细胞间遗传标记示踪技术的制作方法

1.本发现涉及细胞间遗传标记示踪系统、方法及其用途。


背景技术：

2.遗传谱系示踪技术是研究发育、疾病与再生的有效手段。实时标记细胞之间的接 触对于揭示复杂的生命现象非常重要，另外，示踪接触细胞的命运也能带来很多重大 的发现。
3.细胞之间的相互作用在多细胞生物体内发挥着重要作用，解析细胞之间的相互作 用对于研究机体稳态和病理机制至关重要，目前还缺少有效的研究细胞相互作用的工 具。除了分泌各种细胞因子影响邻近细胞外，细胞之间的直接物理接触对细胞正常功 能的维持必不可少。在早期，判定两个细胞是否物理接触采用的手段通常是电镜照片， 但是电镜结果并不能反映体内的真实情况。近期有研究利用细胞膜上的转肽酶实现相 邻细胞的标记(pasqual et al.,2018)，但是蛋白水平上的标记不能长时程示踪、解析 和干预细胞命运。cre-loxp同源重组系统可以谱系示踪和调控基因，但只能在单个 细胞内发生，不能跨细胞反应，无法解读细胞之间的相互作用。因此，将体内细胞间 相互作用的信号转变为可操控的遗传信息将极大的推进基因体内的功能性研究。
4.细胞表面配体和受体特异性结合会激活下游信号通路，进而影响特定基因的转录 表达。notch信号通路借助配体-受体特异性结合在多细胞生物体内发挥着重要作用。 当细胞表面的delta家族配体与notch受体结合后，一系列的膜内蛋白剪切过程发生 (kopan and ilagan,2009)，包括解聚素(disintegrin)，金属蛋白酶(adam)和γ
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分泌酶复合物(γ-secretase complex)的蛋白水解。蛋白剪切完成后，notch胞内段从 细胞膜释放并作为转录调节因子入核，调节靶基因的表达。如图1(a)所示。
5.本发明通过人工改造notch信号通路的受体和配体提供一种细胞间遗传标记示 踪系统，实现邻近细胞的标记。


技术实现要素：

6.本发明第一方面提供一种融和蛋白，所述融和蛋白包括第一标记物受体，notch 跨膜结构域或与其具有至少90％序列相同性并具有释放胞内段功能的突变体和用于 激活细胞内感兴趣蛋白表达的效应子结构域。
7.在一个或多个实施方案中，所述第一标记物是第一示踪标记物，优选第一光学 标记物。在一个或多个实施方案中，所述第一标记物是荧光蛋白，优选选自绿色荧光 标记、红色荧光标记、黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白；更优选为gfp。
8.在一个或多个实施方案中，所述第一标记物受体的氨基酸序列如seq id no:1 的1-159所示或与其具有至少90％序列相同性并具有荧光显色功能的突变体。
9.在一个或多个实施方案中，所述notch跨膜结构域的氨基酸序列如seq id no: 1的160-492所示。
10.所述效应子结构域是转录因子，优选tta转录因子，tta转录因子的氨基酸序 列如seq id no:1的493-740所示或与其具有至少90％序列相同性并具有转录因子 功能的突变体。
11.在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。
12.本发明第二方面提供核酸分子，包含选自以下的多核苷酸序列：(1)本发明第 一方面中任一实施方案所述的融合蛋白的编码序列；(2)(1)的5’端具有rox或 loxp和终止序列的序列；(3)(1)或(2)所述序列的互补序列；和(4)(1)
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(3)中任一序列的片段。
13.在一个或多个实施方案中，(2)是(1)的5’端具有rox-终止序列-rox或loxp
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终止序列-loxp的序列。
14.在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列如seq id no:2、12或13所示。
15.在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列在(1)-(3)中任一序列的两端 还包含用于同源重组的同源臂；优选地，所述同源重组使同源臂中的序列在细胞中由 组织特异启动子调控。
16.本发明第三方面提供一种多核苷酸产品，包含：
17.(a)权利要求3第(1)－(3)项中任一项所述的多核苷酸序列，和任选的下 述(b)-(e)中的一种或多种：
18.(b)编码受所述效应子结构域活化的重组酶cre或dre的多核苷酸序列，
19.(c)选自如下结构的多核苷酸序列：loxp-终止序列-loxp-第二标记物和rox
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终止序列-rox-第二标记物，
20.(d)编码在细胞表面表达的第一标记物的多核苷酸序列，优选其5’末端具有 rox-终止序列-rox或loxp-终止序列-loxp，更优选地，所述编码第一标记物的多核苷 酸序列在两端还包含用于同源重组的同源臂，更优选地，所述同源重组使同源臂中的 序列在细胞中由第二组织特异启动子调控，
21.(e)编码重组酶cre或dre与雌激素受体er的融合蛋白的多核苷酸序列。
22.在一个或多个实施方案中，(a)中所述多核苷酸序列在两端还包含用于同源重 组的同源臂，更优选地，所述同源重组使同源臂中的序列在细胞中由第一组织特异启 动子调控。
23.在一个或多个实施方案中，(d)中所述编码第一标记物的多核苷酸序列的5
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末端具有rox或loxp和终止序列，优选其5’末端具有rox-终止序列-rox或loxp-终 止序列-loxp。
24.在一个或多个实施方案中，(d)中所述编码第一标记物的多核苷酸序列在两端 还包含用于同源重组的同源臂，优选地，所述同源重组使同源臂中的序列在细胞中由 第二组织特异启动子调控。
25.在一个或多个实施方案中，所述重组酶cre的氨基酸序列如seq id no:3所示。
26.在一个或多个实施方案中，所述重组酶dre的氨基酸序列如seq id no:4所示。
27.在一个或多个实施方案中，所述终止序列的核酸序列如seq id no:7的 1764-2629所示。
28.在一个或多个实施方案中，所述第一标记物是荧光蛋白，优选gfp。在一个或 多个实施方案中，gfp的氨基酸序列如seq id no:8所示。
29.在一个或多个实施方案中，所述第二标记物是第二示踪标记物，优选第二光学 标记物。在一个或多个实施方案中，所述第二标记物是荧光蛋白，优选tdtomato。 在一个或多个实施方案中，tdtomato的氨基酸序列如seq id no:6所示。
30.在一个或多个实施方案中，所述雌激素受体er的氨基酸序列如seq id no:9 所示。
31.在一个或多个实施方案中，(b)的多核苷酸序列如seq id no:5所示。
32.在一个或多个实施方案中，(c)的多核苷酸序列如seq id no:7所示。
33.在一个或多个实施方案中，(d)的多核苷酸序列如seq id no:10或11所示。
34.在一个或多个实施方案中，所述第一和第二组织特异启动子不同。
35.本发明还提供本文任一实施方案的核酸分子或多核苷酸产品的核酸构建物，优 选所述核酸构建物是载体。
36.本发明还提供宿主细胞，所述宿主细胞：
37.(a)含有权利要求3第(1)－(3)项中任一项所述的多核苷酸序列和/或表 达权利要求1或2所述的融合蛋白，优选地，(a)中所述多核苷酸序列或融合蛋白 在宿主细胞中由组织特异启动子调控；
38.(b)含有权利要求3所述的核酸分子；
39.(c)含有权利要求4所述的多核苷酸产品；和/或
40.(d)含有权利要求5所述的核酸构建物。
41.本发明还提供一种细胞标记方法，包括：提供表面表达第一标记物的第一细胞， 提供含有本文任一实施方案所述的多核苷酸产品或核酸构建物的第二细胞，和在第一 细胞与第二细胞接触后，通过第二标记物对第二细胞或其后代细胞进行标记。
42.本发明还提供一种体内细胞标记方法，包括：提供转基因动物，其含有表面表 达第一标记物的多核苷酸序列和本文任一实施方案所述的多核苷酸产品或核酸构建 物，和在转基因动物中通过第二标记物对细胞进行标记。
43.本发明还提供本文任一实施方案所述的融和蛋白、核酸分子、多核苷酸产品、 核酸构建物或宿主细胞在细胞标记或细胞示踪中的用途。
44.本发明还提供一种构建转基因动物的方法，包括将本文任一实施方案所述的核 酸分子导入动物细胞并培养，筛选基因组中包含所述多核苷酸序列的转基因动物。
45.本发明还提供一种构建转基因动物的方法，包括：
46.(1)提供第一转基因动物，其基因组中含有本文第三方面所述的(a)-(e)的多 核苷酸序列中一种或多种多核苷酸序列；
47.(2)提供第二转基因动物，其基因组中含有本文第三方面所述的(a)-(e)的多 核苷酸序列中与第一转基因动物所含不同的一种或多种或剩余多核苷酸序列；和
48.(3)将所述第一转基因动物和所述第二转基因动物交配，在子代动物中发生同源 重组从而获得子代转基因动物。
附图说明
49.图1：notch信号通路及其改造模式。(a)生物体内正常的notch信号通路。(b) 改造的notch跨膜蛋白。(c)改造过的notch信号通路。(d)永久标记受体细胞。
50.图2：构造并鉴定tnnt2-gfp小鼠。(a)同源重组技术将gfp-wpre-polya序 列插入tnnt2基因第一个密码子前面。(b)tnnt2-gfp小鼠e9.5的胚胎，只有心脏 特异性表达绿色荧光蛋白gfp。(c)tnnt2-gfp小鼠e9.5的胚胎切片染色，只有心 肌细胞特异性表达gfp，内皮细胞不表达。(d)tnnt2-gfp小鼠p0各个组织切片染 色，只有心肌细胞特异性表达gfp蛋白，其他组织不表达gfp。(e)tnnt2-gfp小 鼠p0心脏切片染色，p0小鼠几乎全部心肌都表达gfp，内皮细胞不表达gfp。(f) tnnt2-gfp小鼠8周各个组织整片(wholemount)荧光照片，只有心脏表达gfp荧 光蛋白，其他组织不表达。(g)tnnt2-gfp小鼠8周心脏切片染色，gfp特异性表 达在心肌细胞。b和f中比例尺为1mm，其他比例尺为100μm。tnnt2是心肌细胞特 异表达基因。
51.图3：构造并鉴定cdh5-agfp-tta小鼠。(a)同源重组技术将agfp-tta-wpre-polya 序列插入cdh5基因第一个密码子前面。(b)cdh5-agfp-tta小鼠p0各个组织切片染色， 只有内皮细胞特异性表达agfp-tta重组蛋白。重组蛋白中含有myc-tag，因此染色时用 到myc-tag抗体。其他组织未发现表达agfp-tta。比例尺为100μm。
52.图4：通过细胞接触标记邻近细胞。(a)分别为四种基因型小鼠e9.5胚胎，x-gal 整片染色。当内皮细胞中不表达notch受体agfp-tta时，检测不到lacz信号；当 心肌细胞不表达配体gfp时，同样检测不到lacz信号。只有当内皮细胞表达受体， 同时心肌细胞表达配体，此时才能检测到lacz信号(如a(4)所示)。而且lacz 信号只表达在心脏。(b)tnnt-gfp；cdh5-agfp-tta；teto-lacz小鼠e9.5胚胎切片， 免疫组化染色。lacz阳性的细胞紧贴着心肌细胞。(c) tnnt-gfp；cdh5-agfp-tta；teto-lacz小鼠e9.5胚胎切片，免疫组化染色。lacz阳性 的细胞是pecam阳性的内皮细胞，可以看到这些内皮细胞紧贴心肌细胞，说明内皮 与心肌细胞之间存在物理接触，接触的内皮细胞被标记为lacz阳性。(d)心室、心 房以及房室垫中lacz阳性内皮细胞的比例统计。心室中大约50％的内皮细胞被标记， 心房中大约有70％的内皮细胞被标记，房室垫中的内皮细胞由于和心肌细胞分离，且 发生了emt，几乎检测不到lacz阳性的内皮细胞。a和f中比例尺为1mm，其他比 例尺为100μm。
53.图5：根据一个实施方案的永久性标记并示踪邻近细胞的示例。(a)永久性标 记邻近细胞的过程。心肌表面的gfp配体同内皮细胞表面的受体结合后，激活内皮 细胞的notch通路，cre激活表达，切割rosa26位点的终止序列，红色荧光蛋白表 达，内皮细胞被永久标记。(b)e9.0,e10.0以及p0三个时间点的房室垫以及瓣膜。 (c)e9.0胚胎心脏整片图，右边为切片免疫荧光。通过心肌被标记的心内膜脱离心 肌，迁移到房室垫。这些被标记的心内膜及其子代会一只表达红色荧光蛋白tdtomato。 (d)e10.0胚胎整片图，右边为切片免疫荧光。大量被标记的心内膜细胞向方式垫迁 移，并发生emt产生间质细胞。间质细胞不再表达cdh5,但仍然被tdtomato标记。 (e)四种基因型小鼠心脏整片图。只有当tnnt2-gfp和cdh5-agfp-tta同时存在时， 才能激活报告基因，标记内皮细胞。dox可以抑制tta同tet启动子结合，从而阻止 报告基因的激活。当给小鼠饮用dox后，内皮细胞无法被标记。因此，我们可以通 过dox在时间上控制标记。(f和g和h)p0小鼠心脏切片以及流式分析内皮细胞标 记百分比。对照组以及饮用dox组几乎检测不到tdtomato阳性的内皮细胞，四基因 型无处理组中的内皮几乎全部被标记。(i)p0小鼠心脏瓣膜切片染色。瓣膜表面的 心内膜被标记为tdtomato，同时瓣膜处大量的pdgfra阳性的间质细胞也被标记为 tdtomato，说明这些间质细胞的祖细胞是在胚胎早期与心肌接触过的内皮细胞。比例 尺为100μm。
构域和效应子结构域。
60.本文所述的“第一标记物”或“第二标记物”可以是本领域已知的任何标记物。 所述的“第一”和“第二”仅是为了相对区分两种物质，并非旨在限制物质的顺序、 成分或关系。本文中，“标记物”可以是任何便于展示、示踪的物质，例如核酸、蛋 白质、脂质、碳水化合物、代谢产物，只要该物质自身或其衍生物可以以某种方式提 示自身的存在性，例如通过抗原抗体反应、光学显示、对抗生素的响应、化学修饰例 如甲基化的方式。本文示例中，第一标记物或第二标记物为荧光蛋白，包括但不限于 绿色荧光标记(如gfp、zsgreen)、红色荧光标记(如tdtomato、dsred、mcherry)、 黄色荧光蛋白(yfp)和青色荧光蛋白(cfp)等。优选的是，第二标记物与第一标 记物不同。第一标记物和/或第二标记物可在细胞表面表达。优选地，第一标记物在 细胞表面表达。适用于本文的标记物也包括保留了标记功能的标记物突变体，例如保 留了荧光功能的荧光蛋白突变体。示例性的标记物是gfp和tdtomato，序列分别如 seq id no:8和seq id no:6所示。本文中提及gfp和tdtomato均是为了便于描 述的示例性实施方式，本领域技术人员容易理解gfp和tdtomato可以替换为任何标 记物或荧光蛋白。
61.本文中，标记物受体则为可与标记物特异性结合的物质，如标记物的特异性抗体。 优选地，该特异性抗体是纳米抗体。本领域周知，纳米抗体指缺失轻链的抗体，该抗 体只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2与ch3区，是目前已知的可结 合目标抗原的最小单位。适用于本文的特异性抗体也包括保留了配体结合能力的抗体 突变体。在本发明的一些实施方案中，第一标记物为gfp，其受体为gfp的纳米抗 体。本文中提及gfp抗体均是为了便于描述的示例性实施方式，本领域技术人员容 易理解gfp抗体可以替换为对应标记物或荧光蛋白的相应抗体。在某些实施方案中， 适用于本发明第一标记物受体的氨基酸序列如seq id no:1第1-159位所示。
62.适用于本文的效应子结构域可以是本领域已知的任何效应子结构域，例如转录因 子。在某些实施方案中，效应子结构域是反式作用因子。在某些实施方案中，效应子 结构域是tta或rtta转录因子。当改造的notch跨膜蛋白激活后，tta从细胞膜上 释放并入核，作为转录激活因子与tet启动子结合，激活后续基因的表达。在某些实 施方案中，适用于本发明效应子结构域的氨基酸序列如seq id no:1第493-740位所 示。在某些实施方案中，tta-tet系统可以更换为gal4-uas系统；在某些实施方案 中，效应子结构域是cre或creer,dre或dreer,flp等重组酶。当改造的notch跨 膜蛋白激活后，重组酶从细胞膜上释放并入核，重组报告基因前端的终止序列，激活 报告基因的表达；或者用于敲基因，终止特定基因的表达。
63.本发明改造的notch跨膜蛋白中，所述notch跨膜结构域包括野生型notch跨膜 蛋白所含的天然的notch跨膜结构域。示例性的天然的notch跨膜结构域如seq idno:1的160-492所示。本发明改造的notch跨膜蛋白中的notch跨膜结构域也包括 本领域已知的对该跨膜结构域做出了突变、但突变所得的跨膜结构域仍保留了天然跨 膜结构域所具有的生物学功能的突变体(即突变后，notch跨膜蛋白仍能在其胞外区 与配体蛋白结合后释放胞内效应区域)。因此，本发明的改造的notch跨膜蛋白的跨 膜结构域可如seq id no:1的160-492所示，或者与seq id no:1的160-492具有 至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、 更优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性
的氨基酸序列；或者与seq id no:1 第160-492位氨基酸序列相比具有一个或多个(20个以内)氨基酸突变，优选是取代， 更优选是保守性取代。
64.在某些实施方案中，本文的改造的notch跨膜蛋白的氨基酸序列如seq id no:1 所示。
65.本文也包括重组酶cre或dre与雌激素受体er的融合蛋白。在一个实施方案中， 所述融合蛋白的氨基酸序列从n端到c端分别是重组酶cre-er和/或dre-er与雌激 素受体er。本文也包括编码重组酶cre或dre与雌激素受体er的融合蛋白的多核 苷酸序列。在没有诱导剂的情况下，cre-er和dre-er位于细胞胞质中。在诱导剂如 他莫昔芬存在的情况下，cre-er和dre-er入核，可以对基因组中存在的识别区域进 行重组。
66.本文的cre重组酶可以是本领域周知的cre重组酶，其基因编码区序列全长 1029bp(embl数据库登录号x03453)，编码由343个氨基酸组成的38kda的单体 蛋白。cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的dna序列， 即loxp位点，能介导两个loxp位点(序列)之间的特异性重组，使loxp位点间的 基因序列被删除或重组。适用于本文的cre重组酶也包括保留了重组酶酶活的cre的 突变体。在某些实施方案中，重组酶cre的氨基酸序列如seq id no:3的所示。dre 是一种与cre相类似的同源重组酶，与cre特异性的识别loxp位点类似，dre特异性 识别另外一个重组位点rox。适用于本文的dre重组酶也包括保留了重组酶酶活的dre 的突变体。在某些实施方案中，重组酶dre的氨基酸序列如seq id no:4所示。本 文所述的“loxp”和“rox”具有本领域公认的含义，其序列为本领域所周知。
67.本文所述蛋白或多肽也包括与所述蛋白或多肽具有至少80％序列相同性并保留 蛋白或多肽活性的变体。所述变体包括：与参照序列具有至少70％，至少80％，优 选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参 照序列的生物学活性(如荧光显色、释放胞内段、转录因子功能等活性)的氨基酸序列。 可采用例如ncbi的blastp计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括 在所述氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该参照序 列的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－50个以内，例如1-20、1-10、 1-8、1-5或1-3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似 的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似 的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧 链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、 谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝 氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨 基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基 替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
68.本文包括核酸分子，其包含编码本文所述改造的notch跨膜蛋白的多核苷酸序列 或其互补序列。该多核苷酸序列可含有本文所述的改造的notch跨膜蛋白的编码序列， 和/或与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列或基因组同源重组所需的序列。 本文的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna或人工合成的dna。dna可以是单链的
适用于本文的标记物也包括保留了标记功能的标记物突变体，例如保留了荧光功能的 荧光蛋白突变体。在一个或多个实施方案中，所述第一标记物是gfp。gfp的氨基 酸序列如seq id no:8所示。所述多核苷酸序列可含有本文所述的第一标记物的编 码序列，和/或与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列或基因组同源重组所需 的序列。所述多核苷酸序列还可在第一标记物的编码序列的5’末端具有rox或loxp 和终止序列，从而可以利用cre或dre调控第一标记物的表达。示例性的此类多核苷 酸可具有结构：rox-终止序列-rox-第一标记物或loxp-终止序列-loxp第一标记物。在 一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列与诱导型或组成型启动子操作性连接。在 某些实施方案中，编码第一标记物的多核苷酸可具有结构：同源臂-rox-stop-rox-gfp
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同源臂或者同源臂-loxp-stop-loxp-gfp-同源臂。在一个或多个实施方案中，同源臂 是将其中的序列导入rosa26位点的同源臂。
76.本发明还提供多核苷酸产品。本文所述“多核苷酸产品”表示包含一种或多种本 文所述多核苷酸序列的产品。多核苷酸产品中包含的多核苷酸序列可相同或不同。所 述多种多核苷酸序列可以以任意数量相互关联或彼此相互独立。在一个实施方案中， 所述多核苷酸产品包括彼此分开的多种多核苷酸序列。本发明的多核苷酸产品包含(a) 权利要求3第(1)－(3)项中任一项所述的多核苷酸序列，和任选的下述(b)
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(e)中的一种或多种：(b)编码受所述效应子结构域活化的重组酶cre或dre的多 核苷酸序列，(c)选自如下结构的多核苷酸序列：loxp-终止序列-loxp-第二标记物 和rox-终止序列-rox-第二标记物，(d)编码在细胞表面表达的第一标记物的多核苷 酸序列，优选所述编码第一标记物的多核苷酸序列在两端还包含用于同源重组的同源 臂，更优选地，所述同源重组使同源臂中的序列在细胞中由第二组织特异启动子调控， (e)编码重组酶cre或dre与雌激素受体er的融合蛋白的多核苷酸序列。
77.在示例性实施方案中，多核苷酸产品包括(1)编码本文所述的notch跨膜蛋白 的多核苷酸序列或其互补序列，和任选的(2)编码受notch跨膜蛋白的效应子结构 域活化的重组酶cre或dre的多核苷酸序列或其互补序列，和/或(3)选自如下结构 的多核苷酸序列或其互补序列：loxp-终止序列-loxp-第二标记物，和rox-终止序列
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rox-第二标记物。在另一个示例性实施方案中，多核苷酸产品包括(1)编码本文所 述的notch跨膜蛋白的多核苷酸序列或其互补序列，所述notch跨膜蛋白的编码序列 的5’末端具有rox或loxp和终止序列，和(2)编码重组酶cre或dre与雌激素受 体er的融合蛋白的多核苷酸序列或其互补序列。
78.本文还包括含有本文所述多核苷酸的核酸构建物。本文包括含有编码本文所述 notch跨膜蛋白的多核苷酸序列的第一核酸构建物。该核酸构建物含有本文所述的 notch跨膜蛋白的编码序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列或基 因组同源重组所需的序列。本发明所述的notch跨膜蛋白可以多种方式被操作以保证 所述跨膜蛋白的表达，例如同源重组。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体 的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组dna方法来改变多核苷酸序列的 技术是本领域已知的。示例性的第一核酸构建物包含agfp-tta。
79.本文所述“调控序列”可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白 的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核 苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或 异源的
酸产品的核酸构建物。或者，细胞标记系统包含：(1)第一核酸构建物，含有编码 本文所述notch跨膜蛋白的多核苷酸序列，和任选的(2)第二核酸构建物，含有编 码受notch跨膜蛋白的效应子结构域活化的重组酶cre或dre的多核苷酸序列，和/ 或(3)第三核酸构建物，含有选自如下结构的多核苷酸序列：loxp-终止序列-loxp
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第二标记物，和rox-终止序列-rox-第二标记物。示例性的细胞标记系统包含：(1) 包含agfp-tta的第一核酸构建物，和任选的(2)包含teto-cre或teto-dre的第二 核酸构建物和/或(3)包含rox-stop-rox-tdt或loxp-stop-loxp-tdt的第三核酸构建物。 所述各核酸构建物还可包含位于各自对应的多核苷酸序列两端的基因组同源重组所 需的5’同源臂和3’同源臂。
87.或者，细胞标记系统包含：(1)第一核酸构建物，含有编码本文所述的notch 跨膜蛋白的多核苷酸序列，所述notch跨膜蛋白的编码序列的5’末端具有rox或loxp 和终止序列，和(2)第五核酸构建物，含有编码重组酶cre或dre与雌激素受体er 的融合蛋白的多核苷酸序列。在示例性实施方案中，细胞标记系统包含含有 rox-stop-rox-agfp-tta的第一核酸构建物和含有dre-er的第二核酸构建物，或者细 胞标记系统包含含有loxp-stop-loxp-agfp-tta的第一核酸构建物和含有cre-er的 第二核酸构建物。所述各核酸构建物还可包含位于各自对应的多核苷酸序列两端的基 因组同源重组所需的5’同源臂和3’同源臂。
88.核酸构建物可以是载体。例如，可将本文的多核苷酸序列插入到重组表达载体或 基因敲入载体中。在一些实施方案中，第一、第二、第三核酸构建物包含在同一载体 上。在某些实施方案中，第一、第二、第三核酸构建物是分开的载体。
89.术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病 毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。只要能在宿主体内复制和 稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启 动子、标记基因和翻译控制元件。表达载体还可包括翻译起始用的核糖体结合位点和 转录终止子。本文所述的多核苷酸序列可操作性地连接到表达载体中的适当启动子上， 以经由该启动子指导mrna合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp 启动子；λ噬菌体pl启动子；真核启动子包括cmv立即早期启动子、hsv胸苷激 酶启动子、早期和晚期sv40启动子、反转录病毒的ltr和其它一些已知的可控制 基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转化 的宿主细胞的表型性状，包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗 性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。当本文 所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，则将会使 转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对， 作用于启动子以增强基因的转录。
90.可将本文所述的载体转化适当的宿主细胞，以使其能够表达本文所述的蛋白。在 某些实施方案中，本文所述多核苷酸或细胞标记系统包含在宿主细胞的基因组中。宿 主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细 胞、或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。宿主细胞可为体细胞，例如心肌细胞和/ 或干细胞。宿主细胞可为内皮细胞，例如心脏内皮细胞和/或肝脏内皮细胞。宿主细 胞还可以是植物细胞。宿主细胞的代表性例子有：大肠杆菌；链霉菌属；鼠伤寒沙门 氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细 胞；cho、cos、293细胞、或bowes黑素瘤细胞
所述第一至第五核酸构建物中的一种、两种、三种或四种核酸构建物的第一转基因动 物；(2)提供基因组中含有本文所述第一至第五核酸构建物中的与(1)所述核酸构建 物不同的四种、三种、两种或一种核酸构建物的第二转基因动物；和(3)将所述第一 转基因动物和所述第二转基因动物交配，在子代动物中发生同源重组从而获得子代转 基因动物。本发明还包括利用本发明所述融合蛋白、编码序列、多核苷酸序列和/或 核酸构建物进行的体内细胞标记方法，包括：提供转基因动物，其含有表面表达第一 标记物的多核苷酸序列和本文所述的多核苷酸产品或细胞标记系统，和在转基因动物 中通过第二标记物对细胞进行标记。
98.将第一标记物的编码序列与在第一细胞表面表达的基因串联，可以得到在第一细 胞表面表达第一标记物的第一转基因动物。例如，利用同源重组技术，将 gfp-wpre-polya序列插入到心肌细胞特异性tnnt2基因的起始密码子前，可得到 tnnt2-gfp基因插入小鼠。采用同样的方法，将gfp-wpre-polya序列插入到alb基 因的起始密码子前，可得到alb-gfp基因插入小鼠。tnnt2-gfp小鼠只有心肌细胞表 达gfp蛋白，其他细胞不表达；而alb-gfp小鼠只有肝细胞表达gfp蛋白，其他细 胞不表达。
99.将本发明的notch融和蛋白的编码序列与在第二细胞中表达的基因串联，可以得 到在第二细胞中表达本文所述notch融和蛋白的第二转基因动物。例如，利用同源重 组技术将agfp-tta-wpre-polya序列插入到cdh5基因的起始密码子前，可以得到 cdh5-agfp-tta基因插入小鼠，其中agfp-tta表示notch融和蛋白的编码序列。 cdh5-agfp-tta小鼠只有内皮细胞表达notch融和蛋白agfp-tta，其他细胞不表达。
100.类似地，利用同源重组，可以得到包含编码受效应子结构域活化的重组酶cre或 dre的多核苷酸序列的第三转基因动物，和包含具有选自loxp-终止序列-loxp-第二 标记物和rox-终止序列-rox-第二标记物的结构的多核苷酸序列的第四转基因动物。例 如teto-cre基因型小鼠和rosa26-tdt基因型小鼠，这两种小鼠本领域已知。
101.通过第一-第四转基因动物的交配得到含有表面表达第一标记物的多核苷酸序列 和本文所述的多核苷酸产品或细胞标记系统的转基因动物。得到的转基因动物包含表 达受调控的cre或dre以及被终止序列阻断表达的第二标记物，并且该转基因动物的 第一细胞表达第一标记物，第二细胞表达本发明的notch融和蛋白。对于与第一细胞 相邻的第二细胞，在第一细胞表面表达的第一标记物识别第二细胞的notch融和蛋白 的第一标记物受体，从而激活第二细胞的notch通路，使得notch融和蛋白的效应结 构域从细胞膜上释放，激活cre或dre的表达。cre或dre能重组loxp位点或rox 位点，切割终止序列，从而激活第二标记物的永久性表达。
102.例如，通过小鼠交配得到tnnt2-gfp；cdh5-agfp-tta；teto-cre；rosa26-tdt四基 因型小鼠。在表达agfp-tta的内皮细胞与表达gfp的心肌细胞接触后，tta入核启 动cre的表达，cre切掉rosa26位点处的终止序列，tdtomato荧光蛋白永久表达， 内皮细胞被标记并示踪。同样，通过alb-gfp；cdh5-agfp-tta；teto-cre；rosa26-tdt 四基因型小鼠，可以标记并示踪与肝细胞(表达gfp)接触的内皮细胞(表达 agfp-tta)。
103.此外，本发明还涉及rosa26-rox-stop-rox-gfp或者rosa26-loxp-stop-loxp-gfp 小鼠。利用该小鼠，只需借助与特定细胞启动子关联的cre或dre小鼠，就能让特定 细胞表达配体gfp。例如，使用与心肌细胞启动子(tnnt2)或肝细胞启动子(alb) 关联的cre小鼠与
rosa26-rox-stop-rox-gfp小鼠交配，得到的 tnnt2-cre:rosa26-rox-stop-rox-gfp小鼠可以在心肌细胞中表达gfp，得到的 alb-cre:rosa26-rox-stop-rox-gfp可以在肝细胞中表达gfp。rosa26-rox-stop-rox-gfp 或者rosa26-loxp-stop-loxp-gfp小鼠可以利用本领域熟知的小鼠构建和交配方法获 得。例如，本发明还涉及rosa26-loxp-stop-loxp-rox-stop-rox-gfp小鼠，通过分别用 全身表达cre(例如actb cre)或dre(例如cag dre)的小鼠与 rosa26-loxp-stop-loxp-rox-stop-rox-gfp交配，可以得到rosa26-rox-stop-rox-gfp或 者rosa26-loxp-stop-loxp-gfp小鼠。
104.此外，本发明还涉及rosa26-rox-stop-rox-agfp-tta小鼠或 rosa26-loxp-stop-loxp-agfp-tta。利用这些小鼠，只需借助特定的cre或dre小鼠 (例如与特定细胞启动子关联的cre或dre小鼠)，就能让特定细胞表达受体 agfp-tta。例如，使用与内皮细胞启动子(cdh5)关联的cre小鼠与 rosa26-rox-stop-rox-agfp-tta小鼠交配，得到的 cdh5-cre:rosa26-rox-stop-rox-agfp-tta小鼠可以在内皮细胞中表达gfp。
105.本发明还提供试剂盒，所述试剂盒含有本文所述融和蛋白、编码序列、多核苷酸 序列、含所述多核苷酸序列的细胞标记系统或含所述细胞标记系统的宿主细胞，以及 将本发明所述的多核苷酸序列敲入细胞基因组中所需的试剂。
106.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解， 下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具 体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁 克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品 说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
107.材料与方法
108.一、实验材料：
109.试剂：rfp抗体、neun抗体、cdh5抗体、dapi、他莫昔芬(他莫昔芬)、多 聚甲醛(pfa)、蔗糖、pbs缓冲液、oct包埋剂、驴血清、triton x-100、x-gal、 戊二醛、egta、mgcl2、重铬酸钠、np-40和磷酸钠，购自商业途径。
110.设备：zeiss体式显微镜(axio zoom.v16)、olympus激光共聚焦显微镜 (fv1200)。
111.二、实验方法
112.1、基因插入小鼠的构建
113.采用crispr/cas9技术建立基因插入小鼠。该技术为通过设计针对目的基因的 guide rna引导cas9核酸酶对插入位置的基因组进行修饰，从而造成该基因修饰区 域同源重组效率增加，将目的片段同源重组到目的位点。该技术制备基因敲入小鼠的 路线如下：
114.(1)设计针对目的位点基因组的向导rna(guide rna，seq id no:22)靶序 列，并根据序列将其进行体外转录获得针对该基因的向导rna；
115.(2)构建用于目的片段重组的供体dna重组质粒。构建上述agfp-notchcore-tta载体所用的引物如下：5’arm：seq id no:14和seq id no:15； rgntta-wpre-polya：seq id no:16和seq id no:17；frt-pgk-neo-polya-frt： seq id no:18和seq id no:19；3’arm：seq id no:20和seq id no:21。基因打 靶载体图如图7，a～图7，e所示。
116.(3)将体外转录的向导rna及构建的供体dna重组质粒进行受精卵注射，获 得f0代小鼠；
117.(4)通过pcr及测序的办法对获得的f0代小鼠进行基因型鉴定；
118.(5)将f0代小鼠与野生型c57小鼠交配得到稳定的f1代基因插入小鼠。
119.2、x-gal染色，包括整片染色和切片染色
120.整片染色：
121.(1)去除胚胎后放入pbs中。在lacz固定液中固定30分钟，轻摇；
122.(2)lacz洗涤缓冲液清洗3次，每次10分钟；
123.(3)lacz染色液染色，避光，37℃，摇床；
124.(4)pbs清洗3次，每次10分钟，zeiss显微镜下拍照。
125.切片染色：
126.(1)按如上方式固定胚胎，在pbs中清洗3次；
127.(2)15％蔗糖-pbs脱水至胚胎下沉；
128.(3)30％蔗糖-pbs脱水至胚胎下沉；
129.(4)oct预包埋1小时，在-80℃包埋；
130.(5)冰切样本7-10μm，用lacz染色液染色；
131.(6)olympus显微镜下拍照。
132.3、免疫组织化学染色或免疫荧光染色
133.(1)胚胎或者组织置于pbs中，在4％pfa中固定1小时，pbs清洗三次；
134.(2)样本用30％蔗糖-pbs脱水至下沉；用oct预包埋1小时，并在-80℃包埋；
135.(3)冰切样本厚度为7-10μm；
136.(4)用pbs洗掉切片上的oct，pbs-0.1％triton x-100-5％驴血清封闭30分 钟；接着一抗4℃孵育过夜；
137.(5)次日二抗孵育30分钟,olympus显微镜拍照。
138.实施例
139.实施例1-转基因小鼠的构建
140.如图2所示，利用同源重组技术，将gfp-wpre-polya序列插入到tnnt2基因的 起始密码子前，得到心肌细胞特异性表达gfp小鼠tnnt2-gfp。采用同样的方法， 将gfp-wpre-polya序列插入到alb基因的起始密码子前，得到肝细胞特异性表达 gfp小鼠alb-gfp。通过pcr以及测序鉴定出正确插入的小鼠。切片染色发现，tnnt2-gfp小鼠只有心肌细胞表达gfp蛋白，其他细胞不表达；alb-gfp小鼠只有肝 细胞表达gfp蛋白，其他细胞不表达。因此，成功构建了两种提供配体细胞的小鼠。
141.如图3所示，利用同源重组技术，将agfp-tta-wpre-polya序列插入到cdh5 基因的起始密码子前，得到内皮细胞特异性表达agfp-tta小鼠cdh5-agfp-tta。我 们通过pcr以及测序鉴定出正确插入的小鼠。切片染色发现，cdh5-agfp-tta小鼠 只有内皮细胞表达agfp-tta蛋白，其他细胞不表达。因此，成功构建了提供受体细 胞的小鼠。
142.将tnnt2-gfp小鼠与cdh5-agfp-tta小鼠交配得到tnnt2-gfp；cdh5-agfp-tta 小鼠。将得到的小鼠与teto lacz小鼠交配，得到tnnt2-gfp；cdh5-agfp-tta；tetolacz三基因型小鼠，如图4所示。该基因型小鼠心肌细胞特性型表达gfp配体，内 皮细胞特异性表达受体，同时含有受tta调控的报告基因teto lacz。利用该三基因 型小鼠观察心脏内皮细胞是否与心肌接触，被lacz标记。同样，利用 alb-gfp；cdh5-agfp-tta；teto lacz三基因型小
鼠，观察肝脏中的内皮细胞是否与肝 细胞接触，被lacz标记。
143.将tnnt2-gfp小鼠与cdh5-agfp-tta小鼠交配得到tnnt2-gfp；cdh5-agfp-tta 小鼠。将teto-cre小鼠与rosa26-tdt小鼠交配得到teto-cre；rosa26-tdt小鼠。然后 用tnnt2-gfp；cdh5-agfp-tta小鼠与tnnt2-gfp；cdh5-agfp-tta小鼠交配，得到 tnnt2-gfp；cdh5-agfp-tta；teto-cre；rosa26-tdt四基因型小鼠，如图5所示。该小 鼠能够永久标记并示踪与心肌细胞接触的内皮细胞。内皮细胞与心肌接触后，tta入 核启动cre的表达，cre切掉rosa26位点处的终止序列，tdtomato荧光蛋白永久表 达，内皮细胞被标记。同样，如图6所示，通过 alb-gfp；cdh5-agfp-tta；teto-cre；rosa26-tdt四基因型小鼠，可以示踪与肝细胞接 触的内皮细胞。
144.构建rosa26-loxp-stop-loxp-rox-stop-rox-gfp小鼠以及rosa26-rox-stop
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rox-agfp-tta小鼠。通过分别用全身表达cre(actb cre)或dre(cag dre)的小 鼠与rosa26-loxp-stop-loxp-rox-stop-rox-gfp交配，得到rosa26-rox-stop-rox-gfp 或者rosa26-loxp-stop-loxp-gfp小鼠。利用该小鼠，只需借助特定的cre或dre小 鼠，就能让特定细胞表达配体gfp。同样，利用rosa26-rox-stop-rox-agfp-tta小鼠， 只需借助特定的dre小鼠，就能让特定细胞表达受体agfp-tta。
145.实施例2-心内膜在胚胎早期会部分迁移到肝脏，形成肝脏内皮细胞
146.利用tnnt2-gfp；cdh5-agfp-tta；teto-cre；rosa26-tdt小鼠，p0取出各个组织观 察发现，除了心脏有tdtomato阳性的内皮细胞外，在肝脏也存在tdtomato阳性内皮 细胞。但是肝脏在发育过程中没有细胞表达gfp配体，这暗示着肝脏中被标记的内 皮细胞是在胚胎发育早期从心脏迁移的。取了e11.5的胚胎样本，发现在e11.5时间 点心内膜就迁移到肝脏。
147.实施例3-胚胎晚期至成体过程中，心内膜几乎不与心肌细胞接触
148.利用tnnt2-gfp；cdh5-agfp-tta；teto-tdt小鼠，取出p0心脏，切片染色发现 tdtomato标记的内皮主要集中在致密层的血管内皮，而心肌小梁处的心内膜几乎不 被tdtomato标记。说明在p0期血管内皮与心肌紧密接触，但心内膜不与心肌接触。 可能在心肌小梁层存在大量胞外基质，例如层粘连蛋白、胶原蛋白i等，隔断了细胞 之间的直接接触。
149.实施例4-瓣膜处心内膜和间质细胞的不同来源
150.利用tnnt2-gfp；cdh5-agfp-tta；teto-cre；rosa26-tdt小鼠，在e8.5给予小鼠 dox，抑制之后的内皮标记，于p0收取心脏样本。观察到房室瓣的心内膜几乎不被 标记，而房室瓣的间质细胞被大量标记。说明形成间质细胞的心内膜在e9.0(e8.5 给dox，大约e9.0作用)已经被标记完全，而瓣膜表面的心内膜至少是在e9.0之后 才和心肌接触。从这个结果推断，瓣膜的心内膜和间质细胞来源于不同的早期心内膜。 这一点是用以前的工具无法发现并解释的。
151.总结
152.我们通过人工改造信号通路结合遗传学技术，在小鼠体内实现了基于细胞接触的 遗传示踪和基因调控，称为细胞间遗传学技术。结合本发明技术，可以研究细胞之间 的相互作用，示踪接触的细胞并进行遗传操作，这是以前的技术不能够实现的。本发 明技术可以将细胞间物理接触信号转化成为可操纵的遗传信息，然后利用遗传学技术 解析或干预
体内的细胞命运。该技术可用于解析肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用 及其病理生理意义，阐述器官中功能细胞与免疫细胞相互作用与调控功能，研究干细 胞与微环境细胞之间相互作用及机理，描绘细胞迁移过程中的细胞接触图谱，达到更 精准地基因操作以及更特异的肿瘤靶向治疗等。同时，我们构建了普适性的配体小鼠， rosa26-loxp-stop-loxp-rox-stop-rox-gfp以及受体小鼠rosa26-rox-stop-rox
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agfp-tta，为以后的研究开拓了工具。
153.在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域研究人员可以对本发明作各种改动 或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书写限定的范围。