一种鸭剩余采食量相关的microRNA分子标记及其应用的制作方法

一种鸭剩余采食量相关的microrna分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种鸭剩余采食量相关的microrna分子标记及其应用。
技术背景
2.剩余采食量(fri)是评价动物饲料效率的一个新的选择性状，它是实际采食量与预测采食量之间的差值。剩余采食量与机体组成、营养物质的消化率、新陈代谢能力、基础代谢、能量效率、活动量、免疫反应等生物学因素密切相关，同时以剩余采食量为选择性状的遗传进展明显。多项研究表明剩余采食量在不同畜禽品种的遗传力属于中等或中上遗传力，在0.28～0.58之间，选择低剩余采食量的个体可以提高饲料利用率，降低饲养成本，获得更高的经济效益。
3.肝脏是动物体内重要的器官，在糖、脂肪和蛋白质等物质代谢和能量平衡中起重要作用。已有研究表明，脂类代谢沉积与饲料利用率呈显著相关。脂类代谢是影响肉鸡剩余采食量的重要因素，且与脂类代谢相关的基因在低剩余采食量组个体中高表达。鉴于此，肝脏脂代谢是影响动物剩余采食量的重要因素。
4.microrna(mirna)是一类长度约20-24nt的非编码单链小分子rna，可以通过与靶基因mrna的3'-utr互补结合对靶基因进行转录后调控，在细胞增殖、分化和凋亡、细胞氧化应激应答、肿瘤形成等生理过程中发挥重要的调控作用。研究表明，mirna作为重要的调控因子在肝脏脂代谢过程中起着重要作用。另有研究表明，高低rfi肉鸭肝脏存在差异的mirna表达谱，并发现mirna与鸭rfi密切关联，但其作用及分子机制尚不清楚，与鸭剩余采食量相关及脂质代谢相关的差异表达的mirna仍未名确。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鸭剩余采食量相关的microrna分子标记，该microrna分子标记为mirna-1260-5p，序列为seq id no.1。
6.本发明另一目的在于提供所述microrna分子标记的应用，microrna分子标记用于预测或辅助预测高饲料利用率鸭；或用于选育不同饲料利用率鸭。
7.本发明还提供了所述microrna分子标记的另一应用，该microrna分子标记用于制备预测或辅助预测高饲料利用率鸭的试剂，或用于制备选育不同饲料利用率鸭的试剂。
8.优选的，上述试剂通过核酸扩增技术检测所述microrna分子标记的表达水平，用于核酸扩增的引物包括所述microrna分子标记的茎环引物和上游引物、下游引物，所述茎环引物的序列为seq id no.2，所述上游引物的序列为seq id no.3，所述下游引物的序列为seq id no.4。
9.优选的，该试剂还包括内参microrna的上游引物和下游引物，所述内参上游引物的序列为seq id no.5，所述内参下游引物的序列为seq id no.6。
10.优选的，该试剂检测的样本为肝脏组织。
11.本发明的有益效果在于：
12.本发明利用mirna-seq技术和生物信息学方法，比较分析鸭高、低剩采食量肝脏组织基因表达谱，鉴定筛选与剩余采食量及脂代谢相关的关键差异表达mirna，为改善肉鸭的饲料利用率的分子选育提供理论依据。
附图说明
13.图1为agilent 2100bioanalyzer检测rna完整性的结果，其中1-6为hrfi，7-12为lrfi；由图上可清晰看见28s和18s两条带，说明提取的rna完整性均较好。
14.图2为高组(hrfi)和低组(lrfi)文库中mirna长度分布频率，可以看出大部分mirna序列的长度在20-24nt范围内，其中21nt、22nt和23nt这三个序列长度占比超过总数的80％，符合mirna序列长度分布特点。
15.图3为通过对高、低鸭肝脏组织基因进行差异表达分析，共鉴定得到41个差异表达mirna，其中包含33个上调基因(图右)，8个下调基因(图左)；
16.图4为差异表达microrna的qpcr结果与mirna-seq结果的比较，rt-pcr的组间差异倍数与mirna-seq组间差异倍数趋势一致。
17.图5为mirna差异表达倍数在qpcr与mirna-seq间的回归分析，可以看出qpcr与mirna-seq得出的差异倍数的相关系数为0.9502，p《0.001,说明回归方程有意义，mirna-seq的结果真实可靠，准确性高。
具体实施方式
18.为了便于理解，下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：
19.实施例1：试验材料
20.1.试验动物
21.本试验中的试验动物为肉用型公鸭，由黄山强英鸭业有限公司提供并在其公司饲养。试验按1∶5比例，人工授精，收集种蛋并孵化。出雏时，戴翅号，鉴别公母，接种疫苗后测量初生体重。随后选取健康强健、体重均匀的1日龄肉公鸭，将所选取的肉鸭统一混合饲养至21日龄，21日龄时对所有的肉鸭进行称重并随机挑选体重相近的1000只肉公鸭并对它们进行个体笼中饲养，饲喂相同饲粮，每个笼子都配备了单独的食槽和饮水乳头。
22.饲料放入个体笼的个体料槽中并保证每只鸭只能吃到自己料槽中的饲料。为保证试验鸭自由采食，每天早上和晚上两次检查料槽饲料量，针对于吃的较快的鸭，进行补饲，并根据日期进行记录。为保证不因饲料氧化或霉变而影响鸭的采食，一周为一循环，称取每个料槽的剩余料量，重新放入新鲜饲料，进行下一循环。42日龄时试验结束。
23.2.测定rfi和肝脏样品采集
24.试验期间，收集计录肉公鸭21日龄体重(bw
21
)、42日龄体重(bw
42
)、采食量(fi)、计算每只肉鸭平均日增重(bwg)，平均日采食量(adfi)、日增重(adg)、饲料转化率(fcr)和剩余采食量(rfi)，剩余采食量(rfi)的计算公式如下：
25.rfi＝adfi
–
(b0 b1×
mbw
0.75
b2×
adg)
26.其中，adfi为日采食量；mbw
0.75
为平均代谢体重；adg为日增重；b0为截距，b1、b2为回归系数。采用sas 9.4软件中的线性拟合函数来计算肉鸭的rfi值。
27.根据统计计算出的rfi值，按照rfi的高低将试验鸭群进行排序，并将试验肉公鸭分为高rfi组和低rfi组，结合试验期间统计的fcr值，从高rfi组和低rfi组中随机挑选肉公鸭各6只，试验肉公鸭屠宰之后，迅速采集鸭肝脏组织，剪成小块，装填入5ml冻存管中，投入液氮冷冻，之后转移到-80℃冰箱长期保存，用于总rna的提取。
28.3.主要试验仪器
29.表主要实验仪器及生产厂家
[0030][0031]
4.主要试剂
[0032]
(1)pcr引物(page纯化)，通用生物公司
[0033]
(2)逆转录试剂盒(aort-0060)，吉真生物公司
[0034]
(3)aceq qpcr sybr green master mix(q121-02)，吉真生物公司
[0035]
(4)琼脂糖，中国biosharp公司
[0036]
(5)荧光定量pcr96孔板(pcr-96-flt-c)，爱思进公司
[0037]
(6)6
×
dna loading buffer，北京天根生化科技有限公司
[0038]
(7)氯仿，无锡市展望化工试剂有限公司
[0039]
(8)无水乙醇，江苏强盛功能化学股份有限公司
[0040]
(9)platemax ultraclear sealing(uc-500)，axygen公司
[0041]
(10)各型号tips(kg1011、kg1212)，科进
[0042]
(11)superred/gelred核酸染料(10000水溶液)，中国biosharp公司
[0043]
(12)depc水(biotech grade)，吉真生物公司
[0044]
(13)5
×
tbe，上海生工生物工程有限公司
[0045]
实施例2：实验过程及结果分析
[0046]
1.组织总rna提取
[0047]
耗材：2ml和1.5ml离心管若干，75％乙醇，高压蒸汽灭菌的钢珠，灭菌的小剪刀，trizol试剂，三氯甲烷，异丙醇，depc水，枪头(黄、蓝、白)。
[0048]
提前准备：离心机预冷(4℃)，三氯甲烷、异丙醇(提前放入-20℃冰箱)，75％酒精(depc水稀释)。
[0049]
操作步骤：
[0050]
s1. 2ml离心管重加入4个小钢珠，加入1000μl trizol；
[0051]
s2.酒精灯旁用小剪刀取50-100mg组织样(绿豆粒大小)，放入含trizol的离心管中；
[0052]
s3.用快速研磨仪匀浆1min，60hz(最好研磨两次)，匀浆后室温放置10min，以便充分裂解样品；
[0053]
s4.向匀浆组织中加入200μl三氯甲烷，充分震荡15s，并置于室温下5min；
[0054]
s5. 12000g离心15min(离心机温度4℃)离心之后匀浆分三层，rna存在于水相层，水相约占匀浆液50％；
[0055]
s6.用移液枪将上层水相析出于新ep管中(约500μl，吸出300-350μl，以免吸到白色蛋白避免污染)；
[0056]
s7.向ep管中加入500μl冰异丙醇，充分混匀后放置室温10min；
[0057]
s8. 4℃12000g离心10min；
[0058]
s9.舍弃上清液，(用枪头尽量吸干，不要吸出沉淀)留下rna沉淀，并加入1000μl 75％酒精(rna可在75％酒精-20℃保存一年，4℃保存一个星期)；
[0059]
s10.简短离心后，在4℃10000g离心5min，倒掉废液(用枪头尽量吸干，不要吸出沉淀)；
[0060]
s11.将rna沉淀放置在空气中干燥5-10min(可使用10μl白枪头吸出，避免230/260过低)；放入无酶离心管中，加入30-50μl depc水，吹打几次使沉淀溶解，-80℃保存。
[0061]
2.rna质量检测
[0062]
(1)琼脂糖凝胶电泳检测：用天平称取1.0g琼脂糖，锥形瓶中加入100ml1
×
tbe缓冲液，将琼脂糖倒入锥形瓶中然后进行加热，当琼脂糖完全溶解时停止加热，待温度稍微降下后，将10.0μl的核酸染料加至琼脂糖溶液中，充分混匀之后，将其倒入清洗干净的胶槽中，将梳子插好，水平放置待凝固后使用。然后，吸取5μl的rna样品和1μl的6
×
loading buffer使之充分混匀，将混匀的样品用移液枪加入点样孔中，点样完成后，打开电泳仪，电压调至120v，时间调至15-20min，电泳结束后关闭电源，把凝胶放在凝胶成像系统中观察rna的28s、18s条带，检测rna是否完整和是否存在dna的污染。
[0063]
(2)rna纯度检测：为了检测rna的纯度，使用nanodrop分光光度计测定rna的od值，od260与od280的比值1.8-2.0这个范围是最好的，od260与od230的比值在2.2左右是最好的。
[0064]
(3)检测rna的完整值(rin)：rna的质量可以根据rna的完整值(rin)来判断，使用agilent 2100可以检测rna的完整值，rin值从0-10，根据大小反映出rna质量的好坏，值越大越能说明rna质量高完整性好。结果如图1与表1所示。
[0065]
本实施例中提取的rna纯度检测结果如下表所示，可见rna的完整值都在8以上，质量较好，可以开展后续试验。
[0066]
表1 rna质量检测表
[0067][0068][0069]
3.rna文库构建
[0070]
用trizol试剂从肝脏组织中提取总rna，选择18-30nt的片段进行琼脂糖凝胶电泳切胶。然后与3’接头进行连接，用15％变性page胶对连接产物进行电泳分离，对36-44nt目的条带进行切胶。切胶产物回收，与5’接头进行连接，对连接了两侧接头的小rna样本进行反转录pcr。用3.5％琼脂糖凝胶对反转录产物进行电泳分离，对140-160bp区域条带进行切胶，最后得到的胶回收产物就是终文库。使用illumina miseqtm4000进行测序，下机数据为原始测序数据raw reads，见表2。
[0071]
4.原始数据质控
[0072]
为了保证数据质量，要在信息分析前对原始数据进行质控，并且通过数据过滤来减少数据噪音。我们对下机的clean reads再进行更严格的过滤，得到high quality clean reads，用于后续的信息分析。过滤的步骤如下:
[0073]
1)去除含接头(adapter)的reads；
[0074]
2)去除含n比例大于10％的reads；
[0075]
3)去除低质量reads(质量值q≤20的碱基数占整条read的50％以上)。
[0076]
通过质控去除含有接头、ploy-n及低质量的reads，最终获得clean reads用于后续分析，结果见表2。通过对高组(hrfi)和低组(lrfi)文库中mirna长度分布分析发现，大部分mirna序列的长度在20-24nt这样一个范围，长度分布如图2所示，其中23nt的序列长度所占比例是最高，22nt的占比与23nt占比接近，21nt、22nt和23nt这三个序列长度占比超过总数的80％，符合mirna序列长度分布特点。我们可以得出该试验高组(hrfi)和低组(lrfi)文库序列长度分布较好，得到了目的srna-mirna。
[0077]
表2通过illumina miseq 4000测序对总小rna标签进行分类
[0078][0079]
5.参考基因组比对与转录本拼接
[0080]
利用blastall 2.2.25(blastn)软件将clean reads与genbank和rfam数据库进行
比对，尽量去除样本中的snrna、trna、rrna、scrna和snorna等rna。选用bowtie(version 1.1.2)软件将小rna序列与鸭参考基因组进行比对，根据比对结果可以分析其表达情况以及在肉鸭参考序列的分布。将与参考序列匹配成功的小rna序列与mirbase数据库(http://www,mirbase.org/)中家禽的mirnas作为背景，筛选已知的mirnas。序列进行比对，计算各文库鸭mirna的二级结构的匹配情况，mirna的序列、长度、频率等匹配情况。将clean reads序列与参考基因组进行比对，因为mirna有着特殊的二级结构，所以通过这种比对方式能够对mirna的二级结构进行预测，来探寻可能存在的新mirna。具体鉴定过程如下：
[0081]
1：将已存在的mirna、已知的mirna、mrna降解片段、repeat区域以及其它小rna的序列去除。
[0082]
2：将比对上基因组的reads通过软件mireap_v0.2预测mirna的特殊的二级结构，寻找可能存在的一些新mirna，比对参考基因组见表3。
[0083]
表3各样本比对上基因组的tag统计
[0084][0085][0086]
6.高低rfi肉鸭肝脏mirna表达及差异分析
[0087]
对每个样品鉴定的所有mirna进行整理，根据计算公式计算它们的tpm(tags per million)表达量，计算公式为：tpm＝t*106/n(t表示mirna的tags，n表示总mirna的tags)，这样就获取了所有mirna的表达谱。此外，对已知mirna和新的mirna的表达情况，我们还分别做出了分析。为了鉴定高、低rfi差异mirna的分布，我们通过火山图(volcano plot)可以很清晰的看到结果。其中(|log2(fc)|》0.58且p《0.05)的mirnas为高、低rfi组显著差异mirnas。
[0088]
计算公式为：fold change＝log2(lrfi/hrfi)
[0089]
p-value计算公式为：
[0090][0091][0092][0093]
公式中，x表示mirna在lrfi文库中归一化的表达量，y表示mirna在hrfi文库中归一化的表达量，n1表示lrfi文库中所有纯净序列的总表达量，n2分表示hrfi文库中所有纯净序列的总表达量。高、低rfi组肉鸭肝脏中总共发现610个mirna，其中有414个mirna在高、低rfi肉鸭肝脏中共同表达，81个mirna在低rfi组肉鸭肝脏中表达，115个mirna在高rfi组肉鸭肝脏中表达。
[0094]
差异分析表明，低组(lrfi)相对于高组(hrfi)共鉴定41个差异表达的mirna，包含33个上调的mirna，8个下调的mirna。如图3所示，上调的mirna用红点表示，下调的mirna用蓝点表示，差异不显著的mirna用绿点表示。其中，差异表达显著上调的前10个mirna为：mir-1984-5p、mir-1408-3p、mir-96-5p、mir-67-3p、mir-150-5p、mir-1260-5p、mir-139-5p、mir-5100-3p、mir-204-5p、mir-425-5p，差异表达显著下调的8个mirna为：mir-423-3p、mir-9-5p、mir-33-5p、mir-499-5p、mir-32-5p、mir-1423p、mir-4510-5p、mir-22-3p。其中以mirna-1260-5p为代表的差异表达mirna纳入我们的研究对象。
[0095]
7.靶基因预测
[0096]
为了更深层的探究mirna-seq鉴定的mirna所具有的功能以及可能参与的生物学过程，我们对鉴定到的mirna进行靶基因预测。依据mirna与靶基因的互补性、mirna与靶基因结合位点的保守性、mirna的热稳定性和二级结构以及靶基因的热稳定性和二级结构等。
[0097]
靶基因预测的方法有三种，第一种：rnahybrid(v2.1.2) svm_light(v6.01)法，
[0098][0099]
之后我们对比对区域取5'端1-9nt的区域为seed region，用程序筛选过滤掉两个连续gu matches的情况再用svm_light和已经建立好的预测模型进行分类。
[0100]
第二种：miranda(v3.3a)法
[0101][0102]
第三种：targetscan(version:7.0)法：取small rna 5'端2-8nt作为seed sequences与转录本的3'-utr区做预测。
[0103]
将上述三种方法预测的结果取交集即为mirna靶基因预测的最终结果。高组(hrfi)中鉴定到529个mirna预测到的靶基因数目是10409个，低组(lrfi)中鉴定到的鉴定到495个mirna预测到的靶基因数目是10086个，41个差异的mirna对应的靶基因数目是1424个。其中mirna-1260-5p为代表的差异表达mirna对应的靶基因sorbs1纳入我们的研究对象之中。
[0104]
8.差异表达基因go及kegg pathway富集分析
[0105]
为了对靶基因进行功能注释以及靶基因相关的功能，我们对它们进行go和kegg通路分析。go(gene ontology,http://www.geneontology.org)富集作为国际标准化的分类体系之一，它能够全面描述基因及基因表达产物的属性。go总共有分子功能(molecular function)、细胞组分(cellular component)、参与的生物过程(biological process)三个本体。term是它的基本单位，每一个term都有一个与之对应的属性。go功能分析可以对靶基因进行功能分类注释，也可以对靶基因的功能进行显著性富集分析。计算出每个term所包含的基因数目，得到含有基因数目统计的term。通过超几何检验，在对比基因组下，发掘靶基因显著富集的go条目,假设检验的计算公式为：：
[0106][0107]
其中，n为go注释的基因数目；n为靶基因的数目；m为特定go term的基因数目；m为注释为靶基因中该特定go term的基因数目。pvalue通经过fdr校正，corrected-pvalue≤0.05作为阈值，符合此要求的被称为靶基因中显著富集的go条目。靶基因主要行使的生物学功能可以通过显著性富集go功能体现。不同的基因在生物体内通过相互协调发挥生物学功能，通过pathway的分析更加有助于对基因生物学功能的了解。kegg是通路的的主要公共数据库。
[0108]
kegg pathway是pathway显著性富集的单位，通过超几何检验，发掘在与整个基因组背景相比之下，靶基因具有显著性富集的pathway。pathway显著性富集假设检验的计算公式与go显著富集的计算方法是类似的。
[0109]
计算公式如下:
[0110]
[0111]
差异表达mirna的靶基因go功能表明，靶基因显著富集在脂蛋白代谢过程的调节、脂蛋白代谢过程的负调控、谷氨酸受体信号通路、aminoglycan生物合成的过程、精氨酸代谢过程、己糖代谢过程、单糖代谢过程、分解代谢过程的负调控、细胞氮化合物生物合成过程、干细胞增殖的调控等go中。靶基因所富集的通路一共有132个，其中主要富集在卟啉和叶绿素代谢、苯丙氨酸代谢、胰岛素信号通路、抗坏血酸和醛酸代谢、ppar信号通路、戊糖和葡糖醛酸的相互转化、淀粉和蔗糖的代谢、酪氨酸代谢、视黄醇的新陈代谢、泛酸酯和辅酶a的生物合成、mtor信号通路、胰岛素抵抗、碳代谢、foxo信号通路等与能量代谢相关的通路中。本试验中筛选的mirna-1260-5p通过对靶基因sorbs1的表达，参与肝脏脂质代谢。
[0112]
9.差异表达mirna的荧光定量pcr验证
[0113]
在差异表达显著上调和下调的18个mirna中选取10个进行茎环qpcr验证，根据10条mirnas的相应序列，利用primer premier 6.0设计反转录引物和扩增引物，应用blast检测已经设计好的引物序列的特异性，u6序列稳定，选取u6作为该荧光定量的内参基因，引物序列见表4。
[0114]
表1用于qpcr验证的差异表达mirna的引物序列
[0115][0116][0117]
以总rna为模板，采用hiscript 1st strand cdna synthesis kit(cdna一链合成
试剂盒)对所提取的rna进行逆转录处理。
[0118]
用美国bio-rad生产的实时荧光定量仪进行荧光定量pcr，用反转录得到的cdna作为为模板，根据由吉真生物公司生产的aceq qpcr sybr green master mix试剂盒的说明进行操作。程序如表5所示，该反应的总体系为10.0μl，其中该体系中加入10.0μl 2
×
sybr green mix，0.5μl的上游引物，0.5μl的下游引物，2.0μl的cdna，加ddh2o至10.0μl。将上述配置好的反应溶液移至不含rna酶的ep管内，每个样品按照上述的操作以及反应体系进行3个重复，轻微摇荡配置好的反应溶液使之能够混匀，将该反应体系用移液枪转移移入到八联管内，将八联管用镊子夹入离心机内，避免造成污染，对实验结果造成影响，混匀之后，再用镊子将八联管夹入荧光定量仪内。该荧光定量的反应程序见表5。本试验中荧光定量pcr判别依据为：扩增曲线ct值为18-30，融解曲线单一峰值；标准曲线的扩增效率(e)为0.9-1.1之间，r2》0.99。
[0119]
表2反应程序
[0120][0121]
10.数据处理分析与结果
[0122]
根据试验中所得到的目的基因的ct值和内参基因u6的ct值，采用2
–
δδct
计算方法计算挑选的mirna的相对表达量，mirna相对表达量计算好后，根据log2(lrfi/hrfi)的算法，计算mirna的表达趋势，通过荧光定量pcr的试验结果与高通量测序的结果的表达趋势进行比较分析，将荧光定量的结果与mirna-seq测序结果进行相关性分析。结果表明rt-pcr的组间差异倍数与mirna-seq组间差异倍数趋势一致，如图4所示，mirna-1260-5p在低rfi鸭肝脏组织中显著上调表达，并优于其他组。将rt-pcr得到的结果与mirna-seq得到的结果进行相关性分析，结果如图5所示，表明qpcr与mirna-seq得出的差异倍数的相关系数为0.9502，p《0.001，说明回归方程有意义。由此表明mirna-seq的结果真实可靠，准确性高。
[0123]
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
[0124]
[0125]