靶向TACI的抗体和嵌合抗原受体的制作方法

靶向taci的抗体和嵌合抗原受体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2019年6月4日提交的标题为“靶向taci的抗体和嵌合抗原受体(antibodies and chimeric antigen receptors that target taci)”的美国临时申请号62/856998、2019年9月30日提交的标题为“靶向taci的抗体和嵌合抗原受体(antibodies and chimeric antigen receptors that target taci)”的美国临时申请号62/907930、以及2020年4月20日提交的标题为“靶向taci的抗体和嵌合抗原受体(antibodies and chimeric antigen receptors that target taci)”的美国临时申请号63/012735的权益，将这些申请中的每一个的全部内容通过引用并入本文。


背景技术：

3.嵌合抗原受体(car)引导细胞毒性t细胞对表达所选择的靶抗原(最常见的是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原)的靶细胞的应答。car是t细胞受体的改型物，其中抗原结合结构域被特异性结合衍生性靶抗原的抗体的抗原结合结构域替代。靶细胞的表面上靶抗原被例如t细胞(“car-t细胞”或“car-t”)上表达的car接合促进对靶细胞的杀伤。


技术实现要素：

4.本文描述了靶向跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(taci)的抗体、抗体-药物缀合物、双特异性t细胞接合物(bite)和嵌合抗原受体(car)，其可用于治疗患有疾病或障碍例如癌症、浆细胞疾病或障碍或自身免疫疾病或障碍的受试者。
5.本公开文本的一些方面提供了与跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(taci)特异性结合的抗体，其中所述抗体包含：
6.(i)含有seq id no:1的氨基酸序列的重链可变区(vh)的重链互补决定区1(cdr-h1)、重链互补决定区2(cdr-h2)和重链互补决定区3(cdr-h3)；和/或
7.(ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的轻链可变区(vl)的轻链互补决定区1(cdr-l1)、轻链互补决定区2(cdr-l2)和轻链互补决定区3(cdr-l3)。
8.在一些实施方案中，所述抗体包含：
9.(i)seq id no:26所示的cdr-h1、seq id no:27所示的cdr-h2和seq id no:28所示的cdr-h3；seq id no:29所示的cdr-l1、seq id no:30所示的cdr-l2和seq id no:31所示的cdr-l3；
10.(ii)seq id no:32所示的cdr-h1、seq id no:33所示的cdr-h2和seq id no:34所示的cdr-h3；seq id no:35所示的cdr-l1、seq id no:36所示的cdr-l2和seq id no:31所示的cdr-l3；或者
11.(iii)seq id no:37所示的cdr-h1、seq id no:38所示的cdr-h2和seq id no:39所示的cdr-h3；seq id no:40所示的cdr-l1、seq id no:30所示的cdr-l2和seq id no:41所示的cdr-l3。
12.在一些实施方案中，所述抗体以约2nm或更低的kd与taci结合，任选地其中所述抗
体以在约500pm与约1nm之间的kd与taci结合，进一步任选地其中所述抗体以在约700pm与约900pm之间的kd与taci结合。在一些实施方案中，所述抗体以约861pm的kd与taci结合。
13.在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变结构域(vh)，其含有与seq id no:1的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(vl)，其含有与seq id no:2的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述vh包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，并且所述vl包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seq id no:1的氨基酸序列的vh和含有氨基酸序列seq id no:2的氨基酸序列的vl。
14.在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方案中，所述抗体是特异性结合taci的抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体片段选自fab、fab'、fab'-sh、fv、scfv和(fab')2片段。在一些实施方案中，所述抗体是igg抗体，任选igg1抗体。在一些实施方案中，所述抗体是scfv。在一些实施方案中，所述scfv包含与seq id no:4或seq id no:5至少85％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scfv包含seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scfv与fc融合。
15.本文描述的本发明的另一方面涉及包含本文描述的任一种抗体的组合物。
16.本文描述的本发明的另一方面涉及编码本文描述的任一种抗体的多核苷酸。
17.本文描述的本发明的另一方面涉及包含本文描述的任一种多核苷酸的载体。
18.本文描述的本发明的另一方面涉及包含本文描述的任一种载体的宿主细胞。
19.在一个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
20.在另一个实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在一个实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌(e.coli)。
21.本文描述的本发明的另一方面涉及产生特异性结合taci的抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养本文描述的任一种宿主细胞。在一个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞或所述培养基回收所述抗体。
22.本文描述的本发明的另一方面涉及包含本文描述的任一种抗体的抗体-药物缀合物。
23.本文描述的本发明的另一方面涉及包含胞外靶标结合结构域的嵌合抗原受体(car)多肽，其中所述胞外靶标结合结构域包含taci结合结构域。
24.在一个实施方案中，所述car多肽包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
25.在一实施方案中，所述car多肽还包含一个或多个共刺激结构域。
26.在一个实施方案中，所述taci结合结构域不包含april、baff、camlg或其一部分。
27.在一个实施方案中，所述taci结合结构域以约2nm或更低的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述taci结合结构域以在约500pm与约1nm之间的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述taci结合结构域以在约700pm与约900pm之间的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述taci结合结构域以约861pm的kd与taci结合。
28.在一个实施方案中，所述taci结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
29.本文所述的本发明的另一方面涉及包含胞外靶标结合结构域的car多肽，所述胞外靶标结合结构域包含本文描述的任一种抗体或其抗原结合片段。
30.在任何方面的一个实施方案中，所述taci结合结构域包含抗taci单链可变片段(scfv)。
31.在任何方面的一个实施方案中，所述抗taci scfv包含含有与seq id no:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(vh)。
32.在任何方面的一个实施方案中，所述vh包含seq id no:1的氨基酸序列。
33.在任何方面的一个实施方案中，所述抗taci scfv包含含有与seq id no:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(vl)。
34.在任何方面的一个实施方案中，所述vl包含seq id no:2的氨基酸序列。
35.在任何方面的一个实施方案中，所述抗taci scfv包含含有seq id no:1的氨基酸序列的vh和含有seq id no:2的氨基酸序列的vl。
36.在任何方面的一个实施方案中，所述vh位于所述vl的n末端。
37.在任何方面的另一个实施方案中，所述vl位于所述vh的n末端。
38.在任何方面的一个实施方案中，所述vh和所述vl经由接头序列连接。
39.在任何方面的一个实施方案中，所述接头序列包含seq id no:3、14、15、16或17的氨基酸序列。
40.在任何方面的一个实施方案中，所述接头序列包含seq id no:3的氨基酸序列。
41.在任何方面的一个实施方案中，所述taci结合结构域包含与seq id no:4或5的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
42.在任何方面的一个实施方案中，所述taci结合结构域包含seq id no:4或5的氨基酸序列。
43.在任何方面的一个实施方案中，所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。
44.在任何方面的一个实施方案中，所述铰链/跨膜结构域包括免疫球蛋白样蛋白、cd28、cd8或4-1bb的铰链/跨膜结构域。
45.在任何方面的一个实施方案中，所述铰链/跨膜结构域是cd8的铰链/跨膜结构域，任选地其中cd8的铰链/跨膜结构域包含seq id no:7的氨基酸序列。
46.在任何方面的一个实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含cd3ζ、cd3ε或cd3θ的细胞内信号传导结构域。
47.在任何方面的一个实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含cd3ζ的细胞内信号传导结构域，任选地其中cd3ζ的细胞内信号传导结构域包含seq id no:9的氨基酸序列。
48.在任何方面的一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1bb、cd28、cd27、icos或ox40的共刺激结构域。
49.在任何方面的一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1bb的共刺激结构域，任选地其中4-1bb的共刺激结构域包含seq id no:8的氨基酸序列。
50.在任何方面的一个实施方案中，所述car多肽包含与seq id no:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
51.在任何方面的一个实施方案中，所述胞外靶标结合结构域还包含与非taci的第二靶标结合的靶标结合结构域。
52.在任何方面的一个实施方案中，所述第二靶标是b细胞成熟抗原(bcma)。
53.在任何方面的一个实施方案中，所述靶标结合结构域包含所述第二靶标的配体。
54.在任何方面的一个实施方案中，所述靶标结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
55.在任何方面的一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含scfv。
56.在任何方面的一个实施方案中，所述scfv是抗bcma scfv。
57.在任何方面的一个实施方案中，所述抗bcma scfv位于所述抗taci scfv的n末端。
58.在任何方面的一个实施方案中，所述抗taci scfv位于所述抗bcma scfv的n末端。
59.在任何方面的一个实施方案中，所述car多肽包含与seq id no:18-25中任一个的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
60.本文描述的本发明的另一方面涉及包含seq id no:10的氨基酸序列的car多肽。
61.本文描述的本发明的另一方面涉及包含seq id no:11的氨基酸序列的car多肽。
62.本文描述的本发明的另一方面涉及包含seq id no:12的氨基酸序列的car多肽。
63.本文描述的本发明的另一方面涉及包含seq id no:13的氨基酸序列的car多肽。
64.本文描述的本发明的另一方面涉及包含seq id no:18-25中任一个的氨基酸序列的car多肽。
65.本文描述的本发明的另一方面涉及编码本文描述的任一种car多肽的多核苷酸。
66.在一个实施方案中，所述多核苷酸还包含自杀基因。
67.在一个实施方案中，所述多核苷酸还包含编码信号序列的序列。
68.本文描述的本发明的另一方面涉及包含本文描述的任一种car多肽和/或本文描述的任一种多核苷酸的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是诱导多能干细胞(ipsc)。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞。在一个实施方案中，所述免疫细胞是t细胞或自然杀伤(nk)细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。
69.本文描述的本发明的另一方面涉及与taci和cd3结合的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含taci结合结构域和cd3结合结构域。
70.在任何方面的一个实施方案中，所述taci结合结构域以约2nm或更低的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述taci结合结构域以在约500pm与约1nm之间的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述taci结合结构域以在约700pm与约900pm之间的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述taci结合结构域以约861pm的kd与taci结合。
71.在任何方面的一个实施方案中，所述taci结合结构域包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的vh和/或含有与seq id no:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的vl。
72.本文描述的本发明的另一方面涉及与taci和cd3特异性结合的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含taci结合结构域和cd3结合结构域，其中所述taci结合结构域包含含有vh seq id no:1的氨基酸序列的vh和含有seq id no:2的氨基酸序列的vl。
73.在任何方面的一个实施方案中，所述taci结合结构域位于所述cd3结合结构域的n末端。
74.在任何方面的一个实施方案中，所述cd3结合结构域位于所述taci结合结构域的n
末端。
75.在任何方面的一个实施方案中，所述taci结合结构域和所述cd3结合结构域通过接头序列连接。
76.在任何方面的一个实施方案中，所述接头序列包含seq id no:3、14、15、16或17的氨基酸序列。
77.在任何方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
78.在任何方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体是单克隆抗体。
79.在任一方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体是全长抗体。
80.在任何方面的另一个实施方案中，所述双特异性抗体是与taci和cd3特异性结合的抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体片段选自fab、fab'、fab'-sh、fv、scfv和(fab')2片段。
81.在任何方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体是igg抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是igg1抗体。
82.本文描述的本发明的另一方面涉及包含本文描述的任一种双特异性抗体的组合物。
83.本文描述的本发明的另一方面涉及编码本文描述的任一种双特异性抗体的多核苷酸。
84.本文描述的本发明的另一方面涉及包含编码本文描述的双特异性抗体的任一种多核苷酸的载体。
85.本文描述的本发明的另一方面涉及包含任一种所述载体(例如，包含任一种编码本文描述的双特异性抗体的多核苷酸的载体)的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在一个实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌(e.coli)。
86.本文描述的本发明的另一方面涉及产生与taci和cd3特异性结合的双特异性抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养本文描述的任一种宿主细胞(例如，包含任一种所述载体(例如，包含任一种编码本文描述的双特异性抗体的多核苷酸的载体)的宿主细胞)。
87.在一个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞或所述培养基回收所述双特异性抗体。
88.本文描述的本发明的另一方面涉及治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用以下中的一种或多种：(i)本文描述的任一种car多肽、本文描述的任一种多核苷酸和/或本文描述的任一种哺乳动物细胞；(ii)本文描述的任一种抗体；(iii)本文描述的任一种抗体-药物缀合物；以及(iv)本文描述的任一种双特异性抗体。
89.在一个实施方案中，所述疾病或障碍是癌症、自身免疫障碍或浆细胞疾病或障碍。
90.在一个实施方案中，所述疾病或障碍是癌症。
91.在一个实施方案中，所述癌症包含表达taci的细胞。
92.在一个实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤。
93.在一个实施方案中，所述受试者对抗bcma疗法具有抗性。
94.在一个实施方案中，所述疾病或障碍是自身免疫疾病或障碍。
95.在一个实施方案中，所述自身免疫疾病或障碍的特征在于促成所述自身免疫障碍的抗体的高滴度。
96.在一个实施方案中，所述自身免疫疾病或障碍是移植排斥反应、移植物抗宿主病或血友病合并因子抑制剂。
97.在一个实施方案中，所述疾病或障碍是浆细胞疾病或障碍。
98.在一个实施方案中，所述浆细胞疾病或障碍是浆细胞增生症、浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链疾病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病和郁积型多发性骨髓瘤。
99.定义
100.为了方便起见，以下提供在说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或从上下文暗示，否则以下术语和短语包括以下提供的含义。提供这些定义以帮助描述特定实施方案，并且不旨在限制要求保护的技术，因为所述技术的范围仅由权利要求书限制。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本技术所属领域普通技术人员通常所理解含义相同的含义。如果术语在本领域中的用法与其在本文提供的定义之间存在明显差异，则以说明书中提供的定义为准。
101.免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下文献中找到：merck manual of diagnosis and therapy,第19版,由merck sharp&dohme corp.出版,2011(isbn978-0-911910-19-3)；robert s.porter等人(编辑),the encyclopedia of molecular cell biology and molecular medicine,由blackwell science ltd.出版,1999-2012(isbn9783527600908)；以及robert a.meyers(编辑),molecular biology and biotechnology:a comprehensive desk reference,由vch publishers,inc.出版,1995(isbn 1-56081-569-8)；werner luttmann的immunology,由elsevier出版,2006；janeway's immunobiology,kenneth murphy,allan mowat,casey weaver(编辑),taylor&francis limited,2014(isbn0815345305,9780815345305)；lewin's genes xi,由jones&bartlett publishers出版,2014(isbn-1449659055)；michael richard green和joseph sambrook,molecular cloning:a laboratory manual,第4版,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,new york,usa(2012)(isbn 1936113414)；davis等人,basic methods in molecular biology,elsevier science publishing,inc.,new york,usa(2012)(isbn 044460149x)；laboratory methods in enzymology:dna,jon lorsch(编辑)elsevier,2013(isbn 0124199542)；current protocols in molecular biology(cpmb),frederick m.ausubel(编辑),john wiley and sons,2014(isbn 047150338x,9780471503385)；current protocols in protein science(cpps),john e.coligan(编辑),john wiley and sons,inc.,2005；以及current protocols in immunology(cpi)(john e.coligan,ada m kruisbeek,david h margulies,ethan m shevach,warren strobe,(编辑)john wiley and sons,inc.,2003(isbn 0471142735,9780471142737)，所述文献中的每一篇的内容全部通过引用以其全文并入本文。
102.在一些实施方案中，“激活”可以是指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的
t细胞状态。在一些实施方案中，激活可以是指诱导的细胞因子产生。在其他实施方案中，激活可以是指可检测的效应子功能。最低程度地，如本文所用的“激活的t细胞”是增殖性t细胞。
[0103]“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的那些)测量。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述于下文中。
[0104]
如本文所用，“施用”是指向受试者给予一定剂量的化合物(例如，抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car)或组合物(例如，药物组合物，例如包含抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car的药物组合物)。在本文描述的方法中使用的组合物可以通过以下方式施用或被配制用于通过以下方式施用：例如，肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、外用、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、膀胱内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以霜剂或以脂质组合物的形式。施用的方法可以根据各种因素(例如，所施用的化合物或组合物和所治疗的病症、疾病或障碍的严重程度)而变化。优选地，将所述化合物(例如，本发明的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car)或组合物(例如，包含抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car的药物组合物)口服施用或配制用于口服施用。
[0105]
术语“抗taci抗体”、“与taci结合的抗体”和“与taci特异性结合的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合taci使得所述抗体可用作靶向taci的预防剂、诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗taci抗体与无关的非taci蛋白的结合程度小于所述抗体与taci的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(ria)所测量的。在某些实施方案中，与taci结合的抗体具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm或≤0.001nm(例如10-8
m或更小，例如从10-8
m至10-13
m，例如从10-9
m至10-13
m)的解离常数(kd)。
[0106]
如在本文中以最广泛的含义使用的术语“抗体”涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现出所需的抗原结合活性即可。“抗体”可以指例如包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(hc)和两条轻链(lc)的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)构成。所述重链恒定区可以由三个结构域即ch1、ch2和/或ch3组成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)构成。所述vh和vl区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为“互补决定区”(cdr)，散布有更保守的区域，称为“框架区”(fr)。每个vh和vl可以由例如三个cdr和四个fr构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq)。
[0107]“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的与完整抗体所结合的
抗原(例如，taci)特异性结合的一部分。抗体片段的例子包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scfv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。这些抗体片段是使用常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用筛选所述片段。抗体片段可以通过重组dna技术或通过完整的免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。
[0108]“双特异性t细胞接合器”、“bite抗体构建体”或“bite”意指各自包括串联连接的单链可变片段(scfv)的多肽。任选地，所述scfv通过接头(例如，富含甘氨酸的接头)连接。bite的一个scfv结合t细胞受体(tcr)(例如，结合cd3ε亚基)，并且另一个scfv结合靶抗原(例如，肿瘤相关抗原)。
[0109]
如本文所用，术语“嵌合”是指至少两个或更多个不同多核苷酸分子的部分的融合产物。在一个实施方案中，术语“嵌合的”是指通过操纵已知元件或其他多核苷酸分子产生的基因表达元件。
[0110]
如本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“car”或“多个car”是指工程化t细胞受体，其将配体或抗原特异性移植到t细胞(例如，幼稚t细胞、中央记忆t细胞、效应记忆t细胞或其组合)上。car也被称为人工t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体。如本文所用，“car t细胞”或“car-t”是指表达car的t细胞。当在t细胞中表达时，car具有例如利用单克隆抗体的抗原结合特性，以非mhc限制性方式将t细胞特异性和反应性重定向至所选靶标的能力。非mhc限制性抗原识别给予表达car的t细胞不依赖抗原加工而识别抗原的能力，由此绕过肿瘤逃逸的主要机制。
[0111]
如本文所用的术语“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(apc)上的分子，其与t细胞上的同源共刺激分子特异性地结合，从而提供信号，除了由例如tcr/cd3复合物与装载肽的mhc分子的结合提供的初级信号之外，所述信号也介导t细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于4-1bbl、ox40l、cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、诱导型共刺激配体(icos-l)、细胞间粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受体、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem、结合toll样受体的激动剂或抗体以及与b7-h3特异性结合的配体。共刺激配体还可以包括但不限于与t细胞上存在的共刺激分子(如但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3)特异性结合的抗体以及与cd83特异性结合的配体。也可以根据标准方法使用本领域已知的其他共刺激配体。
[0112]“共刺激分子”是指t细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性地结合，从而介导t细胞的共刺激应答(如但不限于增殖)。共刺激分子包括但不限于mhc i类分子、btla、toll样受体、cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和cd83。
[0113]
术语“减少”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”或“抑制”是指与参考水平(例如，不存在给定的治疗或药剂)相比减少了至少10％，并且可以包括例如，减少了至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。典型地，这种减少是统计上显著的。如本文所用，“降低”或“抑制”不涵盖与参考水平相比的完全抑制或降低。“完全
抑制”是与参考水平相比的100％抑制。在适当的情况下，减少可以优选降至对于没有给定障碍的个体来说正常范围内的可接受水平。
[0114]“疾病”是动物(例如，人)的健康状态，其中动物无法维持体内平衡，并且其中如果疾病没有得到改善，则动物的健康将继续恶化。相比之下，动物的“障碍”是一种健康状态，在这种状态中动物能够维持体内稳态的，但与不存在所述障碍的情况相比，动物的健康状态不太有利。如果不及时治疗，障碍不一定导致动物健康状态进一步下降。
[0115]
如本文所用的术语“ec50”是指在体内或体外测定中诱导最大反应的50％(即，在最大反应与基线之间的中间点)的反应的抗体或其抗原结合部分的浓度。
[0116]
如本文所用的术语“有效量”、“有效剂量(effective dose)”和“有效剂量(effective dosage)”被定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。术语“治疗有效剂量”或“治疗有效量”被定义为足以预防、治愈或至少部分阻止已经患有所述疾病或有风险患上所述疾病的患者中的所述疾病(例如，腹泻)及其并发症的量。对于这种用途有效的量将取决于所治疗的障碍的严重程度和患者的自身免疫系统的一般状况。
[0117]
在一些实施方案中，如本文所用的术语“工程化”及其语法等同物可以指核酸(例如生物体基因组内的核酸)的一种或多种人为设计的改变。在另一个实施方案中，工程化可以指基因的改变、添加和/或缺失。“工程化细胞”可以指具有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。如本文所用的术语“细胞”或“工程化细胞”及其语法等同物可以指人或非人动物来源的细胞。
[0118]
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上的由免疫球蛋白或抗体特异性地结合的位点。表位可以由通过蛋白质的三级折叠并列的连续氨基酸或非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位典型地在暴露于变性溶剂时得以保持，而通过三级折叠形成的表位典型地在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包含处于独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。测定表位的空间构象的方法包括本领域的技术和本文所述的技术，例如x射线晶体学和二维核磁共振。参见例如，epitope mapping protocols in methods in molecular biology,第66卷,g.e.morris,编辑(1996)。表位也可以通过靶蛋白(例如，taci)中影响所述抗体(例如，单克隆抗体)的结合的点突变来定义。
[0119]
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换地使用以指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含有如本文所定义的fc区的重链的抗体。
[0120]
如本文所用的术语“宿主细胞”旨在指其中已引入表达载体的细胞。应理解，此类术语旨在不仅是指特定受试者细胞，还是指这种细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这种后代可能实际上与亲代细胞是不同的，但是仍然包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
[0121]
术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)的抗体。人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)(参见lonberg,n.等人(1994)nature 368(6474):856-859)；lonberg,n.(1994)handbook of experimental pharmacology 113:49-101；lonberg,n.和huszar,d.(1995)intern.rev.immunol.第13卷:65-93以及harding,f.和lonberg,n.(1995)ann.n.y.acad.sci 764:536-546)。然而，术语“人抗体”不包括其中源自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的cdr序列已经被移植到人
框架序列上的抗体(即，人源化抗体)。
[0122]“分离的抗体”是已从其自然环境的组分鉴定和分离和/或回收和/或基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与taci特异性结合的分离的抗体基本上不含与除taci以外的抗原特异性结合的抗体)。其自然环境的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至：(1)如通过劳里法(lowry method)所确定的抗体重量大于95％，并且最优选重量大于99％，(2)足以获得通过使用旋杯式序列分析仪所测的至少15个残基的n末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)在还原或非还原条件下使用coomassie
tm
蓝或优选银染色通过sds-page测得的同质性。分离的抗体包括重组细胞内原位抗体，因为抗体的自然环境的至少一种组分将不存在。类似地，分离的抗体包括培养基中重组细胞周围的抗体。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
[0123]
如本文所用的术语“k
d”旨在是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。典型地，当在biacore 3000仪器中使用重组taci作为分析物以及抗体作为配体通过表面等离子体共振(spr)技术进行测定时，所述抗体以小于约10-6
m，如小于约10-7
m、10-8
m、10-9
m或10-10
m或甚至更低的解离平衡常数(kd)与taci结合。
[0124]
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指对特定表位显示出单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”或“humab”是指显示单一结合特异性并且具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的从具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的b细胞。
[0125]
如本文所用，术语“可操作地连接”是指与第二可转录多核苷酸分子(如目的基因)连接的第一多核苷酸分子(如启动子)，其中所述多核苷酸分子的排列使得第一多核苷酸分子影响第二多核苷酸分子的功能。两个多核苷酸分子可以是或可以不是单个连续多核苷酸分子的一部分，并且可以相邻或可以不相邻。例如，如果启动子调节或介导细胞中目的基因的转录，则所述启动子与目的基因可操作地连接。
[0126]
在一些实施方案中，本文所述的多肽(或编码这种多肽的核酸)可以是本文所述氨基酸序列之一的功能片段。如本文所用，“功能片段”是根据本领域已知或本文下文所述的测定保留至少50％的野生型参考多肽活性的肽的片段或区段。功能片段可以包含本文公开的序列的保守取代。
[0127]
在一些实施方案中，本文所述的多肽可以是本文所述的多肽或分子的变体。在一些实施方案中，变体是保守性修饰的变体。例如，可以通过天然核苷酸序列的突变获得保守取代变体。如本文所提及的“变体”是与天然或参考多肽基本上同源的多肽，但是它的氨基酸序列与天然或参考多肽的氨基酸序列由于一个或多个缺失、插入或取代而不同。编码变体多肽的dna序列在与天然或参考dna序列相比时涵盖包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代的序列，但是所述序列编码保留非变体多肽活性的变体蛋白或其片段。各种各样的基于pcr的位点特异性诱变方法是本领域已知的，并且可以被普通技术人员所应用。例如，变体氨基酸或dna序列可以与天然或参考序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多相同。
[0128]
关于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在用以实现最大百分比序列同一性而比对序列和引入空位(如果需要的话)并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括对所比较序列的全长实现最大比对所需的任何算法。
[0129]
如本文所用，术语“dna”定义为脱氧核糖核酸。术语“多核苷酸”在本文中可与“核酸”互换使用，以表示核苷的聚合物。通常，多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的天然发现于dna或rna中的核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)构成。然而，所述术语涵盖含有核苷或核苷类似物的分子，所述核苷或核苷类似物含有化学或生物学修饰的碱基、修饰的主链等，无论是否存在于天然存在的核酸中，并且此类分子对于某些应用可能是优选的。当本技术涉及多核苷酸时，应当理解提供了dna、rna两者，并且在每种情况下均提供了单链和双链两种形式(以及每个单链分子的互补物)。如本文所用的“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料本身和/或在生物化学上表征特定核酸的序列信息(即，用作碱基缩写的一连串字母)。除非另有说明，否则本文呈现的多核苷酸序列以5'至3'的方向呈现。
[0130]
如本文所用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是相对较短的多肽，通常长度在约2与60个氨基酸之间。本文所用的多肽通常含有氨基酸，如蛋白质中最常见的20种l-氨基酸。然而，可以使用本领域已知的其他氨基酸和/或氨基酸类似物。多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学实体(如碳水化合物基团、磷酸基团、脂肪酸基团，用于缀合、官能化的接头等)进行修饰。具有与其共价或非共价缔合的非多肽部分的多肽仍被认为是“多肽”。示例性修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源中纯化，使用重组dna技术产生或通过化学手段(如常规固相肽合成等)合成。如本文所用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以是指多肽材料本身和/或生物化学上表征多肽的序列信息(即，用作氨基酸名称的缩写的一连串字母或三字母代码)。除非另外指明，否则本文呈现的多肽序列以n末端至c末端的方向呈现。
[0131]
在一些实施方案中，编码如本文所述的多肽(例如，car多肽)的核酸被包含在载体中，例如在表达载体中。在本文所述的一些方面中，编码如本文所述的给定多肽的核酸序列与载体可操作地连接。如本文所用，术语“载体”是指被设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。载体可以包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒体等。
[0132]
如本文所用，术语“表达载体”是指引导例如来自与载体上的转录调节序列连接的序列的rna或多肽的表达的载体。表达的序列将通常但不一定对于细胞是异源的。表达载体可以包含另外的元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其在两种生物体中被维持，例如在人细胞中进行表达，并在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生rna和蛋白质以及在适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用时包括但不限于例如转录、转
录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的rna，以及通过从基因转录的mrna翻译获得的多肽。术语“基因”意指当与合适的调节序列可操作地连接时在体外或体内转录(dna)为rna的核酸序列。所述基因可以包括或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如5'非翻译(5'utr)或“前导”序列和3'utr或“尾部”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[0133]
如本文所用，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，其包含至少一个病毒来源的元件并且具有被包装到病毒载体颗粒中的能力。病毒载体可以含有编码如本文所述多肽的核酸，以代替非必需病毒基因。可以将载体和/或颗粒用于在体外或体内将核酸转移到细胞中的目的。许多形式的病毒载体是本领域已知的。
[0134]“重组载体”意指包含能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应理解，在一些实施方案中，本文所述的载体可以与其他合适的组合物和疗法组合。在一些实施方案中，所述载体是游离型的。合适的附加型载体的使用提供了使目的核苷酸维持在受试者中的高拷贝数染色体外dna中的手段，从而消除了染色体整合的潜在影响。
[0135]
术语“药物组合物”是指呈使得其中含有的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对所述配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。
[0136]“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0137]
如本文所用，术语“特异性结合”和“特异性地结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的物理相互作用，其中第一实体与第二靶标实体结合的特异性和亲和力大于其与作为非靶标的第三实体结合的特异性和亲和力。在一些实施方案中，特异性结合可以指第一实体对于第二靶标实体的亲和力，其是相同条件下对于第三非靶标实体的亲和力的至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多。对给定靶标具有特异性的试剂是在所使用的测定条件下对所述靶标展现出特异性结合的试剂。非限制性例子包括识别同源结合配偶体(例如，存在于t细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白并与其结合的抗体或配体。例如，当在biacore 3000仪器中通过例如使用重组taci作为分析物以及所述抗体作为配体进行的表面等离子体共振(spr)技术测定时，特异性抗体可以以大约小于10-7
m，如大约小于10-8
m、10-9
m或10-10
m或甚至更低的亲和力(kd)与其靶标结合。在一些实施方案中，所述抗体与预定抗原的结合的亲和力是其对于与除预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如，bsa、酪蛋白)结合的亲和力的至少两倍。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”与术语“与抗原特异性地结合的抗体”在本文中可互换使用。
[0138]
如本文所用，“信号肽”或“信号序列”是指在新合成的蛋白质的n末端处的肽，所述肽用于将新生的蛋白质引入内质网。在一些实施方案中，所述信号肽是cd8信号肽。
[0139]
如本文所用，“刺激配体”是指这样的配体，其当存在于抗原呈递细胞(apc)(例如，巨噬细胞、树突状细胞、b细胞、人工apc等)上时可以与t细胞上的同源结合配偶体(在本文中称为“刺激分子”或“共刺激分子”)特异性结合，从而介导t细胞的初级应答，包括但不限于增殖、激活、免疫应答的启动等。刺激性配体在本领域中是熟知的，并且尤其涵盖装载肽、抗cd3抗体、超激动剂抗cd28抗体和超激动剂抗cd2抗体的mhc i类分子。
[0140]
如本文所用的术语“刺激性分子”意指t细胞上与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激性配体特异性地结合的分子。
[0141]“受试者”或“个体”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人灵长类动物如猴)、兔、鹿和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述受试者或个体是人。
[0142]
受试者可以是先前已被诊断出或被鉴定为罹患或患有需要治疗的病症(例如，本文描述的疾病和障碍)或与这样的病症有关的一种或多种并发症，并且任选地，已经经历了针对所述病症或与所述病症有关的一种或多种并发症的治疗的受试者。可替代地，受试者还可以是先前未被诊断为患有这种病症或有关并发症的受试者。例如，受试者可以是展现出对于所述病症或与所述病症有关的一种或多种并发症的一种或多种风险因素的受试者，或者是未展现出风险因素的受试者。
[0143]
针对特定病症“需要治疗的受试者”可以是患有所述病症、被诊断为患有所述病症或有风险患上所述病症的受试者。
[0144]
术语“跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物”或“taci”也称为肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员13b(tnfrsf13b)并且是tnfr超家族的淋巴细胞特异性成员。taci与肿瘤坏死因子(tnf)家族的另外两个成员b细胞激活因子(baff)和增殖诱导配体(april)相互作用，并且控制t细胞非依赖性b细胞抗体应答、同种型转换和b细胞体内平衡。
[0145]
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、treating)”或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减慢或阻止与疾病或障碍相关的病症的进展或严重程度，例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、急性淋巴母细胞性白血病或其他癌症、疾病或障碍。术语“治疗”包括减少或减轻病症、疾病或障碍的至少一种不良影响或症状。如果一种或多种症状或临床标记减少，则治疗通常是“有效的”。可替代地，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标记的改善，还包括与在没有治疗的情况下预期相比，停止或至少减缓症状的进展或恶化。有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状减轻、疾病的程度减小、疾病状态稳定(即，不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和、缓解(无论是部分还是全部)和/或死亡率降低，无论是可检测的还是不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的解除(包括姑息治疗)。
[0146]
如本文所用，术语“肿瘤抗原”和“癌抗原”可互换使用，是指由癌细胞差异表达的抗原，并且因此可以被利用以便靶向癌细胞。癌症抗原是可能潜在地刺激明显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些是由正常细胞编码的，但不一定表达。这些抗原可以被表征为在正常细胞中通常沉默(即，不表达)的抗原、仅在分化的某些阶段表达的抗原以及暂时表达的抗原，如胚胎和胎儿抗原。其他癌症抗原由突变细胞基因(如癌基因(例如，激活的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变体p53)和由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白)编码。其他癌症抗原也可以由病毒基因(如携带在rna和dna肿瘤病毒上的基因)编码。
[0147]
其他术语定义于本技术的各个方面和实施方案的描述内，如下文所述。
[0148]
本文描述的构建体和方法提供了若干个优点。例如，本文描述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和抗taci car提供的一个有点是靶向taci允许减轻bcma抗原逃逸的问题。尽管迄今为止，抗bcma疗法已对多发性骨髓瘤产生了有希望的结果，但也已显示靶向bcma导致bcma car t细胞治疗后的复发和/或bcma抗原丢失。虽然这种事件的频率尚未确定，但最近在研究中观察到总体客观反应率为85％，但中位无进展存活期为11.8个月(raje
等人,n engl j med.2019；380(18):1726-1737)，这表明用car t细胞单特异性靶向bcma可能不是大多数患者的治愈性疗法。由于在抗bcma car t细胞治疗的选择性压力下的bcma抗原丢失而导致的疾病抗性的报道也不断出现。因此，在治疗受bcma抗原逃逸影响的疾病时，靶向taci提供了独特的优势。
[0149]
以上概述意在以非限制性方式说明本文公开的技术的一些实施方案、优点、特征和用途。从具体实施方式、附图、实施例和权利要求中本文公开的技术的其他实施方案、优点、特征和用途将变得清楚。
附图说明
[0150]
附图并未旨在按比例绘制。本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一张或多张彩色附图的本专利或专利申请公开案的副本。在附图中：
[0151]
图1是显示用于产生抗跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(taci)抗体的一般方法及其在本文所述的抗taci嵌合抗原受体(car)t细胞中的用途的图。
[0152]
图2是显示使用抗taci抗体的表面等离子体共振测定的结果的图。
[0153]
图3是显示本文称为“抗taci(h/l)”和“抗taci(l/h)”的抗taci car的设计的图。
[0154]
图4是显示在mm1s、mm1s bcma敲除、k562、k562-taci和k562-bcma细胞系上的bcma和taci表达的一系列图。
[0155]
图5是显示在t细胞中taci表达的一系列图。
[0156]
图6是显示如通过mcherry表达测量的抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci(l/h)car t细胞的转染效率的图。感染复数(moi)＝10。
[0157]
图7是显示使用mm1s细胞作为靶细胞时未转导(utd)、抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci(l/h)car t细胞的杀伤活性的图。
[0158]
图8是显示使用mm1s bcma敲除细胞作为靶细胞时utd、抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci(l/h)car t细胞的杀伤活性的图。
[0159]
图9是显示t细胞上的cd45ro和ccr7表达来确定t细胞免疫表型(例如，幼稚t细胞、中央记忆(cm)t细胞、效应记忆(em)t细胞和晚期效应t细胞(emra))的一系列图。观察到cm t细胞群富集。
[0160]
图10是显示图9中鉴定的幼稚t细胞群(即cd45-ccr7 t细胞)上的cd95和cd127表达的一系列图。cd95和cd127是t干细胞记忆(tscm)群的生物标记物。
[0161]
图11是显示抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci(l/h)car t细胞的cd107a表达的图。cd107a是细胞毒性脱粒的标记物。
[0162]
图12a-图12c是显示抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci(l/h)car t细胞与可溶性taci(staci)(图12a)、可溶性bcma(sbcma)(图12b)和可溶性april(sapril)(图12c)的结合的一系列图。
[0163]
图13a-图13e是显示与mm1s靶细胞(图13a)、mm1s bcma敲除细胞(图13b)、k562-bcma细胞(图13c)、k562-taci细胞(图13d)和u266细胞(图13e)一起孵育的抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci(l/h)car t细胞的细胞因子产生的一系列图。
[0164]
图14是显示响应于用表达k562的靶细胞的刺激的抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci
(l/h)car t细胞的群体倍增数的图。
[0165]
图15是显示在体内测试utd、抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci(l/h)car t细胞的实验设计的图。向小鼠静脉内(i.v.)注射1x 106个mm1s细胞。两周后，向小鼠注射2x 106个car t或utd细胞。每周拍摄两次生物发光图像。
[0166]
图16a和图16b是通过生物发光成像拍摄的图，其显示小鼠中的肿瘤负荷。
[0167]
图17是显示通过生物发光测量的小鼠中肿瘤负荷的量化(光子/秒)的图。
[0168]
图18是显示utd、抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci(l/h)car t细胞的肿瘤杀伤的图。
[0169]
图19是显示用utd、抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci(l/h)car t细胞处理后小鼠的存活比例的图。
[0170]
图20a-图20e显示了抗taci car的功能性。图20a显示了抗taci和对照抗bcma car的构建体设计。图20b显示了bcma和taci染色。图20c显示了抗taci car和抗bcma car(对照)针对多发性骨髓瘤细胞系mmls、rpml-8266和u266的基于萤光素酶的杀伤测定。图20d了显示了在car处理后mmls的体内萤光素酶成像。图20e显示了可溶性taci与bcma和taci car的结合。
[0171]
图21a-图21e显示了串联双特异性bcma-taci car与tripril的比较。图21a显示了双靶向car t细胞构建体设计。图21b显示了构建体的转导效率。图21c显示了双靶向car针对多发性骨髓瘤细胞系mmls、rpml-8226和u266的基于萤光素酶的杀伤测定。图21d显示了bcma和taci在表达非特异性crispr/cas9、靶向bcma的crispr/cas9和靶向taci的crispr/cas9的mmls细胞上的表达。图21e显示了在平底板中针对来自图21d的mmls敲除细胞系的基于萤光素酶的杀伤测定。
[0172]
图22a-图22c显示了使用靶向三种不同骨髓瘤系的car的基于萤光素酶的杀伤测定。将t细胞与表达cbg-gfp的肿瘤细胞系一起孵育18小时，然后裂解并分析萤光素酶表达。
[0173]
图23显示了通过流式细胞术测量的用taci抗体对外周血单个核细胞(pbmc)的染色。
[0174]
图24显示了如在流式细胞术分析中通过mcherry阳性细胞％测量的用抗-taci h-l、抗-taci l-h或抗-bcma对正常供体t细胞的转导效率。
[0175]
图25a-图25b显示了可溶性taci蛋白与未转导的t细胞以及与表达抗taci h-l、抗taci l-h或抗bcma的t细胞的结合的测量。将细胞与不同浓度下的荧光可溶性taci蛋白一起孵育，然后使用流式细胞术测量细胞的荧光，表示为taci阳性细胞的百分比(图25a)或相对于在未转导的细胞中测量的信号的中值荧光强度(mfi)(图25b)。
[0176]
图26a-图26h显示了car t细胞对小鼠中的rpmi8226皮下肿瘤的影响。图26a显示了实验的时间线。图26b-图26f显示了用抗taci h-l car(图26b)、抗taci l-h car(图26c)、抗bcma car(图26d)或未转导的t细胞(图26e，阴性对照)处理的小鼠或未处理的(图26f，阴性对照)小鼠中的rpmi8226肿瘤的单独生长曲线。图26g显示了小鼠随时间而变的存活。图26h显示了静脉内施用2x 106个car t细胞后21天小鼠的血液中每微升的car t细胞数。
[0177]
图27a-图27b显示了抗taci car t细胞对表达taci的肿瘤细胞具有特异性作用。图27a显示了在用或未用cas9破坏taci的情况下mm1s cas9癌细胞的流式细胞术分析，并且针对taci和bcma染色。图27b显示了通过与抗taci h-l car、抗taci l-h car、抗bcma car
或未转导的t细胞以不同的t细胞与癌细胞的比率共孵育导致的对mm1s cas9和mm1s cas9 taci敲除的细胞毒性。
[0178]
图28显示了通过流式细胞术测量的双特异性和单特异性car t细胞对其各自可溶性抗原的结合亲和力。顶部两个小图显示了荧光bcma与以下项的结合并且底部两个小图显示了荧光taci与以下项的结合：抗taci h-l car、抗taci l-h car、抗bcma、抗taci/抗bcma双特异性car、抗bcma/抗taci双特异性car或未转导的t细胞。左侧两个小图显示了bcma或taci阳性细胞的百分比。右侧两个小图显示了每个细胞群相对于未转导的细胞的中值荧光强度。
[0179]
图29显示了来自单独或与抗taci/抗bcma双特异性car、抗bcma/抗taci双特异性car或未转导的t细胞共培养的mm1s(顶部小图)或rpmi8226(底部小图)癌细胞的培养物的上清液中细胞因子浓度的测量。左侧小图显示了白介素-2(il-2)浓度，中间小图显示了干扰素-γ(ifng)浓度，并且右侧小图显示了肿瘤坏死因子α(tnfa)浓度。
[0180]
图30a-图30e显示了来自使用双特异性car t细胞的mm1s应激模型的结果。图30a显示了实验的时间线，其中在第-14天将1x 106个mm1s细胞静脉内注射至小鼠中，然后在第0天静脉内注射2x 106个car t细胞，并在第0、4、7、11和14天进行生物发光成像测量。图30b、图30c和图30d显示了在未处理或用来自三个不同供体的(使用抗taci/抗bcma双特异性car或抗bcma/抗taci双特异性car转导的，或未转导的)t细胞处理的小鼠中测量的来自mm1s细胞的生物发光通量。图30e显示了来自用来自供体1的细胞处理的小鼠的代表性生物发光图像。
[0181]
图31a-图31f显示了来自rpmi8226皮下肿瘤模型的结果。图31a显示了实验的时间线，其中在第-14天将5x 106个rpmi8226细胞皮下植入小鼠中，然后在第0天静脉内注射2x106个car t细胞，并且在第0、4、7、10和14天对肿瘤进行卡尺测量。图31b显示了第14天(左)和第21天(右)小鼠的血液中每微升的car t细胞数量。图31c、图31d、图31e和图31f显示了在用抗taci/抗bcma双特异性car(图31c)、抗bcma/抗taci双特异性car(图31d)或未转导的(图31e)t细胞处理的小鼠或未处理的小鼠(图31f)中测量的肿瘤体积曲线。
[0182]
图32a-图32b显示了在重复抗原刺激之后监测t细胞耗竭的实验结果。图32a显示了实验的时间线，其中在第0天将1x 106个t细胞(未转导的或使用抗bcma car、抗taci/抗bcma双特异性car或抗bcma/抗taci双特异性car转导的)用辐照的过表达bcma的k562细胞刺激，并在第0、7、14、21和28天进行流式细胞术分析以监测耗竭和记忆表型。在每个时间点对t细胞进行计数，针对1x 106个细胞进行再归一化，并进行再刺激。图32b显示了t细胞上tim-3和lag3随时间而变的流式细胞术测量结果。
[0183]
图33a-图33c显示了重复刺激的car t细胞中t细胞表型的分析结果。图33a显示了实验的时间线，其中在第0天用经辐照的过表达bcma的k562细胞刺激1x 106个car t细胞，并在第0、7、14和21天通过流式细胞术计数和分析。在第7天和第14天再刺激car t细胞。图33b显示了根据左侧所示的定义(中央记忆(cm)：ccr7

cd45ra
–
；效应记忆(em)：ccr7
–
cd45ra
–
；幼稚：ccr7

cd45ra

；终末分化效应(tde)：ccr7
–
cd45ra

)，通过流式细胞术分类为每种效应物表型的每种类型的car t细胞(抗bcma、抗taci/抗bcma双特异性或抗bcma/抗taci双特异性)的百分比。图33c显示了car t细胞随时间而变的生长，以细胞数/106计。
具体实施方式
[0184]
本文提供了抗跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(taci)抗体、其抗体-药物缀合物、靶向taci的双特异性t细胞接合器(bite)以及抗taci嵌合抗原受体(car)。此类抗体、抗体-药物缀合物、bite和car可以用于例如治疗有需要的受试者的癌症、自身免疫障碍或浆细胞疾病或障碍的方法中。
[0185]
抗taci抗体
[0186]
本发明提供了与taci特异性结合的分离的抗体。
[0187]
在一些方面，本公开文本提供了本文描述的抗taci抗体的重链和轻链可变结构域序列以及重链和轻链cdr序列。当使用不同的定义系统(例如，imgt定义、kabat定义或chothia定义)时，抗体的cdr可能具有不同的氨基酸序列。定义系统用编号注释给定抗体序列(例如，vh或vl序列)中的每个氨基酸，并且对应于重链和轻链cdr的编号提供于表3。根据不同定义系统的抗taci抗体的例子的cdr序列提供于表4。
[0188]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含来自选自表4的任一种抗taci抗体的cdr-h(例如，cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)氨基酸序列中的一个或多个。在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含提供于表4中的对于每个编号系统提供的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含来自选自表4的任一种抗taci抗体的cdr-l(例如，cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)氨基酸序列中的一个或多个。在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含提供于表4中的对于每个编号系统提供的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。
[0189]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含表4中对于每个编号系统提供的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。在一些实施方案中，抗体重链和轻链cdr3结构域可以在抗体对抗原的结合特异性/亲和力方面起特别重要的作用。因此，本公开文本的抗taci抗体可以至少包含提供于表4中的任一种抗taci抗体的重链和/或轻链cdr3。
[0190]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含具有seq id no:1的氨基酸序列的重链可变结构域的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含具有seq id no:2的氨基酸序列的轻链可变结构域的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。
[0191]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含具有seq id no:26(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:27(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:28(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3、具有seq id no:29(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:30(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2以及具有seq id no:31(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3。
[0192]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含这样的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其与具有seq id no:26的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:27的氨基酸序列的cdr-h2和具有seq id no:28的氨基酸序列的cdr-h3相比总共含有不多于5个氨基酸变异(例如，不多于5、4、3、2或1个氨基酸变异)。“总共”是指所有三个重链cdr中的氨基酸变异总数在限定的范围内。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含这样的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其与具有seq id no:29的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:30的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:31的氨基酸序列的cdr-l3相比总共含有不多于5个氨基酸
变异(例如，不多于5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
[0193]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含这样的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其与具有seq id no:26的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:27的氨基酸序列的cdr-h2和具有seq id no:28的氨基酸序列的cdr-h3总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含这样的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其与具有seq id no:29的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:30的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:31的氨基酸序列的cdr-l3总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。
[0194]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含：与具有seq id no:26的氨基酸序列的cdr-h1相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-h1；与具有seq id no:27的氨基酸序列的cdr-h2相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-h2；和/或与具有seq id no:28的氨基酸序列的cdr-h3相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-h3。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含：与具有seq id no:29的氨基酸序列的cdr-l1相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-l1；与具有seq id no:30的氨基酸序列的cdr-l2相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-l2；和/或与具有seq id no:31的氨基酸序列的cdr-l3相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-l3。
[0195]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含具有seq id no:32(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:33(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:34(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3、具有seq id no:35(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:36(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2以及具有seq id no:31(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3。
[0196]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含这样的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其与具有seq id no:32的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:33的氨基酸序列的cdr-h2和具有seq id no:34的氨基酸序列的cdr-h3相比总共含有不多于5个氨基酸变异(例如，不多于5、4、3、2或1个氨基酸变异)。“总共”是指所有三个重链cdr中的氨基酸变异总数在限定的范围内。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含这样的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其与具有seq id no:35的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:36的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:31的氨基酸序列的cdr-l3相比总共含有不多于5个氨基酸变异(例如，不多于5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
[0197]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含这样的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其与具有seq id no:32的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:33的氨基酸序列的cdr-h2和具有seq id no:34的氨基酸序列的cdr-h3总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。或者或此外，本公开的抗taci抗体包含这样的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其与具有seq id no:35的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:36的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:31的氨基酸序列的cdr-l3总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。
[0198]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含：与具有seq id no:32的氨基酸序列的cdr-h1相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-h1；与具有seq id no:33的氨基酸序列的cdr-h2相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-h2；和/或与具有seq id no:34的氨基酸序列的cdr-h3相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-h3。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含：与具有seq id no:35的氨基酸序列的cdr-l1相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-l1；与具有seq id no:36的氨基酸序列的cdr-l2相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-l2；和/或与具有seq id no:31的氨基酸序列的cdr-l3相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-l3。
[0199]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含具有seq id no:37(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:38(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:39(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3、具有seq id no:40(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:30(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2以及具有seq id no:41(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3。
[0200]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含这样的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其与具有seq id no:37的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:38的氨基酸序列的cdr-h2和具有seq id no:39的氨基酸序列的cdr-h3相比总共含有不多于5个氨基酸变异(例如，不多于5、4、3、2或1个氨基酸变异)。“总共”是指所有三个重链cdr中的氨基酸变异总数在限定的范围内。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含这样的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其与具有seq id no:40的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:30的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:41的氨基酸序列的cdr-l3相比总共含有不多于5个氨基酸变异(例如，不多于5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
[0201]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含这样的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其与具有seq id no:37的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:38的氨基酸序列的cdr-h2和具有seq id no:39的氨基酸序列的cdr-h3总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。或者或此外，本公开的抗taci抗体包含这样的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其与具有seq id no:40的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:30的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:41的氨基酸序列的cdr-l3总共至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同。
[0202]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含：与具有seq id no:37的氨基酸序列的cdr-h1相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-h1；与具有seq id no:38的氨基酸序列的cdr-h2相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-h2；和/或与具有seq id no:39的氨基酸序列的cdr-h3相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-h3。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含：与具有seq id no:40的氨基酸序列的cdr-l1相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-l1；与具有seq id no:30的氨基酸序列的cdr-l2相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1
个氨基酸变异)的cdr-l2；和/或与具有seq id no:41的氨基酸序列的cdr-l3相比具有不多于3个氨基酸变异(例如，不多于3、2或1个氨基酸变异)的cdr-l3。
[0203]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含含有seq id no:1的氨基酸序列的vh。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含含有seq id no:2的氨基酸序列的vl。
[0204]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含与seq id no:1所示的vh相比含有不多于20个氨基酸变异(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的vh。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含与seq id no:2所示的vl相比含有不多于20个氨基酸变异(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的vl。
[0205]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体包含如下vh，其含有与seq id no:1所示的vh至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同的氨基酸序列。可替代地或另外地，本公开文本的抗taci抗体包含如下vl，其含有与seq id no:2所示的vl至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同的氨基酸序列。
[0206]
在一些实施方案中，本公开文本的抗taci抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述人源化抗taci抗体包含人源化vh，其含有具有seq id no:26(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:27(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:28(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3；以及人源化vl，其含有具有seq id no:29(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:30(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:31(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3。
[0207]
在一些实施方案中，所述人源化抗taci抗体包含人源化vh，其含有具有seq id no:32(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:33(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:34(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3；具有seq id no:35(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:36(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2以及具有seq id no:31(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3。
[0208]
在一些实施方案中，所述人源化抗taci抗体包含人源化vh，其含有具有seq id no:37(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:38(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:39(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3；具有seq id no:40(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:30(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2以及具有seq id no:41(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3。
[0209]
在一些实施方案中，所述抗taci抗体是igg、fab片段、f(ab')片段、f(ab')2片段、scfv或与恒定区融合的scfv(例如，n或c末端融合物)。本文提供了不同形式的抗taci抗体的非限制性例子。
[0210]
在一些实施方案中，所述抗taci抗体是在单个多肽链中包含vh和vl的单链片段可变区(scfv)。在一些实施方案中，所述scfv在单个多肽链上包含本文描述的重链cdr、轻链cdr、vh和/或vl中的任一种。在一些实施方案中，所述scfv包含在所述vl的n末端连接的vh。
在一些实施方案中，所述scfv包含在所述vh的n末端连接的vl。在一些实施方案中，所述vh和vl经由接头(例如，多肽接头)连接。任何多肽接头均可以用于连接所述scfv中的vh和vl。接头序列的选择在本领域技术人员的能力范围内。
[0211]
在一些实施方案中，所述scfv包含如下vh，其含有具有seq id no:26(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:27(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:28(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3；以及如下vl，其含有具有seq id no:29(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:30(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:31(根据imgt定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3，其中所述vh和vl在单个多肽链上(例如，经由酰胺键连接或经由接头如肽接头连接)，并且其中所述vh与所述vl的n末端或c末端连接。在一些实施方案中，所述vh和vl经由包含ggggsggggsggggsggggs(seq id no:3)的氨基酸序列的接头连接。在一些实施方案中，所述scfv包含seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列。
[0212]
在一些实施方案中，所述scfv包含如下vh，其含有具有seq id no:32(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:33(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:34(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3；以及如下vl，其含有具有seq id no:35(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:36(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:31(根据kabat定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3，其中所述vh和vl在单个多肽链上(例如，经由酰胺键连接或经由接头如肽接头连接)，并且其中所述vh与所述vl的n末端或c末端连接。在一些实施方案中，所述vh和vl经由包含ggggsggggsggggsggggs(seq id no:3)的氨基酸序列的接头连接。在一些实施方案中，所述scfv包含seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列。
[0213]
在一些实施方案中，所述scfv包含如下vh，其含有具有seq id no:37(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:38(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-h2、具有seq id no:39(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-h3；以及如下vl，其含有具有seq id no:40(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:30(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:41(根据chothia定义系统)的氨基酸序列的cdr-l3，其中所述vh和vl在单个多肽链上(例如，经由酰胺键连接或经由接头如肽接头连接)，并且其中所述vh与所述vl的n末端或c末端连接。在一些实施方案中，所述vh和vl经由包含ggggsggggsggggsggggs(seq id no:3)的氨基酸序列的接头连接。在一些实施方案中，所述scfv包含seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列。
[0214]
在一些实施方案中，所述scfv包含vh，其含有与seq id no:1所示的vh至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同的氨基酸序列；以及如下vl(例如人源化vl)，其含有与seq id no:2所示的vl至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)相同的氨基酸序列，其中所述vh和vl在单个多肽链中(例如，经由酰胺键连接或经由接头如肽接头连接)，并且其中所述vh与所述vl的n末端或c末端连接。在一些实施方案中，所述vh和vl经由包含ggggsggggsggggsggggs(seq id no:3)的氨基酸序列的接头连接。在一些实施方案中，所述scfv包含与seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。
[0215]
在一些实施方案中，所述scfv包含与seq id no:1所示的vh相比含有不多于20个氨基酸变异(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的vh，以及与seq id no:2所示的vl相比含有不多于20个氨基酸变异(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的vl，其中所述vh和vl在单个多肽链中(例如，经由酰胺键连接或经由接头如肽接头连接)，并且其中所述vh与所述vl的n末端或c末端连接。在一些实施方案中，所述vh和vl经由包含ggggsggggsggggsggggs(seq id no:3)的氨基酸序列的接头连接。在一些实施方案中，所述scfv包含与seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列相比含有不多于20个氨基酸变异(例如，不多于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的氨基酸序列。
[0216]
在一些实施方案中，所述scfv包含含有seq id no:1的氨基酸序列的vh和含有seq id no:2的氨基酸序列的vl，其中所述vh和vl在单个多肽链中(例如，经由酰胺键连接或经由接头如肽接头连接)，并且其中所述vh与所述vl的n末端或c末端连接。在一些实施方案中，所述vh和vl经由包含ggggsggggsggggsggggs(seq id no:3)的氨基酸序列的接头连接。
[0217]
在一些实施方案中，所述scfv包含与含有seq id no:2的氨基酸序列的vl的n末端连接的含有seq id no:1的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，所述vh和vl经由包含ggggsggggsggggsggggs(seq id no:3)的氨基酸序列的接头连接。
[0218]
在一些实施方案中，所述scfv包含与含有seq id no:2的氨基酸序列的vl的c末端连接的含有seq id no:1的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，所述vh和vl经由包含ggggsggggsggggsggggs(seq id no:3)的氨基酸序列的接头连接。
[0219]
在一些情况下，所述抗体以约5nm或更低(例如，约5nm或更低、约4nm或更低、约3nm或更低、约2nm或更低、约1nm或更低、约900pm或更低、约875pm或更低、约850pm或更低、约825pm或更低、约800pm或更低、约700pm或更低、约600pm或更低、或约500pm或更低)的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述抗体以在约500pm与约1nm之间的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述抗体以在约700pm与约900pm之间的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述抗体以约861pm的kd与taci结合。
[0220]
在一些情况下，所述抗体包含如下重链可变结构域(vh)序列，其与seq id no:1具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有seq id no:1的序列。在其他例子中，所述抗体包含如下轻链可变结构域(vl)序列，其与seq id no:2具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有seq id no:2的序列。在一些情况下，所述抗体包含如下vh，其与seq id no:1具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有seq id no:1的序列；以及如下vl，其与seq id no:2具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有seq id no:2的序列。
[0221]
例如，此类抗体可以是单克隆的、人的、人源化的或嵌合的。所述抗体可以是全长
抗体或其抗体片段(例如，结合taci的抗体片段)。所述抗体片段可以选自fab、fab'-sh、fv、scfv和(fab')2片段。在一些情况下，所述抗体是igg抗体(例如，igg1抗体)。此类抗体可以具有≥3天(例如≥1周，例如≥2周，例如≥1个月，例如≥2个月，例如≥3个月，例如≥4个月，例如≥5个月，例如≥6个月)的半衰期。
[0222]
在其他方面，根据任何上述实施方案的抗taci抗体可以单独或组合并入如下文章节所述的任何特征。
[0223]
抗体亲和力
[0224]
在某些实施方案中，本文提供的抗体可以具有≤10μm、≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm或≤0.01nm的解离常数(kd)。在一些情况下，所述抗体以约5nm或更低(例如，约5nm或更低、约4nm或更低、约3nm或更低、约2nm或更低、约1nm或更低、约900pm或更低、约875pm或更低、约850pm或更低、约825pm或更低、约800pm或更低、约700pm或更低、约600pm或更低、或约500pm或更低)的kd与taci结合。
[0225]
在一个实施方案中，所述抗体以在约500pm与约1nm之间的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述抗体以在约700pm与约900pm之间的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述抗体以约861pm的kd与taci结合。
[0226]
在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定(ria)测量kd。在一个实施方案中，使用目的抗体的fab形式及其抗原进行ria。例如，fab对抗原的溶液结合亲和力是通过以下方式来测量：在未标记的抗原的滴定系列的存在下用最小浓度的(
125
i)标记的抗原平衡fab，然后用抗fab抗体包被的板捕获结合的抗原(参见例如，chen等人,j.mol.biol.293:865-881(1999))。为了建立测定条件，将多孔板(thermo scientific)用50mm碳酸钠(ph 9.6)中的5μg/ml的捕获抗fab抗体(cappel labs)包被过夜，并且随后在室温(大约23℃)下用pbs中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭2至5小时。在非吸附板(nunc#269620)中，将100pm或26pm的[
125
i]-抗原与目的fab的连续稀释液混合(例如，与presta等人,cancer res.57:4593-4599(1997)中的抗vegf抗体fab-12的评估一致)。然后将目的fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长的时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将所述混合物转移到捕获板中，以在室温下孵育(例如，1小时)。然后去除溶液，并且将板用pbs中的0.1％聚山梨醇酯20(tween-)洗涤8次。当板干燥后，添加150μl/孔的闪烁体(microscint-20
tm
；packard)，并且将板在topcount tm
伽马计数器(packard)上计数10分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的每种fab的浓度用于竞争性结合测定。
[0227]
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定测量kd。例如，以约10个反应单位(ru)用固定化抗原cm5芯片在25℃下使用-3000(biacore,inc.，新泽西州皮斯卡塔韦)进行测定。在一个实施方案中，根据供应商的说明，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(cm5,biacore,inc.)用n-乙基-n'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)激活。在以5μl/分钟的流速注射前，将抗原用10mm乙酸钠(ph 4.8)稀释至5μg/ml(约0.2μm)以获得大约10个反应单位(ru)的偶联蛋白。在注射抗原之后，注射1m乙醇胺以封闭未反应的基团。用于动力学测量，在25℃下，以大约25μl/min的流速，将fab的两倍连续稀释液(0.78nm至500nm)注射到含有0.05％聚山梨醇酯20(tween-20
tm
)表面活性剂的pbs(pbst)中。使用简单的一对一langmuir结合模型(
评价软件3.2版)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k
on
)和解离速率(k
off
)。所述平衡解离常数(kd)计算为比率k
on
/k
off
。参见例如，chen等人,j.mol.biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定测得的缔合速率超过106m-1
s-1
，则可以通过使用荧光猝灭技术确定缔合速率，所述荧光猝灭技术在25℃下，在递增浓度的抗原的存在下，测量ph 7.2的pbs中20nm抗抗原抗体(fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在带搅拌比色皿的光谱仪(如装有停流计(stop-flow)的分光光度计(aviv instruments)或8000系列slm-aminco tm
分光光度计(thermospectronic))中所测量的。
[0228]
根据另一个实施方案，使用如本文实施例1中所述的表面等离子体共振测定来测量kd。
[0229]
抗体片段
[0230]
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于本领域已知的fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2、fv和scfv片段。还包括双抗体，其具有可以为二价或双特异性的两个抗原结合位点，如本领域已知的。三抗体和四抗体也是已知的。单结构域抗体也是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。
[0231]
抗体片段可以通过各种技术(包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(e.coli)或噬菌体)产生，如本文所述)制备。
[0232]
嵌合抗体和人源化抗体
[0233]
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(如猴)的可变区)和人恒定区。在一个进一步的例子中，嵌合抗体是类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
[0234]
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，人源化非人抗体以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含hvr(例如，cdr)(或其部分)衍生自非人抗体，并且fr(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些fr残基经来自非人抗体(例如，衍生出hvr残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
[0235]
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，sims等人j.immunol.151:2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如，carter等人proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；和presta等人j.immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如，almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008))；以及源自筛选fr文库的框架区(参见例如，baca等人,j.biol.chem.272:10678-10684(1997)和rosok等人,j.biol.chem.271:22611-22618(1996))。
[0236]
人抗体
[0237]
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体(例如，人单克隆抗体(humab)，例如抗taci humab)。人抗体可以使用本领域已知的多种技术来产生。
[0238]
人单克隆抗体可以使用各种已知技术来产生，如kohler和milstein,nature 256:495(1975)描述的标准体细胞杂交技术。尽管优选体细胞杂交程序，原则上也可以使用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如b淋巴细胞的病毒性或致癌性转化、使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
[0239]
在一些情况下，通过直接从获得自人受试者的人b细胞克隆重链和轻链基因来获得人抗体。将b细胞从外周血(例如，通过流式细胞术，例如，facs)分离，针对一种或多种b细胞标记物染色，并针对抗原结合进行评估。提取编码重链和轻链可变区(或整个重链和轻链)的rna并将其逆转录成dna，从中扩增(例如，通过pcr)抗体基因并进行测序。然后可以使用已知的抗体序列来表达针对已知靶抗原(例如，taci)的重组人抗体。
[0240]
在一些情况下，人抗体可以通过将免疫原(例如，taci)施用至转基因动物来制备，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其替代内源免疫球蛋白基因座，或者其存在于在染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，通常已经使内源免疫球蛋白基因座失活。来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区可以例如通过与不同的人恒定区组合来进行进一步修饰。
[0241]
在一些情况下，人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法来制备。用于产生杂交瘤的优选动物系统是鼠系统，所述杂交瘤产生人单克隆抗体。在小鼠中的杂交瘤产生是本领域熟知的，包括用于分离和融合免疫脾细胞的免疫方案和技术。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。
[0242]
也可以通过分离选自人来源的噬菌体展示文库的fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。下文描述了用于从抗体文库选择人抗体的技术。
[0243]
也可以使用例如如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物产生抗taci抗体。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗taci抗体的分离的核酸。这种核酸可以编码包含所述抗体的vl的氨基酸序列和/或包含所述抗体的vh的氨基酸序列(例如，所述抗体的轻链和/或重链)。在其他实施方案中，提供了包含这种核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在其他实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含以下项(例如，已经被以下项转化)：(1)含有编码包含所述抗体的vl的氨基酸序列和包含所述抗体的vh的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)含有编码包含所述抗体的vl的氨基酸序列的核酸的第一载体和含有编码包含所述抗体的vh的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴细胞(例如，y0、ns0、sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗taci抗体的方法，其中所述方法包括在适用于表达所述抗体的条件下培养包含编码如以上所提供的抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收所述抗体。
[0244]
对于抗taci抗体的重组产生，分离编码例如如上所述的抗体的核酸，并且将其插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码所述抗体重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。
[0245]
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核
细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和fc效应子功能时。表达后，能以可溶性级分从细菌细胞糊中分离所述抗体，并且可以将其进一步纯化。
[0246]
除原核生物之外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。
[0247]
用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞也衍生自多细胞有机体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞结合使用的许多杆状病毒株，特别是用于草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)细胞的转染。植物细胞培养物也可以用作宿主。
[0248]
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。其他有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是由sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚胎肾系(如例如graham等人,j.gen virol.36:59(1977)中描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠支持细胞(如例如mather,biol.reprod.23:243-251(1980)中描述的tm4细胞)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck)；buffalo大鼠肝细胞(brl 3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hep g2)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562)；如例如mather等人,annals n.y.acad.sci.383:44-68(1982)中描述的tri细胞；mrc 5细胞；以及fs4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞(包括dhfr-cho细胞)以及骨髓瘤细胞系(如y0、ns0和sp2/0)。
[0249]
抗体变体
[0250]
在某些实施方案中，考虑了抗taci抗体的氨基酸序列变体。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过在编码所述抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如所述抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，条件是最终的构建体具有所需的特征(例如，抗原结合)。
[0251]
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的目的位点包括cdr和fr。保守取代示于表1中“优选取代”标题下。表1中“示例性取代”标题下提供了更实质的变化，如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸取代引入目的抗体中，并筛选产物的所需活性，例如，保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的adcc或cdc。
[0252]
表1.示例性和优选的氨基酸取代
[0253][0254][0255]
可根据常见的侧链特性将氨基酸分组：
[0256]
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
[0257]
(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；
[0258]
(3)酸性：asp、glu；
[0259]
(4)碱性：his、lys、arg；
[0260]
(5)影响链取向的残基：gly、pro；
[0261]
(6)芳香族：trp、tyr、phe。
[0262]
非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。
[0263]
一个类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高
变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将具有某些生物学特性的修饰(例如，改进)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)和/或将基本保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简而言之，突变一个或多个cdr残基并且在噬菌体上展示变体抗体，并且针对特定的生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。
[0264]
可以在cdr中进行改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在cdr“热点”中进行，所述热点即在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基和/或抗原接触的残基，并且测试所得变体vh或vl的结合亲和力。通过从二级文库构建并再选择所得到的亲和力成熟是本领域已知的。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何一种(例如，易错pcr、链改组或寡核苷酸指导的诱变)，将多样性引入选择进行成熟的可变基因中。然后建立二级文库。然后筛选所述文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。用于引入多样性的另一种方法涉及cdr指导的方法，其中随机化若干个cdr残基(例如，每次4-6个残基)。抗原结合涉及的cdr残基可以使用例如丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定。特别地，通常靶向cdr-h3和cdr-l3。
[0265]
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个cdr内发生，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在cdr中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。例如，此类改变可以在cdr中的抗原接触残基之外。在上文所提供的变体vh和vl序列的某些实施方案中，每个cdr或者不发生改变，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
[0266]
用于鉴定可以靶向进行诱变的抗体残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所描述。在此方法中，鉴定残基或靶残基组(例如，带电残基，如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入进一步的取代，证明对初始取代的功能敏感性。可替代地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有所需特性。
[0267]
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有n末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的n末端或c末端与酶(例如用于adept)或增加抗体的血清半衰期的多肽融合。
[0268]
在某些实施方案中，可以对抗体的fc区进行改变。这些改变可以单独进行，或者与一个或多个抗体可变结构域(即，vh或vl区)或其区域(例如，一个或多个cdr或fr)的改变一起进行。fc区的改变可以例如通过增加c1q对调理细胞的亲合力导致增强的抗体效应子功能(例如，补体依赖性细胞毒性(cdc))。增强cdc的示例性突变包括例如fc突变e345r、e430g和s440y。因此，抗taci抗体可以含有一个或多个cdc增强fc突变，其促进igg六聚体形成以及随后第一补体组分c1的招募和激活。
[0269]
在某些实施方案中，所述抗体的fc区的氨基酸序列的改变可以改变抗体在宿主中的半衰期。改变与新生儿fc受体(fcrn)的结合的某些突变可以延长抗体在血清中的半衰期。例如，具有重链位置252中的酪氨酸、位置254中的苏氨酸和重链位置256中的谷氨酸的
抗体可以在血清中具有明显延长的半衰期(参见例如，美国专利号7,083,784)。
[0270]
抗taci的单克隆抗体的表征
[0271]
本发明的人单克隆抗体的序列信息可以使用本领域熟知的测序技术来确定。
[0272]
类似地，也可以使用标准技术评估所述抗体对taci的亲和力。例如，可以使用biacore3000确定humab对taci的亲和力。将humab例如经由胺偶联(sensor chip cm5)捕获在biacore芯片(ge healthcare)的表面上。可以将捕获的humab暴露于溶液中的各种浓度的taci，并且可以例如通过biaevaluation软件计算亲和力(kd)的k
on
和k
off
。
[0273]
还可以使用多种已知技术(如elisa、蛋白质印迹等)表征本发明的人单克隆抗体与taci的结合。通常，所述抗体最初通过elisa进行表征。在一些情况下，可以使用elisa测定筛选抗体，从而筛选产生显示出与taci免疫原的阳性反应性的抗体的杂交瘤。然后可以将与taci结合，优选以高亲和力结合的杂交瘤亚克隆并进一步表征。然后可以选择(通过elisa)来自每个杂交瘤的保留了亲本细胞的反应性的一个克隆用于制备细胞库以及用于抗体纯化。
[0274]
在一些情况下，可以使用竞争测定鉴定与本发明的抗taci抗体竞争结合taci的抗体。在某些实施方案中，此类竞争抗体与本发明的抗taci抗体所结合的表位相同的表位(例如，线性或构象表位)结合。用于为抗体所结合的表位作图的详细示例性方法提供于morris(1996)“epitope mapping protocols,”在methods in molecular biology第66卷(humana press,totowa,nj)。
[0275]
抗体-药物缀合物
[0276]
在一些实施方案中，本发明的抗taci抗体可以通过可生物降解的稳定接头(例如，通过二硫化物或不可切割的硫醚接头)共价附接至药物部分，即作为抗体-药物缀合物。所述抗体共价附接的药物在未与所述抗体缀合时可以具有细胞毒性或细胞生长抑制作用。所述抗体-药物缀合物可以用于将有效剂量的细胞毒性剂选择性地递送至表达taci的细胞(例如，递送至表达taci的肿瘤组织)以实现更大的选择性并因此实现更低的有效剂量。通过实现更高的选择性，所述抗体-药物缀合物的使用还可以降低全身暴露并增加所述药物的耐受性。另外，与所述药物和/或抗体以其未缀合形式施用时相比，所述抗体-药物缀合物可以改善所述药物和/或所述抗体的生物利用度。
[0277]
双特异性t细胞接合器(bite)
[0278]
本文还提供了称为双特异性t细胞接合器(bite)的双特异性抗体。此类分子可以通过结合t细胞抗原(例如通过结合cd3)靶向t细胞，以及靶向靶抗原(例如taci)。bite可以用于增大例如肿瘤微环境中的t细胞应答。bite的两种组分可以任选地通过如本文所述的接头(例如，基于甘氨酸/丝氨酸的接头)彼此分开，并且也可以以任一取向连接，例如其中抗cd3组分在抗taci组分的n末端，或反之亦然。
[0279]
可用于本文所述方法的示例性bite包含cd3结合结构域和taci结合结构域。这种bite可以包含抗cd3 scfv作为cd3结合结构域。所述抗cd3 scfv可以源自本领域已知的任何抗cd3抗体。
[0280]
在一些情况下，所述taci结合结构域(例如，抗体)以约5nm或更低(例如，约5nm或更低、约4nm或更低、约3nm或更低、约2nm或更低、约1nm或更低、约900pm或更低、约875pm或更低、约850pm或更低、约825pm或更低、约800pm或更低、约700pm或更低、约600pm或更低、或
约500pm或更低)的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述taci结合结构域(例如，抗体)以在约500pm与约1nm之间的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述taci结合结构域(例如，抗体)以在约700pm与约900pm之间的kd与taci结合。在一个实施方案中，所述taci结合结构域(例如，抗体)以约861pm的kd与taci结合。
[0281]
此外，所述bite可以包含源自如上所述的抗taci抗体的taci结合结构域。在一些实施方案中，所述taci结合结构域包含如下vh，其与seq id no:1具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有seq id no:1的序列。在其他实施方案中，所述taci结合结构域包含如下vl，其与seq id no:2具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90、％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有seq id no:2的序列。在某些实施方案中，所述taci结合结构域包含如下vh，其与seq id no:1具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有seq id no:1的序列；以及如下vl，其与seq id no:2具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有seq id no:2的序列。
[0282]
所述taci结合结构域可以位于所述cd3结合结构域的n末端，或者所述cd3结合结构域可以位于所述taci结合结构域的n末端。所述taci结合结构域和所述cd3结合结构域可以任选地经由接头序列(例如seq id no:3、14、15、16或17的接头序列(如下所述)以及本文描述的或本领域已知的任何其他接头)连接。
[0283]
嵌合抗原受体(car)
[0284]
本文所述的技术提供了用于在免疫疗法中使用的改善的嵌合抗原受体(car)。以下讨论了car和各种改善。
[0285]
car是指工程化t细胞受体，其将配体或抗原特异性移植到工程化为表达car的细胞(例如，t细胞、自然杀伤(nk)细胞或诱导多能干细胞(ipsc))上。car将嵌合胞外靶标结合结构域(其特异性地结合在待靶向以得到t细胞应答的细胞表面上表达的靶标，例如多肽)置于包含t细胞受体分子的跨膜结构域和一个或多个细胞内结构域的构建体上。在一个实施方案中，嵌合胞外靶标结合结构域包括抗体的一个或多个抗原结合结构域，所述抗体特异性结合在待靶向用于t细胞应答的细胞表面上表达的抗原。如本领域已知且如本文所公开，car的一个或多个细胞内信号传导结构域的特性可以变化，但是当嵌合靶标/抗原结合结构域结合所靶向细胞表面上的靶标/抗原时，一个或多个嵌合靶标/抗原结合结构域使受体对信号传导激活敏感。
[0286]
关于细胞内信号传导结构域，所谓的“第一代”car包含在抗原结合后仅提供cd3zeta(cd3ζ)信号的那些。所谓的“第二代”car包括提供共刺激(例如，cd28或cd137)和激活(cd3ζ)结构域两者的car，而所谓的“第三代”car包括提供多个共刺激(例如，cd28和cd137)结构域和激活结构域(例如，cd3ζ)的car。在各种实施方案中，选择car以对靶标/抗原具有高亲和力或亲合力-例如，与天然存在的t细胞受体相比，抗体来源的靶标或抗原结合结构域通常将对靶抗原具有更高的亲和力和/或亲合力。这种特性与可以选择抗体的高
特异性组合提供了由car t细胞进行的高特异性t细胞靶向。
[0287]
胞外靶标结合结构域
[0288]
如本文所用，术语“胞外靶标结合结构域”是指在细胞外部发现的足以促进与靶标结合的多肽。胞外靶标结合结构域将特异性地结合其结合配偶体，即靶标。作为非限制性例子，胞外靶标结合结构域可以包括识别并结合同源结合配偶体蛋白的抗体或抗体试剂或配体的抗原结合结构域。在这个背景下，配体是与蛋白质和/或受体的一部分特异性结合的分子。在本文所述的方法和组合物中有用的配体的同源结合配偶体通常可以在细胞表面上发现。配体:同源配偶体结合可以导致带有配体的受体的改变，或激活生理反应，例如激活信号传导途径。在一个实施方案中，配体可以是基因组非天然的。任选地，配体在至少两个物种上具有保守功能。
[0289]
抗体试剂
[0290]
在各种实施方案中，本文所述的car包含抗体试剂或其抗原结合结构域作为胞外靶标结合结构域。
[0291]
如本文所用，术语“抗体试剂”是指包括至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列并且特异性结合给定抗原的多肽。例如，可用于本文所述的car的抗体试剂包括上述任一种抗体。抗体试剂可以包括抗体或含有抗体的抗原结合结构域的多肽。在任何方面的一些实施方案中，抗体试剂可以包括单克隆抗体或含有单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可以包含vh和vl。在另一个例子中，抗体包含两个vh和两个vl。术语“抗体试剂”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、fab和sfab片段，f(ab')2、fd片段、fv片段、scfv、cdr和结构域抗体(dab)片段(参见例如de wildt等人,eur.j.immunol.26(3):629-639,1996；将其通过引用以其全文并入本文))以及完整抗体。抗体可以具有iga、igg、ige、igd或igm(及其亚型和组合)的结构特征。抗体可以来自任何来源，包括小鼠、兔、猪、大鼠和灵长类动物(人和非人灵长类动物)以及灵长类化抗体。抗体还包括微型抗体(midibodies)、人源化抗体，嵌合抗体等。可以使用本领域普通技术人员已知的方法，例如，从噬菌体展示文库中选择完整的人抗体结合结构域。此外，抗体试剂包括单结构域抗体，如骆驼科动物抗体。
[0292]
在一个实施方案中，car的胞外靶标结合结构域包括单链fv(scfv)片段或基本上由其组成，所述单链fv片段是通过经由柔性接头肽将抗体(通常为单克隆抗体)的vh和vl结构域融合而产生的。在各种实施方案中，scfv融合至跨膜结构域并且融合至t细胞受体细胞内信号传导结构域，例如如本文所述的工程化细胞内信号传导结构域。在另一个实施方案中，car的胞外靶标结合结构域包括单结构域(骆驼科)动物抗体。抗体结合结构域以及对其进行选择和克隆的方式是本领域普通技术人员所熟知的。
[0293]
靶标/抗原
[0294]
任何细胞表面部分均可以被car靶向。通常，靶标是可以在希望靶向用于t细胞应答的细胞上差异或优先表达的细胞表面多肽。如本文所述，为了靶向肿瘤或癌细胞，可以使抗体结构域靶向例如taci。靶向为肿瘤特有的肿瘤抗原或肿瘤相关抗原可以提供在避免或至少限制对非肿瘤细胞或组织的附带损害的同时靶向肿瘤细胞的手段。
[0295]
本文提供的car靶向taci，其是识别april、baff和caml的受体。已知许多物种的taci序列，例如人taci(ncbi基因id：23495)多肽(例如，ncbi ref seq：np_036584.1)和
harb.protoc.2011(9),2011(将其内容通过引用以其全文并入本文)所述；以及具有添加的功能性(例如表位标签或含有cre-lox重组位点的编码序列)的接头序列，如通过sblattero等人,nat.biotechnol.18(1):75-80,2000(将其内容通过引用以其全文并入本文)所述。
[0301]
在具体实施方案中，本文所述的抗taci car可以包含如下抗taci scfv，其与seq id no:3(vh-vl)或seq id no:4(vl-vh)具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有seq id no:3(vh-vl)或seq id no:4(vl-vh)的序列。
[0302]
双特异性car
[0303]
在另一个实施方案中，可用于本文所述技术的car包含含有至少两个抗原特异性靶向区的胞外靶标结合结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域。在此类实施方案中，两个或更多个抗原特异性靶向区靶向至少两种不同的抗原，并且可以串联排列并被接头序列分开。在另一个实施方案中，所述car是双特异性car。双特异性car对两种不同的抗原(例如taci和本文所述的任一种另外的靶标(例如，bcma))具有特异性。
[0304]
例如，双特异性car可以靶向taci和bcma并且包含taci结合结构域和bcma结合结构域。这种双特异性car可以包含如上所述的taci结合结构域(例如，抗taci scfv)。在一些实施方案中，所述bcma结合结构域包括抗bcma scfv。所述抗bcma scfv可以源自本领域已知的任何抗bcma抗体。所述taci结合结构域可以位于所述bcma结合结构域的n末端，或者所述bcma结合结构域可以位于所述taci结合结构域的n末端。所述taci结合结构域和所述bcma结合结构域可以任选地经由接头序列(例如seq id no:3、14、15、16或17的接头序列以及本文描述的或本领域已知的任何其他接头)连接。
[0305]
在一些实施方案中，本文所述的靶向taci和bcma的双特异性car包含与seq id no:18-25中任一个的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的靶向taci和bcma的双特异性car包含与seq id no:18-25中任一个的氨基酸序列为80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的靶向taci和bcma的双特异性car包含seq id no:18-25中任一个的氨基酸序列。
[0306]
铰链和跨膜结构域
[0307]
如本文所述的每个car包含将胞外靶标结合结构域连接至细胞内信号传导结构域的跨膜结构域，例如铰链/跨膜结构域。
[0308]
car的结合结构域后面任选地具有一个或多个“铰链结构域”，其在将抗原结合结构域远离效应细胞表面定位以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活中起作用。car任选地在结合结构域与跨膜结构域(tm)之间包括一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适用于本文所述的car的说明性铰链结构域包括源自1型膜蛋白(如cd8(例如cd8α)、cd4、cd28、4-1bb和cd7)的胞外区域的铰链区，其可能是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在一些实施方案中，铰链区源自免疫球蛋白样蛋白(例如，iga、igd、ige、igg或igm)、cd28或cd8的铰链区。在一个实施方案中，铰链结构域包括cd8α铰链区。
[0309]
如本文所用，“跨膜结构域”(tm结构域)是指car中的如下部分，所述部分任选地经
由铰链结构域将胞外结合部分与细胞内部分(例如，共刺激结构域和细胞内信号传导结构域)融合，并且将所述car锚定至免疫效应细胞的质膜上。跨膜结构域通常是car中跨越细胞质膜的疏水性区域。tm结构域可以是跨膜蛋白(例如i型跨膜蛋白或其他跨膜蛋白)的跨膜区或其片段、人工疏水序列或其组合。虽然本文提供了具体例子并用于实施例中，但是其他跨膜结构域对于本领域技术人员而言将是明显的，并且可以与本技术的替代实施方案结合使用。选择的跨膜区或其片段优选不干扰car的预期功能。如关于蛋白质或多肽的跨膜结构域所使用的，“其片段”是指跨膜结构域中足以将蛋白质锚定或附着至细胞表面的部分。
[0310]
在一些例子中，本文所述的car的跨膜结构域或其片段包括选自以下的跨膜结构域的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd11a、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、4-1bbl、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrfl)、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7r a、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crt am、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d和/或nkg2c。
[0311]
如本文所用，“铰链/跨膜结构域”是指包含铰链结构域和跨膜结构域两者的结构域。例如，铰链/跨膜结构域可以源自cd8、cd28、cd7或4-1bb的铰链/跨膜结构域。在一个实施方案中，car或其片段的铰链/跨膜结构域源自或包含cd8的铰链/跨膜结构域。
[0312]
cd8是优先在细胞毒性t淋巴细胞的细胞表面上发现的抗原。cd8介导免疫系统内的细胞-细胞相互作用，并充当t细胞共受体。cd8由α(cd8α或cd8a)和β(cd8β或cd8b)链组成。已知许多物种的cd8a序列，例如，人cd8a(ncbi基因id：925)多肽(例如，ncbi ref seq np_001139345.1)和mrna(例如，ncbi ref seq nm_000002.12)。cd8可以指人cd8，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，cd8可以指例如狗、猫、牛、马、猪等的cd8。通过本领域技术人员例如，使用ncbi直系同源物搜索功能或为给定物种搜索与参考cd8序列相似的序列的可用序列数据，容易地为此类物种鉴定人cd8的同源物和/或直系同源物。
[0313]
在一些实施方案中，所述cd8铰链和跨膜序列对应于seq id no:7的氨基酸序列；或包含seq id no:7的序列；或包含与seq id no:7的序列具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
[0314]
共刺激结构域
[0315]
本文所述的每个car任选地包括一个或多个共刺激分子的细胞内结构域，或共刺激结构域。如本文所用，术语“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除了抗原受体或fc受体之外的细胞表面分子，其在结合抗原时提供t淋巴细胞有效激活和功能所需的第二信号。共刺激结构域可以是例如4-1bb、cd27、cd28或ox40的共刺激结构域。此类共刺激分子的另外的说明性例子包括card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd150(slamf1)、cd152(ctla4)、
cd223(lag3)、cd270(hvem)、cd273(pd-l2)、cd274(pd-l1)、cd278(icos)、dap10、lat、nkd2c slp76、trim和zap70。
[0316]
在一个实施方案中，所述共刺激结构域是4-1bb的共刺激结构域。4-1bb是一种膜受体蛋白，也称为cd137，其是肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族的成员。4-1bb在激活的t淋巴细胞上表达。已知许多物种的4-1bb序列，例如，人4-1bb，也称为tnfrsf9(ncbi基因id：3604)和mrna(ncbi参考序列：nm_001561.5)。4-1bb可以指人4-1bb，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，4-1bb可以指例如狗、猫、牛、马、猪等的4-1bb。通过本领域技术人员例如，使用ncbi直系同源物搜索功能或为给定物种搜索与参考4-1bb序列相似的序列的可用序列数据，容易地为此类物种鉴定人4-1bb的同源物和/或直系同源物。
[0317]
在一些实施方案中，4-1bb的共刺激结构域对应于seq id no:8的氨基酸序列；或包含seq id no:8的序列；或包含与seq id no:8的序列具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
[0318]
细胞内信号传导结构域
[0319]
如本文所述的car包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指car多肽的一部分，所述部分参与将有效car与靶抗原结合的信息转导至免疫效应细胞内部，以引发效应细胞功能，例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括向car结合的靶细胞释放细胞毒性因子，或在抗原与胞外car结构域结合后引发的其他细胞应答。在各种例子中，细胞内信号传导结构域来自cd3ζ(参见例如，下文)。在所述技术中特别使用的含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的细胞内信号传导结构域的另外的非限制性例子包括源自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3θ、cd3δ、cd3η、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。
[0320]
cd3是t细胞共受体，其在同时参与适当的共刺激(例如，共刺激分子的结合)时促进t淋巴细胞激活。cd3复合物由4条不同的链组成；哺乳动物cd3由cd3γ链、cd3δ链和两条cd3ε链组成。这些链与称为t细胞受体(tcr)的分子和cd3ζ缔合，以在t淋巴细胞中生成激活信号。完整的tcr复合物包括tcr、cd3ζ和完整的cd3复合物。
[0321]
在任何方面的一些实施方案中，本文所述的car多肽包含细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含来自cd3 zeta(cd3ζ)(包括cd3ζ的变体，如itam突变的cd3ζ)、cd3η或cd3θ的基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam。在任何方面的一些实施方案中，所述itam包含cd3ζ的itam的三个基序(itam3)。在任何方面的一些实施方案中，cd3ζ的itam的三个基序没有突变，并且因此包括天然或野生型序列。在一些实施方案中，所述cd3ζ序列包含如本文提供的序列中所示的cd3ζ序列，例如seq id no:9的cd3ζ序列或其变体。
[0322]
例如，本文所述的car多肽包含cd3ζ的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述cd3ζ细胞内信号传导结构域对应于seq id no:9的氨基酸序列；或包含seq id no:9的序列；或包含与seq id no:9的序列具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
[0323]
如本领域技术人员可以确定的，如本文所述的单独car和其他构建体组分可以彼
此一起使用，并且可以在本文所述的各种构建体中换入和换出。这些组分中的每一个可以包含本文中所示的任何相应序列或其变体或由本文中所示的任何相应序列或其变体组成。
[0324]
car和car t细胞的更详细描述可以见于以下文献中：maus等人,blood 123:2624-2635,2014；reardon等人,neuro-oncology 16:1441-1458,2014；hoyos等人,haematologica97:1622,2012；byrd等人,j.clin.oncol.32:3039-3047,2014；maher等人,cancer res69:4559-4562,2009；和tamada等人,clin.cancer res.18:6436-6445,2012；将所述文献中的每一篇通过引用以其全文并入本文。
[0325]
在一些实施方案中，如本文所述的car多肽包含信号肽。信号肽可以源自具有胞外结构域或被分泌的任何蛋白质。如本文所述的car多肽可以包括本领域已知的任何信号肽。在一些实施方案中，所述car多肽包含cd8信号肽，例如如下cd8信号肽，其对应于seq id no:6的氨基酸序列；或包含seq id no:6的氨基酸序列；或包含与seq id no:6的序列具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
[0326]
在其他实施方案中，本文所述的car多肽可以任选地不包含本文所述的信号肽之一，例如，seq id no:6的cd8信号肽。
[0327]
在一个实施方案中，所述car还包含接头结构域。如本文所用，“接头结构域”是指长度为约2至100个氨基酸的寡肽或多肽区域，其将如本文所述的car的任何结构域/区域连接在一起。在一些实施方案中，接头可以包括柔性残基如甘氨酸和丝氨酸或由其构成，使得相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。可用于本发明的接头序列可以具有2至100个氨基酸、5至50个氨基酸、10至15个氨基酸、15至20个氨基酸或18至20个氨基酸的长度，并且包括本领域已知和/或本文所述的任何合适的接头(例如，seq id no:3、14、15、16或7的接头序列)。当期望确保两个相邻的结构域彼此之间不发生空间干扰时，可以使用更长的接头。此外，接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头的例子包括2a接头(例如，p2a和t2a)、2a样接头或其功能等同物及其组合。在各种例子中，使用具有如本文所示序列或其变体的接头。应当理解，在构建体中的特定位置中的特定接头的指示并不意指在那里仅可以使用该接头。而是，如本领域技术人员可以确定的，不同的接头序列(例如，p2a和t2a)可以彼此交换(例如，在本发明的构建体的情境下)。在一个实施方案中，所述接头区是源自明脉扁刺蛾β四体病毒(thosea asigna virus)的t2a。可以在该技术中使用的接头的非限制性例子包括t2a、p2a、e2a、bmcpv2a和bmifv2a。
[0328]
在一些实施方案中，如本文所述的car任选地进一步包含报告分子，例如以允许非侵入性成像(例如，正电子发射断层摄影pet扫描)。在包括报告分子的双特异性car中，第一胞外结合结构域和第二胞外结合结构域可以包括不同或相同的报告分子。在双特异性car t细胞中，第一car和第二car可以表达不同或相同的报告分子。在另一个实施方案中，如本文所述的car进一步包括可单独成像或与底物或化学物质(例如9-[4-[
18
f]氟-3-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤([
18
f]fhbg))组合成像的报吿分子(例如潮霉素磷酸转移酶(hph))。在另一个实施方案中，如本文所述的car进一步包括可以使用非侵入性技术容易地成像的纳米颗粒(例如，用
64
cu
2
功能化的金纳米颗粒(gnp))。用于非侵入性成像的car t细胞的标记综述于例如以下文献中：bhatnagar等人,integr.biol.(camb).5(1):231-238,2013，和keu等人,sci.transl.med.18；9(373),2017，将所述文献通过引用以其全文并入本文。
[0329]
gfp和mcherry在本文中显示为可用于对在t细胞(例如，car t细胞)上表达的car进行成像的荧光标签。预期基本上本领域已知的任何荧光蛋白都可以用作用于该目的的荧光标签。对于临床应用，car不需要包括荧光标签或荧光蛋白。因此，在本文提供的特定构建体的每种情况下，可以除去存在于构建体中的任何标记。本发明包括具有或不具有标记的构建体。因此，当本文提及特定构建体时，可以认为具有或不具有任何标记物或标签都包括在本发明内。
[0330]
在一些实施方案中，所述car多肽序列对应于、包含或包含与seq id no:10、11、12或13的序列具有至少80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列，任选地不包含如本文所述的cd8信号肽。如本领域技术人员可以确定的，这些car的各种功能相似或等效的组分可以彼此交换或取代，以及与本领域已知或本文列出的其他相似或功能等效组分交换或取代。
[0331]
编码car的核酸
[0332]
在一些实施方案中，本文所述的任何car多肽(例如，seq id no:10、11、12或13的car多肽)由病毒载体中包含的多核苷酸编码。任选地，可以将编码如本文所述的car多肽的多核苷酸进行密码子优化以增强表达或稳定性。可以根据本领域已知的任何标准方法来进行密码子优化。在一些实施方案中，所述car的表达可以由组成型表达的启动子(例如，ef1α启动子)或诱导型表达的启动子(例如，nfat反应元件)驱动。
[0333]
此外，本发明的多核苷酸可以包括自杀基因的表达。这样做可以促进所施用细胞的外部药物介导的控制。例如，通过使用自杀基因，在例如不良事件的情况下，可以从患者耗尽经修饰的细胞。在一个例子中，将fk506结合结构域与半胱天冬酶9促凋亡分子融合。使以此方式工程化的t细胞对免疫抑制药物他克莫司敏感。自杀基因的其他例子是胸苷激酶(tk)、cd20、胸苷酸激酶、截短的前列腺特异膜抗原(psma)、截短的低亲和力神经生长因子受体(lngfr)、截短的cd19和经修饰的fas，它们可以通过施用特定分子(例如，更昔洛韦对tk 细胞)或抗体或抗体-药物缀合物来触发条件性消融。
[0334]
逆转录病毒(如慢病毒)提供了便利的平台用于递送编码目的基因或嵌合基因的核酸序列。可以使用本领域已知的技术将所选择的核酸序列插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其例如在体外或离体地递送到细胞中。逆转录病毒系统是本领域熟知的，并且在例如以下文献中有描述：美国专利号5,219,740；kurth和bannert(2010)“retroviruses:molecular biology,genomics and pathogenesis”calster academic press(isbn:978-1-90455-55-4)；以及hu和pathak pharmacological reviews 2000 52:493-512；将所述文献通过引用以其整体并入本文。用于有效dna递送的慢病毒系统可以从马里兰州罗克维尔的origene购买。在替代实施方案中，本文所述的任何car的car多肽经由转染或电穿孔包含编码car的核酸的表达载体而在哺乳动物细胞中表达。转染或电穿孔方法是本领域已知的。
[0335]
可以使用检测编码car的核酸的mrna、dna或基因产物的标准测定(诸如rt-pcr、facs、rna印迹、蛋白质印迹、elisa或免疫组织化学)来评估本文所述的任何car多肽的car多肽的高效表达。在一些实施方案中，本文所述的任何car多肽的car多肽由重组核酸序列编码。
[0336]
细胞
[0337]
本发明的另一个方面涉及一种哺乳动物细胞，其包含本文所述的任何car多肽；或编码本文所述的任何car多肽的核酸。在一个实施方案中，哺乳动物细胞包含抗体、抗体试剂、其抗原结合部分、或本文所述的任何car多肽；或者编码这样的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分、或本文所述的任何car多肽的核酸。哺乳动物细胞或组织可以是人、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫源的，但是可以使用任何其他哺乳动物细胞。在任何方面的优选实施方案中，所述哺乳动物细胞是人的。
[0338]
在一个例子中，所述哺乳动物细胞是诱导多能干细胞(ipsc)，例如，如由takahashi k和yamanaka s,"induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors,"cell.126(4):663
–
76(2006)所述，将其通过引用以其整体并入本文。在其他实施方案中，所述细胞是免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫反应中起作用的细胞。免疫细胞是造血起源的，并且包括淋巴细胞，诸如b细胞和t细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是t细胞；nk细胞；nkt细胞；淋巴细胞，如b细胞和t细胞；和髓样细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一个实施方案中，所述细胞是t细胞或自然杀伤(nk)细胞。
[0339]
所述哺乳动物细胞(例如，ipsc或免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞))可以从患有或被诊断为患有癌症、浆细胞疾病或障碍、或自身免疫疾病或障碍的受试者获得。例如，所述哺乳动物细胞(例如，ipsc或免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞))可以从患有癌症(例如，多发性骨髓瘤、郁积型骨髓瘤或华氏巨球蛋白血症)的受试者获得。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞(例如，ipsc或免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞))是从对抗bcma疗法具有抗性的受试者获得。细胞还可以从同种异体供体获得，所述供体是与所述细胞的预期接受者是同一物种的非基因相同的个体。
[0340]
可以在本发明中使用的哺乳动物细胞(例如，ipsc或免疫细胞(例如，t或nk细胞))包括自体细胞，所述自体细胞是在离体修饰和扩增后从随后将被施用所述细胞的受试者获得的。例如，所述哺乳动物细胞(例如，ipsc或免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞))可以从患有或被诊断为患有癌症、浆细胞疾病或障碍、或自身免疫疾病或障碍的个体获得。哺乳动物细胞(例如，ipsc或免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞))还可以从同种异体供体获得，所述供体是与所述细胞的预期接受者是同一物种的非基因相同的个体。可用于本发明的哺乳动物细胞包括但不限于ipsc和免疫细胞(例如，t或nk细胞)。
[0341]
用于获得t细胞和nk的方法是本领域已知的，并且可用于本文所述的工程化免疫细胞。t细胞和nk细胞通常获自外周血，所述外周血是通过例如，静脉穿刺或者通过植入端口或导管撤回而从受试者收集的。任选地，可以通过包括白细胞单采术的方法获得血液，其中白细胞获自受试者的血液，而其他血液组分返回至受试者。使用本领域已知的方法处理血液或白细胞单采术产物(新鲜或冷冻保存的)以富集t细胞或nk细胞。例如，可以进行密度梯度离心(使用例如ficoll)和/或逆流离心淘析来富集单核细胞(包括t细胞或nk细胞)。在一个例子中，对于t细胞，可以进一步进行采用例如涂覆在磁珠上的cd3/cd28抗体或表达例如细胞表面结合的抗cd3和抗cd28抗体片段的人工抗原呈递细胞(aapc)(参见下文)的t细
胞刺激步骤，以便刺激t细胞并耗尽其他细胞(例如，b细胞)。然后可以对富集的t细胞制剂的t细胞进行基因修饰。
[0342]
作为外周血的替代物，可以将包括骨髓、淋巴结、脾脏和肿瘤在内的组织用作t细胞和nk细胞的来源。t细胞和nk细胞可以是人、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫源的，但是可以使用任何其他哺乳动物细胞。在任何方面的某些实施方案中，所述t或nk细胞是人的。
[0343]
哺乳动物细胞(例如，ipsc或免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞))可以被工程化为包含本文所述的任何car多肽(例如，seq id no:10、11、12或13的car多肽)；或编码本文所述的任何car多肽的核酸(例如，编码seq id no:10、11、12或13的car多肽的核酸)。
[0344]
此外，本发明提供了治疗和预防疾病和病症的组合物和方法，所述疾病和病症包括例如癌症、自身免疫疾病或障碍、或浆细胞疾病或障碍。这些方法包括使用哺乳动物细胞(例如，ipsc或免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞))包括如本文所述的car多肽或编码所述car的核酸的免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞)，以及向受试者施用经修饰的哺乳动物细胞以治疗例如癌症。在任何所述方面的一些实施方案中，经修饰的哺乳动物细胞(例如，ipsc或免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞)，其包含如本文所述的一个或多个另外的修饰)在施用至受试者之前被刺激和/或激活。
[0345]
治疗方法
[0346]
本文所述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car可以用于治疗受试者的疾病或障碍，例如癌症、自身免疫障碍或浆细胞疾病或障碍。
[0347]
如本文所用的术语“癌症”是指细胞的过度增殖，所述细胞的独特性状(正常细胞控制的丧失)导致生长失调、缺乏分化、局部组织浸润和转移。如本文所用，术语“肿瘤”是指例如恶性类型或良性类型的细胞或组织的异常生长。癌症的例子包括但不限于胶质母细胞瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或实体瘤，例如肺癌和胰腺癌。白血病的非限制性例子包括急性髓性白血病(aml)、慢性髓性白血病(cml)、急性淋巴细胞性白血病(all)和慢性淋巴细胞性白血病(cll)。在一个实施方案中，癌症是all或cll。淋巴瘤的非限制性例子包括弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、毛细胞白血病(hcl)和t细胞淋巴瘤(例如，外周t细胞淋巴瘤(ptcl)，包括皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)和间变性大细胞淋巴瘤(alcl))。在一个实施方案中，癌症是dlbcl或滤泡性淋巴瘤。实体瘤的非限制性例子包括肾上腺皮质瘤、腺泡状软组织肉瘤、癌、软骨肉瘤、结直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦瘤、上皮样血管内皮瘤、尤文肉瘤、生殖细胞肿瘤(实体瘤)、骨和软组织巨细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、肾瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(nrsts)、骨肉瘤、椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和肾母细胞瘤。实体瘤可以发现于骨、肌肉或器官中，并且可以是肉瘤或癌。
[0348]
如本文所用，“自身免疫疾病或障碍”的特征在于患者的免疫系统无法区分外来细胞与健康细胞。这会导致患者的免疫系统靶向其健康细胞，造成程序性细胞死亡。自身免疫疾病或障碍的非限制性例子包括炎性关节炎、1型糖尿病、多发性硬化症、银屑病、炎性肠病、sle和血管炎、过敏性炎症，如过敏性哮喘、特应性皮炎和接触性超敏反应。自身免疫疾病或障碍的其他例子包括但不限于移植排斥反应、移植物抗宿主病、血友病合并因子抑制
剂、类风湿性关节炎、多发性硬化症(ms)、系统性红斑狼疮、格雷夫斯病(甲状腺功能亢进)、桥本甲状腺炎(甲状腺活动不足)、乳糜泻、克罗恩病和溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征、原发性胆汁性硬化/肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、雷诺现象、硬皮病、舍格伦综合征、古德帕斯综合征、韦格纳肉芽肿病、风湿性多肌痛、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、慢性疲劳综合症(cfs)、银屑病、自身免疫性艾迪生氏病、强直性脊柱炎、急性播散性脑脊髓炎、抗磷脂抗体综合症、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、眼阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎、ord's甲状腺炎、天疱疮、恶性贫血、犬多发性关节炎、赖特综合征、多发性大动脉炎、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿病和纤维肌痛(fm)。
[0349]
浆细胞是由b淋巴细胞产生的白细胞，其功能是生成和释放抵抗感染所需的抗体。如本文所用，“浆细胞疾病或障碍”的特征在于浆细胞的异常增殖。异常浆细胞能够“挤出”健康浆细胞，这导致降低了抵抗异物(如病毒或细菌细胞)的能力。浆细胞疾病或障碍的非限制性例子包括浆细胞增生症、浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链疾病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病和郁积型多发性骨髓瘤。
[0350]
可通过本文描述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car治疗的示例性癌症包括包含表达taci的细胞的癌症，例如多发性骨髓瘤。可通过本文描述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car治疗的示例性自身免疫疾病包括特征在于促成自身免疫障碍的抗体的高滴度的自身免疫疾病。例如，所述自身免疫疾病可以是移植排斥反应、移植物抗宿主病或血友病合并因子抑制剂。可通过本文描述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car治疗的浆细胞疾病或障碍包括浆细胞增生症、浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链疾病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病和郁积型多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，所述受试者对抗bcma疗法具有抗性。
[0351]
施用
[0352]
在一些实施方案中，本文所述的方法涉及用包含本文描述的任何抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car的哺乳动物细胞治疗患有或被诊断为患有癌症、浆细胞疾病或障碍或者自身免疫疾病或障碍的受试者。例如，本文描述的抗taci car包括哺乳动物细胞，其包含本文描述的任何抗taci car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)或编码本文描述的任何抗taci car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)的核酸。患有癌症、浆细胞疾病或障碍、或自身免疫疾病或障碍的受试者可以由医师使用当前诊断病症的方法来鉴定。作为这些病症的特征并帮助诊断的病症症状和/或并发症是本领域熟知的，并且包括但不限于疲劳、持续性感染和持续性出血。可以帮助诊断例如病症的测试包括但不限于血液筛查和骨髓测试，并且对于给定病症是本领域已知的。病症的家族病史或对病症的风险因素的暴露也可以帮助确定受试者是否可能患有所述病症或帮助进行所述病症的诊断。
[0353]
可以将本文所述的组合物施用至患有或被诊断为患有病症的受试者。在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者施用有效量的本文所述的激活car t细胞，以减轻病症的症状。如本文所用，“减轻病症的症状”是改善任何病症或与病症相关的症状。与等同的未治疗对照相比，如通过任何标准技术所测量，这种减少为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。向受试者施用本文所述的组合物的多种方式是
car作为单一疗法施用，即，不将用于病症的另一种治疗并行施用至受试者。
[0361]
作为一般的主张，施用至人的治疗有效量的抗-taci抗体、抗体-药物缀合物和/或bite将在约0.01至约100mg/kg患者体重的范围内，无论是通过一次还是多次施用。在一些实施方案中，使用的抗体为约0.01至约45mg/kg、约0.01至约40mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.01至约30mg/kg、约0.01至约25mg/kg、约0.01至约20mg/kg、约0.01至约15mg/kg、约0.01至约10mg/kg、约0.1至约10mg/kg或约1至约10mg/kg，一次(单次施用)或多次(多次施用，例如，每日施用)施用。在一个例子中，使用的抗体为约10mg/kg，优选口服施用。在一个实施方案中，将本文描述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物和/或bite在21天周期的第1天以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg或约1400mg的平剂量施用至人。所述剂量可以作为单个剂量或多个剂量(例如，2或3剂)施用，如输注。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，通常持续治疗直至出现所需疾病症状抑制。所述抗体的一个示例性剂量将在约0.01mg/kg至约10mg/kg的范围内。此类剂量可以例如每周或每三周间歇地施用(例如，使得患者接受约二至约二十或例如约六个剂量的所述抗taci抗体、抗体-药物缀合物和/或bite)。可以施用初始较高负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。通过常规技术和测定可以容易地监测此疗法的进展。
[0362]
在另一方面，包含含有本文描述的抗taci car的哺乳动物细胞的药物组合物通常可以以104至109个细胞/kg体重，在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括在那些范围内的所有整数值)的剂量施用。如果需要的话，所述细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如rosenberg等人,new eng.j.med.319:1676,1988)。在一些情况下，可能期望将激活car t细胞施用至受试者，然后随后重新抽取血液(或进行单采术)，如本文所述激活来自所述血液的t细胞，并向患者重新输注这些激活和扩增的t细胞。此过程可以每几周进行多次。在某些方面，可以从10cc至400cc的血液抽取物激活t细胞。在某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取物激活t细胞。施用方式可以包括例如静脉内(i.v.)注射或输注。本文所述的组合物可以经动脉、肿瘤内、结节内或髓内施用至患者。在一些实施方案中，可以将t细胞的组合物直接注射至肿瘤、淋巴结或感染位点中。在一个实施方案中，将本文所述的组合物施用到体腔或体液(例如，腹水、胸膜液、腹膜液或脑脊液)中。
[0363]
在特定的示例性方面，受试者可以经历白细胞单采术，其中白细胞被离体收集、富集或耗尽以选择和/或分离目的细胞，例如t细胞。这些t细胞分离物可以通过与人工apc(例如，表达抗cd28和抗cd3 cdr的aapc)接触而扩增，并且经过处理使得可以引入本技术的一种或多种car构建体，从而产生car t细胞。有需要的受试者可以随后经历高剂量化学疗法的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在移植之后或与之并行，受试者可以接受扩增的car t细胞的输注。在一个实施方案中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。
[0364]
在一些实施方案中，在施用如本文所述的一种或多种car t细胞之前，对受试者进行淋巴细胞清除。在此类实施方案中，淋巴细胞清除可以包括施用美法仑、环磷酰胺(cytoxan)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和氟达拉滨中的一种或多种。
[0365]
待施用至患者的上述治疗的剂量将随所治疗病症的确切性质和治疗接受者而变化。可以根据本领域公认的实践针对人类施用进行剂量的缩放。
[0366]
在一些实施方案中，需要单一治疗方案。在其他情况下，可以进行一种或多种后续剂量或治疗方案的施用。例如，在每两周治疗三个月之后，可以每月重复一次治疗，持续六个月或一年或更长时间。在一些实施方案中，在初始治疗后不施用另外的治疗。
[0367]
如本文所述的组合物的剂量可以由医师确定，并且根据需要加以调整以适应观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者以确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否药施用进一步的细胞、停止治疗、恢复治疗或对治疗方案做出其他改变。剂量不应大到引起不良副作用，如细胞因子释放综合征。通常，剂量将随患者的年龄、病症和性别而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在有任何并发症的情况下，所述剂量也可以由个体医师调整。
[0368]
组合疗法
[0369]
如本领域技术人员可以确定为适当的，本文描述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car可以任选地彼此以及与其他已知的药剂和疗法组合使用。在一个例子中，可以组合施用两种或更多种不同类型的靶向不同癌症抗原(例如，taci和bcma)的car。
[0370]
如本文所用，“组合”施用意指在受试者患有障碍的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，所述两种或更多种治疗在受试者被诊断患有所述障碍后且在所述障碍被治愈或消除或治疗因其他原因停止前被递送。在一些实施方案中，当开始第二种治疗的递送时，一种治疗的递送仍在进行，使得在给药方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方案中，由于组合施用，所述治疗更有效。例如，与在没有第一种治疗的情况下施用第二种治疗相比，第二种治疗更有效，例如，用较少的第二种治疗观察到等同的效果，或者第二种治疗在更大程度上减轻症状，或者用第一种治疗观察到类似的情况。在一些实施方案中，递送使得症状或与障碍相关的其他参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减少。两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得当递送第二种治疗时，所递送的第一种治疗的效果仍然是可检测的。本文描述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car以及所述至少一种另外的治疗剂可以同时、以相同或分开的组合物或依序施用。对于依序施用，可以首先施用本文描述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car，然后可以施用另外的药剂，或者可以反转施用顺序。所述抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car疗法和/或其他治疗剂、程序或方式可以在活动障碍期间，或在缓解期或活动较少的疾病期间施用。所述抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car疗法可以在另一种治疗之前、与所述治疗并行、在治疗后或在障碍缓解期间施用。
[0371]
当组合施用时，所述抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car疗法以及另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部，可以以高于、低于或等于单独使用的每种药剂(例如作为单一疗法)的量或剂量的量或剂量施用。在某些实施方案中，所施用的激活car t细胞、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的量或剂量比单独使用的每种药剂的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施例中，得到所需效果(例如，癌症治疗)的激活car t细胞、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的量或剂量比实现相同治疗效果单独需要的每种药剂的量或剂量低(例如，低至少20％、至少
30％、至少40％或至少50％)。在进一步的实施方案中，在治疗方案中本文所述的激活car t细胞可以与手术、化学疗法、辐射、mtor途径抑制剂、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和fk506)、抗体、或其他免疫清除剂(如campath)、抗cd3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228、细胞因子或肽疫苗(如izumoto等人,j.neurosurg.108:963-971,2008中描述的那些)组合使用。
[0372]
在一个例子中，本文描述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car可以与检查点抑制剂组合使用。示例性检查点抑制剂包括抗pd-1抑制剂、抗ctla4抑制剂、抗pdl1抑制剂和抗tim3抑制剂。
[0373]
在另一个实施方案中，本文描述的抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car可以与化疗剂组合使用。
[0374]
功效
[0375]
所述抗taci抗体、抗体-药物缀合物、bite和/或抗taci car在例如治疗本文所述病症或诱导如本文所述反应(例如癌细胞减少)方面的功效可以由熟练的临床医生确定。然而，如果在根据本文所述的方法治疗后，本文所述病症的一种或多种体征或症状以有益方式改变，其他临床上可接受的症状得到改善或甚至减轻，或者所需反应被诱导，例如程度为至少10％，则治疗被视为“有效治疗”(在所述术语用于本文中时)。例如，可以通过测量根据本文所述方法治疗的病症的标记、指标、症状和/或发病率或任何其他适当的可测量参数来评估功效。根据本文所述方法的治疗可以使病症的标记或症状的水平降低例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
[0376]
功效还可以通过如住院治疗或需要医疗干预(即停止疾病进展)所评估的个体恶化的失败来衡量。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。
[0377]
治疗包括对个体或动物(一些非限制性例子包括人或动物)的疾病进行的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如，预防症状(例如，疼痛或炎症)的恶化；或(2)减轻疾病的严重程度，例如引起症状的消退。治疗疾病的有效量意指当施用有需要的受试者时足以导致对所述疾病有效治疗的量，如所述术语在本文中所定义。药剂的功效可以通过评估病症或所希望反应的物理指标来确定。通过测量此类参数中的任一个或参数的任何组合来监测给药和/或治疗的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。可以在本文所述病症的动物模型中评估给定方法的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标记的统计学上显著的改变时证明治疗的功效。
[0378]
整个本技术中引用的所有专利和其他出版物；包括参考文献、已授权的专利、已公布的专利申请和共同未决的专利申请均出于描述和公开的目的通过引用明确地并入本文，例如，在此类出版物中描述的方法可以与本文所述的技术结合使用。提供这些出版物仅仅是因为它们在本技术的提交日期之前披露。就此而言，任何内容都不应被解释为承认诸位发明人由于先前技术或任何其他原因而无权先于此披露。关于日期的所有陈述或关于这些文件内容的表述均基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
[0379]
本公开文本的实施方案的描述并不旨在穷举或将本公开文本限制为所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开文本的具体实施方案和实施例，但如相关
领域的技术人员将认识到的，在本公开文本的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但替代实施方案可以以不同的顺序执行功能，或者功能可以基本上并行执行。本文提供的本公开本文的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文所述的各种实施方案可以组合以提供另外的实施方案。如果需要，可以修改本公开文本的各方面以采用以上参考文献和申请的组成、功能和概念来提供本公开本文的又另一个实施方案。此外，由于对生物学功能的等效性考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或量的情况下对蛋白质结构进行一些改变。根据详细说明，可以对公开文本作出这些和其他改变。所有此类修改均旨在被包括在所附权利要求的范围内。
[0380]
任何前述实施方案的特定要素均可以被组合或取代其他实施方案中的要素。此外，虽然与本公开文本某些实施方案相关的优点已在这些实施方案的上下文中被描述，但其他实施方案也可以表现出此类优点，并且并非所有实施方案都需要展现出此类优点以落入本公开文本的范围内。
[0381]
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，所述实施例决不应被解释为进一步限制。
[0382]
实施例
[0383]
以下是有用的方法和组合物的实施例。应当理解，根据本文提供的描述可以实施各种其他实施方案。
[0384]
实施例1.抗taci抗体的产生
[0385]
产生了与跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(taci)特异性结合的单克隆抗体(mab)。
[0386]
首先，通过将骨髓瘤细胞与b细胞融合来产生mab产生细胞(即杂交瘤)。细胞融合后，根据抗原特异性和免疫球蛋白类别筛选并选择大量克隆。鉴定出候选杂交瘤细胞系后，对抗体进行验证，并使用若干个下游功能测定对其进行表征(图1)。对mab进行测序，并使用可变重链(vh)和可变轻链(vl)产生第二代嵌合抗原受体。
[0387]
根据以下程序通过表面等离子体共振分析抗体(图2)。将his标记的重组taci与抗taci抗体的结合在抗小鼠igg上捕获至120ru(对于taci)。
[0388]
捕获：使抗体在运行缓冲液中达到1mg/ml并捕获在抗小鼠igg表面(cm5芯片，根据制造商的说明书通过标准胺定向化学固定化的10,000ru抗igg抗体，ge healthcare，目录号br-1008-38)以达到130ru以供taci分析。
[0389]
运行缓冲液：pbs-p(10mm磷酸钠、150mm nacl、0.005％tween 20，ph 7.4)。
[0390]
再生缓冲液：10mm甘氨酸，ph 2.1
[0391]
流速和注射方案：流速：50ml/min，2min接触时间，5min解离
[0392]
测定的结果示于图2。结果：ka(缔合速率常数)＝1.407x 10
6 1/ms，kd(解离速率常数)＝0.00121 1/s，kd(平衡解离常数)＝8.61x 10-10
m，rmax(最大结合(拟合))＝31.28ru以及chi2＝0.943ru2。ru：共振单位。
[0393]
实施例2.抗taci嵌合抗原受体(car)的设计
[0394]
如图3所示设计第二代嵌合抗原受体(car)。产生了两种抗taci car构建体，一种在抗taci单链可变片段(scfv)的vl的n末端具有vh(抗taci(h/l))，并且另一种在抗taci scfv的vh的n末端具有vl(抗taci(l/h))。car中包含的vh和vl序列源自实施例1中描述的抗
taci抗体。每个car还包含cd8铰链/跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域和cd3ζ细胞内信号传导结构域。根据标准方法在t细胞中表达car(参见实施例3及后续部分)。
[0395]
为了测试抗taci抗体对免疫细胞的潜在影响，将外周血单个核细胞(pbmc)与抗taci抗体一起孵育，并通过流式细胞术测量结合。结果证明抗taci抗体不结合分离的t细胞(静息或激活的)或各种其他pbmc(图23)。过表达taci的k562用作阳性对照。
[0396]
为了评价抗taci car的表达、结合功效和结合特异性，将正常供体t细胞用抗taci h-l、抗taci l-h或抗bcma转导，并通过由流式细胞术测量对于mcherry表达呈阳性的每个t细胞群的百分比来评价转导效率。结果证明两种抗taci car构建体的转导效率都很高并且类似于抗bcma car(图24)。为了比较不同car的结合效率和特异性，将表达每种car构建体的t细胞与荧光标记的可溶性taci一起孵育，并通过流式细胞术进行分析。结果证明，抗taci l-h car对可溶性taci的结合亲和力高于抗taci h-l car，并且抗bcma car显示不与可溶性taci蛋白结合(图25a和图25b)。
[0397]
为了进一步评价抗taci car对taci的特异性，产生了表达cas9的mm1s癌细胞。产生了表达taci的细胞或经由cas9敲除而缺乏taci的细胞。图27a显示taci的cas9敲除是成功的。将mm1s cas9和mm1s cas9 taci敲除(ko)细胞与未转导或用抗taci h-l、抗taci l-h或抗bcma转导的t细胞一起孵育，并测量细胞毒性。结果证明，抗taci car对taci具有特异性，并且表达其的t细胞对taci ko细胞具有很小的功效，只有阳性对照抗bcma car t细胞对taci ko细胞具有显著的细胞毒性(图27b)。
[0398]
实施例3.bcma和taci抗原表达
[0399]
在本文所述的实验中使用多发性骨髓瘤细胞系mm1s。mm1s表达taci和b细胞成熟抗原(bcma)二者。产生了bcma敲除mm1s细胞系以及表达taci的k562细胞系和表达bcma的k562细胞系(图4)。
[0400]
由于taci在激活的t细胞中表达，因此评价了静息car t细胞或激活的car t细胞(用珠激活)是否表达taci或上调taci的表达。如图5所示，在静息细胞上有一些表达，但当car t细胞被激活时变化非常小。
[0401]
实施例4.抗taci car t细胞的转染效率和杀伤活性
[0402]
抗taci car t细胞的转染效率通过mcherry阳性细胞的定量来测量，因为car t细胞已被工程化为表达mcherry(参见图3)。如图6所示，抗bcma-bbz car的转染效率与两种taci car的转染效率非常相似。目标感染复数(moi)＝10。
[0403]
进行杀伤测定以评价抗taci(h/l)和(l/h)car t细胞与抗bcma car和未转导的(utd)t细胞相比的活性。测定的结果示于图7。将car t细胞与靶细胞以图7所示的不同的效应物:靶标(e:t)比率孵育过夜。使用的靶细胞是表达bcma和taci二者的mm1s细胞。结果证明，抗bcma car和抗taci car t细胞二者都是出色的杀手。在低e:t比率下，抗taci(l/h)car t细胞显现出更有效。
[0404]
使用实施例3中产生的mm1s bcma敲除细胞系作为靶细胞用如上所述的抗bcma car、抗taci(h/l)car、抗taci(l/h)car以及utd t细胞进行类似的杀伤测定。观察到抗bcma car t细胞无法杀伤mm1s bcma敲除细胞系，而两种抗taci car t细胞都特异性地识别taci，从而杀伤靶标(图8)。
[0405]
实施例5.car t细胞的免疫表型分析
[0406]
图9显示了针对cd45ro和ccr7进行标记的t细胞，其允许表征4个不同的功能群体：幼稚、中央记忆(cm)、效应记忆(em)和晚期效应(emra)t细胞。正如通常使用第二代4-1bb car观察到的那样，富集了t细胞的cm群。当将抗bcma car与两种抗taci car进行比较时，观察到类似的结果。
[0407]
先前描述的对免疫系统中的长期记忆而言重要的群体是t干细胞记忆(tscm)群，其由来自图9中所示的幼稚群(cd45-ccr7 )的特定标记物定义。tscm群特有的标记物是cd95和cd127。图10显示抗taci car t细胞具有tscm群。
[0408]
实施例6.car t细胞的脱粒和特异性结合
[0409]
将bcma和taci car t细胞用抗cd107a抗体(添加了蛋白质转运蛋白抑制剂)染色并单独放置(阴性对照：-cl)，与不同靶标共同孵育，或用pma/离子霉素激活(阳性对照： cl)6小时。进行流式细胞术并对活的car t细胞设门以评价cd107a(一种细胞毒性脱粒的标记物)的表达。结果示于图11。观察到特异性地响应于taci 靶标的抗taci car t细胞脱粒，而对于bcma /taci-靶标则没有。
[0410]
评价了抗bcma、抗taci(h/l)和抗taci(l/h)car t细胞与可溶性taci(staci)、可溶性bcma(sbcma)和可溶性april(sapril)结合的能力。将t细胞在pbs 4％bsa中洗涤4次，并与标记的蛋白质一起在冰上在4℃下孵育40min。孵育后，将细胞用facs缓冲液洗涤两次，并在对活的car t细胞设门的情况下进行流式细胞术以计算蛋白质结合。结果示于图12a-图12c。如图12a所示，抗taci(l/h)car t细胞与可溶性taci的结合效率高于抗taci(h/l)car t细胞。在图12b中，显示出两种抗taci car t细胞与bcma的结合均可忽略不计。最后，图12c显示抗bcma和两种抗taci car t细胞对可溶性april具有相似的结合效率。
[0411]
实施例7.抗taci car t细胞的细胞因子产生和长期增殖
[0412]
通过将car t细胞与指定靶标(mm1s或mm1s bcma基因敲除细胞系)一起孵育来评价抗bcma和两种抗taci car t细胞的细胞因子产生。将未转导的细胞用作对照。细胞因子产生的水平示于图13a和图13b。显示出抗taci car t细胞响应于mm1s和mm1s bcma基因敲除细胞而产生细胞因子。类似地，评价了抗bcma和两种抗taci car t细胞的细胞因子产生，这次使用k562-taci和k562-bcma细胞系作为靶标(图13c和图13d)。两种抗taci car t细胞响应于表达taci的靶标而产生的细胞因子比它们响应于表达bcma的靶标而产生的细胞因子更多。最后，用另一种多发性骨髓瘤细胞系u266细胞评价car t细胞的细胞因子产生。结果示于图13e。
[0413]
此外，已经证明，当用k562靶细胞刺激时，抗taci car t细胞可以在体外经历长期增殖。在箭头所示的日子刺激car t细胞，car t细胞的群体倍增数示于图14。
[0414]
实施例8.体内抗taci car t细胞
[0415]
使用抗taci car t细胞的体内实验的实验设计示于图15。将一百万个mm1s细胞静脉内(i.v.)注射至小鼠中。2周后，向小鼠注射200万个car t细胞或utd细胞。每周拍摄两次图像并将生物发光定量。生物发光图像示于图16a和图16b。在图17中，生物发光通过光子/秒进行定量，并针对所使用的每种car t细胞呈现在四张图中。
[0416]
如图18所示，抗taci(l/h)car t细胞在治疗bcma /taci 多发性骨髓瘤方面与抗bcma car t细胞一样有效。图19显示了抗taci car t细胞治愈taci 多发性骨髓瘤的能力。
[0417]
使用抗taci car t细胞的另外的体内实验的设计示于图26a。将5x 106个
rpmi8226细胞皮下植入小鼠中。2周后，向小鼠静脉内注射2x 106个car t细胞或未转导的细胞，或者不对小鼠进行处理。在car t处理后4、7、10和14天，通过卡尺测量肿瘤体积。单独肿瘤生长曲线示于图26b、图26c、图26d、图26e和图26f。图26g显示了来自每个处理组的小鼠的存活。结果证明，抗taci car t细胞在皮下肿瘤生长模型中在体内既有效地抑制了肿瘤生长又延长了存活期，并且表明l-h构建体可能比h-l构建体更有效。图26h进一步显示了抗taci l-h car t细胞在第21天血液中显示出扩增。抗bcma car t细胞充当阳性对照，并且未转导的和仅肿瘤的组充当阴性对照。
[0418]
实施例9.用car t细胞疗法克服血液恶性肿瘤中的抗原丢失
[0419]
目前，除car19(靶向cd19的car)外，car t细胞疗法最有希望的候选物之一是用靶向b细胞成熟抗原(bcma)(tnf受体超家族的成员)的car t细胞治疗多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤占所有血液恶性肿瘤的13％，并且对于新疗法的临床需求未得到满足。目前临床上bcma car的报告具有11.8个月的中位无进展存活期，这表明仅靶向bcma可能是不够的。与car19治疗和cd19阴性复发所观察到的情况类似，有证据表明用bcma靶向疗法治疗的患者可能会受到bcma阴性复发的阻碍。在cd19 恶性肿瘤中，已有许多方法用于克服cd19阴性恶性肿瘤，所述方法包括靶向两种抗原(如cd19和cd20或者cd19和cd22)的串联car t细胞。在多发性骨髓瘤中，除bcma以外的可能的靶标是跨膜激活物和caml相互作用物(taci)。与bcma一样，taci也是tnf受体超家族的成员并且为浆细胞提供存活信号。该抗原已被使用其天然配体(增殖诱导配体(april))的car t细胞靶向，所述配体也识别bcma。目前还没有已公布的仅靶向taci的car t细胞。迄今为止，尚未对基于scfv的双靶向car t细胞与天然配体设计进行直接比较。
[0420]
通过免疫小鼠并从所得杂交瘤构建抗taci car在本公开文本中设计并提供了一种靶向taci的新型car t细胞。基于可变重链和可变轻链的取向，存在两种形式的抗taci car(图20a)。抗taci car在体外针对对于bcma和taci二者呈阳性的多发性骨髓瘤系mmls和rpml-8226具有功能性，并且针对taci低骨髓瘤系u266具有低得多的活性(图20b-图20c)。在多发性骨髓瘤的转基因模型中，scfv的l-h取向治愈得更快，并且在体外l-h car更有效地结合可溶性taci(图20d-图20e)。
[0421]
尽管抗taci car在taci抗原的存在下具有功能性，但它们在抗原丢失时失去功效，这类似于bcma car(图21d-图21e)。为了克服抗原的潜在丢失(这是car19失败的根源)，设计了串联双特异性car t细胞，其使用抗taci scfv(vh-vl配置)靶向bcma和taci二者。经修饰的双靶向bcma和taci car也是基于它们的天然配体april设计的(图21a)。这种名为tripril的构建体具有三个重复的截短的april配体以形成三聚体，所述三聚体已显示出是其分泌形式。尚不清楚双靶向car、串联双特异性car或天然配体的哪种设计将是更有效的疗法。尽管载体尺寸较大，但双靶向car构建体的转导效率与正常供体t细胞中的单链scfv的转导效率是可比较的(图21b)。在体外，双靶向串联双特异性car与tripril针对mmls和rpml-8226骨髓瘤系的细胞毒性是可比较的(图21c)。抗taci-抗bcma双特异性物和tripril显现出对具有低taci表达的多发性骨髓瘤系u266具有相同的功能性(图20b)。抗bcma-抗taci双特异性物的效果较差。对于抗原丢失的情况，bcma的丢失显示出最大不同，其中抗taci-抗bcma双特异性物损失一些功效(图21d-图21e)。同样地，收获来自这些测定的上清液以评估细胞因子产生。
[0422]
实施例10.针对多发性骨髓瘤的双特异性car t细胞：天然配体与串联scfv设计的比较
[0423]
实施例9中显示，基于串联scfv或天然配体设计的双bcma和taci靶向car对野生型多发性骨髓瘤模型具有相似的功效。然而，这在单一抗原丢失的情况下发生变化。在长期暴露于单一抗原的情况下表征了这些car的增殖(群体倍增数)和激活能力(cd69)以及它们的记忆(ccr7、cd45ra)和耗竭表型(pd-1、tim3、lag-3)。结果表明，串联双特异性car与天然配体car对抗原密度的敏感性不同。结果表明，双靶向car t细胞之间的结构差异影响它们的功能。
[0424]
为了测试双特异性car t细胞结合其各自抗原的功效，t细胞或者不转导或者用抗taci h-l car、抗taci l-h car、抗bcma car、抗taci/抗bcma双特异性car或抗bcma/抗taci双特异性car转导，并测试其可溶性抗原的结合。结果证明，双特异性car与其单特异性对应物相比对其可溶性抗原具有较低的结合亲和力，并且所测试的双特异性car的两个组分的取向不影响它们的结合(图28)。
[0425]
为了测试双特异性car对癌细胞/t细胞共培养物中细胞因子产生的影响，将mm1s或rpmi8226多发性骨髓瘤细胞单独培养或与未转导的t细胞、用抗taci/抗bcma双特异性car转导的t细胞或用抗bcma/抗taci双特异性car转导的t细胞共培养，并且在培养上清液中测量细胞因子。结果表明，双特异性car t细胞在体外响应于多发性骨髓瘤细胞系而产生白介素-2(il-2)、干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)(图29)。
[0426]
在体内使用双特异性car t细胞的另外的实验的设计示于图30a。首先，将1x 106个mm1s多发性骨髓瘤细胞静脉内(i.v.)注射至小鼠中。然后，2周后，注射2x 106个car t细胞并进行生物发光成像以检测随时间而变的mm1s细胞活力。对于来自三个不同供体的t细胞，在未处理或用未转导的t细胞或用抗taci/抗bcma双特异性car或抗bcma/抗taci双特异性car转导的t细胞处理的小鼠中随时间而变的生物发光通量测量示于图30b、图30c和图30d。来自供体1的代表性生物发光图像示于图30e。结果表明，双特异性car t细胞在体内对mm1s具有功能性，并且来自3个供体中的2个供体的抗bcma/抗taci car t细胞是有效的，并且来自3个供体中的3个供体的抗taci/抗bcma car t细胞是有效的。
[0427]
双特异性car t细胞在多发性骨髓瘤的皮下肿瘤模型中显示出进一步的功效。图31a显示了实验设计，其中将5x 106个rpmi8226细胞皮下植入小鼠中，然后在2周后静脉内注射car t细胞。随着时间的推移测量肿瘤体积，并在注射后第14天和第21天对血液中的car t细胞进行计数。结果证明，抗bcma/抗taci car t细胞比抗taci/抗bcma car t细胞或未转导的t细胞在体内扩增更多(图31b)，并且相对于未转导的t细胞或未处理的小鼠中的肿瘤，两种car t细胞类型均抑制皮下肿瘤生长(图31c、图31d、图31e和图31f)。t细胞耗竭可以导致car t细胞的无效。为了评价双特异性car t细胞的耗竭，根据图32a所示的时间线进行实验。首先，将未转导的或用抗bcma car、抗taci/抗bcma双特异性car或抗bcma/抗taci双特异性car构建体转导的1x 106个t细胞铺板。在初始铺板后第0、7、14、21和28天，对tim-3和lag3耗竭标记物进行流式细胞术分析。在每个时间点，对t细胞进行计数，在每种条件下以1x 106个细胞铺板，并用过表达bcma的辐照的k562细胞对其(再)刺激。结果表明，与抗bcma和抗taci/抗bcma双特异性car t细胞相比，抗bcma/抗taci双特异性car t细胞在重复刺激的情况下显示出耗竭标记物tim-3和lag3的较低表达，这可能导致其对单一抗原的
功效更强。
[0428]
根据图33a中总结的实验设计评价car t细胞群内的t细胞表型。对表达抗bcma car、抗taci/抗bcma双特异性car或抗bcma/抗taci双特异性car的car t细胞进行计数，并铺板1x 106个细胞，并且每周通过流式细胞术对记忆表型进行定量。根据图33b左侧所示的四种表型对car t细胞进行表征。如果细胞对ccr7呈阳性且对cd45ra呈阴性，则细胞被归类为中央记忆细胞(cm)；如果它们对ccr7和cd45ra二者均呈阴性，则归类为效应记忆细胞(em)；如果它们对ccr7呈阴性且对cd45ra呈阳性，则归类为终末分化效应细胞(tde)；或者如果它们对ccr7和cd45ra二者均呈阳性，则归类为幼稚细胞。参见x.wang等人,blood(2016)127(24):2980-2990；l.gattinoni等人,nat.med.(2011)17(10):1290-1297；以及l.biasco等人,sci.transl.med.(2015)7(273):273ra213。结果表明，与抗taci/抗bcma双特异性car t细胞或抗bcma car t细胞相比，更大比例的抗bcma/抗taci双特异性car t细胞保留了中央记忆表型，而其在相同的时间范围内转化为效应表型(图33b)。观察到各组之间的扩增差异很小(图33c)。
[0429]
表2.氨基酸序列
[0430]
[0431]
[0432]
[0433]
[0434][0435]
[0436][0437]
表3.互补决定区(cdr)定义
[0438] imgt1kabat2chothia3cdr-h127-3831-3526-32cdr-h256-6550-6553-55cdr-h3105-116/11795-10296-101cdr-l127-3824-3426-32cdr-l256-6550-5650-52cdr-l3105-116/11789-9791-96
[0439]1the international immunogenetics informationimgt.org,lefranc,m.-p.等人,nucleic acids res.,27:209-212(1999)
[0440]2kabat等人(1991)sequences of proteins of immunological interest,第五版,u.s.department of health and human services,nih publication no.91-3242
[0441]3chothia等人,j.mol.biol.196:901-917(1987))。
[0442]
表4.抗taci互补决定区(cdr)氨基酸序列
[0443]
[0444]
可以根据以下任何编号的段落限定本文所述技术的一些实施方案：
[0445]
1.一种特异性结合跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(taci)的分离的抗体，其中所述抗体以约2nm或更低的kd与taci结合。
[0446]
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体以在约500pm与约1nm之间的kd与taci结合。
[0447]
3.根据段落1或2所述的抗体，其中所述抗体以在约700pm与约900pm之间的kd与taci结合。
[0448]
4.根据段落1-3中任一项所述的抗体，其中所述抗体以约861pm的kd与taci结合。
[0449]
5.一种特异性结合taci的分离的抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域(vh)，其含有与seq id no:1的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(vl)，其含有与seq id no:2的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[0450]
6.根据段落5所述的抗体，其中所述vh包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，并且所述vl包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[0451]
7.根据段落5所述的抗体，其中所述vh包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且所述vl包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0452]
8.根据段落5所述的抗体，其中所述vh包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且所述vl包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
[0453]
9.根据段落5所述的抗体，其中所述vh包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且所述vl包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
[0454]
10.一种与taci特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有seq id no:1的氨基酸序列的vh和含有seq id no:2的氨基酸序列的vl。
[0455]
11.根据段落1-10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0456]
12.根据段落11所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
[0457]
13.根据段落1-12中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全长抗体。
[0458]
14.根据段落1-12中任一项所述的抗体，其中所述抗体是特异性结合taci的抗体片段。
[0459]
15.根据段落14所述的抗体，其中所述抗体片段选自fab、fab'、fab'-sh、fv、scfv和(fab')2片段。
[0460]
16.根据段落1-15中任一项所述的抗体，其中所述抗体是igg抗体。
[0461]
17.根据段落16所述的抗体，其中所述抗体是igg1抗体。
[0462]
18.一种包含根据段落1-17中任一项所述的抗体的组合物。
[0463]
19.一种编码根据段落1-17中任一项所述的抗体的多核苷酸。
[0464]
20.一种包含根据段落19所述的多核苷酸的载体。
[0465]
21.一种包含根据段落16所述的载体的宿主细胞。
[0466]
22.根据段落21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
[0467]
23.根据段落22所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
[0468]
24.根据段落21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
[0469]
25.根据段落24所述的宿主细胞，其中所述原核细胞是大肠杆菌。
[0470]
26.一种产生特异性结合taci的抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养根据段落21-25中任一项所述的宿主细胞。
[0471]
27.根据段落22所述的方法，其中所述方法还包括从所述宿主细胞或所述培养基回收所述抗体。
[0472]
28.一种包含根据段落1-27中任一项所述的抗体的抗体-药物缀合物。
[0473]
29.一种嵌合抗原受体(car)多肽，所述嵌合抗原受体多肽包含胞外靶标结合结构域，其中所述胞外靶标结合结构域包含taci结合结构域。
[0474]
30.根据段落29所述的car多肽，其中所述car多肽包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
[0475]
31.根据段落29或30所述的car多肽，所述car多肽还包含一个或多个共刺激结构域。
[0476]
32.根据段落29-31中任一项所述的car多肽，其中所述taci结合结构域不包含april、baff、camlg或其一部分。
[0477]
33.根据段落29-32中任一项所述的car多肽，其中所述taci结合结构域以约2nm或更低的kd与taci结合。
[0478]
34.根据段落29-33中任一项所述的car多肽，其中所述taci结合结构域以在约500pm与约1nm之间的kd与taci结合。
[0479]
35.根据段落29-34中任一项所述的car多肽，其中所述taci结合结构域以在约700pm与约900pm之间的kd与taci结合。
[0480]
36.根据段落29-35中任一项所述的car多肽，其中所述taci结合结构域以约861pm的kd与taci结合。
[0481]
37.根据段落29-36中任一项所述的car多肽，其中所述taci结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
[0482]
38.一种包含胞外靶标结合结构域的car多肽，所述胞外靶标结合结构域包含根据段落1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
[0483]
39.根据段落29-38中任一项所述的car多肽，其中所述taci结合结构域包含抗taci单链可变片段(scfv)。
[0484]
40.根据段落39所述的car多肽，其中所述抗taci scfv包含重链可变结构域(vh)，所述重链可变结构域含有与seq id no:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0485]
41.根据段落40所述的car多肽，其中所述vh包含seq id no:1的氨基酸序列。
[0486]
42.根据段落39-41中任一项所述的car多肽，其中所述抗taci scfv包含轻链可变结构域(vl)，所述轻链可变结构域含有与seq id no:2的氨基酸序列具有至少90％序列同
一性的氨基酸序列。
[0487]
43.根据段落42所述的car多肽，其中所述vl包含seq id no:2的氨基酸序列。
[0488]
44.根据段落39-43中任一项所述的car多肽，其中所述抗taci scfv包含含有seq id no:1的氨基酸序列的vh和含有seq id no:2的氨基酸序列的vl。
[0489]
45.根据段落40-44中任一项所述的car多肽，其中所述vh位于所述vl的n末端。
[0490]
46.根据段落40-44中任一项所述的car多肽，其中所述vl位于所述vh的n末端。
[0491]
47.根据段落40-46中任一项所述的car多肽，其中所述vh和所述vl经由接头序列连接。
[0492]
48.根据段落47所述的car多肽，其中所述接头序列包含seq id no:3、14、15、16或17的氨基酸序列。
[0493]
49.根据段落48所述的car多肽，其中所述接头序列包含seq id no:3的氨基酸序列。
[0494]
50.根据段落29-49中任一项所述的car多肽，其中所述taci结合结构域包含与seq id no:4或5的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0495]
51.根据段落49或50所述的car多肽，其中所述taci结合结构域包含seq id no:4或5的氨基酸序列。
[0496]
52.根据段落29-51中任一项所述的car多肽，其中所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。
[0497]
53.根据段落52所述的car多肽，所述铰链/跨膜结构域包括免疫球蛋白样蛋白cd28、cd8或4-1bb的铰链/跨膜结构域。
[0498]
54.根据段落53所述的car多肽，其中所述铰链/跨膜结构域是cd8的铰链/跨膜结构域，任选地其中所述cd8的铰链/跨膜结构域包含seq id no:7的氨基酸序列。
[0499]
55.根据段落29-54中任一项所述的car多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包括cd3ζ、cd3ε或cd3θ的细胞内信号传导结构域。
[0500]
56.根据段落55所述的car多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包括cd3ζ的细胞内信号传导结构域，任选地其中所述cd3ζ的细胞内信号传导结构域包含seq id no:9的氨基酸序列。
[0501]
57.根据段落31-56中任一项所述的car多肽，其中所述共刺激结构域包括4-1bb、cd28、cd27、icos或ox40的共刺激结构域。
[0502]
58.根据段落57所述的car多肽，其中所述共刺激结构域包括4-1bb的共刺激结构域，任选地其中所述4-1bb的共刺激结构域包含seq id no:8的氨基酸序列。
[0503]
59.根据段落29-58中任一项所述的car多肽，其中所述car多肽包含与seq id no:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0504]
60.根据段落29-58中任一项所述的car多肽，其中所述胞外靶标结合结构域还包含与非taci的第二靶标结合的靶标结合结构域。
[0505]
61.根据段落60所述的car多肽，其中所述第二靶标是b细胞成熟抗原(bcma)。
[0506]
62.根据段落60或61所述的car多肽，其中所述靶标结合结构域包含所述第二靶标的配体。
[0507]
63.根据段落60或61所述的car多肽，其中所述靶标结合结构域包含抗体或其抗原
结合片段。
[0508]
64.根据段落63所述的car多肽，其中所述抗体或其抗原结合片段包括scfv。
[0509]
65.根据段落64所述的car多肽，其中所述scfv是抗bcma scfv。
[0510]
66.根据段落65所述的car多肽，其中所述抗bcma scfv位于所述抗taci scfv的n末端。
[0511]
67.根据段落65所述的car多肽，其中所述抗taci scfv位于所述抗bcma scfv的n末端。
[0512]
68.一种包含seq id no:10的氨基酸序列的car多肽。
[0513]
69.一种包含seq id no:11的氨基酸序列的car多肽。
[0514]
70.一种包含seq id no:12的氨基酸序列的car多肽。
[0515]
71.一种包含seq id no:13的氨基酸序列的car多肽。
[0516]
72.一种编码根据段落29-71中任一项所述的car多肽的多核苷酸。
[0517]
73.根据段落72所述的多核苷酸，所述多核苷酸还包含自杀基因。
[0518]
74.根据段落72或73所述的多核苷酸，所述多核苷酸还包含编码信号序列的序列。
[0519]
75.一种哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含根据段落29-71中任一项所述的car多肽和/或根据段落72-74中任一项所述的多核苷酸。
[0520]
76.一种根据段落75所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是诱导多能干细胞(ipsc)。
[0521]
77.根据段落75所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是免疫细胞。
[0522]
78.根据段落77所述的哺乳动物细胞，其中所述免疫细胞是t细胞或自然杀伤(nk)细胞。
[0523]
79.根据段落75-78中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
[0524]
80.一种结合taci和cd3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含taci结合结构域和cd3结合结构域。
[0525]
81.根据段落80所述的双特异性抗体，其中所述taci结合结构域以约2nm或更低的kd与taci结合。
[0526]
82.根据段落80或81所述的双特异性抗体，其中所述taci结合结构域以在约500pm与约1nm之间的kd与taci结合。
[0527]
83.根据段落80-82中任一项所述的双特异性抗体，其中所述taci结合结构域以在约700pm与约900pm之间的kd与taci结合。
[0528]
84.根据段落80-83中任一项所述的双特异性抗体，其中所述taci结合结构域以约861pm的kd与taci结合。
[0529]
85.根据段落80-84中任一项所述的双特异性抗体，其中所述taci结合结构域包含含有与seq id no:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的vh；和/或含有与seq id no:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的vl。
[0530]
86.一种与taci和cd3特异性结合的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含taci结合结构域和cd3结合结构域，其中所述taci结合结构域包含含有seq id no:1的氨基酸序列的vh和含有seq id no:2的氨基酸序列的vl。
[0531]
87.根据段落80-86中任一项所述的双特异性抗体，其中所述taci结合结构域位于cd3结合结构域的n末端。
[0532]
88.根据段落80-86中任一项所述的双特异性抗体，其中所述cd3结合结构域位于所述taci结合结构域的n末端。
[0533]
89.根据段落80-88中任一项所述的双特异性抗体，其中所述taci结合结构域和所述cd3结合结构域通过接头序列连接。
[0534]
90.根据段落89所述的双特异性抗体，其中所述接头序列包含seq id no:3、14、15、16或17的氨基酸序列。
[0535]
91.根据段落80-90中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0536]
92.根据段落91所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是单克隆抗体。
[0537]
93.根据段落80-92中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是全长抗体。
[0538]
94.根据段落80-92中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是特异性结合taci和cd3的抗体片段。
[0539]
95.根据段落94所述的抗体，其中所述抗体片段选自fab、fab'、fab'-sh、fv、scfv和(fab')2片段。
[0540]
96.根据段落80-95中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是igg抗体。
[0541]
97.根据段落96所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是igg1抗体。
[0542]
98.一种包含根据段落80-97中任一项所述的双特异性抗体的组合物。
[0543]
99.一种编码根据段落80-97中任一项所述的双特异性抗体的多核苷酸。
[0544]
100.一种包含根据段落99所述的多核苷酸的载体。
[0545]
101.一种包含根据段落100所述的载体的宿主细胞。
[0546]
102.根据段落101所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
[0547]
103.根据段落102所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
[0548]
104.根据段落101所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
[0549]
105.根据段落104所述的宿主细胞，其中所述原核细胞是大肠杆菌。
[0550]
106.一种产生特异性结合taci和cd3的双特异性抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养根据段落101-105中任一项所述的宿主细胞。
[0551]
107.根据段落106所述的方法，其中所述方法还包括从所述宿主细胞或所述培养基回收所述双特异性抗体。
[0552]
108.一种治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用以下中的一种或多种：(i)根据段落29-71中任一项所述的car多肽、根据段落19、72-74和99中任一项所述的多核苷酸和/或根据段落22、23、75-79、102和103中任一项所述的哺乳动物细胞；(ii)根据段落1-17中任一项所述的抗体；(iii)根据段落28所述的抗体-药物缀合物；以及(iv)根据段落80-97中任一项所述的双特异性抗体。
[0553]
109.根据段落108所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症、自身免疫障碍或浆细
胞疾病或障碍。
[0554]
110.根据段落109所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症。
[0555]
111.根据段落110所述的方法，其中所述癌症包含表达taci的细胞。
[0556]
112.根据段落111所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
[0557]
113.根据段落110-112中任一项所述的方法，其中所述受试者对抗bcma疗法具有抗性。
[0558]
114.根据段落109所述的方法，其中所述疾病或障碍是自身免疫疾病或障碍。
[0559]
115.根据段落114所述的方法，其中所述自身免疫疾病或障碍的特征在于促成自身免疫障碍的抗体的高滴度。
[0560]
116.根据段落114或115所述的方法，其中所述自身免疫疾病或障碍是移植排斥反应、移植物抗宿主病或血友病合并因子抑制剂。
[0561]
117.根据段落109所述的方法，其中所述疾病或障碍是浆细胞疾病或障碍。
[0562]
118.根据段落117所述的方法，其中所述浆细胞疾病或障碍是浆细胞增生症、浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链疾病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病和郁积型多发性骨髓瘤。
[0563]
其他实施方案
[0564]
尽管出于清楚理解的目的，已通过说明和例子的方式详细地描述了前述发明，但描述和例子不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用以其整体并入。
[0565]
等同物和范围
[0566]
本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文描述的实施方案的许多等同方案。本公开文本的范围并不旨在受限于上述说明，而是如所附的权利要求书中所述。
[0567]
除非上下文明确指示相反或其他含义，否则诸如“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”等冠词可以意指一个或多于一个。除非上下文明确指示相反或其他含义，否则在一组的两个或更多个成员之间包含“或”的权利要求或说明书被视为满足如下条件：存在一个、多于一个或全部组成员。在两个或更多个组成员之间包含“或”的组的公开文本提供了其中恰好存在所述组的一个成员的实施方案、其中存在所述组的多于一个成员的实施方案以及其中存在全部组成员的实施方案。出于简洁的目的，那些实施方案没有在本文中单独阐述，但是应当理解，这些实施方案中的每一个都提供于本文中并且可以被特别地要求保护或拒绝保护。
[0568]
应当理解，本公开文本涵盖所有变化、组合和排列，其中来自一个或多个权利要求或来自说明书的一个或多个相关部分的一个或多个限制、元素、条款或描述性术语被引入另一个权利要求中。例如，从属于另一个权利要求的权利要求可以修改为包括在从属于同一基础权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个限制。此外，当权利要求引用组合物时，应理解，除非本领域的普通技术人员清楚将出现矛盾或不一致，否则根据本文所公开的任何制备或使用方法或根据本领域已知的方法(如果有的话)制备或使用所述组合物的方法被包括在内。
[0569]
在元素以列表形式(例如，以马库什组形式)呈现的情况下，应当理解，还公开了元
素的每个可能的亚组，并且可以从所述组去除任何元素或元素亚组。还应注意，术语“包含”旨在是开放式的并且允许包括其他元素或步骤。应当理解，一般而言，当实施方案、产物或方法被称为包括特定元素、特征或步骤时，也提供了由此类元素、特征或步骤组成或基本上由其组成的实施方案、产物或方法。出于简洁的目的，那些实施方案没有在本文中单独阐述，但是应当理解，这些实施方案中的每一个都提供于本文中并且可以被特别地要求保护或拒绝保护。
[0570]
在给出范围时，端点被包括在内。此外，应理解，除非根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另有说明或有其他明确含义，否则在同一实施方案中，表示为范围的值可以假定所述范围内的任何具体值，除非上下文明确另有规定，否则精确至所述范围的下限的单位的十分之一。出于简洁的目的，每个范围内的值在本文中并未单独阐述，但应理解这些值中的每一个都提供于本文中并且可以被特别地要求保护或拒绝保护。还应理解，除非根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另有说明或有其他明确含义，否则表示为范围的值可以假定给定范围内的任何子范围，其中所述子范围的端点是以如下相同的精度表示：所述范围的下限的单位的十分之一。
[0571]
在提供网站的情况下，url地址以非浏览器可执行代码的形式提供，且括号中是相应网址的周期(period)。实际网址不含括号。
[0572]
另外，应理解，本公开文本的任何特定实施方案可以明确地从任何一项或多项权利要求排除。在给出范围的情况下，所述范围内的任何值可以明确地从任何一项或多项权利要求排除。本公开文本的组合物和/或方法的任何实施方案、元素、特征、应用或方面可以从任何一项或多项权利要求排除。出于简洁的目的，本文未明确阐述排除了一个或多个元素、特征、目的或方面的所有实施方案。