一种靶向切除尾叶桉CAD基因编码区DNA的基因编辑方法与流程

一种靶向切除尾叶桉cad基因编码区dna的基因编辑方法
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及尾叶桉cad基因编码区dna的靶向切除。


背景技术：

2.桉树是世界三大速生树种之一，中国引种桉树已有100多年历史，逐渐发展成为南方人工林种植与加工利用的主导树种。近年来许多国际大型造纸企业竞相在两广、海南地区投产建厂，纸浆材需求急速攀升。尾叶桉(eucalyptus urophylla)具有木材纤维素含量较高，木质素、热水抽出物含量低的特性，更易于制浆和漂白，是两广地区首选的制浆纤维原料林造林树种。木质素含量是纸浆材遗传选育中的重要选择性状之一。早在20世纪末即有学者尝试利用基因工程技术控制木质素代谢中关键酶基因的特异性表达，开展低木质素含量桉树育种研究。肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, cad)是尾叶桉木质素合成的关键酶之一，在木质素单体合成途径的最后一步中催化羟肉桂醛转变为对应的醇，促进木质素前体的形成。抑制cad基因表达的转基因烟草中木质素含量显著降低，对尾叶桉cad基因进行敲除很可能降低其木质素含量，这与纸浆材品种选育目标相一致，具有极大的研究价值。
3.随着分子育种技术的发展，更先进的crispr/cas9基因编辑技术具有操作简单高效、靶向特异性强、可同时进行多基因编辑等优势，亦可更容易获得不含外源片段的个体，安全性更高，因此在水稻、小麦等农作物中被广泛应用，但在大多数林木树种中的研究尚停留在技术体系摸索阶段。2018年起有学者尝试将crispr/cas9技术应用于桉树分子育种当中，但可能受桉树遗传转化技术尚不成熟所限，未见有应用载体转化植物后的基因编辑成功的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的：提供一种靶向切除尾叶桉cad基因编码区dna的基因编辑方法。该方法针对尾叶桉cad基因设计靶位点，利用该方法提供的靶点序列进行基因编辑，具有靶向性强的基因编辑效果。
5.本发明是这样实现的：一种靶向切除尾叶桉cad基因编码区dna的基因编辑方法，包括以下步骤：（1）构建含有grna1(seq id no. 1)和grna2(seq id no. 2)两个靶点序列的基因编辑载体。
6.（2）将含有grna1和grna2两个靶点序列的基因编辑载体转化尾叶桉原生质体，或通过农杆菌转化、基因枪等手段将基因编辑载体转化至尾叶桉植株。
7.（3）对转化获得的尾叶桉植物材料提取dna进行pcr鉴定，通过电泳检测dna切除效果。
8.详细的步骤可参考具体实施方式。
9.本发明的有益效果：1、本发明首次公开了靶向切除尾叶桉cad基因编码区dna的两个靶位点，并利用靶点序列成功实现了对目标基因的靶向切除。
10.2、本发明建立的基因编辑方法靶向性强，可应用于桉树基因编辑育种，为进一步创制cad敲除突变体提供研究基础。
附图说明
11.图1：靶位点设计示意图。
12.图2：prgeb35载体结构示意图。
13.图3：分离获得的原生质体。
14.图4：原生质体pcr扩增产物电泳图。
具体实施方式
15.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
16.实施例1：基因编辑载体构建根据尾叶桉glu4无性系中cad基因序列kf467162.1，利用crispr-pv2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)分析序列中的的潜在靶点，选择位于第2个外显子前端和第3个外显子末端的两个靶位点用于基因编辑(图1)，序列为tacatcaaggtgttgagctgcgg (grna1，seq id no. 1)和tacaatgacgtgtacaccgatgg (grna2，seq id no. 2)，下划线为pam序列。prgeb35载体元件结构如图2，pgtr中携带串联的trna-grna scaffold片段。
17.依据grna1、grna2、pgtr序列分别设计包含bsai酶切位点的引物cad-1f、cad-1r、cad-2f、cad-2r以及lf、lr引物（表1）用于载体构建。以pgtr质粒为模板分别用sf/cad-1r、cad-1f/cad-2r、cad-2f/sr扩增初级片段。将pcr产物用试剂盒纯化后使用golden gate assembly kit (neb)将初级片段与经bsai酶消化处理的prgeb35载体骨架连接。连接产物转化dh5α 大肠杆菌菌株，利用载体上的测序引物v-f/v-r（表1）测序确定插入片段正确的克隆，命名为prgeb35-cad。
18.表1 引物序列
实施例2：桉树原生质体分离取尾叶桉glu4无性系继代苗茎尖0.1 g，用小刀切成0.5 mm长的丝状小段，加入10 ml mannitol (.5 mol/l)黑暗放置10 min。弃处理液后，加入10 ml 酶解液(1.5% 纤维素酶r-10, 0.75% 离析酶r-10, 10 mmol/l ph=5.7 mes, 0.5 mol/l mannitol, 1 mmol/l cacl2, 5 mmol/l β-巯基乙醇, 0.1% bsa)，锡箔纸包裹避光，抽真空0.5 h后置于40 r/min摇床酶解6 h。酶解结束前20 min，转速调至80 r/min加速摇晃。贴壁加入10 ml w5 (2 mmol/l ph=5.7 mes, 154 mmol/l nacl, 5 mmol/l kcl, 125 mmol/l cacl2)，手摇1 min，锡纸包好后继续60 r/min摇床20 min。取40 μm孔径的细胞筛用95%乙醇清洗吹干，用w5冲洗，300 g离心3 min过滤上述酶解液，弃上清。贴壁加入10 ml w5重悬原生质体，取出部分计数，其余黑暗放置1 h后100 g离心3 min，弃上清。加入mmg缓冲液(4 mmol/l ph=5.7 mes, 0.6 mol/l mannitol, 15 mmol/l mgcl2)重悬，使原生质体浓度达到1
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106/ml，分离出的原生质体细胞形态正常，状态良好(图3)。
19.实施例3：原生质体转化将prgeb35-cad质粒转化桉树原生质体，抽提原生质体dna，使用位于两个靶位点外侧的eucad-f/eucad-r引物（表1）能够扩增到包含两个靶位点的片段，据此进行基因编辑效果检测。收集转化后的原生质体提取dna作为模板进行pcr扩增，wt原生质体中应获得833 bp的cad基因片段，转化成功并发生基因编辑的原生质体中两个靶位点之间的335 bp片段被删除，可扩增得到498 bp片段，两者可通过琼脂糖凝胶电泳进行区分，直观检测到基因编辑结果。
20.电泳结果显示，两组转化后的原生质体检测到约500 bp的目标条带，wt中则仅有约800 bp条带，证实转化prgeb35-cad的原生质体中发生了预期的基因编辑(图4)。


技术特征：
1.一种靶向切除尾叶桉cad基因编码区dna的基因编辑方法，其特征在于：所述基因编辑方法使用grna1和grna2两个靶位点完成。2.根据权利要求1所述的grna1靶位点，其特征在于具有seq id no. 1所示的dna序列，位置在于尾叶桉cad基因编码区243-256bp处。3.根据权利要求1所述的grna2靶位点，其特征在于具有seq id no. 2所示的dna序列，位置在于尾叶桉cad基因编码区569-605bp处。

技术总结
本发明公开了一种靶向切除尾叶桉CAD基因编码区DNA的基因编辑方法。本发明提供的方法是利用根据尾叶桉CAD基因设计靶位点gRNA1和gRNA2，通过基因编辑靶向切除尾叶桉CAD基因编码区片段。本发明提供的基因编辑方法靶向性强，可应用于桉树基因编辑育种，为进一步创制CAD敲除突变体提供研究基础。CAD敲除突变体提供研究基础。


技术研发人员：陈博雯 黄开勇 袁剑英 钟连香 李红 覃玉凤 林东
受保护的技术使用者：广西壮族自治区林业科学研究院
技术研发日：2021.11.29
技术公布日：2022/3/1