一株蒙氏肠球菌及其在发酵中草药中的应用的制作方法

1.本发明属于微生物领域，涉及一株蒙氏肠球菌，特别是指一株蒙氏肠球菌（enterococcus mundtii）及其在发酵中草药中的应用。


背景技术：

2.黄芪是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，是一种历史悠久的传统中药，中医临床上常用的大宗中药材，其常与其他中药组成方剂，用来发挥抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗辐射损伤、心血管保护、免疫调节、肝肾保护、调节血糖、降血脂、降压、利尿等作用。不仅如此，其在食品、保健品、化妆品等行业具有广泛的应用前景。黄芪中的主要成分为黄芪多糖、黄酮类、皂苷类、氨基酸等，此外，黄芪中还含有生物碱类、木脂素类、甾醇类和微量元素等，具有很高的应用价值。运用传统方法如压榨法、水蒸气蒸馏法、溶剂提取法等直接提取黄芪中的有效成分，其产出量低，不能得到充分利用。
3.中药发酵是以微生物或酶为生物催化剂，对中药或中药提取物进行生物转化，使中药成为快速利用、定量疗效的新型药物。中药发酵可以提高中药有效成分的含量，增强疗效并可能产生新的活性成分，同时改善中药口感及减轻中药毒副作用。目前，利用益生菌发酵中药的报道较多，以往的多项研究也说明了利用发酵技术可以使黄芪活性成分得到较大程度的释放。牛是一种草食性动物，其分解纤维素、半纤维素的能力很强，这可能因为其胃肠道中含有大量具有木质纤维素酶等水解酶的菌株有关；而中草药中也含有大量木质纤维素及其他含糖基天然产物，药效与其有效成分的释放量高低相关。通过喂食中草药，有望在牛粪中分离培养得到水解提高黄芪等中草药活性成分的相关菌株，用于发酵黄芪等中草药，从而提高黄芪中黄芪多糖、黄酮类、皂苷类等有效成分的含量。
4.因此，本领域有待于利用菌株分离、培养、鉴定和发酵等技术来提高黄芪中有效成分的含量。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明公开了一株蒙氏肠球菌（enterococcus mundtii）及其在发酵中草药中的应用，其分离自一头六个月大、健康的西门塔尔牛的粪便物。并将其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号cctcc no:m 20211504，分类名为分类名为enterococcus mundtii my-yd-1，保藏时间2021年11月29日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
6.上述的蒙氏肠球菌在发酵中草药高产黄芪多糖中的应用。
7.上述的蒙氏肠球菌在发酵中草药高产总黄酮中的应用。
8.上述的蒙氏肠球菌在发酵中草药高产总皂苷中的应用。
9.优选的，所述中草药为黄芪。
10.包含所述的蒙氏肠球菌的发酵菌剂。
11.进一步，所述的发酵菌剂的制备方法，步骤为：将蒙氏肠球菌接入mrs培养基进行
斜面培养，所得培养物再进行发酵培养，所得产物为发酵菌剂。
12.优选的，所述蒙氏肠球斜面培养的接种量为10
3 cfu。
13.优选的，所述斜面培养的条件为：温度37℃，厌氧培养，时间为24h，ph值为6.0-6.4。
14.优选的，所述发酵培养的条件为：温度37℃，厌氧培养，转速100r/min，时间为48小时，ph值为6.0-6.4。
15.本发明具有以下有益效果：1、本发明从河南省卫辉市太公镇郭坡村和唐庄镇唐庄村中，采集了西门塔尔（9头）、夏洛莱（2头）、黑白花（1头）共三个品种12头牛的粪便样本，通过培养组学的方法，从中培养并筛选出了一株蒙氏肠球菌（enterococcus mundtii）my-yd-1菌株，并利用其发酵黄芪产多糖、黄酮类和皂苷类化合物，较对照组产量分别提高了72.6%，37.5%，和51.1%，具有良好的应用和开发前景。
16.2、本发明的菌株具有发酵黄芪性能好，安全性高，黄芪多糖、黄酮类和皂苷类化合物产量高的特点。可用于制备和生产黄芪的活性成分。本发明实用性强，操作简便，对发酵设备及生产条件没有特殊要求，利用一般发酵厂的设备和生产条件即可生产，投资少、见效快、效益高，不但适合于小批量的生产，还适合于大规模的生产，具有广阔的实际应用前景。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为本发明的蒙氏肠球菌（enterococcus mundtii）my-yd-1菌株的菌落形态图。
19.图2为本发明的蒙氏肠球菌（enterococcus mundtii）my-yd-1菌株的生长曲线图。
20.图3为菌株my-yd-1发酵黄芪前后活性成分含量对比图。
21.图4为菌株my-yd-1发酵黄芪过程中总多糖含量变化图。
22.图5为菌株my-yd-1发酵黄芪过程中总黄酮含量变化图。
23.图6为菌株my-yd-1发酵黄芪过程中总皂苷含量变化图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1牛粪来源的菌株的分离和培养：（1）样本采集与处理准备12支无菌的10ml的玻璃材质的样品收集管，在河南省卫辉市太公镇郭坡村、唐庄镇唐庄村和唐庄镇山彪村共3个村庄中，采集了西门塔尔（9头）、夏洛莱（2头）、黑白花
（1头）共三个品种12头牛的粪便样本。这些牛所食用的饲料有全价精料、全株青贮、干草、玉米、麦麸以及牧生元（发酵中药）。采集并准确称取上述12头牛各0.5g的粪便样本，分别加入9.5ml的样品稀释液（0.9 %质量浓度的生理盐水），加入编号分别为1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3、3-1、3-2、3-3、4-1、4-2、4-3的样品收集管中快速振荡混匀。分别稀释到10-5
、10-6
、10-7
三个倍数。
26.mrs琼脂培养基蛋白胨10g/l，牛肉浸粉5g/l，酵母浸粉4g/l，葡萄糖20g/l，吐温-1ml/l，磷酸氢二钾2g/l，无水乙酸钠5g/l，柠檬酸铵2g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.05g/l，琼脂粉20g/l，加超纯水至1l，调ph到6.0-6.4。121℃，高压蒸汽灭菌20min。
27.（2）菌株分离与纯化取100μl上述梯度稀释过的混悬液用涂布棒快速均匀涂布到mrs琼脂培养基中，用封口膜封口，放入厌氧罐中，厌氧罐中放入一包产气厌氧袋，保证无氧环境。37℃培养24h。
28.挑取上述琼脂培养基上的典型菌落，接种到装有5ml的mrs液体培养基的厌氧管中，37℃培养24h。固体和液体mrs培养基反复接种5次。
29.mrs液体培养基蛋白胨10g/l，牛肉浸粉5g/l，酵母浸粉4g/l，葡萄糖20g/l，吐温-1ml/l，磷酸氢二钾2g/l，无水乙酸钠5g/l，柠檬酸铵2g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.05g/l，加超纯水至1l，调ph到6.0-6.4。121℃，高压蒸汽灭菌20min。
30.（3）菌株的冻存总共分离培养得到了12个菌株，对最后一次培养的菌液进行保种，分别取300μl的甘油（50%，v/v）和700μl的菌液，装入保种管，编号，放入-80℃冻存。
31.实施例2筛选能提高黄芪活性成分含量的菌株黄芪饮片为蒙古黄芪。黄芪经自然干燥、粉碎至60目，保存待用。
32.（1）菌株的复苏、传代配制mrs培养基，高压备用。将冻存的12个分离菌株，按照2%的比例，即将1ml菌液接种到已经配制好的50mlmrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h。经复苏的菌株继续按照2%的比例接种到新的mrs液体培养基中，如此传至第4代。
33.（2）发酵培养基的配制、发酵配制12组发酵培养基各2l，并设置3个重复，以200g生药黄芪根为对照组，比较用各个菌株发酵前后黄芪主要成分的含量变化，各组培养基均在121℃条件下高压灭菌20min。
34.分别将上述传至第4代的12个分离菌株按照5％的接菌量接到发酵培养基中，在37 ℃、ph为5.6的发酵条件下发酵48h。
35.（3）粗多糖、总黄酮及总皂苷的提取与测定分别在发酵24小时前每隔2小时、24小时后每隔4小时取样，将其发酵产物采用冷冻干燥机冻干，冻干粉干燥保存。冻干粉中黄芪成分与总重量之比为4：6。对照组生药黄芪根称取与冻干粉中黄芪成分相等的重量，与冻干粉一同测定。
36.a. 粗多糖的提取及测定
标准曲线的制作：准确称取干燥至恒重的葡萄糖20mg，置于100ml容量瓶中，加纯水制成0.2mg/ml的葡萄糖溶液。分别吸取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0和13.0ml置于25ml容量瓶中，加水稀释至刻度线。分别准确吸取2.0ml置于具塞试管中，加入5%苯酚1.0ml，摇匀，室温下静置10min，沸水浴15min，冷却。在490nm处测定吸光度。
37.分别取三组黄芪的发酵冻干粉14.25g及发酵前样品10g溶于纯水中，3000r/min离心10min，将上清液分装在50ml离心管中。将离心后的残渣继续加纯水，沸水浴1.5h，离心，取上清液，合并两次上清液即得黄芪粗提液。将黄芪粗提液浓缩至黏稠状态，加入95% 乙醇过夜。离心，用20ml纯水充分溶解沉淀，200倍稀释。准确吸取稀释液2ml于具塞试管中，加入5%新鲜配置的苯酚溶液1ml，摇匀。再加入5ml浓硫酸，沸水浴15min，室温静置10min，冷却，在490nm处测定吸光度。
38.b. 总黄酮的提取及测定标准曲线的制作：准确称取经105℃干燥的芦丁对照品5mg，置于25ml容量瓶中，加入乙醇7.5ml，经水浴微热使其溶解，待冷却后，加蒸馏水稀释至刻度线，摇匀，即得0.2mg/ml标准溶液。准确称取0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0ml芦丁标准溶液，分别放入10ml容量瓶中，分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4和0ml30%乙醇溶液，加入5%亚硝酸钠0.5ml，摇匀，放置6min。加入10%硝酸铝溶液0.5ml，放置6min，加入4%氢氧化钠溶液4.0ml，以蒸馏水稀释至刻度线。摇匀后放置15min，在510nm处测定吸光度。
39.将按照上述方法制得的黄芪粗提液浓缩至10ml，准确吸取2ml于10ml容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.5ml，摇匀，放置6min。加入10%硝酸铝溶液0.5ml，放置6min。加入4%氢氧化钠溶液4.0ml，摇匀。加入30%乙醇至刻度线，放置15min，在510nm处测定吸光度。
40.c. 总皂苷的提取及测定标准曲线的制作：准确称取黄芪甲苷5mg置于25ml容量瓶中，加入甲醇，定容至刻度线，溶解摇匀，即得0.2mg/ml黄芪甲苷溶液。分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6和0.8ml黄芪甲苷标准品加入干燥的试管中，水浴蒸发多余甲醇，加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，于60℃恒温水浴中加热15min，取出。流水冷却2min，加冰醋酸5ml，摇匀，以相应试剂为空白对照，在590ml处测吸光度。
41.准确吸取黄芪浓缩液0.2ml于干燥的试管中，水浴蒸发上清液，加入新鲜配制的5%香草醛－冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，在60℃水浴中加热15min，取出。流水冷却2min，加人冰醋酸5ml，摇匀，在590nm处测定吸光度。
42.经测定，用菌株my-yd-1发酵过的黄芪发酵液，主要活性成分的含量明显高于其他11个菌株，其中总多糖为14.5mg/ml（图3，组1），发酵过程中含量变化（图4）；总黄酮为0.11mg/ml（图3，组3），发酵过程中含量变化（图5）；总皂苷的含量为0.68 ml/ml（图3，组5），发酵过程中含量变化（图6）；未经发酵的对照组黄芪中总多糖为8.4 mg/ml（图3，组2），总黄酮为0.08mg/ml（图3，组4），总皂苷的含量为0.45ml/ml（图3，组6）。
43.经过上述一系列实验证明，菌株my-yd-1用于发酵黄芪使其主要活性成分总多糖、总黄酮、总皂苷的产量分别提高了72.6%，37.5%，和51.1%；如运用到生产和生活中，将会带来巨大的经济价值。
44.实施例3包含菌株my-yd-1的发酵菌剂的制备实施例
将菌株my-yd-1（接种量为103cfu）接入mrs培养基斜面进行培养：时间：16-24小时，环境：厌氧发酵，温度：36.5-37.5℃，初始ph：6.0-6.4。
45.mrs斜面培养基成分为：1%蛋白胨，1%牛肉浸膏，0.5%酵母粉，0.2%枸橼酸二胺，2%葡萄糖，0.5%乙酸钠，0.2%磷酸氢二钾，0.0058%的mgso4·
7h2o，0.025%的mnso4·
4h2o，0.1%（v/v）的吐温-80，ph为6.2，3%琼脂。
46.将上步得到的培养物（接种量为10
3 cfu）为接入一级或二级种子培养基培养：时间24-48小时，环境：厌氧发酵，温度：36.5-37.5℃，转速100r/min，初始ph：6.0-6.4，培养后得到发酵菌剂。
47.种子培养基成分为：1%蛋白胨，1%牛肉浸膏，0.5%酵母粉，0.2%枸橼酸二胺，2%葡萄糖，0.5%乙酸钠，0.2%磷酸氢二钾，0.0058%的mgso4·
7h2o，0.025%的mnso4·
4h2o，0.1%（v/v）的吐温-80，ph为6.2。
48.实施例4菌株my-yd-1的鉴定（1）pcr扩增16s rdna1）扩增模板的获得。另取1ml的上述最后一次培养得到的菌株的菌液于1.5ml的ep管中，10000 g转速离心1min，弃去培养基，加入1ml的灭菌超纯水，重悬，再次10000 g转速离心1min，弃去上清液，重复3遍，最后加入0.2mmol/l的溶菌酶1ml，重悬，在振荡器上振荡20min，得到用于pcr扩增的模板。
49.2）pcr体系为50μl，其中mix为25μl，模板为1μl，引物27f为1μl（10 μm），引物1492r为1μl（10 μm），ddh2o为22μl。
50.所用引物为27f（5
’‑
agagtttgatcctggctca-3’）,seq id no：2和1492r（5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’）,seq id no：3。扩增片段长度约1500bp。
51.3）pcr条件dna双链在95℃，5min的条件下预变性；95℃，30s变性；55℃，30s，复火；72℃，70s延伸，并循环27次，最后72℃下保持10min。
52.（2）琼脂糖凝胶电泳称取0.8g琼脂糖溶于80ml的1*tae溶液中，微波炉加热2min溶解后，加入8μl核酸染料；注胶凝固后，每个点样孔加样3-5μl；于220v电压下运行10min；胶板在uv下观察图像，挑选条带清晰的pcr产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序。
53.（3）16s rdna序列分析鉴定经北京擎科生物科技有限公司测序，得到菌株my-yd-1的16s rdna序列如seq id no.1所示，并采用blast分析工具(blast.ncbi.nlm.nih.gov)与genbank/embl/ddbj数据库比对，经分析鉴定，菌株my-yd-1为蒙氏肠球菌（enterococcus mundtii）。
54.（4）该菌菌落图如图1所示，菌落特征为：呈球状，mrs琼脂培养基上菌落为白色，菌落大小0.5mm-0.8mm，凸起，光滑，湿润，不透明。
55.（5）该菌生理生化反应特性：溶血试验出现溶血，生化鉴定出现苦杏仁昔、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、水杨昔、蔗糖和海藻糖的阳性反应乳糖、接触酶、氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖酸钠、松三糖鼠李糖、核糖、山梨醇和木糖的阴性反应。
56.（6）菌株my-yd-1生长曲线的绘制：取第4代菌株my-yd-1接种到50 ml的mrs液体培养基中，在100r/min 、37 ℃条件下厌氧培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h，取出，根据需要稀释后测吸光度，设置三个平行重复，绘制菌的生长曲线，如图2所示。
57.依据形态特征、生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性16s rdna将该菌鉴定为蒙氏肠球菌（enterococcus mundtii）。该蒙氏肠球菌（enterococcus mundtii）已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no:m 20211504，保藏日期为2021年11月29日，命名为my-yd-1。
58.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。