～100mm nacl，1～5mm cacl2，ph 7.5～9.0。为验证层析工艺稳定性，在优化的各项层析参数下，将填料体积从摸索阶段的1ml，依次放大至8.6ml、28ml、84ml。结果表明逐级放大层析的蛋白回收均大于70％。逐级放大层析结果见表4。放大至84ml的sp bestarose ff层析图谱见附图4。
[0073]
表4 sp bestarose ff逐级放大层析结果
[0074][0075]
3.蛋白酶k固液分离
[0076]
蛋白酶k在低盐环境，蛋白浓度较高的情况下容易结晶析出。本发明利用蛋白酶k这一特性，调节sp bestarose ff层析洗脱液的ph在7.5～9.0，cond在0～10ms/cm，蛋白浓度在40～50mg/ml范围内，搅拌混匀后，20～25℃静置4～6h。
[0077]
在上述条件下，蛋白酶k结晶析出分层。结晶沉淀和分层结果见附图5。
[0078]
利用我司固液分离技术平台，选择合适大小的过滤纸板和正压过滤装置对析出的沉淀进行收集。其中过滤纸板为沈阳长城过滤纸板，滤板孔径为0.2～5μm，采用该过滤纸板进行过滤，蛋白酶k沉淀被截留在过滤纸板上形成滤饼，而过滤液澄清透明。取30ml沉淀后混悬液进行压滤，共进行三次实验。取压滤液和滤饼复溶液进行蛋白含量测定。结果表明结晶沉淀后蛋白回收均大于90％，采用此方式收集沉淀，可起到去除杂质和浓缩的目的。测定结果见表5。
[0079]
表5蛋白酶k结晶沉淀蛋白回收结果
[0080][0081]
4.蛋白酶k冻干工艺
[0082]
获得的含重组蛋白酶k的滤饼加入10～50mm tris、0～5mm cacl2，ph 7.5～9.0或10～50mm naac、0～5mm cacl2，ph 4.5～5.5复溶。按照w/v＝(1:20)比例加入甘露醇混合均匀。将混合液倒入冻干盘中，设置预冻温度为-40～-45℃，降温时间为30min，维持3～6h。设置一次干燥第一段温度为-35～-40℃，升温时间为30min，维持1～2h，真空度设置为10～20pa。第二段温度为0～10℃，升温时间4～6h，维持40～45h。
[0083]
优选的冻干工艺，其冻干参数控制为：-45℃，降温时间为30min，维持6h；设置一次干燥第一段温度为-40℃，升温时间为30min，维持1h，真空度设置为20pa；第二段温度为0℃，升温时间6h，维持45h。冻干后的蛋白酶k见附图6。
[0084]
取上述冻干工艺的冻干粉进行活性测定(酪蛋白为底物)，结果显示不同取样点的冻干粉活性测定值均大于30u/mg，且与merck蛋白酶k活性相当。活性测定结果见表6。
[0085]
表6不同取样点蛋白酶k冻干粉活性测定结果
[0086]
[0087]
5.蛋白酶k溶解性研究
[0088]
5.1蛋白酶k冻干粉溶解缓冲液摸索
[0089]
为探索蛋白酶k冻干粉最佳溶解条件，本发明分别采用20mm tris-hcl，ph9.68～7.15；20mm pb，ph 8.02～5.60；20mm naac，ph 7.60～5.20对蛋白酶k冻干粉进行溶解，观察溶解状态。结果显示蛋白酶k在20mm naac，ph 5.20～5.60范围内溶解良好。
[0090]
为验证该结果，准确称取蛋白酶k冻干粉7份，每份100mg于10ml ep管中，分别配制20mm naac，ph 5.58、5.48、5.40、5.28、5.21缓冲液各100ml，然后向其中5管中分别加入5ml上述不同ph的缓冲液，震荡混匀后观察溶解状态。另取两管分别加入5ml 50％甘油和5ml超纯水作为对照。活性测定结果见表7，溶解结果见附图7。
[0091]
表7蛋白酶k在不同ph的乙酸钠-乙酸缓冲液中的溶解活性测定结果
[0092][0093][0094]
实施例2：蛋白酶k工艺放大
[0095]
2.1生产原材料及仪器设备
[0096]
蛋白酶k发酵液，购于济南百斯杰生物工程有限公司；
[0097]
三羟甲基氨基甲烷，购于南京化学试剂股份有限公司，分析纯；
[0098]
无水氯化钙，购于河北华晨药业有限公司，药用级；
[0099]
氯化钠，购于河北华晨药业有限公司，药用级；
[0100]
氢氧化钠，购于成都华邑药用辅料制造有限责任公司，药用级；
[0101]
乙醇，购于南京化学试剂股份有限公司，药用级；
[0102]
甘露醇，购于石家庄华旭药业，药用级；
[0103]
硫柳汞钠，购于国药集团化学试剂有限公司，分析纯；
[0104]
超滤系统，购于默克密理博，型号为cuf 100；
[0105]
超滤膜包，购于赛多利斯，型号为hydro，5kd；
[0106]
工业级层析柱，购于美国通用电气公司，型号chromflow 800；
[0107]
层析填料，购于上海博格隆，型号sp bestarose ff；
[0108]
冻干机，购于北京速原中天科技股份有限公司，型号：yldz-0.5
[0109]
2.2原液生产
[0110]
步骤(1)：原料预处理。
[0111]
将10桶，25l/桶发酵液，用10寸，0.22μm除菌过滤器进行除菌过滤，分装于两桶，每桶约125l；
[0112]
步骤(2)：初步浓缩。
[0113]
将步骤(1)的每桶发酵液先用5kd膜包，透析液1(配方为：0.111g/l cacl2水溶液)等体积透析1-2次，再将每桶发酵液浓缩至75l后两桶合并为一桶150l，继续用透析1等体积透析3-4次，再用透析液2(配方为：1.21g/l tris，0.111g/l cacl2，ph 7.5
±
0.1，cond 0.8-1ms/cm)，等体积透析3-5次后；
[0114]
步骤(3)：上样液调配。
[0115]
用tris调节上述步骤(2)浓缩后料液的ph至7.5
±
0.1，调节电导至0.8-1.2ms/cm，再用透析液2(配方为：1.21g/l tris，0.111g/l cacl2，ph 7.5
±
0.1，cond 0.8-1ms/cm)将料液蛋白含量稀释至10-15mg/ml，即形成层析上样液；
[0116]
步骤(4)层析纯化。
[0117]
按如下步骤1)至步骤7)进行层析纯化，并收集层析洗脱液为目标组分。
[0118]
1)装柱：采用ge chromflow 800层析柱，sp bestarose ff填料，装柱高度16-18cm，装填层析填料体积为80-86l，检测柱效大于3000。
[0119]
2)填料水洗：用纯化水清洗层析柱350-420l，流速约为145cm/h，清洗时长大于30min。
[0120]
3)平衡：用平衡缓冲液(1.21g/l tris，0.111g/l cacl2，ph 7.5
±
0.1，cond 0.8-1ms/cm)平衡层析柱600-700l，流速约为145cm/h，平衡至层析柱出口透过液ph和电导率基线平稳。
[0121]
4)上样：用步骤(3)所述层析上样液进行上样，上样载量小于67.5mg总蛋白/ml填料。上样流速约为145cm/h，上样层析柱进口压力小于2.0bar。
[0122]
5)再平衡：用上述平衡缓冲液对层析柱再次平衡550-650l，流速约为145cm/h。再平衡至层析出口透过液紫外吸收值小于20mv时止。
[0123]
6)洗脱与目标组分的收集：用洗脱缓冲液(1.21g/l tris，0.555g/l cacl2，5.844g/l nacl，ph 7.5
±
0.1，cond 12
±
1ms/cm)对层析柱进行洗脱，洗脱流速约为145cm/h，当层析出峰并且紫外吸收值大于30mv时开始收集，边收集边搅拌均匀，当紫外吸收值小于30mv时停止收集，即为目标组分。
[0124]
7)再生和保存：洗脱结束后，分别用2m nacl、0.5m naoh对层析柱进行再生，再生流速145cm/h，再生体积均为300-420l。再生结束后，用20％乙醇对层析柱进行保存。
[0125]
步骤(5)：沉淀与压滤分离。
[0126]
将步骤(4)层析纯化收集的目标组分，静置沉淀5h以上，开始用75μm过滤纸板进行正压过滤分离，收集沉淀(滤饼)，同时收集澄清上清液。压滤过程中的进口压力不超过4bar。
[0127]
步骤(6)：原液制备。
[0128]
先用20l步骤(5)澄清上清液加入到滤饼中，进行溶解，再添加10l原液调配母液
(2.5kg甘露醇和5g硫柳汞，用澄清上清液进行溶解)加入到滤饼中，最后用澄清上清液定容至50l，即形成蛋白酶k原液。
[0129]
2.3冻干
[0130]
步骤(1)预冻：将料液摇匀后，把溶液倒入不锈钢冻干盘中，在-45℃下预冻4小时；
[0131]
步骤(2)后箱降温：待预冻结束后，后箱开始降温，产品温度保持-45℃，后箱降温30min；
[0132]
步骤(3)抽真空：待后箱降温结束后，箱体抽真空，真空控制在25pa以下；
[0133]
步骤(4)升温：板层开始升温，6小时升温至0℃，真空度控制20-30pa；
[0134]
步骤(5)一次升华：维持板层温度0℃，真空度控制15-30pa，产品温度达到-1.5℃以上后，进入下一区段；
[0135]
步骤(6)升温：30min将板层温度升温至10℃，真空度控制10-15pa；
[0136]
步骤(7)二次升华：维持板层温度10℃，真空度控制5-10pa；
[0137]
步骤(8)终点判断：待真空度小于5pa后，关闭前后箱阀门，前箱真空度3min小于5pa，结束冻干。
[0138]
2.4成品分包装：
[0139]
步骤(1)冻干粉粉碎：待冻干结束后，将蛋白酶k进行粉碎并收集到双层无菌袋中，即获得冻干细粉。
[0140]
步骤(2)分包装：在洁净室隔离器内对蛋白酶k冻干细粉进行称量和分包装后，即获得重组蛋白酶k成品。
[0141]
根据上述实施例进行工艺放大生产，工艺稳定可靠，制备产品的多批产量结果如表8：
[0142]
表8不同制备批次蛋白酶k产量和纯化收率
[0143]
批次收率(％)制备批170.5％制备批273.3％制备批370.5％制备批470.0％制备批570.5％制备批670.5％
[0144]
实施例3：蛋白酶k活性测定
[0145]
3.1实验原理：该方法是以牛血红蛋白作为蛋白酶k活性检测的底物。牛血红蛋白溶液在蛋白酶k的作用下水解成可溶于三氯乙酸的肽类和氨基酸，肽类和氨基酸在碱性条件下将酚试剂还原，产生蓝色化合物，在波长750nm处化合物颜色深浅与酶水解产物浓度呈正比。
[0146]
活性单位定义：在37℃ph7.5时，1个单位的蛋白酶k每分钟水解经过尿素变性的牛血红蛋白的产物与福林酚试剂作用产生的颜色，等同于1.0μmol酪氨酸与福林酚试剂作用产生的颜色。
[0147]
3.2主要仪器设备
[0148]
ph计(sartorius pb-10)
[0149]
酶标仪(molecular device versamax)
[0150]
3.3试剂和溶液的配制
[0151]
磷酸二氢钾、牛血红蛋白、氢氧化钠、尿素、氯化钙、三氯乙酸、酚试剂(福林酚)、l-酪氨酸、盐酸
[0152]
3.3.1试剂的配制
[0153]
试剂配制使用高纯水(≥18mωxcm resistivity at 25℃)
[0154]
(1)1m磷酸二氢钾溶液：称取13.61g磷酸二氢钾用50ml水溶解，再用1m koh在37℃下调节ph至7.5，定容至100ml。
[0155]
(2)底物(100mm磷酸二氢钾-2.0％(w/v)牛血红蛋白-6m尿素)：称取2.0g牛血红蛋白用40ml水在37℃溶解搅拌30min，加入8.0ml的1m naoh在37℃搅拌20min，再加入36.0g尿素37℃下搅拌60min，加入10ml 1m磷酸二氢钾，并用5m hcl在37℃下调节ph至7.5，定容至100ml。
[0156]
(3)20mm cacl2溶液：称取0.295g氯化钙用水溶解并定容至100ml。
[0157]
(4)305mm tca溶液(三氯乙酸溶液)：称取24.9g三氯乙酸用水溶解并定容至500ml。
[0158]
(5)naoh溶液：
[0159]
a.1m naoh溶液：称取20g氢氧化钠用水溶解并定容至500ml。
[0160]
b.0.5m naoh溶液：用水等体积稀释1m naoh溶液即得。
[0161]
(6)盐酸溶液：
[0162]
a.1m盐酸：取8.33ml盐酸用水稀释并定容至100ml。
[0163]
b.0.5m盐酸：取1m盐酸用水等体积稀释。
[0164]
3.3.2标准曲线配制
[0165]
称取20mg l-酪氨酸，用80ml水加热70-80℃使其完全溶解，冷却至室温用水定容至100ml。可在2-8℃冰箱中保存6个月。
[0166]
按照表9配制步骤进行l-酪氨酸标准曲线配制，最终反应体系中各标准品含量为0.0088、0.0264、0.044、0.0616、0.0792、0.0968、0.1144、0μmol。
[0167]
表9l-酪氨酸标准曲线配制表
[0168][0169]
3.3.3蛋白酶k样品制备
[0170]
a固体样品：称取固体粉末0.5g用高纯水溶解并定容至25ml，再用cacl2溶液稀释
至0.075-0.175u/ml活性范围内进行测定。
[0171]
b液体样品：用高纯水将蛋白浓度稀释至20mg/ml，再用cacl2溶液稀释至0.075-0.175u/ml活性范围内进行测定。
[0172]
3.4检测步骤
[0173]
3.4.1蛋白酶k及merck蛋白酶k的蛋白浓度测定(bca法)
[0174]
准确称取200mg蛋白酶k冻干粉，加入到10ml高纯水中，震荡使其充分溶解。然后用高纯水稀释40倍，merck蛋白酶k稀释至标准曲线范围内。
[0175]
取25μl稀释后的样品和bsa标准品加入到酶标板中，继续加入200μl bca工作液，37℃孵育30min，设置酶标仪的波长为562nm进行读数。浓度测定过程参照“reference bca plus
tm protein assay reagent protol for measurement，prod#1856210,thermo”试剂盒中的protocol进行测定。
[0176]
同法测定merck蛋白酶k浓度。
[0177]
3.4.2蛋白酶k活性测定
[0178]
3.4.2.1按照下表，每管中加入0.50ml底物。
[0179][0180]
3.4.2.2 37℃平衡10min后，再加入0.10ml已稀释的酶液，空白对照管加0.10ml的20mm cacl2溶液。
[0181][0182]
3.4.2.3涡旋震荡混匀，37℃孵育10min，再加入1.00ml 305mm tca溶液。
[0183][0184]
3.4.2.4涡旋震荡混匀，室温静置20min。
[0185]
3.4.2.5 13000rpm离心1min，取出全部上清，震荡混匀。
[0186]
3.4.2.6离心后每管取上清0.20ml加入0.40ml 0.5m氢氧化钠溶液，盖盖后涡旋混匀。
[0187][0188]
[0189]
3.4.2.7涡旋混匀每一个浓度的l-酪氨酸标准品与标准品空白。
[0190]
3.4.2.8取3.3.2配制的l-酪氨酸标准品0.6ml于2ml ep管中，然后取0.12ml福林酚试剂加入其中震荡混匀，3.4.2.6处理的待测样品同步加入0.12ml福林酚试剂震荡混匀，室温反应30min。
[0191]
3.4.2.9取反应后的标准品和待测样品各300μl加入到酶标板的各孔中，设置酶标仪的波长为750nm进行读数。
[0192]
注意：如果溶液浑浊，用0.45μm过滤头过滤，再进行读数。
[0193]
3.4.3数据处理
[0194]
3.4.3.1标准曲线
[0195]
δa
750
标品＝a
750
标准品-a
750
空白
[0196]
以酪氨酸含量(μmol)为x轴，平均od值为y轴进行线性拟合，公式如下：y＝a bx，r2≥0.99，拟合的标准曲线见附图8。
[0197]
3.4.4结果分析
[0198]
3.4.4.1多批检测结果如下表10所示：
[0199]
表10自制批和市售对照蛋白酶k活性检测
[0200][0201]
3.4.4.2样品计算公式：
[0202]
样品δa
750
＝a
750
样品-a
750
空白
[0203]
酪氨酸含量(样品)＝(样品δa
750-a)/b
[0204]
样品酶活＝酪氨酸含量(样品)
×
1.6
×
稀释倍数/(0.1
×
10
×
0.2)
[0205]
1.6＝完全停止反应的体积(ml)
[0206]
0.2＝与f&c试剂停止反应的体积(ml)
[0207]
df＝稀释因子
[0208]
0.10＝加入酶溶液(ml)
[0209]
10＝实验孵育时间(分钟)
[0210]
m＝待测酶的重量(mg)
[0211]
v＝酶的溶解体积
[0212]
总活＝样品酶活/(m/v)
[0213]
比活＝样品酶活/bca法测得蛋白含量
[0214]
因此，采用上述方法检测，所测两批自制蛋白酶k的比活分别为40u/mgp和43u/mgp，与市售的merck的蛋白酶k产品的比活(41u/mgp)相当，本检测方法可靠且稳定。