用于对抗癌症的作为BMX抑制剂的苯并[H][1,6]萘啶-2(1H)-酮的制作方法

用于对抗癌症的作为bmx抑制剂的苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮
[0001]
相关申请
[0002]
本案要求2019年6月7日(07.06.2019)提交的gb01908171.0的权益和优先权，其内容据此以引用方式整体并入。
发明领域
[0003]
本发明提供具有与吡啶酮稠合的喹啉三环核的化合物，以及包含此类化合物的药物组合物。所述化合物和组合物可用于治疗方法，如治疗癌症的方法中。还提供了包含与多肽共价结合(如与bmx共价结合)的本发明化合物的复合物，以及这些复合物的多晶型物。


背景技术：

[0004]
在过去的几年里，不可逆激酶抑制剂的开发在学术界和制药行业都获得了更多的关注(chaikuad等人；singh等人2018)。从历史观点上说，不可逆抑制剂被认为是有问题的，因为它们缺乏选择性，并且存在与不希望的脱靶参与相关的安全问题。然而，这些潜在的缺陷是可克服的，而共价小分子激酶抑制剂的开发最近又引起了人们的兴趣(singh等人；barf等人；bourne等人；lagoutte等人；gilbert等人)。为了支持共价抑制剂的价值和“复兴”，fda最近批准了四种小分子实体用于临床使用：阿法替尼(afatinib)(egfr和her2抑制剂)、依鲁替尼(ibrutinib)和阿卡替尼(acalabrutinib)(btk抑制剂)、奥希替尼(osimertinib)(egfr抑制剂)和来那替尼(neratinib)(egfr和her2抑制剂)(byrd等人；honigberg等人；rabindran等人；soria等人；miller等人)。然而，并非所有激酶都可进行共价结合，因为这取决于靶氨基酸的定位(zhang等人；liu等人chem.biol.2013；zhao等人；lanning等人)。其中一种这样的令人感兴趣的激酶是上皮和内皮酪氨酸激酶(etk)，通常称为x染色体中的骨髓酪氨酸激酶(bmx)。
[0005]
bmx，连同itk、tec、btk和txk，是非受体酪氨酸激酶tec家族的主要成员(由smith等人和horwood等人综述)。tec激酶被许多细胞表面受体相关信号传导复合物活化，并被各种脂质和蛋白质募集到质膜或特定微环境中。通过这一机制，它们参与了响应于无数细胞外刺激，包括由生长因子受体、细胞因子受体、g蛋白偶联受体、抗原受体、整合素和死亡受体介导的刺激的信号转导。此外，tec激酶调节许多主要信号传导通路，如pi3k、pkc、plcγ、akt、stat3和p活化激酶1(pak1)的信号传导通路(参见jarboe等人和qiu等人)，同时负责多种细胞过程，包括调节基因表达、钙动员、肌动蛋白再组织/运动和存活/凋亡(smith等人和horwood等人)。
[0006]
bmx广泛表达于粒细胞、单核细胞、上皮和内皮细胞谱系，以及脑、前列腺、肺和心脏中，并且它特异性地参与致瘤性、粘附性、运动性、血管生成、增殖和分化(参见wen等人；guryanova等人；kaukonen等人；mano等人)。此外，已发现它在包括乳腺癌(bagheri-yarmand等人；chen等人；cohen等人)、前列腺癌(dai等人cancer res.2006；dai等人cancer res.2010)、结肠癌(potter等人neoplasia 2014)和宫颈癌(li等人)在内的多种癌症类型
中过表达，表明bmx水平升高会增加癌细胞的存活。此外，bmx也是干细胞维持和存活所必需的(参见kaukonen等人)，其上调可使原发性肿瘤和对细胞凋亡和许多化学治疗剂具有高度耐受性的癌症干细胞的存活受益。纯合bmx基因敲除小鼠具有正常的寿命，没有任何明显的表型改变，这表明基于bmx抑制的疗法可能具有很少的副作用(rajantie等人)。
[0007]
因此，考虑到多种下游靶蛋白的存在，多种不同信号传导通路的整合，以及调节增殖、迁移和抗凋亡作用的事实，bmx成为癌症疗法多个方面的潜在靶标。最近的研究也强调了调节bmx活性使细胞对治疗剂敏感，从而改善对化学疗法dna损伤剂或辐射的反应。这些研究有力地证明，直接抑制bmx或通过调节相关通路均可提高治疗功效(potter等人neoplasia 2014；fox等人；potter等人mol.cancer ther.2016)。
[0008]
显示几种内皮生长因子受体(egfr)抑制剂可以上述方式不可逆地将bmx的独特的半胱氨酸残基烷基化(hur等人)。这些分子来源于可逆egfr受体吉非替尼和厄洛替尼方式是在atp结合位点添加与半胱氨酸残基(cys496)反应的迈克尔(michael)受体部分。该半胱氨酸残基是在atp结合口袋中发现的独特现象，其存在于tec家族激酶成员的所有五个成员中。因此，凭借结构同源性，这些化合物也可以是tec家族中其他激酶的共价抑制剂。
[0009]
bmx-in-1是文献中报告的最有效的bmx抑制剂之一(ic
50
：8.0nm)，并且还以非常高的亲和力结合btk(ic
50
：10.4nm)(liu等人acs chem.biol.2013)。
[0010]
wo 2014/063054描述了用作x染色体上骨髓酪氨酸激酶(bmx)的抑制剂的化合物。这包括具有喹啉三环核的化合物，该喹啉三环核在喹啉的3位和4位与吡啶酮稠合。核在吡啶酮环氮原子处被取代，并在喹啉环的6位被进一步取代。6取代基含有苯基，其可直接连接至喹啉环的6位，或可通过c
1-6
烃接头如亚乙基接头(-chch-)连接。
[0011]
据说在wo 2014/063054中举例说明的某些化合物结合其他激酶，如btk、mtor、blk、tec、tak1、clk1/2和jak3。
[0012]
wo 2014/063054注意到所公开的化合物具有抗增殖活性，因此适用于治疗癌细胞如wm和淋巴瘤细胞系。
[0013]
liu等人公开了一种用作bmx的抑制剂的化合物。该化合物的喹啉三环核在喹啉的3位和4位与吡啶酮稠合。核在吡啶酮环氮原子处被取代，并在喹啉环的6位被进一步取代。6取代基是被磺酰胺取代的苯基。
[0014]
所公开的化合物显示出对一组前列腺癌细胞系具有抗增殖活性。
[0015]
wu等人(scientific reports)公开了一种用作bruton酪氨酸激酶(btk)的抑制剂的化合物。该化合物具有与吡啶酮稠合的喹啉三环核，该三环核类似于wo 2014/063054和liu等人中公开的三环核。喹啉环的6取代基是吡唑基。
[0016]
所公开的化合物显示出在类风湿性关节炎模型中抑制炎症反应。
[0017]
在进一步的研究工作中，wu等人(acs chem.biol.)也表明同一种化合物是b细胞淋巴瘤的抑制剂。
[0018]
wang等人公开了用作btk的抑制剂的化合物。该化合物具有与吡啶酮稠合的喹啉三环核，该三环核类似于wo 2014/063054和liu等人中公开的三环核。喹啉环的6取代基是芳族基团如苯基，但一种示例性化合物除外，其中苯基通过亚乙基接头连接至6位。
[0019]
某些化合物显示出对一组癌细胞系(包括肺癌、前列腺癌和结肠直肠癌细胞系)具
有抗增殖活性。
[0020]
jarboe等人和liang等人分别是对已知的bmx和btx抑制剂的综述。这些综述中公开的抑制剂与上文引用的文献中描述的抑制剂不同。
[0021]
需要用于治疗癌症的替代化合物，例如其中此类化合物共价结合如bmx、btk和tec的激酶。


技术实现要素：

[0022]
在一般方面，本发明提供了具有喹啉环的化合物，所述喹啉环在喹啉的3位和4位与吡啶酮(且更具体地是2-吡啶酮)稠合。核在吡啶酮环氮原子处被环状基团取代，并在喹啉环的7位被进一步取代。
[0023]
还提供了相关化合物，其中喹啉环的6位被取代，而不是7位被取代。6取代基不含有与喹啉环连接的芳族基团，或6取代基不含有通过c
1-6
烃接头与喹啉环连接的芳族基团。
[0024]
与本领域中已知的化合物相比，本发明的化合物可具有改善的与bmx和其他激酶的结合。考虑到本领域的教导，特别是关于现有技术预测的结合模式，本发明的化合物还可具有出乎意料的与bmx和其他激酶的结合。本发明的化合物可具有改变的(如改善的)对激酶如bmx的选择性，或优化的物理化学特性。
[0025]
本发明的化合物适于与激酶如bmx形成复合物，并且这种复合物是可结晶的。晶体结构提供了对结合模式的深入了解，并可用于未来开发具有更高功效和选择性的抑制剂。
[0026]
因此，在本发明的第一方面，提供了一种式(i)化合物：
[0027][0028]
及其盐、溶剂合物和受保护形式，
[0029]
其中：
[0030]-a-是选自亚芳基、亚环烷基和亚杂环基的任选取代的环状基团，所述环状基团可与另一个环稠合；
[0031]-l-是共价键或c
1-6
亚烷基；
[0032]-d是受体基团，如迈克尔受体基团；并且
[0033]-r7是-l
7a-l
7b-r
7a
，其中
[0034]-l
7a-是共价键，或选自*-o-、*-s-、*-nh-、*-n(rn)-、*-c(o)-、*-c(o)nh-、*-c(o)n(rn)-、*-nhc(o)-、*-n(rn)c(o)-、*-s(o)2nh-、*-s(o)2n(rn)-、*-nhs(o)
2-和*-n(rn)s(o)
2-，其中-rn是c
1-6
烷基并且星号表示与喹啉的连接点；
[0035]-l
7b-选自共价键或选自c
1-6
亚烷基、c
2-6
亚烯基、c
2-6
亚炔基和c
2-6
亚杂烷基；并且
[0036]-r
7a
选自任选取代的环烷基、杂环基和芳基，并且当-l
7b-是共价键时，-r
7a
进一步选自任选取代的烷基、烯基、炔基和杂烷基。
[0037]
在本发明的第二方面，提供了一种式(ii)化合物：
[0038][0039]
及其盐、溶剂合物和受保护形式，
[0040]
其中：
[0041]-a-是选自亚芳基、亚环烷基和亚杂环基的任选取代的环状基团，所述环状基团可与另一个环稠合；
[0042]-l-是共价键或c
1-6
亚烷基；
[0043]-d是受体基团，如迈克尔受体基团；并且
[0044]-r6是-l
6a-l
6b-r
6a
，其中
[0045]-l
6a-是共价键或选自*-o-、*-s-、*-nh-、*-n(rn)-、*-c(o)-、*-c(o)nh-、*-c(o)n(rn)-、*-nhc(o)-、*-n(rn)c(o)-、*-s(o)2nh-、*-s(o)2n(rn)-、*-nhs(o)
2-和*-n(rn)s(o)
2-，其中-rn是c
1-6
烷基并且星号表示与喹啉的连接点；
[0046]-l
6b-是共价键或选自c
1-6
亚烷基、c
2-6
亚烯基、c
2-6
亚炔基和c
2-6
亚杂烷基；并且
[0047]-r
6a
选自任选取代的环烷基和杂环基，并且当-l
6b-是共价键时，-r
6a
进一步选自任选取代的烷基、烯基、炔基和杂烷基。
[0048]
任选地，式(ii)化合物不是以下化合物之一：
[0049][0050]
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的第一方面的式(i)化合物或根据本发明的第二方面的式(ii)化合物以及药学上可接受的载体。
[0051]
在另一方面，本发明提供了在治疗人体或动物体的方法中，根据本发明的第一方面的式(i)化合物的用途、根据本发明的第二方面的式(ii)化合物的用途，或根据本发明的第三方面的药物组合物的用途。
[0052]
在又一方面，本发明提供了在治疗增殖性疾病如癌症的方法中，根据本发明的第一方面的式(i)化合物的用途、根据本发明的第二方面的式(ii)化合物的用途，或根据本发明的第三方面的药物组合物的用途。
[0053]
在另一方面，本发明提供了在治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎或狼疮的方法中，根据本发明的第一方面的式(i)化合物的用途、根据本发明的第二方面的式(ii)化合物的用途，或根据本发明的第三方面的药物组合物的用途。
[0054]
本发明还提供了治疗人体或动物体的方法。此类方法利用如上所述的本发明的化
合物和组合物，可将治疗有效量的所述化合物和组合物施用至受试者。
[0055]
本发明还提供了一种处理细胞的方法，所述方法包括使细胞与根据本发明的第一方面的式(i)化合物或根据本发明的第二方面的式(ii)化合物接触的步骤。细胞可为增殖细胞，如癌细胞。所述方法可在体外或体内进行。
[0056]
在一方面，本发明提供了与根据本发明的第一方面的式(i)化合物或根据本发明的第二方面的式(ii)化合物共价结合的多肽的复合物。
[0057]
在另一方面，提供了一种形成复合物的方法，所述方法包括使根据本发明的第一方面的式(i)化合物或根据本发明的第二方面的式(ii)化合物与多肽反应的步骤。
[0058]
在这些方面的每一方面中，多肽可为蛋白质，如激酶，如bmx或btk。
[0059]
在本文中更详细地描述本发明的这些和其他方面和实施方案。
附图说明
[0060]
图1显示了与bmx-in-1相比，化合物9-29的bmx ic
50
值的变化。将人重组bmx与化合物一起孵育，并通过htrf测量生物素化肽的磷酸化。值以相对于每组实验中使用的对照bmx-in-1的效力增加或损失(倍数)表示。在4个不同的实验中测试了完整的文库，其中bmx-in-1始终用作对照。化合物10的效力损失为58倍，而化合物11-13的效力损失超过275倍。
[0061]
图2显示了bmx以及药物缀合的bmx的质谱分析。(a)hbmx的天然ms分析。指示了测量的分子量。(b)药物缀合的hbmx的变性ms分析。指示了测量的分子量。(c)对序列上标记的hbmx的药物缀合的胰蛋白酶肽进行的串联ms分析(顶部)和ms/ms质谱(底部)。红色星号指示药物缀合的cys。
[0062]
图3显示了表现出24与hbmx激酶催化结构域的结合模式的共晶结构。a)24的丙烯酰胺与cys496之间的共价键。b)24与lys445和ile492之间的非键合相互作用。c)采用外型构象的dfg基序(d)指向atp口袋外的磺酰胺芳环的定位。
[0063]
图4显示了在lncap前列腺癌细胞的凋亡研究中使用bmx-in-1和化合物24-27的流式细胞术结果。
[0064]
图5显示了化合物24-26与akt1/2(akt抑制剂)、氟他胺(雄激素受体拮抗剂)和ly293002(pi3k抑制剂)的组合在lncap细胞中的抗增殖活。a)用24(3μm)、25(5μm)和26(6μm)与akt1/2(1μm)共同处理的细胞；b)用24(3μm)、25(5μm)和26(6μm)与氟他胺(50μm)共同处理的细胞；c)用24(3μm)、25(5μm)和26(6μm)与ly294002(3μm)共同处理的细胞。值报告为针对dmso对照归一化的细胞活力％，并且是以三份重复进行的三个单独实验的平均值。确定的p值示为ns(p》0.05)，*(p≤0.05)，**(p≤0.01)，***(p≤0.001)和****(p≤0.0001)。
[0065]
图6显示了在初级dlbcl样品中b癌细胞上诱导的靶细胞细胞毒性。a)增加dmso中25的浓度时活靶细胞的相对细胞分数(rcf)；相对细胞分数是靶细胞群的百分比。b)增加dmso中的浓度时归一化为靶细胞群的分数的结果。c)根据按rcf的1-平均值计算的化合物25的药物反应评分(drs)排列的11个初级患者样品。
具体实施方式
[0066]
本发明的化合物适于与激酶如bmx形成共价键。
[0067]
本发明的化合物具有喹啉三环核，所述喹啉三环核在喹啉的3位和4位与吡啶酮
(且更具体地是2-吡啶酮)稠合。核在吡啶酮环氮原子处被取代，并在喹啉环的6位或7位被进一步取代。
[0068]
本领域中先前描述的化合物具有喹啉三环核，该核在喹啉的3位和4位与吡啶酮稠合，并且该核在喹啉环的6位被进一步取代。存在于已知化合物的6位上的取代基直接地或通过c
1-6
烃接头连接至喹啉环的芳族基团。
[0069]
式(i)化合物与现有技术中已知的那些化合物的不同之处在于它们在喹啉环的7位而不是6位被取代。
[0070]
式(ii)化合物与现有技术中已知的那些化合物的不同之处在于它们在6位被取代基取代，所述取代基不含有直接地或通过c
1-6
烃接头连接至喹啉环的芳族基团。
[0071]
在下文中更详细地描述式(i)和式(ii)化合物。
[0072]
式(i)化合物
[0073]
本发明提供了一种式(i)化合物：
[0074][0075]
及其盐、溶剂合物和受保护形式，
[0076]
其中：
[0077]-a-是选自亚芳基、亚环烷基和亚杂环基的任选取代的环状基团，所述环状基团可与另一个环稠合；
[0078]-l-是共价键或c
1-6
亚烷基；
[0079]-d是受体基团，如迈克尔受体基团；并且
[0080]-r7是-l
7a-l
7b-r
7a
，其中
[0081]-l
7a-是共价键，或选自*-o-、*-s-、*-nh-、*-n(rn)-、*-c(o)-、*-c(o)nh-、*-c(o)n(rn)-、*-nhc(o)-、*-n(rn)c(o)-、*-s(o)2nh-、*-s(o)2n(rn)-、*-nhs(o)
2-和*-n(rn)s(o)
2-，其中-rn是c
1-6
烷基并且星号表示与喹啉的连接点；
[0082]-l
7b-是共价键或选自c
1-6
亚烷基、c
2-6
亚烯基、c
2-6
亚炔基和c
2-6
亚杂烷基；并且
[0083]-r
7a
选自任选取代的环烷基、杂环基和芳基，并且当-l
7b-是共价键时，-r
7a
进一步选自任选取代的烷基、烯基、炔基和杂烷基。
[0084]
在下文中更详细地描述-r
7a
的取代基和任选的取代基。
[0085]
式(ii)化合物
[0086]
本发明还提供了一种式(i)化合物：
[0087][0088]
及其盐、溶剂合物和受保护形式，
[0089]
其中：
[0090]-a-是选自亚芳基、亚环烷基和亚杂环基的任选取代的环状基团，所述环状基团可与另一个环稠合；
[0091]-l-是共价键或c
1-6
亚烷基；
[0092]-d是受体基团，如迈克尔受体基团；并且
[0093]-r6是-l
6a-l
6b-r
6a
，其中
[0094]-l
6a-是共价键或选自*-o-、*-s-、*-nh-、*-n(rn)-、*-c(o)-、*-c(o)nh-、*-c(o)n(rn)-、*-nhc(o)-、*-n(rn)c(o)-、*-s(o)2nh-、*-s(o)2n(rn)-、*-nhs(o)
2-和*-n(rn)s(o)
2-，其中-rn是c
1-6
烷基并且星号表示与喹啉的连接点；
[0095]-l
6b-是共价键或选自c
1-6
亚烷基、c
2-6
亚烯基、c
2-6
亚炔基和c
2-6
亚杂烷基；并且
[0096]-r
6a
选自任选取代的环烷基和杂环基，并且当-l
6b-是共价键时，-r
6a
进一步选自任选取代的烷基、烯基、炔基和杂烷基。
[0097]
在下文中更详细地描述-r
6a
的取代基和任选的取代基。
[0098]
在一个实施方案中，式(ii)化合物可不为：
[0099][0100]
在一个实施方案中，式(ii)化合物可不为：
[0101][0102]
上文鉴定的化合物在liang等人中作为化合物7和8(liang等人2017)公开。该文档中的化合物也在wo2013154778中有所讨论。在病毒病灶形成测定和病毒蛋白积聚测定中测试了这些化合物对登革热病毒的抗病毒活性。它们被公开为不适用于治疗与改变的激酶活性相关的任何疾病，如增殖性疾病，并且据说它们不结合tec或任何其他激酶。
[0103]
这种排除仅适用于与式(ii)化合物、含有式(ii)化合物的组合物以及此类化合物和组合物在医学治疗方法中的用途(特别地是它们在抗病毒治疗，如登革热病毒感染治疗中的用途的相关程度)有关的本发明的那些方面。
[0104]-a-[0105]
基团-a-是环状基团，其是三环核内吡啶酮环的氮环原子上的取代基。
[0106]
本发明的工作实施例使用亚苯基作为环状基团-a-进行了举例说明。本领域中已知在该位置可使用其他环状基团。例如，wo 2014/063054描述了具有一系列环状基团和双环基团，包括亚苯基、亚吡啶、亚四氢喹啉基和亚四氢异喹啉基等(这些在该现有技术公开中是基团-c-和-f-)的化合物。因此，本案的化合物不限于在-a-处使用亚苯基。
[0107]
环状基团被基团-l-d取代，并且任选地被进一步取代，例如被一个或多个基团-ra取代。每个环状基团可为单环或可为一系列稠环，如双环。
[0108]
基团-a-可为选自亚芳基、亚环烷基和亚杂环基的环状基团，所述环状基团可与另一个环稠合。每个环状基团任选地被一个或多个取代基-ra取代。优选地，环状基团被另一个取代基-ra取代。
[0109]
基团-a-优选地是仅具有6、9或10个环原子的环状基团。每个环原子可为碳环原子，并且任选地其中一个环原子可为氮环原子。
[0110]
当-a-包含两个或更多个稠环时，优选的是连接至吡啶酮基团的氮环原子的环是6元环。稠合至6元环的环优选地是5元环或6元环。
[0111]
当-a-是亚芳基时，其可为亚碳芳基或亚杂芳基。亚芳基可为单环的，或可包含多个稠环。当存在多个环时，连接至吡啶酮基团的环是芳族的。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和或部分不饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0112]
亚碳芳基可选自亚苯基(c6亚碳芳基)、亚萘基和亚四氢萘基(tetralinylene)(c
10
亚芳基)。
[0113]
亚杂芳基可为c
5-10
亚杂芳基，如c
5-6
亚杂芳基。
[0114]
亚杂芳基可选自亚吡啶基(c6)；亚吲哚基、亚异吲哚基、亚苯并咪唑基、亚吲哚啉基和亚异吲哚啉基(c9)；亚四氢喹啉基和亚四氢异喹啉基(c
10
)。
[0115]
在给出原子数的情况下，这是指环原子的总数，适当时包括碳和杂(氮)环原子。
[0116]
当-a-是亚环烷基时，这可为c
3-10
亚环烷基，如c
5-10
亚烷基。亚环烷基可为单环的，或可包含多个稠环。亚环烷基可为部分不饱和的(但不是芳族的)。
[0117]
当存在多个环时，连接至吡啶酮基团的环是非芳族的，并且优选地是完全饱和的环。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和的、部分不饱和的或饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0118]
亚环烷基可选自亚环戊基(c5)、亚环己基(c6)、亚四氢萘基和亚十氢萘基(c
10
)，如亚环己基。
[0119]
当-a-是亚杂环基时，这可为c
3-10
亚杂环基，如c
5-10
亚杂环基。亚杂环基具有一个或两个环杂原子，每个环杂原子选自o、s和n(h)。环杂原子不与吡啶酮的氮环原子相连。亚杂环基可为部分不饱和的(但不是芳族的)。
[0120]
亚杂环基可为单环的，或可包含多个稠环。当存在多个环时，连接至吡啶酮基团的环是非芳族的，并且优选地是完全饱和的环。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和的、部分不饱和的或饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0121]
亚杂环基可选自亚吡咯烷基、亚四氢呋喃基、亚四氢噻吩基、亚吡咯啉基(c5)；亚哌啶基、亚哌嗪基、亚四氢吡喃基、亚二噁烷基、亚噻烷基、二亚噻烷基、亚吗啉基和硫代吗啉基(c6)；亚吲哚啉基、亚十氢异喹啉基、亚十氢喹啉基和亚四氢喹啉，以及四氢异喹啉(c
10
)。
[0122]
当环状基团仅具有6个环原子时，基团-l-d优选地提供于3位(其中1位是吡啶酮基团的氮环原子的连接点)。
[0123]
当环状基团仅具有6个环原子时，基团-l-d优选地提供于3位并且任何其他取代基-ra可提供于2位、4位、5位和6位中的一者或多者(同样，其中1位是吡啶酮基团的氮环原子的连接点)。优选地，环状基团在2位或6位未被取代。通常，取代基提供于4位。最优选的是基团-ra提供于4位且基团-l-d提供于3位。
[0124]
优选地，基团-a-是选自亚苯基、亚吡啶基、亚吲哚基、亚异吲哚基、亚苯并咪唑基、亚吲哚啉基、亚异吲哚啉基、亚四氢喹啉基和亚四氢异喹啉基的任选取代的基团。
[0125]
更优选地，基团-a-是选自亚苯基、亚吡啶基、亚吲哚基、亚1,2,3,4-四氢喹啉基和亚吲哚啉基的任选取代的基团。
[0126]
环状基团连接至三环核的吡啶酮和-l-。环状基团可任选地被进一步取代，如被一个、两个、三个或四个另外的取代基-ra取代。
[0127]
当-a-是亚苯基时，其可为苯基-1,3-烯。此处，1位是连接至吡啶酮氮的碳环原子。
[0128]
当亚苯基被-ra取代时，它们可提供于2位、4位、5位和6位中的一者或多者，并且优选地提供于4位和5位中的一者或多者，如上文所指出。优选地，亚苯基是单取代的，并且是在4位被取代。
[0129]
当-a-是亚吡啶时，其可为选自由吡啶基-2,3-烯、吡啶基-2,4-烯、吡啶基-2,5-烯、吡啶基-2,6-烯、吡啶基-3,4-烯和吡啶基-3,5-烯。此处，1位是氮环原子。
[0130]
优选地，亚吡啶基未被取代或被-ra单取代。亚吡啶基可在位于2位、3位、4位、5位或6位的碳环原子处被取代，其中该位置可用于取代。
[0131]
当-a-是亚吲哚基时，其可为吲哚基-1,6-烯，其中1位是氮环原子。亚吲哚基可通过氮环原子连接至-l-。此处，亚吲哚基可通过6位连接至吡啶。
[0132]
亚吡啶基未被取代或被-ra单取代。亚吲哚基优选地在苯环上被-ra取代。
[0133]
当-a-是亚异吲哚基时，其可为异吲哚基-2,5-烯，其中2位是氮环原子。亚异吲哚基可通过氮环原子连接至-l-。此处，亚异吲哚基可通过5位连接至吡啶。
[0134]
亚异吡啶基未被取代或被-ra单取代。亚异吲哚基优选地在苯环上被-ra取代。
[0135]
当-a-是亚苯并咪唑基时，其可为苯并咪唑基-1,6-烯，其中1位是氮环原子。亚苯并咪唑基可通过氮环原子连接至-l-。此处，亚苯并咪唑基可通过6位连接至吡啶。
[0136]
亚苯并咪唑基未被取代或被-ra单取代。亚苯并咪唑基优选地在苯环上被-ra取代。
[0137]
当-a-是亚吲哚啉基时，其可为吲哚啉基-1,6-烯，其中1位是氮环原子。亚吲哚啉基可通过氮环原子连接至-l-。此处，亚吲哚啉基可通过6位连接至吡啶。
[0138]
亚吲哚啉基未被取代或被-ra单取代。亚吲哚啉基优选地在苯环上被-ra取代。
[0139]
当-a-是亚异吲哚啉基时，其可为异吲哚啉基-2,5-烯，其中2位是氮环原子。亚异吲哚啉基可通过氮环原子连接至-l-。此处，亚异吲哚啉基可通过5位连接至吡啶。
[0140]
亚异吲哚啉基未被取代或被-ra单取代。亚异吲哚啉基优选地在苯环上被-ra取代。
[0141]
当-a-是亚四氢喹啉基(或亚1,2,3,4-四氢喹啉基)时，其可为四氢喹啉基-1,7-烯，其中1位是氮环原子。亚四氢喹啉基可通过氮环原子连接至-l-。此处，亚四氢喹啉基可通过7位连接至吡啶。亚四氢喹啉基未被取代或被-ra单取代。亚四氢喹啉基优选地在苯环上被-ra取代。
[0142]
当-a-是亚四氢异喹啉基(或亚1,2,3,4-四氢异喹啉基)时，其可为四氢异喹啉基-2,6-烯，其中1位是氮环原子。亚四氢异喹啉基可通过氮环原子连接至-l-。此处，亚四氢异喹啉基可通过6位连接至吡啶。亚四氢异喹啉基未被取代或被-ra单取代。亚四氢异喹啉基优选地在苯环上被-ra取代。
[0143]
优选地，基团-a-是任选取代的亚苯基，如被一个另外的取代基-ra取代的亚苯基。最优选地，亚苯基是苯基-1,3-烯，任选地在4位被取代。此处，1位是连接至吡啶酮氮的碳环原子。
[0144]
基团-a-可为任选取代的亚吲哚啉基，如吲哚啉基-1,6-烯，其中1位是氮环原子。亚吲哚啉基优选地未被取代。
[0145]-ra[0146]
基团-ra是环状基团-a-的取代基。环状基团-a-可具有一个或多个取代基，每个取代基是-ra。在一个实施方案中，环状基团-a-未被-ra取代，被-ra单取代或被-ra二取代。然而，优选地，环状基团未被-ra取代，或者被-ra单取代。
[0147]
在本案的工作实施例中，基团-a-未被进一步取代或被甲基进一步取代。从本领域中已知，可向基团-a-提供其他取代基，同时保持生物活性。例如，wo 2014/063054描述了大范围的可能的取代基(这些在该现有技术中是基团-rc和-rf)。因此，本案的化合物不限于其中-a-未被进一步取代或被甲基进一步取代的那些。
[0148]
当存在-ra时，它通常是环碳原子的取代基。
[0149]
每个基团-ra独立地选自-l
aa-r
aa
、卤基、羟基(-oh)、氨基(-nh2)、硫醇(-sh)、氰基、硝基和羧基(-cooh)，其中：
[0150]-l
aa-是共价键或选自*-c(o)-、*-s(o)-、*-s(o)
2-*-n(h)c(o)-、*-n(rn)c(o)-、*-n(h)s(o)-、*-n(rn)s(o)-、*-n(h)s(o)
2-、*-n(rn)s(o)
2-、*-n(h)-和-n(rn)-，其中-rn是c
1-6
烷基，并且星号表示与环状基团的连接点；并且
[0151]-r
aa
选自任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基和芳基。
[0152]
其中-r
aa
任选地被取代，每个任选的取代基可选自卤基、羟基(-oh)、氨基(-nh2)、硫醇(-sh)、氰基(-cn)、硝基、羧基(-cooh)和苯基，其中-r
aa
是环烷基、杂环基或芳基，任选的取代基进一步选自烷基，如c
1-6
烷基，如甲基和乙基。
[0153]
基团-l
aa-优选地是共价键。因此，此处的基团-r
aa
直接连接至环状基团-a-。这是优选的。
[0154]
基团-r
aa
可为烷基，如c
1-6
烷基，如甲基或乙基。
[0155]
基团-r
aa
可为烯基，如c
2-6
烯基，如乙烯基或丙烯基。
[0156]
基团-r
aa
可为炔基，如c
2-6
炔基，如乙炔基或丙炔基。
[0157]
烷基、烯基或炔基可为直链或支链的。
[0158]
基团-r
aa
可为环烷基，如c
3-14
环烷基，如环戊基和环己基。环烷基可为单环的，或者可含有两个或更多个稠环，其中每个环是环烷基环。环烷基是非芳族的。环烷基环可为不饱和的或部分饱和的或完全饱和的(但不是芳族的)。
[0159]
基团-r
aa
可为杂环基，如c
3-14
杂环基，如吡咯啉基、哌啶基、四氢呋喃基和四氢吡喃基。杂环基可为单环的，或者可含有两个或更多个稠环，其中一个环是杂环基环，另一个环可为环烷基环或杂环基环。杂环基是非芳族的。杂环基中的每个环可为不饱和的或部分饱
和的或完全饱和的(但不是芳族的)。
[0160]
基团-r
aa
可为芳基，如碳芳基和杂芳基。
[0161]
碳芳基可为c
6-14
碳芳基，如苯基和萘基。
[0162]
杂芳基可为c
5-14
杂芳基，如c
5-10
杂芳基，如吡啶基、吡咯基、呋喃基和噻吩基。
[0163]
卤基团可选自氟基、氯基、溴基和碘基，如氟基。
[0164]
优选地，基团-ra是-r
aa
或卤基，如-ra是烷基或卤基，如甲基或氟基。
[0165]
最优选地，-ra是甲基或乙基，如最优选地是甲基。
[0166]-l-[0167]
基团-l-是环状基团-a-和受体基团-d之间的连接。基团-l-可为共价键或亚烷基。
[0168]
在本案的工作实施例中，基团-l-是共价键。
[0169]
本领域中已知可使用其他接头将受体基团连接至环状基团。例如，wo 2014/063054描述了其中基团-a-可通过作为烃链的接头连接至迈克尔受体基团的化合物(这些在该现有技术中是基团-l-和-v-)。因此，本案的化合物不限于其中环状基团-a-直接连接至-d的那些。
[0170]
当-l-是亚烷基时，其可为c
1-6
亚烷基，如c
1-4
亚烷基，如亚甲基或亚乙基。亚烷基是饱和脂族基团。亚烷基可为直链或支链的。
[0171]
优选地，-l-是共价键。此处，环状基团-a-直接连接至-d。
[0172]-d
[0173]
基团-d是受体基团，其适于与多肽如蛋白质中存在的亲核基团反应。受体基团优选地与硫醇官能团具有反应性，硫醇官能团可存在于多肽的半胱氨酸氨基酸残基的侧链内。
[0174]
在这种情况下，本发明的化合物优选地与激酶(如本文所述的那些，包括bmx)反应以形成化合物与激酶的复合物。此处，所述化合物通过受体基团和激酶上的位点与激酶共价连接。
[0175]
在本案的工作实施例中，-d基团是连接至乙烯基的酰胺。本领域中已知在该位置可使用其他受体基团。例如，wo 2014/063054描述了具有一系列受体基团的化合物(这些在该现有技术中是基团-rd和-rg)。因此，本案的化合物不限于使用连接至-d处的乙烯基的酰胺。
[0176]
受体基团可含有α,β-不饱和羰基或α,β-不饱和硫代羰基。
[0177]
受体基团可为-x-m，其中-x-是共价键或-l
m-，并且-m选自烯基、炔基、杂环基、被氰基取代的烷基，以及氰基。
[0178]
基团-m可含有不饱和键，如碳-碳双键，例如其中-m是烯基或杂环基。优选地，该基团被提供为基团-x-的α,β。当-x-含有羰基(-c(o)-)时，这是特别优选的。不饱和键可为碳-碳三键，例如其中-m是炔基。不饱和键可为碳-氮三键，例如其中存在氰基。
[0179]
基团-l
m-可选自*-c(o)-、*-s(o)-、*-s(o)
2-*-n(h)c(o)-、*-n(rn)c(o)-、*-n(h)s(o)-、*-n(rn)s(o)-、*-n(h)s(o)
2-、*-n(rn)s(o)
2-、*-n(h)-和-n(rn)-，其中-rn是c
1-6
烷基，并且星号表示与-l-的连接点(并且其中-l-是共价键，这是与-l-的连接点)。
[0180]
当基团-a-通过氮环原子与-l
m-连接时(例如，当-l-是共价键时)，-x-可为共价键基团，或者-x-可为-l
m-，其中-l
m-选自*-c(o)-、*-s(o)-和*-s(o)
2-。
[0181]
基团-l
m-通常是*-c(o)-、*-s(o)-、*-s(o)
2-、*-n(h)c(o)-或*-n(rn)c(o)-，如*-n(h)c(o)-或*-n(rn)c(o)-，如*-n(h)c(o)-。
[0182]
基团-m包含与多肽(如激酶)形成共价键的反应性官能团。通常，反应性官能团是亲电子的，且更具体地说，与基团-x-一起，它是迈克尔受体基团。
[0183]
当-m是烯基时，这可为c
2-6
烯基。烯基可含有一个碳-碳双键。优选地，双键与作为-x-存在的羰基共轭(因此，提供α,β-不饱和羰基或α,β-不饱和硫代羰基)。
[0184]
当-m是炔基时，其可为c
2-6
炔基。炔基可含有一个碳-碳三键。优选地，三键与作为-x-存在的羰基共轭。
[0185]
当-m是杂环基时，其可为饱和或部分不饱和的杂环基。杂环基可为c
3-7
杂环基，如c3或c5杂环基。
[0186]
杂环基可任选地在可用的环碳原子上被羰基(-c(o)-)取代。优选地，当存在羰基时，其可为环碳原子的取代基，所述环碳原子处于环杂原子如环氮原子α位，例如形成内部(内)酰胺或酰亚胺。
[0187]
当杂环基是c3杂环基时，其优选地是不饱和的。
[0188]
c3杂环基可选自氮丙啶基、环氧乙烷基和环硫乙烷基。
[0189]
当杂环基是c5杂环基时，其优选地是部分饱和的，并且优选地含有单个碳-碳双键。
[0190]
在一个实施方案中，-m是马来酰亚胺基，其通过环氮原子连接至-x-。马来酰亚胺基是c5氮杂环基，其中处于环氮原子α位的每个碳原子被羰基取代。
[0191]
基团-m可为被氰基取代的烷基。烷基可为被氰基取代的c
1-10
烷基，如c
1-6
烷基。烷基可为被氰基取代的甲基或乙基，如甲基。
[0192]
在一个实施方案中，-m选自任选取代的烯基、任选取代的炔基、氰基和被氰基取代的烷基。
[0193]
优选地是-m是任选取代的烯基，更优选地是任选取代的乙烯基，且最优选地是乙烯基(-ch＝ch2)。
[0194]
基团-d，如-l-d一起，可选自-n(h)c(o)chch2、-n(h)c(o)ch2cn、-n(h)c(o)cch、-n(h)c(o)cn、-n(h)c(o)chchme和-n(h)c(o)ccme。
[0195]
基团-d，如-l-d一起，优选地是-n(h)c(o)chch2。
[0196]
为免生疑问，-cf3基团不是受体基团。因此，-d不能是-cf3。
[0197]-r7[0198]
基团-r7是在喹啉环的7位上的取代基。相比之下，本领域中已知的化合物仅在6位被取代。本发明人已经表明在该位置处可容忍一系列不同的基团。
[0199]
本发明人理解，先前在6位使用的那些取代基可在7位替代地提供。因此，wo 2014/063054描述了其中三环核在该核的喹啉环的6位被取代的化合物。存在于6位上的取代基直接地或通过c
1-6
烃接头连接至喹啉环的芳族基团。可在本发明化合物的7位提供这样的取代基。因此，-r7可含有芳基。在此，与在7位具有相同取代基的相关化合物相比，7位取代基的存在可能与提高的生物活性相关。
[0200]
此外，可在7位使用替代基团，其中从未描述过在6位使用此类基团。如上文所指出，wo 2014/063054描述了含有芳基的三环核的取代基。本发明人已经表明替代基团可用
作三环核的取代基，例如包括取代的环烷基和杂环基等。与在6位被取代的那些化合物或在三环核的取代基内具有芳基的那些化合物相比，这些基团的存在可能与相当的或改善的生物活性相关。
[0201]
基团-r7是-l
7a-l
7b-r
7a
，其中
[0202]-l
7a-是共价键，或选自*-o-、*-s-、*-nh-、*-n(rn)-、*-c(o)-、*-c(o)nh-、*-c(o)n(rn)-、*-nhc(o)-、*-n(rn)c(o)-、*-s(o)2nh-、*-s(o)2n(rn)-、*-nhs(o)
2-和*-n(rn)s(o)
2-，其中-rn是c
1-6
烷基并且星号表示与喹啉的连接点；
[0203]-l
7b-是共价键或选自c
1-6
亚烷基、c
2-6
亚烯基、c
2-6
亚炔基和c
2-6
亚杂烷基；并且
[0204]-r
7a
选自任选取代的环烷基、杂环基和芳基，并且当-l
7b-是共价键时，-r
7a
进一步选自任选取代的烷基、烯基、炔基和杂烷基。
[0205]
基团-r
7a
可任选地被一个或多个基团-rs取代。当存在两个或更多个-rs时，每个-rs可相同或不同。在下文中详细地定义这些任选的取代基。
[0206]
优选地，基团-r7含有氮原子。当-r
7a
是杂环基或芳基(例如，杂芳基)时，或当基团-rs含有氮原子时，例如当-rs包括磺酰胺基团时，可提供这种情况。
[0207]
基团-l
7a-和-l
7b-是将核的喹啉环连接至基团-r
7a
的接头。或者，基团-r
7a
可直接连接至喹啉环。在这种情况下，-l
7a-和-l
7b-均为共价键。
[0208]
优选地，-l
7a-和-l
7b-均为共价键。此处，-r7是-r
7a
。因此，-r
7a
直接连接至三环。
[0209]
在另一个实施方案中，-r7是-l
7b-r
7a
，并且优选地-l
7b-是c
2-6
亚烯基。
[0210]
在另一个实施方案中，-r7是-l
7a-r
7a
，并且优选地-l
7a-是-nh-或-n(rn)-。
[0211]
当-r
7a
是芳基时，其可为碳芳基或杂芳基。
[0212]
碳芳基可为c
6-14
碳芳基，如苯基或萘基，且优选地是苯基。
[0213]
杂芳基可为c
5-14
杂芳基，如c
5-10
杂芳基，如c
5-6
杂芳基。
[0214]
芳基可为单环的，或可包含多个稠环。当存在多个环时，连接至-l
7b-的环是芳族的。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和或部分不饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0215]
在一个实施方案中，-r
7a
是任选取代的芳基，如任选取代的苯基、吡啶基、吡咯基、噁唑基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、喹啉基和异喹啉基。
[0216]
优选地，-r
7a
是任选取代的苯基或吡啶基，如苯基。苯基或吡啶基任选地被取代，如任选地被单取代。
[0217]
当-r
7a
是杂环基时，它可为c
3-14
杂环基。
[0218]
杂环基具有一个或两个环杂原子，每个环杂原子选自o、s和n(h)。杂环基可通过环碳原子或环氮原子(如果存在的话)连接至-l
7b-。
[0219]
杂环基可为部分不饱和的(但不是芳族的)。
[0220]
杂环基可为单环的，或可包含多个稠环。当存在多个环时，连接至-l
7b-的环是非芳族的，并且优选地是完全饱和的环。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和的、部分不饱和的或饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0221]
杂环基可选自哌啶基、哌嗪基、吗啉基和硫代吗啉基，如选自哌啶基和哌嗪基。
[0222]
当-r
7a
是环烷基时，其可为c
3-10
环烷基，如c
5-10
环烷基。环烷基可为单环的，或可包含多个稠环。环烷基可为部分不饱和的(但不是芳族的)。
[0223]
当存在多个环时，连接至-l
7b-的环是非芳族的，并且优选地是完全饱和的环。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和的、部分不饱和的或饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0224]
环烷基可选自亚环戊基(c5)、亚环己基(c6)、亚四氢萘基和亚十氢萘基(c
10
)，如亚环己基。
[0225]
当-r
7a
是烷基时，其可为c
1-6
烷基，如c
1-4
烷基，如甲基或乙基。烷基可为直链或支链的。烷基可任选地被取代。
[0226]
当-r
7a
是烯基时，其可为c
2-6
烯基，如c
2-4
烯基，如乙烯基。烯基可为直链或支链的。烯基可任选地被取代。
[0227]
当-r
7a
是炔基时，其可为c
2-6
炔基，如c
2-4
炔基，如乙炔基。炔基可为直链或支链的。炔基可任选地被取代。
[0228]
当-r
7a
是杂烷基时，其可为c
2-6
杂烷基，如c
3-6
杂烷基。炔基可为直链或支链的。杂烷基是其中一个或两个碳原子被选自o、s和n(h)的杂原子置换的烷基。杂原子不置换烷基末端的碳原子。杂烷基可通过杂原子连接，或者它可通过碳原子连接。
[0229]
基团-r
7a
优选地选自任选取代的芳基和杂环基。
[0230]-r6[0231]
基团-r6是在喹啉环的6位上的取代基。取代基不含有与喹啉环连接的芳族基团，或6取代基不含有通过c
1-6
烃接头与喹啉环连接的芳族基团。
[0232]
本领域中已知的化合物在6位被芳族基团取代，所述芳族基团直接连接至喹啉环，或通过c
1-6
烃接头连接。参见，例如，wo 2014/063054中描述的化合物。
[0233]
如上文所指出，从liang等人(liang等人2017)获知两种具有直接在6位与喹啉结合的非芳族基团的化合物。这些化合物可从式(ii)化合物的定义中排除。
[0234]
这些化合物不用于治疗增殖性疾病如癌症，并且未被公开用作任何激酶的结合剂。相反，这些化合物用于它们的抗病毒活性。
[0235]
基团-r6是-l
6a-l
6b-r
6a
，其中
[0236]-l
6a-是共价键或选自*-o-、*-s-、*-nh-、*-n(rn)-、*-c(o)-、*-c(o)nh-、*-c(o)n(rn)-、*-nhc(o)-、*-n(rn)c(o)-、*-s(o)2nh-、*-s(o)2n(rn)-、*-nhs(o)
2-和*-n(rn)s(o)
2-，其中-rn是c
1-6
烷基并且星号表示与喹啉的连接点；
[0237]-l
6b-选自共价键或选自c
1-6
亚烷基、c
2-6
亚烯基、c
2-6
亚炔基和c
2-6
亚杂烷基；并且
[0238]-r
6a
选自任选取代的环烷基和杂环基，并且当-l
6b-是共价键时，-r
6a
进一步选自任选取代的烷基、烯基、炔基和杂烷基。
[0239]
基团-r6可不为吗啉基，如吗啉-4-基(即，通过吗啉环氮连接至喹诺酮环的吗啉基)。这种限制可能仅限于未取代的吗啉基。
[0240]
基团-r6可不为任选取代的哌嗪基，如任选取代的哌嗪-1-基。更具体地，-r6可不为4-苯基哌嗪-1-基。
[0241]
基团-r
6a
可任选地被一个或多个基团-rs取代。当存在两个或更多个-rs时，每个-rs可相同或不同。在下文中详细地定义这些任选的取代基。
[0242]
优选地，基团-r6含有氮原子。当-r
6a
是杂环基时，或当基团-rs含有氮原子时，例如当-rs包括磺酰胺基团时，可提供这种情况。
[0243]
基团-l
6a-和-l
6b-是将喹啉环连接至基团-r
6a
的接头。或者，基团-r
6a
可直接连接至喹啉环。在这种情况下，-l
6a-和-l
6b-均为共价键。
[0244]
优选地，-l
6a-和-l
6b-均为共价键。此处，-r6是-r
6a
。因此，-r
6a
直接连接至三环。
[0245]
在另一个实施方案中，-r6是-l
6b-r
6a
，并且优选地-l
6b-是c
2-6
亚烯基。
[0246]
在另一个实施方案中，-r6是-l
6a-r
6a
，并且优选地-l
6a-是-nh-或-n(rn)-。
[0247]
当-r
6a
是杂环基时，其可为c
3-14
杂环基，如c
5-7
杂环基，如c
5-6
杂环基。
[0248]
杂环基具有一个或两个环杂原子，每个环杂原子选自o、s和n(h)。杂环基可通过环碳原子或环氮原子(如果存在的话)连接至-l
7b-。
[0249]
杂环基可为部分不饱和的(但不是芳族的)。
[0250]
杂环基可为单环的，或可包含多个稠环。当存在多个环时，连接至-l
6b-的环是非芳族的，并且优选地是完全饱和的环。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和的、部分不饱和的或饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0251]
杂环基可选自哌啶基、哌嗪基、吗啉基和硫代吗啉基，如哌啶基、哌嗪基和硫代吗啉基，如选自哌啶基和哌嗪基或选自哌啶基和硫代吗啉基。
[0252]
杂环基可不为吗啉基，例如其中-l
6a-和-l
6b-中的每一者是共价键。
[0253]
杂环基可不为哌嗪基，例如其中-l
6a-和-l
6b-中的每一者是共价键。
[0254]
当-r
6a
是环烷基时，其可为c
3-10
环烷基，如c
5-10
环烷基。环烷基可为单环的，或可包含多个稠环。环烷基可为部分不饱和的(但不是芳族的)。
[0255]
当存在多个环时，连接至-l
6b-的环是非芳族的，并且优选地是完全饱和的环。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和的、部分不饱和的或饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0256]
环烷基可选自亚环戊基(c5)、亚环己基(c6)、亚四氢萘基和亚十氢萘基(c
10
)，如亚环己基。
[0257]
当-r
6a
是烷基时，其可为c
1-6
烷基，如c
1-4
烷基，如甲基或乙基。烷基可为直链或支链的。烷基可任选地被取代。
[0258]
当-r
6a
是烯基时，其可为c
2-6
烯基，如c
2-4
烯基，如乙烯基。烯基可为直链或支链的。烯基可任选地被取代。
[0259]
当-r
6a
是炔基时，其可为c
2-6
炔基，如c
2-4
炔基，如乙炔基。炔基可为直链或支链的。炔基可任选地被取代。
[0260]
当-r
6a
是杂烷基时，其可为c
2-6
杂烷基，如c
3-6
杂烷基。杂烷基可为直链或支链的。杂烷基是其中一个或两个碳原子被选自o、s和n(h)的杂原子置换的烷基。杂原子不置换烷基末端的碳原子。杂烷基可通过杂原子连接，或者它可通过碳原子连接。
[0261]
基团-r
6a
优选为任选取代的杂环基。
[0262]
在一个实施方案中，基团-r6不含有芳族官能团，例如，基团-r6不含有苯基。
[0263]-rs[0264]
基团-rs可作为基团-r
7a
或基团-r
6a
的取代基提供。该取代基任选地存在。通常-r
7a
和-r
6a
中的每一者都是未取代的，或者被-rs单取代。在其他实施方案中，-r
7a
和-r
6a
中的每一者提供有两个或更多个取代基-rs。
[0265]
基团-rs可为基团-r
6a
或-r
7a
内碳原子的取代基。此处，基团-rs是-r
sc
。
[0266]
基团-rs可为基团-r
6a
或-r
7a
内氮原子的取代基。此处，基团-rs是-r
sn
。
[0267]
在一个实施方案中，每个-r
sc
独立地选自-l
sc-r
ss
、卤基、羟基(-oh)、氨基(-nh2)、硫醇(-sh)、氰基、硝基和羧基(-cooh)，其中：
[0268]-l
sc-是共价键或选自*-c(o)-、*-s(o)-、*-s(o)
2-*-n(h)c(o)-、*-n(rn)c(o)-、*-n(h)s(o)-、*-n(rn)s(o)-、*-n(h)s(o)
2-、*-n(rn)s(o)
2-、*-n(h)-和-n(rn)-，其中-rn是c
1-6
烷基，并且星号表示与r
6a
或-r
7a
的连接点；并且
[0269]-r
ss
选自任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基和芳基。
[0270]
在一个实施方案中，-l
sc-是共价键或选自*-n(h)s(o)-、*-n(rn)s(o)-、*-n(h)s(o)
2-、*-n(rn)s(o)
2-，如-l
sc-为共价键或*-n(rn)s(o)
2-。
[0271]
在一个实施方案中，每个-r
sn
独立地选自-l
sn-r
ss
，其中：
[0272]-l
sn-是共价键或选自*-c(o)-、*-s(o)-、*-s(o)
2-，并且星号表示与r
6a
或-r
7a
的连接点；并且
[0273]-r
ss
选自任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基和芳基。
[0274]
在一个实施方案中，-l
sc-是共价键或选自*-s(o)-、*-s(o)
2-，如-l
sc-是共价键或*-s(o)
2-。
[0275]
当-r
ss
是烷基时，其可为c
1-6
烷基，如c
1-4
烷基，如甲基或乙基。烷基可为直链或支链的。烷基可任选地被取代。
[0276]
当-r
ss
是烯基时，其可为c
2-6
烯基，如c
2-4
烯基，如乙烯基。烯基可为直链或支链的。烯基可任选地被取代。
[0277]
当-r
ss
是炔基时，其可为c
2-6
炔基，如c
2-4
炔基，如乙炔基。炔基可为直链或支链的。炔基可任选地被取代。
[0278]
当-r
ss
是环烷基时，其可为c
3-10
环烷基，如c
5-10
环烷基。环烷基可为单环的，或可包含多个稠环。环烷基可为部分不饱和的(但不是芳族的)。
[0279]
当存在多个环时，连接至-l
sn-或-l
sc-的环是非芳族的，并且优选地是完全饱和的环。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和的、部分不饱和的或饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0280]
环烷基可选自亚环戊基(c5)、亚环己基(c6)、亚四氢萘基和亚十氢萘基(c
10
)，如亚环己基。
[0281]
当-r
ss
是杂环基时，它可为c
3-14
杂环基。
[0282]
杂环基具有一个或两个环杂原子，每个环杂原子选自o、s和n(h)。杂环基可通过环碳原子或环氮原子(如果存在的话)连接至-l
sn-或-l
sc-。
[0283]
杂环基可为部分不饱和的(但不是芳族的)。
[0284]
杂环基可为单环的，或可包含多个稠环。当存在多个环时，连接至-l
sn-或-l
sc-的环是非芳族的，并且优选地是完全饱和的环。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和的、部分不饱和的或饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0285]
杂环基可选自哌啶基、哌嗪基、吗啉基和硫代吗啉基。
[0286]
当-r
ss
是芳基时，其可为碳芳基或杂芳基。
[0287]
碳芳基可为c
6-14
碳芳基，如苯基或萘基，且优选地是苯基。
[0288]
杂芳基可为c
5-14
杂芳基，如c
5-10
杂芳基，如c
5-6
杂芳基。
[0289]
芳基可为单环的，或可包含多个稠环。当存在多个环时，连接至-l
sn-或-l
sc-的环是芳族的。其他环任选地是芳族的。其他环可为完全不饱和或部分不饱和的。其他环可独立地选自芳环、环烷基环和杂环基环。
[0290]
在一个实施方案中，-r
ss
是任选取代的芳基，如任选取代的苯基、吡啶基、吡咯基、噁唑基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、喹啉基和异喹啉基。
[0291]
优选地，-r
ss
是烷基。
[0292]
其中-r
ss
任选地被取代，每个任选的取代基可选自由以下组成的组：卤基(如-f、-cl、-br和-i)、羟基(-oh)、氨基(-nh2)、硫醇(-sh)、氰基(-cn)、硝基、羧基(-cooh)和苯基，其中-r
ss
是环烷基、杂环基或芳基，任选的取代基进一步选自烷基，如c
1-6
烷基，如甲基和乙基。
[0293]
示例性式(i)化合物
[0294]
式(i)化合物可为如下所示的化合物：
[0295][0296]
及其盐、溶剂化物和受保护形式，其中-ra、-r7和-m具有与上文给出的相同的含义。此处，连接至吡啶酮氮的亚苯基被-ra单取代。该基团可提供于2位、4位、5位或6位中的任何一者处，且优选地提供于4位。
[0297]
式(i)化合物可为如下所示的化合物：
[0298][0299]
及其盐、溶剂化物和受保护形式，其中-r7和-m具有与上文给出的相同的含义。
[0300]
式(i)化合物可为如下所示的化合物：
[0301]
[0302]
及其盐、溶剂化物和受保护形式，其中-r7和-m具有与上文给出的相同的含义。
[0303]
示例性式(ii)化合物
[0304]
式(ii)化合物可为如下所示的化合物：
[0305][0306]
及其盐、溶剂化物和受保护形式，其中-ra、-r6和-m具有与上文给出的相同的含义。此处，连接至吡啶酮氮的亚苯基被-ra单取代。该基团可提供于2位、4位、5位或6位中的任何一者处，且优选地提供于4位。
[0307]
式(ii)化合物可为如下所示的化合物：
[0308][0309]
及其盐、溶剂化物和受保护形式，其中-r6和-m具有与上文给出的相同的含义。
[0310]
式(ii)化合物可为如下所示的化合物：
[0311][0312]
及其盐、溶剂化物和受保护形式，其中-r6和-m具有与上文给出的相同的含义。
[0313]
复合物
[0314]
在一方面，本发明还提供了与多肽共价结合的式(i)化合物或式(ii)化合物。这种组合可称为化合物与多肽的复合物。
[0315]
多肽通常含有苏氨酸氨基酸残基，并且式(i)化合物或式(ii)化合物通过该苏氨酸残基的侧链官能团与多肽结合。
[0316]
复合物可通过使式(i)化合物或式(ii)化合物与多肽接触而形成。式(i)化合物和式(ii)化合物提供有受体基团如迈克尔受体基团，所述受体基团适于与多肽的氨基残基的侧链官能团如半胱氨酸残基的硫醇官能团反应。
[0317]
在一个实施方案中，多肽是激酶。
[0318]
激酶可选自激酶家族，其选自tec、egfr.jak、src、fak、pi3k、mtor、肝激酶b1、pkb、pak1、tam、abl和pdpk1。
[0319]
tec激酶家族成员可选自由以下组成的组：bmx、btk、itk、tec和txk。
[0320]
egfr激酶家族成员可选自由以下组成的组：egfr、erbb2、erbb3和erbb4。
[0321]
jak激酶家族成员可选自由以下组成的组：jak1、jak2、jak3和tyk2。
[0322]
src激酶家族成员可选自由以下组成的组：fyn、src、yes1、blk、fgr、lck、hck和lyn。
[0323]
fak激酶家族成员可为ptk2。
[0324]
pi3k的激酶家族成员可选自由以下组成的组：pik3ca、pik3cβ、pik3cγ和pik3cδ。
[0325]
mtor激酶家族成员可为mtor。
[0326]
肝激酶b1激酶家族成员可为肝激酶b1。
[0327]
pkb激酶家族成员可选自由以下组成的组：atk1、atk2和atk3。
[0328]
pak1激酶家族成员可为pak1。
[0329]
tam激酶家族成员可选自axl和mertk。
[0330]
abl激酶家族成员可为abl 1。
[0331]
pdpk1激酶家族成员可为pdpk1。
[0332]
优选地，激酶是tec激酶家族，且最优选地激酶是bmk或btk，如bmx。
[0333]
激酶可为人激酶。
[0334]
多肽是具有激酶活性的酶，其中多肽具有如seq id no.:1至6所示的氨基酸序列，或其变体。
[0335]
在一个实施方案中，多肽可包括与seq id no.:1至6中的任一者(如seq id no.:1)具有至少35％、45％、55％、65％、75％、85％、95％、98％、99％或100％同一性的多肽。
[0336]
激酶可包含th结构域，并且通常在活性位点的口袋中包含半胱氨酸残基。
[0337]
激酶可为bmx，如包含具有seq id no.:1所示氨基酸序列的多肽的bmx。式(i)化合物或式(ii)化合物可结合至bmx的cys 496残基。
[0338]
当激酶不是bmx激酶时，化合物可结合至对应于bmx的cys496残基的半胱氨酸残基。
[0339]
激酶
–
一般信息
[0340]
氨基酸序列同一性和相似性可使用标准生物信息学软件工具，如免费获得的emboss或blast软件工具测量。一般使用默认参数。例如，emboss针成对序列比对可用于确定氨基酸序列同一性。使用尼德曼-翁施(needleman-wunsch)算法(j.mol.biol.(48):444-453(1970))的emboss针成对序列比对，可用于确定氨基酸序列相似性，例如使用默认参数以及使用blosum计分矩阵如blosum62计分矩阵。默认参数可与空位形成罚分＝12和空位延伸罚分＝4一起使用。使用gap可能是优选的，但也可使用其他算法，例如blast或tblastn(其使用altschul等人(1990)j.mol.biol.215:405-410的方法)、fasta(其使用pearson和lipman(1988)pnas usa 85:2444-2448的方法)或smith-waterman算法(smith和waterman(1981)j.mol biol.147:195-197)，一般采用默认参数。
[0341]
相对于参考序列的氨基酸序列同一性百分比(％)被定义为在比对序列并引入空
位(如果需要的话)以实现最大百分比的序列同一性之后，并在不将任何保守取代视为序列同一性的部分的情况下，候选序列中与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。百分比同一性值可通过wu-blast-2(altschul等人,methods in enzymology,266:460-480(1996))确定。wu-blast-2使用多个搜索参数，其中大部分参数设置为默认值。可调参数设置为以下值：重叠跨度＝1、重叠分数＝0.125，词阈值(t)＝11。氨基酸序列同一性％值是由wu-blast-2确定的匹配相同残基的数量除以参考序列的残基总数(将wu-blast-2引入参考序列中以最大化对齐评分的空位忽略)乘以100而确定。
[0342]
相对于参考序列的氨基酸序列比对覆盖百分(％)被定义为在比对序列后，候选序列中的氨基酸残基相对于参考序列中的氨基酸残基数的百分比。
[0343]
变体多肽可为截短的多肽。可使用任何截短，只要截短的多肽仍然具有激酶活性。截短会将一个或多个残基从多肽的n端和/或c端去除，所述残基对于激酶活性是非必需的。惯常地，可通过系统地从n端和/或c端截短不同长度的序列来鉴定适当的截短。
[0344]
变体多肽包含一个或多个另外的氨基酸。变体多肽可包含用于纯化变体多肽的亲和标签，如多组氨酸标签、t7标签或gst标签。亲和标签可位于n端或c端。或者或另外，变体多肽还可在n端包含前导序列。前导序列可用于引导重组表达系统中多肽的分泌和/或细胞内靶向。前导序列也称为信号肽并且是本领域中众所周知的。或者或另外，多肽还可包含标记，如荧光标记。
[0345]
氨基酸取代可为保守氨基酸取代，其中给定序列的氨基酸被具有相似特征的氨基酸取代。例如，其中疏水性氨基酸(例如leu)被另一个疏水性氨基酸(例如ile)取代。氨基酸和保守取代如下表所示。保守取代可被定义为氨基酸类别内的取代和/或在blosum62矩阵中评分为正的取代。
[0346][0347]
盐、溶剂合物和其他形式
[0348]
式(i)化合物和式(ii)化合物的盐的实例包括所有药学上可接受的盐，如但不限于强无机酸的酸加成盐(如hcl和hbr盐)和强有机酸的加成盐(如甲磺酸酸盐)。盐的其他实例包括硫酸盐和乙酸盐，如三氟乙酸盐或三氯乙酸盐。
[0349]
式(i)化合物或式(ii)化合物也可配制成前药。前药可包括本文所述的化合物，其中一个或多个氨基被可在体内裂解以释放生物活性化合物的基团保护。
[0350]
在一个实施方案中，式(i)化合物或式(ii)化合物作为前药提供。
[0351]
提及式(i)或(ii)化合物或本文所述的任何其他化合物，也是提及该化合物的溶
剂合物。溶剂合物的实例包括水合物。
[0352]
式(i)化合物或式(ii)化合物或本文所述的任何其他化合物包括其中原子被天然存在或非天然存在的同位素置换的化合物。在一个实施方案中，同位素是稳定同位素。因此，此处描述的化合物包括例如含氘的化合物等等。例如，h可以是任何同位素形式，包括1h、2h(d)和3h(t)；c可以是任何同位素形式，包括
12
c、
13
c和
14
c；o可以是任何同位素形式，包括
16
o和
18
o；等等。
[0353]
某些式(i)化合物或式(ii)化合物或本文所述的任何其他化合物可以一种或多种特定的几何、光学、对映异构、非对映异构、差向异构、立体异构、互变异构、构象或端基异构形式存在，包括但不限于顺式和反式；e-形式和z-形式；c-形式、t-形式和r-形式；内向形式和外向形式；r-形式、s-形式和内消旋形式；d-形式和l-形式；d-形式和l-形式；( )形式和(-)形式；酮基形式、烯醇形式和烯醇化物形式；顺式形式和反式形式；向斜形式和背斜形式；α-形式和β-形式；轴向形式和平伏形式；船式、椅式、扭转式、信封式和半椅式以及其组合，在下文中总称为“异构体”(“异构体形式”)。
[0354]
需注意，除如以下对互变异构形式的讨论外，如本文所用的术语“异构体”具体排除结构(或构造)异构体(即，原子间的连接不同而不是仅空间原子位置不同的异构体)。例如，提及甲氧基-och3不应解释为提及其结构异构体羟甲基-ch2oh。类似地，提及邻氯苯基不应解释为提及其结构异构体间氯苯基。然而，提及一类结构很可能包括属于该类别的结构异构形式(例如，c
1-6
烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；甲氧基苯基包括邻甲氧基苯基、间甲氧基苯基和对甲氧基苯基)。
[0355]
除非另有说明，否则提及特定化合物包括所有此类异构形式，包括其混合物(例如外消旋混合物)。此类异构形式的制备(例如非对称合成)和分离(例如分级结晶和色谱方法)的方法是本领域已知的，或者很容易按照已知方式通过对本文所教导的方法或已知方法进行调整而得到。
[0356]
本发明的一方面涉及呈基本上纯化的形式和/或呈基本上不含污染物的形式的化合物。
[0357]
在一个实施方案中，基本上纯化的形式为至少50重量％，例如至少60重量％，例如至少70重量％，例如至少80重量％，例如至少90重量％，例如至少95重量％，例如至少97重量％，例如至少98重量％，例如至少99重量％。
[0358]
除非另外指明，否则基本上纯化的形式是指任何立体异构或对映体形式的化合物。例如，在一个实施方案中，基本上纯化的形式是指立体异构体的混合物，即相对于其他化合物是纯化的。在一个实施方案中，基本上纯化的形式是指一种立体异构体，例如光学纯的立体异构体。在一个实施方案中，基本上纯化的形式是指对映异构体的混合物。在一个实施方案中，基本上纯化的形式是指对映异构体的等摩尔混合物(即外消旋混合物，外消旋体)。在一个实施方案中，基本上纯化的形式是指一种对映异构体，例如光学纯的对映异构体。
[0359]
在一个实施方案中，污染物占不超过50重量％，例如不超过40重量％，例如不超过30重量％，例如不超过20重量％，例如不超过10重量％，例如不超过5重量％，例如不超过3重量％，例如不超过2重量％，例如不超过1重量％。
[0360]
除非另外指明，否则污染物是指其他化合物，即除立体异构体或对映异构体之外
的化合物。在一个实施方案中，污染物是指其他化合物和其他立体异构体。在一个实施方案中，污染物是指其他化合物和另一种对映异构体。
[0361]
在一个实施方案中，基本上纯化的形式为至少60％光学纯的(即，以摩尔计，化合物的60％是所需的立体异构体或对映异构体，且40％是不需要的立体异构体或对映异构体)，例如至少70％光学纯的，例如至少80％光学纯的，例如至少90％光学纯的，例如至少95％光学纯的，例如至少97％光学纯的，例如至少98％光学纯的，例如至少99％光学纯的。
[0362]
治疗方法
[0363]
式(i)化合物或式(ii)化合物或含有这些化合物的药物制剂适用于治疗和预防的方法中。可将化合物施用至有需要的受试者。
[0364]
式(i)化合物或式(ii)化合物用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。在本发明的一些方面，可将式(i)化合物或式(ii)化合物施用至哺乳动物受试者，如人，以治疗增殖性疾病，如癌症。
[0365]
本发明的另一方面涉及式(i)化合物或式(ii)化合物在制备用于治疗的药物中的用途。在一个实施方案中，药物包含式(i)化合物或式(ii)化合物。
[0366]
本案的化合物可用于治疗增殖性疾病，如癌症。
[0367]
癌症可选自乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和宫颈癌、白血病、骨髓瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。
[0368]
本发明的化合物可用于治疗自身免疫疾病。自身免疫疾病可为例如类风湿性关节炎或狼疮(参见，例如honignerg等人,2010；xia等人,2010；chalmers等人,2015；和rankin等人,2013)。
[0369]
本发明的化合物可用于治疗与激酶活性如升高的激酶活性相关的疾病。
[0370]
治疗
[0371]
如本文在治疗疾患的上下文中所用的术语“治疗”总体上涉及这样的治疗和疗法，不论是对人还是对动物(例如在兽医应用中)：其中获得了一些所需的治疗效果，例如，抑制疾患的进展，并且包括降低进展速率、终止进展速率、减轻疾患症状、改善疾患和治愈疾患。还包括作为预防性措施的治疗(即预防)。例如，与尚未发展疾患但有发展疾患的风险的患者一起使用，涵盖在术语“治疗”中。
[0372]
如本文所用的术语“治疗有效量”涉及当根据所需的治疗方案施用时，有效产生与合理的益处/风险比相称的一些所需治疗效果的化合物，或包含化合物的材料、组合物或剂型的量。
[0373]
术语“治疗”包括联合治疗和疗法，其中将两种或更多种治疗或疗法例如依序地或同时地结合。
[0374]
制剂
[0375]
在一方面，本发明提供包含式(i)化合物或式(ii)化合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。
[0376]
虽然式(i)化合物或式(ii)化合物可单独施用或与第二剂一起施用，但优选地将其作为包含至少一种如本文所述的式(i)化合物或式(ii)化合物的药物制剂(例如组合物、制剂、药物)提供，再加上本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上可接受的成分，包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化
剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。制剂还可包含其他活性剂，例如其他治疗剂或预防剂。
[0377]
因此，本发明还提供如上所定义的药物组合物，以及制备药物组合物的方法，所述方法包括将至少一种如本文所述的式(i)化合物或式(ii)化合物与本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上可接受的成分(例如载体、稀释剂、赋形剂，等等)混合。如果配制成离散单位(例如片剂，等等)，则每个单位含有预定量(剂量)的化合物。该组合物任选地还包含预定量的第二活性剂。
[0378]
如本文所用的术语“药学上可接受的”涉及在合理医学判断范围内适用于与所考虑的受试者(例如人)的组织接触地使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症且与合理的益处/风险比相称的化合物、成分、材料、组合物、剂型等。每种载体、稀释剂、赋形剂等等在与制剂的其他成分相容的含义上也必须为“可接受的”。
[0379]
合适的载体、稀释剂、赋形剂等等可以在标准药学著作，例如，remington's pharmaceutical sciences,第18版,mack publishing company,easton,pa.,1990；和handbook of pharmaceutical excipients,第5版,2005中找到。
[0380]
这些制剂可通过药学领域中众所周知的任何方法来制备。此类方法包括使式(i)化合物或式(ii)化合物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般来讲，通过使化合物与载体(例如液体载体、细分固体载体等)均匀且紧密地结合，然后在必要时将产品成形来制备制剂。
[0381]
制剂可以适当地为以下形式：液体、溶液(例如水性的、非水性的)、悬浮液(例如水性的、非水性的)、乳液(例如水包油、油包水)、酏剂、糖浆、糖饵剂、漱口水、滴剂、片剂(包括例如包衣片剂)、颗粒剂、散剂、锭剂(losenge)、软锭剂(pastille)、胶囊剂(包括例如硬明胶胶囊剂和软明胶胶囊剂)、扁囊剂、丸剂、安瓿、大丸剂、栓剂、阴道栓剂、酊剂、凝胶、糊剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、油、泡沫、喷雾剂、雾或气溶胶。
[0382]
制剂可以适当地作为贴剂、橡皮膏、绷带、敷料等等提供，这些材料浸渍有一种或多种化合物和任选的一种或多种其他药学上可接受的成分，包括例如渗透增强剂、浸透增强剂和吸收增强剂。制剂还可以适当地以贮库或贮器的形式提供。
[0383]
化合物可以溶解在、悬浮在一种或多种其他药学上可接受的成分中或与它们混合。
[0384]
适于口服施用(例如通过摄入)的制剂包括液体、溶液(例如水性的、非水性的)、悬浮液(例如水性的、非水性的)、乳液(例如水包油、油包水)、酏剂、糖浆、糖饵剂、片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、扁囊剂、丸剂、安瓿、大丸剂。
[0385]
适于经颊施用的制剂包括漱口水、锭剂、软锭剂，以及贴剂、橡皮膏、贮库和贮器。锭剂通常将化合物包含在调味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中。软锭剂通常将化合物包含在惰性基质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶中。漱口剂通常将化合物包含在合适的液体载体中。
[0386]
适于舌下施用的制剂包括片剂、锭剂、软锭剂、胶囊剂和丸剂。
[0387]
适于口腔透粘膜施用的制剂包括液体、溶液(例如水性的、非水性的)、悬浮液(例如水性的、非水性的)、乳液(例如水包油、油包水)、漱口水、锭剂、软锭剂，以及贴剂、橡皮膏、贮库和贮器。
[0388]
适于非口腔透粘膜施用的制剂包括液体、溶液(例如水性的、非水性的)、悬浮液(例如水性的、非水性的)、乳液(例如水包油、油包水)、栓剂、阴道栓剂、凝胶、糊剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、油，以及贴剂、橡皮膏、贮库和贮器。
[0389]
适于透皮施用的制剂包括凝胶、糊剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂和油，以及贴剂、橡皮膏、绷带、敷料、贮库和贮器。
[0390]
可以任选地与一种或多种辅助成分通过常规方法例如压制或模制来制备片剂。
[0391]
软膏剂通常由化合物和石蜡或水混溶性软膏基质制备。
[0392]
乳液通常由化合物和油相制备，所述油相可任选地仅包含乳化剂(emulsifier)(也称为乳化剂(emulgent))，或者它可包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。优选地，亲水性乳化剂与充当稳定剂的亲脂性乳化剂一起被包含在内。还优选地包含油和脂肪两者。总之，具有或不具有一种或多种稳定剂的一种或多种乳化剂构成所谓的乳化蜡，并且蜡连同油和/或脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质，所述乳化软膏基质形成乳膏制剂的油性分散相。
[0393]
其中载体是液体的适于鼻内施用的制剂(包括例如鼻喷剂、滴鼻剂)或者通过喷雾器通过气溶胶施用的制剂包括化合物的水性或油性溶液。作为一种替代施用方法，干粉递送可用作喷雾状气溶胶的替代方法。
[0394]
适于鼻内施用的其中载体为固体的制剂包括例如以例如在约20微米至约500微米范围内的粒度的粗粉末形式呈递的那些，这些粗粉末以进行鼻吸的方式，即通过经由鼻腔通道从放在鼻子近处的粉末的容器中快速吸入来施用。
[0395]
适于肺部施用(例如，通过吸入或吹入疗法施用)的制剂包括以气溶胶喷雾的形式，借助于合适的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体从加压包装中呈递的那些。或者或另外，可配制用于肺部施用的制剂以用于从喷雾器或干粉吸入器施用。例如，可为制剂提供载体或脂质体以提供合适的粒度从而到达肺的合适部分，以帮助递送合适的剂量进而增强在肺组织中的滞留。
[0396]
适于眼部施用的制剂包括滴眼剂，其中化合物溶解或悬浮在合适的载体中，尤其是化合物的水性溶剂中。
[0397]
适于直肠施用的制剂可以具有合适基质的栓剂形式呈递，所述基质包括例如天然或硬化油、蜡、脂肪、半液体或液体多元醇，例如可可油或水杨酸盐；或呈现为用于通过灌肠剂进行的治疗的溶液或悬浮液。
[0398]
适于阴道施用的制剂可以除化合物外还含有如本领域中已知为适当的载体的阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂形式呈递。
[0399]
适于肠胃外施用(例如，通过注射)的制剂包括水性或非水性的、等渗的、无热原的、无菌液体(例如溶液、悬浮液)，其中溶解、悬浮或以其他方式(例如，在脂质体或其他微粒中)提供了化合物。此类液体可另外包含其他药学上可接受的成分，如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂以及溶质，所述药学上可接受的成分使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等等。用于在此类制剂中使用的合适的等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸化林格氏注射液。通常，液体中化合物的浓度为约1ng/ml至约100μg/ml，例如约10ng/ml至约10μg/ml，例如约10ng/ml至约1μg/ml。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器(例
如安瓿和小瓶)中，并且可存储于冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在使用前即时添加无菌液体载体(例如注射用水)即可。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
[0400]
药盒
[0401]
本发明的一方面涉及一种药盒，所述药盒包含(a)式(i)化合物或式(ii)化合物、或包含式(i)或式(ii)中任一项所定义的化合物的组合物，例如优选地提供于合适的容器中和/或具有合适的包装；以及(b)使用说明书，例如关于如何施用所述化合物或组合物的书面说明书。
[0402]
书面说明还可包括式(i)化合物或式(ii)化合物适合治疗的适应症的列表。
[0403]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括(c)第二活性剂，或包含第二活性剂的组合物。此处，书面说明还可包括第二活性剂与式(i)化合物或式(ii)化合物一起适合治疗的适应症的列表。
[0404]
施用途径
[0405]
式(i)化合物或式(ii)化合物、第二剂或包含式(i)化合物或式(ii)化合物的药物组合物可通过任何方便的施用途径施用至受试者，无论是以全身方式/周围方式还是以局部方式(即，在所需的作用部位)。
[0406]
施用途径包括但不限于口服(例如通过摄入)；经颊；舌下；透皮(包括例如通过贴片、膏药等)；透粘膜(包括例如通过贴片、膏药等)；鼻内(例如通过鼻喷剂)；眼部(例如通过滴眼剂)；肺部(例如通过使用例如气溶胶，例如经由口或鼻的吸入或吹入疗法)；直肠(例如通过栓剂或灌肠剂)；阴道(例如通过阴道栓剂)；肠胃外，例如通过注射，包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、囊内、包膜下、眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内注射；通过例如皮下、颅内或肌内植入贮库或贮器。
[0407]
受试者/患者
[0408]
受试者/患者可为脊索动物、脊椎动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、有袋类动物(例如袋鼠、袋熊)、啮齿目动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠类(例如小鼠)、兔类动物(例如兔)、禽类(例如鸟)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、猪(porcine)(例如猪(pig))、羊(例如绵羊)、牛科动物(例如奶牛)、灵长类动物、类人猿(例如猴或猿猴)、猴(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。此外，受试者/患者可以是其任何发育形式，例如胎儿。
[0409]
在一个优选的实施方案中，受试者/患者是人。
[0410]
还设想可在具有微生物感染的非人类动物上实施本发明。非人哺乳动物可为啮齿动物。啮齿动物包括大鼠、小鼠、豚鼠、毛丝鼠和实验室研究中使用的其他类似大小的小型啮齿动物。
[0411]
细胞处理
[0412]
本发明提供了一种用式(i)化合物或式(ii)化合物处理细胞或细胞群的方法，所述方法包括使细胞或细胞群与式(i)化合物或式(ii)化合物接触的步骤。
[0413]
所述方法可在体外或体内进行。
[0414]
细胞或细胞群可获自受试者，如本文所述的受试者。
[0415]
可处理细胞以限制或防止其增殖。
[0416]
细胞可为增殖细胞，如癌细胞。癌细胞可选自乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和宫颈癌
细胞。
[0417]
用于治疗的癌细胞的实例包括前列腺癌细胞，如本文例示的lcncap、pc-3和du-145和22rv-1细胞系，并且进一步选自慢性淋巴细胞白血病细胞系、jvm-3、mec-2、mo1043和wac3cd5细胞系。
[0418]
处理细胞或细胞群的方法可包括确定细胞或细胞群增殖的步骤。
[0419]
所述方法可用于确定化合物在治疗方法的使用中的适用性。
[0420]
联合疗法和共同治疗
[0421]
式(i)化合物可与第二剂联合施用。施用可为同时的、分开的或依序的。
[0422]
适当的施用途径以及式(i)化合物和第二剂的施用方式将取决于式(i)化合物和第二剂的药代动力学。
[0423]“同时”施用是指通过相同施用途径以单一剂量向受试者施用式(i)化合物和第二剂。
[0424]“分开”施用是指通过同时发生的两种不同施用途径向受试者施用式(i)化合物和第二剂。这可能发生在例如一种剂通过输注施用而另一种剂在输注过程中口服给予的情况下。
[0425]“依序”是指在不同的时间点施用两种剂，条件是在施用第二剂时在受试者中存在并持续施用的第一剂的活性。
[0426]
一般来讲，将发生依序剂量，使得在施用式(i)化合物后48小时内，优选地在第一剂后24小时内，如在12小时、6小时、4小时、2小时或1小时内施用第二剂。或者，可首先施用活性剂，然后施用式(i)化合物。
[0427]
最终，在联合治疗中化合物和第二剂的施用顺序和时间将取决于各自的药代动力学性质。
[0428]
施用至受试者的式(i)化合物的量将最终取决于受试者和待治疗的疾病的性质。同样，施用至受试者的活性剂的量将最终取决于受试者和待治疗的疾病的性质。
[0429]
第二剂可为作为激酶抑制剂例如pi3k或akt抑制剂的物质。例如，第二剂可能是ly294002(cas号：154447-36-6)或akt1/2激酶抑制剂。第二剂可为雄激素受体抑制剂，例如氟他胺(也以商品名eulexin已知)。第二剂也可充当抗癌剂，如用于治疗前列腺癌的抗癌剂。
[0430]
其他优选要求
[0431]
本文明确公开了上述实施方案的每一个兼容组合，就如同每一个组合都单独且明确地公开一样。
[0432]
本领域的技术人员根据本公开将明了本公开的各种另外的方面和实施方案。
[0433]
当在本文使用时，“和/或”应当视为具体公开两种特定特征或组分中的每一者，带有或不带有另一者。例如“a和/或b”应当视为具体公开(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一者，就如同每一者在本文中单独列出一样。
[0434]
除非上下文另外规定，否则对上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样地适用于所描述的所有方面和实施方案。
[0435]
现在将通过举例并参考上述附图来说明本发明的某些方面和实施方案。
[0436]
实验和结果
[0437]
一般方法和材料
[0438]
除非另外指出，否则起始物质从商业供应商处获得并且无需进一步纯化即可使用。bmx-in-1获自calbiochem。除非另外指出，否则均采用merck si60(60-200μm)硅胶柱作为固定相，分析级溶剂作为洗脱液来进行柱色谱法。所有使用无水条件的反应均在氩气氛下在烘箱干燥的玻璃器皿中进行。
[0439]
通过薄层色谱法(tlc)使用涂覆硅胶板(merck，铝片，涂有荧光指示剂f254的硅胶60)跟踪反应并通过uv光和茚三酮染色(如果需要)进行观察。质子磁共振(1h nmr)光谱在bruker fourier 300光谱仪上以300mhz记录并报告如下：化学位移δ(ppm)(多重性，耦合常数j(hz)，质子数)。多重性标记为：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；m，多重峰；br，宽峰；或这些的组合。
[0440]
在waters acquity qda检测器上获得总离子流轨迹的电喷雾正负电离子化(es /es-)。用于lc/ms分析的分析色谱条件如下。柱是cortecs c18 2.7μm(4.6mm x 50mm)。溶剂a是由milliq水与0.01％甲酸组成的水性溶剂，且溶剂b是乙腈与0.01％甲酸。其他色谱参数如下：流速，0.5ml/min；注入体积，5μl；柱温，40℃；和uv波长范围，210-400nm。除非另外指出，否则使用上述分析方法测量所有测试化合物的纯度均≥95％。
[0441]
高分辨率质谱法(hrms)分析在universidad de santiago de compostela的unidad de espectrometria de masas e prote
ó
mica进行。在bruker daltonics microtof esi-tof质谱仪上记录样品。计算和精确m/z值以道尔顿指示。
[0442]
合成
[0443]
化合物
[0444]
本研究中制备的化合物，包括本发明的化合物和比较化合物，列于下表1中。
[0445]
本发明的化合物包括化合物24-27，其中存在基团-r7。这些是式(i)化合物。
[0446]
本发明的化合物包括化合物20-23，其中存在基团-r6。这些是式(ii)化合物。
[0447]
提供化合物9a-9e和10-19作为比较实施例以用于对本发明的有益的理解。这些化合物具有在wo 2014/063054中描述的类型。
[0448]
提供化合物28作为另外的参考实施例。
[0449]
化合物29是用于制备式(ii)化合物的中间体化合物。
[0450]
表1-化合物
[0451][0452]
合成程序
[0453]
本发明的化合物的合成是使用为已知抑制剂bmx-in-1开发的合成途径设计的(参见liu等人acs chem.biol.2013)。但是，引入了一些修改，要么是为了提高中间步骤的收率，要么是因为报告的程序在我们手上失败了(参见方案1)。
[0454]
方案1-制备化合物9a-9e、10-13和14-23的合成路线.
[0455][0456]
a)回流，24h；ph2o，240℃，5h，40％；b)socl2，回流，5h，100％；c)苯胺，二噁烷，90℃，6h，90％；d)nabh4，etoh，室温，过夜，100％；e)dess-martin过碘烷，dcm，室温，3h，75％；f)膦酰基乙酸三乙酯，k2co3，etoh，100℃，过夜，60％；g)硼酸/酯，pdcl2(pph3)2，na2co3，二噁烷，90℃，过夜，50％或胺，pd(oac)2，r-binap，cs2co3，二噁烷，85℃，过夜，80％；h)fe，nh4cl，etoh/h2o，80℃，2h，100％；i)酰氯，dipea，thf，-10℃至室温，5h，25％或卤代烷，k2co3，dmf，室温，过夜，35％。
[0457]
简而言之，溴羟基喹啉1的形成是通过两步反应实现的。首先，在大约140℃-150℃下进行4-溴苯胺与丙二酸之间的反应过夜，接着在二苯醚中在225℃下进行环化过夜。尽管该文献中有若干报告使用了宽泛的温度值范围(price等人；ramsey等人；lin等人；reis等人)，发现当采用克量的起始物质时，将温度严格控制在230℃与240℃之间对于获得高收率的产物至关重要(rivilli等人)。通过1，经过在socl2中回流获得了100％收率的中间体2。
[0458]
通过用所需苯胺进行亲核芳族取代来完成苯胺3的制备。虽然使用nabh4实现了酯3到醇4的还原，但如最初描述的那样(liu等人acs chem.biol.2013)，使用mno2不能进行到醛5的氧化。使用含naoac的氯铬酸吡啶鎓(pcc)可实现氧化，但是，使用dess-martin过碘烷(dmp)氧化更顺畅，且副产物更少。因此，醇4被源自醛5的dmp氧化。膦酰基乙酸三乙酯的horner-wadsworth-emmons(hwe)环化提供中间体6。
[0459]
在下一步中，通过对应硼酸酯或酸的suzuki交叉偶联或buchwald-hartwig胺化获得中间体7。胺化过程并不简单，尝试使用pd2(dba)3作为钯源，同时筛选k2co3或cs2co3作为碱，以及binap、xphos或tbuxphos作为膦。最后，在90℃下采用二噁烷中的pd(oac)2、cs2co3和rbinap过夜获得了成功的反应。没有按照文献程序(sncl2)(liu等人acs chem.biol.2013)将硝基还原成胺。相反，采用更环保的试剂(在沸腾etoh中的fe/nh4cl)，得到几乎定量收率的中间体8。通过将中间体8与对应酰氯酰化或通过用4-溴丁-2-烯腈和4-溴巴豆酸甲酯进行亲核取代获得最终化合物9-23，分别得到12和13。类似物24-27以相同方式制备，使用3-溴苯胺作为起始物质(方案2)。
[0460]
方案2-制备化合物24-27的合成路线
[0461][0462]
a)回流24h；ph2o，240℃，5h，40％；b)socl2，回流，5h，100％；c)苯胺，二噁烷，90℃，过夜，80％；d)nabh4，etoh，室温，过夜，90％；e)dess-martin过碘烷，dcm，室温，3h，80％；f)膦酰基乙酸三乙酯，k2co3，etoh，100℃，过夜，70％；g)硼酸/酯，pdcl2(pph3)2，na2co3，二噁烷，90℃，过夜，20％或胺，pd(oac)2，r-binap，cs2co3，二噁烷，85℃，过夜，90％；h)fe，nh4cl，etoh/h2o，80℃，2h，70％；i)丙烯酰氯，dipea，thf，-10℃至室温，5h，15％。
[0463]
为了制备化合物28，首先在所描述的条件下进行中间体3a与硼酸酯之间的suzuki偶联(参见方案1中的条件g)，随后用fe/nh4cl还原硝基并用丙烯酰氯酰化(方案3)。最后，化合物29由中间体6a制得，将该中间体用sncl2还原，随后用丙烯酰氯酰化(方案4)。
[0464]
方案3-制备化合物28的合成路线
[0465][0466]
a)4-(甲磺酰基氨基)苯基硼酸频哪醇酯，pdcl2(pph3)2，na2co3，二噁烷，90℃，过夜，73％；b)fe，nh4cl，etoh/h2o，80℃，2h，88％；c)丙烯酰氯，dipea，thf，-10℃至室温，5h，10％。
[0467]
方案4-制备化合物29的合成路线
[0468][0469]
a)sncl2，etoac，85℃，2h，68％；b)酰氯，dipea，thf，-10℃至室温，5h，95％。
[0470]
6-溴-4-羟基喹啉-3-羧酸酯(1)
[0471]
将2-(乙氧基亚甲基)丙二酸二乙酯(11.7ml；58.13mmol)和4-溴苯胺(10g；58.13mmol)加热至145℃。23h后，蒸发溶剂，得到灰白色固体。添加ph2o(25ml)并将反应加热至245℃。6h后，通过tlc检测不到更多的中间体(etoac:己烷20:80)。冷却至室温后，形成沉淀物，添加己烷以诱导更多沉淀。过滤沉淀物，用etoac洗涤并在真空下干燥，得到呈灰白色固体的标题化合物(6.9g，40％收率)。
[0472]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ8.60(s,1h),8.22(d,j＝2.4hz,1h),7.82(dd,j＝8.7,2.4hz,1h),7.58(d,j＝8.7hz,1h),4.20(q,j＝7.1hz,2h),1.27(t,j＝7.1hz,3h)。
[0473]
6-溴-4-氯-3-喹啉羧酸乙酯(2)
[0474]
将6-溴-4-羟基-3-喹啉羧酸酯(13.4g；45.25mmol)悬浮于socl2(130ml；1.792mol)中并将混合物加热至80℃。5h后，得到澄清的黄色溶液。蒸发溶剂并将固体与dcm(5
×
)共蒸发以去除残留的hcl。将其在真空下干燥，得到呈浅黄色固体的标题化合物(14.4g，100％收率)。
[0475]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ9.37(s,1h),8.71(d,j＝2.0hz,1h),8.56(d,j＝9.0hz,1h),8.12(dd,j＝9.0,2.0hz,1h),4.53(q,j＝7.1hz,2h),1.47(t,j＝7.1hz,3h)。
[0476]
一般程序a：亲核芳族取代
[0477]
6-溴-4-((4-甲基-3-硝基苯基)氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(3a)
[0478]
将6-溴-4-氯-3-喹啉羧酸乙酯2(800mg；2.543mmol)和4-甲基-5-硝基苯胺(387mg；2.543mmol)与二噁烷(15ml)混合并加热至90℃。7h后，tlc分析(50％etoac/己烷)不再检测到起始物质。将黄色悬浮液冷却至室温，用h2o稀释并添加naoh(1m)直至达到ph＝8。添加etoac并分离各相。将水相进一步用etoac(2
×
)萃取，并将合并的有机物用盐水洗涤并经mgso4干燥。过滤后，蒸发溶剂，得到呈亮黄色固体的标题化合物(980mg；90％收率)。
[0479]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ10.38(s,1h),9.29(s,1h),7.90(d,j＝9.4hz,1h),7.74(dq,j＝4.3,2.2hz,2h),7.65(d,j＝2.5hz,1h),7.25(d,j＝8.3hz,1h),7.08(dd,j＝8.3,2.5hz,1h),4.45(q,j＝7.1hz,2h),2.58(s,3h),1.46(t,j＝7.1hz,3h)。
[0480]
6-溴-4-((3-甲基-5-硝基苯基)氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(3b)
[0481]
使用一般程序a制备，使中间体2与3-甲基-5-硝基苯胺反应。分离出呈黄色固体的化合物3b(730mg；89％收率)。
[0482]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ10.35(s,1h),9.30(s,1h),7.92(d,j＝8.8hz,1h),7.79-7.73(m,3h),7.61(s,1h),7.11(s,1h),4.45(q,j＝7.1hz,2h),2.39(s,3h),1.45(t,j＝7.1hz,3h)。
13
c nmr(75.5mhz,cdcl3):δ167.9,151.5,150.2,149.6,149.0,143.5,141.2,135.1,132.1,128.4,127.5,120.8,119.7,119.2,113.2,109.1,61.9,14.4。hrms(esi)：c
19h17
brn3o4的m/z[m h] 计算值：430.0397；实验值：430.0401。
[0483]
6-溴-4-((2-甲基-5-硝基苯基)氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(3c)
[0484]
使用一般程序a制备，使中间体2与2-甲基-5-硝基苯胺反应。反应需要在90℃下加热23h，随后在110℃下加热4h。分离出呈黄色固体的化合物3c(730mg，89％收率)。
[0485]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.29(s,1h),8.87(s,1h),8.52
–
8.47(m,1h),7.98
–
7.90(m,3h),7.66(d,j＝2.4hz,1h),7.60(d,j＝8.5hz,1h),3.85(q,j＝7.1hz,2h),2.44(s,3h),1.04(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)：c
19h17
brn3o4的m/z[m h] 计算值：430.0397；实验值：430.0400。无法获得
13
c nmr，因为该化合物在d
6-dmso、d
6-丙酮、d
3-乙腈或d
4-甲醇中
溶解不充分。
[0486]
6-溴-4-((3-硝基苯基)氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(3d)
[0487]
使用一般程序a制备，使中间体2与3-硝基苯胺反应。反应时间为8h。分离出呈橙色固体的化合物3d(640mg；81％收率)。
[0488]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ10.41(s,1h),9.32(s,1h),8.01
–
7.91(m,2h),7.86(t,j＝2.2hz,1h),7.79
–
7.70(m,2h),7.51
–
7.42(m,1h),7.28
–
7.23(m,1h),4.47(q,j＝7.1hz,2h),1.47(t,j＝7.2hz,3h)。13c nmr(75.5mhz,cdcl3):δ167.9,151.5,150.1,149.5,149.0,143.7,135.1,132.1,130.0,128.3,126.6,120.8,119.4,119.0,115.9,109.4,62.0,14.3。hrms(esi)：c
18h15
brn3o4的m/z[m h] 计算值：416.0240；实验值：416.0245。
[0489]
6-溴-4-((4-甲氧基-3-硝基苯基)氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(3e)
[0490]
使用一般程序a制备，使中间体2与4-甲氧基-3-硝基苯胺反应。分离出呈橙色固体的化合物3e(780mg；92％收率)。
[0491]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ10.43(s,1h),9.26(s,1h),7.88(d,j＝9.3hz,1h),7.73
–
7.70(m,2h),7.59(d,j＝2.7hz,1h),7.22
–
7.18(m,1h),7.04(d,j＝9.0hz,1h),4.45(q,j＝7.1hz,2h),3.98(s,3h),1.46(t,j＝7.1hz,3h)。13c nmr(75.5mhz,cdcl3):δ168.2,151.7,151.1,150.4,149.7,139.7,135.2,134.9,132.1,128.4,128.1,120.4,119.7,118.9,114.6,107.8,61.8,57.1,14.4。hrms(esi)：c
19h17
brn3o5的m/z[m h] 计算值：446.0346；实验值：446.0347。
[0492]
7-溴-4-(4-甲基-3-硝基苯基氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(3a’)
[0493]
使用一般程序a制备，使中间体2’与4-甲基-5-硝基苯胺反应。3h后反应完成。分离出呈黄色固体的化合物3f(1.85g；85％收率)。
[0494]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ10.54(s,1h),9.31(s,1h),8.26(d,j＝2.0hz,1h),7.69
[0495]
(d,j＝2.4hz,1h),7.48(d,j＝9.1hz,1h),7.34(dd,j＝9.1,2.0hz,1h),7.28(m,1h),7.13(dd,j＝8.3,2.4hz,1h),4.48(q,j＝7.1hz,2h),2.60(s,3h),1.49(t,j＝7.1hz,3h).
13
c nmr(75.5mhz,cdcl3):δ168.0,152.1,151.8,151.3,149.6,141.5,133.7,132.4,129.6,128.8,127.3,126.4,126.2,117.9,117.7,108.0,61.9,20.1,14.4。hrms(esi)：c
19h17
brn3o4的m/z[m h] 计算值：430.0397；实验值：430.0393。
[0496]
7-溴-4-(3-甲基-5-硝基苯基氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(3b’)
[0497]
使用一般程序a制备，使中间体2’与3-甲基-5-硝基苯胺反应。反应时间为17h。将粗物质用冷的etoac洗涤以去除未反应的苯胺。分离出呈橙色固体的化合物3b’(740mg；58％收率)。
[0498]1h nmr(300mhz,cdcl3)δ10.41(s,1h),9.31(s,1h),8.35
–
8.08(m,1h),7.79(s,1h),7.63(s,1h),7.46(d,j＝9.1hz,1h),7.37
–
7.28(m,1h),7.10(s,1h),4.46(q,j＝7.0hz,2h),2.39(s,3h),1.46(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)：c
19h17
brn3o4的m/z[m h] 计算值：430.0397；实验值：430.0390。
[0499]
7-溴-4-(3-硝基苯基氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(3d’)
[0500]
使用一般程序a制备，使中间体2’与3-硝基苯胺反应。
[0501]
反应时间为17h。分离出呈橙色固体的化合物3d’(2.52g；95％收率)。
[0502]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ10.41(s,1h),9.31(s,1h),8.24(brs,1h),7.79(s,1h),
7.63(s,1h),7.46(d,j＝9.1hz,1h),7.34
–
7.28(m,1h),7.10(s,1h),4.46(q,j＝7.1hz,2h),2.39(s,3h),1.46(t,j＝7.1hz,3h)。
13
c nmr(75.5mhz,cdcl3):δ168.0,152.3,151.7,151.2,149.1,144.0,132.9,130.3,129.0,127.2,126.9,126.3,119.0,118.2,116.0,108.8,62.0,14.4。hrms(esi)：c
18h15
brn3o4的m/z[m h] 计算值：416.0240；实验值：416.0244。
[0503]
一般程序b：酯至醇还原
[0504]
(6-溴-4-((4-甲基-3-硝基苯基)氨基)喹啉-3-基)甲醇(4a)
[0505]
在0℃下将硼氢化钠(5.44g；143.99mmol；将15当量)分批添加至3a(4.13g；9.599mmol)在etoh(35ml)中的搅拌溶液中。15h后，tlc分析(50％etoac/己烷)显示起始物质消失。将橙色溶液在冰浴中冷却并用nh4cl水溶液淬灭。将混合物在h2o与etoac之间分配。分离各相并用etoac(2
×
)进一步萃取水相。将合并的有机物用盐水洗涤，经mgso4干燥并蒸发至干，得到呈橙色固体的标题化合物(3.73g；100％收率)。
[0506]
(6-溴-4-((3-甲基-5-硝基苯基)氨基)喹啉-3-基)甲醇(4b)
[0507]
使用关于4a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物4b(630mg；100％)。
[0508]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.07(s,1h),9.00(s,1h),8.24(s,1h),8.00(d,j＝8.9hz,1h),7.87(d,j＝8.9hz,1h),7.48(s,1h),7.28(s,1h),6.85(s,1h),5.47(t,j＝5.4hz,1h),4.48,(d,j＝5.4hz,2h),2.31(s,3h)。13c nmr(75.5mhz,d6-dmso):δ152.2,148.6,146.9,146.1,140.6,139.9,132.3,131.7,128.7,125.5,125.3,121.3,119.6,114.3,106.5,58.2,20.9。hrms(esi)：c
17h15
brn3o3的m/z[m h] 计算值：388.0291；实验值：388.0293。
[0509]
(6-溴-4-((2-甲基-5-硝基苯基)氨基)喹啉-3-基)甲醇(4c)
[0510]
使用关于4a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物4c(250mg；68％收率)。
[0511]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.03(s,1h),8.20(d,j＝2.1hz,1h),8.09(s,1h),8.00(d,j＝8.9hz,1h),7.87(dd,j＝8.9,2.2hz,1h),7.68(dd,j＝8.3,2.3hz,1h),7.50(dd,j＝8.3,0.9hz,1h),6.88(d,j＝2.4hz,1h),5.47(t,j＝5.5hz,1h),4.39,(d,j＝5.5hz,2h),2.50(s,3h)。13c nmr(75.5mhz,d6-dmso):δ152.0,147.0,146.5,144.4,141.5,134.5,132.4,131.7,131.5,128.2,125.7,125.2,119.5,115.0,109.2,58.3,18.4。hrms(esi)：c
17h15
brn3o3的m/z[m h] 计算值：388.0291；实验值：388.0293。
[0512]
(6-溴-4-((3-硝基苯基)氨基)喹啉-3-基)甲醇(4d)
[0513]
使用关于4a描述的程序准备。通过硅胶柱色谱法进行纯化(洗脱液：meoh:dcm 0:100至5:95)，得到呈黄色固体的化合物4d(250mg；42％收率)。
[0514]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.06(d,j＝5.4hz,2h),8.21(d,j＝2.0hz,1h),7.99(d,j＝8.9hz,1h),7.87(d,j＝8.9hz,1h),7.64(d,j＝8.0hz,1h),7.49
–
7.42(m,2h),7.00(d,j＝8.0hz,1h),5.47(t,j＝5.1hz,1h),4.48(d,j＝5.1hz,2h)。
13
c nmr(75.5mhz,d
6-dmso):δ152.3,148.6,147.0,146.3,139.9,132.4,131.7,130.5,128.8,125.5,125.3,120.9,119.7,113.7,109.1,58.2。hrms(esi)：c
16h13
brn3o3的m/z[m h] 计算值：374.0135；实验值：374.0134。
[0515]
(6-溴-4-((4-甲氧基-3-硝基苯基)氨基)喹啉-3-基)甲醇(4e)
[0516]
使用关于4a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物4e(600mg；93％收率)。
[0517]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ8.97(s,1h),8.67(s,1h),8.26(d,j＝2.1hz,1h),7.94(d,j＝8.9hz,1h),7.83(dd,j＝8.9,2.1hz,1h),7.32
–
7.18(m,2h),7.00(dd,j＝9.0,2.8hz,1h),5.40(t,j＝5.4hz,1h),4.42(d,j＝5.4hz,2h),3.85(s,3h).
13
c nmr(75.5mhz,d6-dmso):δ152.2,147.0,146.0,141.1,139.3,138.2,132.1,131.7,131.7,126.5,125.5,124.6,122.3,119.2,115.5,112.3,58.5,56.9。hrms(esi)：c
17h15
brn3o4的m/z[m h] 计算值：404.0240；实验值：404.0244。
[0518]
(7-溴-4-(4-甲基-3-硝基苯基氨基)喹啉-3-基)甲醇(4a’)
[0519]
使用关于4a描述的程序准备。分离出呈橙色固体的化合物4a’(770mg；100％收率)。
[0520]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.00(s,1h),8.83(s,1h),8.23(d,j＝2.0hz,1h),7.88(d,j＝9.0hz,1h),7.68(dd,j＝9.0,2.1hz,1h),7.32
–
7.21(m,2h),6.86(dd,j＝8.4,2.5hz,1h),5.43(t,j＝5.4hz,1h),4.51(d,j＝5.4hz,2h),2.39(s,3h)。
13
c nmr(75.5mhz,d
6-dmso):δ152.9,149.2,149.1,144.2,141.7,133.4,131.3,129.2,127.8,125.8,123.0,122.5,122.4,120.2,110.6,58.3,18.9。hrms(esi)：c
17h15
brn3o3的m/z[m h] 计算值：388.0291；实验值：388.0293。
[0521]
(7-溴-4-(3-甲基-5-硝基苯基氨基)喹啉-3-基)甲醇(4b’)
[0522]
使用关于4a描述的程序准备。分离出呈黄色固体的化合物4b’(620mg；96％收率)。
[0523]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.03(s,1h),8.94(s,1h),8.24(d,j＝2.0hz,1h),7.88(d,j＝9.0hz,1h),7.68(dd,j＝9.0,2.0hz,1h),7.48
–
7.45(m,1h),7.25(m,1h),6.84(brs,1h),5.47(t,j＝5.4hz,1h),4.52(d,j＝5.4hz,2h),2.29(s,3h)。hrms(esi)：c
17h15
brn3o3的m/z[m h] 计算值：388.0291；实验值：388.0294。
[0524]
(7-溴-4-(3-硝基苯基氨基)喹啉-3-基)甲醇(4d’)
[0525]
使用关于4a描述的程序准备。分离出呈橙色固体的化合物4d’(810mg；91％收率)。
[0526]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.03(s,2h),8.25(d,j＝2.0hz,1h),7.87(d,j＝9.0hz,1h),7.69(dd,j＝9.0,2.1hz,1h),7.62(ddd,j＝8.1,2.2,0.9hz,1h),7.48
–
7.44(m,1h),7.41(d,j＝8.1hz,1h),5.82(s,1h),5.51(t,j＝5.5hz,1h),4.52(d,j＝5.5hz,2h)。hrms(esi)：c
16h13
brn3o3的m/z[m h] 计算值：374.0135；实验值：374.0134。
[0527]
一般程序c：醇氧化成醛
[0528]
6-溴-4-((4-甲基-3-硝基苯基)氨基)喹啉-3-甲醛(5a)
[0529]
将醇4a(2.34g；6.029mmol)悬浮在dcm(150ml)中并将混合物冷却至0℃。分批添加dmp(3.83g；9.041mmol；1.5当量)并将反应升温至室温。2h后，tlc分析(dcm中的5％meoh)显示反应完成。将溶液冷却至0℃，并缓慢添加naoh(1m)。将混合物在室温下搅拌15min。添加h2o并分离各相。用dcm(3
×
)进一步萃取水相。将合并的有机物用盐水洗涤，经mgso4干燥并至干，得到呈黄色固体的标题化合物(1.75g；75％收率)。
[0530]
6-溴-4-((3-甲基-5-硝基苯基)氨基)喹啉-3-甲醛(5b)
[0531]
使用关于5a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物5b(420mg；72％收率)。
[0532]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ11.26(s,1h),10.10(s,1h),8.90(s,1h),7.97
–
7.88(m,2h),7.83
–
7.74(m,2h),7.66(d,j＝2.1hz,1h),7.34
–
7.27(m,1h),2.46(s,3h)。
13
c nmr(75.5mhz,cdcl3):δ193.4,155.0,150.2,149.7,149.0,141.6(2),136.0,132.2,129.5,
128.7,121.4,119.2,118.9,115.3,113.7,21.5。hrms(esi)：
[0533]c17h13
brn3o3的m/z[m h] 计算值：386.0135；实验值：386.0142。
[0534]
6-溴-4-((2-甲基-5-硝基苯基)氨基)喹啉-3-甲醛(5c)
[0535]
使用关于5a描述的程序准备。得到呈黄色固体的化合物5c(165mg；72％收率)。
[0536]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ10.18(s,1h),9.94(s,1h),8.97(s,1h),8.07-8.02(m,2h),7.93-7.88(m,3h),7.67(m,1h),2.42(s,3h)。1h nmr(300mhz,cdcl3):δ11.28(s,1h),10.11(s,1h),8.90(s,1h),8.11(dd,j＝8.4,2.1hz,1h),7.91(d,j＝8.9hz,2h),7.75(dd,j＝9.0,2.1hz,1h),7.55(d,j＝8.4hz,1h),7.45(d,j＝1.9hz,1h),2.48(s,3h)。hrms(esi)：c
17h13
brn3o3的m/z[m h] 计算值：386.0135；实验值：386.0136。
[0537]
6-溴-4-((3-硝基苯基)氨基)喹啉-3-甲醛(5d)
[0538]
使用关于5a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物5d(200mg；65％收率)。
[0539]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ11.27(s,1h),10.12(s,1h),8.93(s,1h),8.14(dd,j＝8.1,2.2hz,1h),8.03(t,j＝2.2hz,1h),7.93(d,j＝9.0hz,1h),7.78(dd,j＝9.0,2.1hz,1h),7.64(d,j＝2.1hz,1h),7.60-7.53(m,1h),7.45(d,j＝8.0hz,1h).
13
c nmr(75.5mhz,cdcl3):δ193.4,154.9 150.1,149.7,149.1,142.0,136.0,132.2,130.6,128.8,128.6,120.8,119.2,119.1,118.0,113.9。hrms(esi)：c
16h11
brn3o3的m/z[m h] 计算值：371.9978；实验值：371.9986。
[0540]
6-溴-4-((4-甲氧基-3-硝基苯基)氨基)喹啉-3-甲醛(5e)
[0541]
使用关于5a描述的程序准备。获得呈橙色固体的化合物5e(370mg；70％收率)。1h nmr(300mhz,cdcl3):δ11.33(s,1h),10.07(s,1h),8.84(s,1h),7.88(dd,j＝8.9,2.1hz,1h),7.77-7.70(m,2h),7.63(d,j＝2.1hz,1h),7.38(dd,j＝8.8,2.7hz,1h),7.14(d,j＝8.9hz,1h),4.02(s,3h).13c nmr(75.5mhz,cdcl3):δ193.3,155.2,151.6,151.0,149.7,139.7,135.8,133.0,132.1,129.9,128.7,121.5,119.0,118.8,114.8,112.9,57.1。hrms(esi)：c
17h13
brn3o4的m/z[m h] 计算值：402.0084；实验值：402.0088。
[0542]
7-溴-4-(4-甲基-3-硝基苯基氨基)喹啉-3-甲醛(5a’)
[0543]
使用关于5a描述的程序准备。得到呈棕色固体的化合物5a’(220mg；85％收率)。
[0544]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ11.29(s,1h),10.06(s,1h),8.85(s,1h),8.18(d,j＝2.0hz,1h),7.80(d,j＝2.4hz,1h),7.40-7.32(m,2h),7.30
–
7.24(m,2h),2.62(s,3h)。
13
c nmr(75.5mhz,cdcl3):δ193.3,155.9,151.8,151.6,149.7,139.8,134.1,132.9,131.4,128.8,127.9,127.5,127.4,119.5,116.6,113.3,20.2。hrms(esi)：c
17h13
brn3o3的m/z[m h] 计算值：386.0135；实验值：386.0135。
[0545]
7-溴-4-(3-甲基-5-硝基苯基氨基)喹啉-3-甲醛(5b’)
[0546]
使用关于5a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物5b’(480mg；82％收率)。
[0547]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ10.37(s,1h),10.11(s,1h),9.03(s,1h),8.22(d,j＝2.1hz,1h),7.92(d,j＝9.1hz,1h),7.78
–
7.75(m,2h),7.67(dd,j＝9.0,2.1hz,1h),7.38(s,1h),2.34(s,3h)。hrms(esi)：c
17h13
brn3o3的m/z[m h] 计算值：386.0135；实验值：386.0127。
[0548]
7-溴-4-(3-硝基苯基氨基)喹啉-3-甲醛(5d’)
[0549]
使用关于5a描述的程序准备。得到呈棕色固体的化合物5d’(790mg；99％收率)。
[0550]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ11.32(s,1h),10.10(s,1h),8.92(s,1h),8.23(d,j＝2.0hz,1h),8.17
–
8.05(m,1h),8.03
–
8.01(m,1h),7.55(t,j＝8.1hz,1h),7.50
–
7.41(m,1h),7.38(d,j＝9.1hz,1h),7.29(dd,j＝9.1,2.0hz,1h)。hrms(esi)：c
16h11
brn3o3的m/z[m h] 计算值：371.9978；实验值：371.9975。
[0551]
一般程序d：horner-wadsworth-emmons(hwe)环化
[0552]
9-溴-1-(4-甲基-3-硝基苯基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(6a)
[0553]
将醛5a(1.74g；4.505mmol)、膦酰基乙酸三乙酯(894μl；4.505mmol)和
[0554]
k2co3(1.87g；13.516mmol；3当量)在氩气下在密封管中在无水etoh(30ml)中混合。将混合物加热至100℃过夜。16h后，将反应冷却至室温并蒸发溶剂。将粗物质在h2o与etoac之间分配。将水相进一步用etoac(3
×
)萃取，合并的有机物用盐水洗涤，经mgso4干燥并至干，得到呈深棕色固体的标题化合物(1.62g；88％收率)。
[0555]
9-溴-1-(3-甲基-5-硝基苯基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(6b)
[0556]
使用关于6a描述的程序准备。得到呈棕色固体的化合物6b(320mg；74％收率)。
[0557]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.97(s,1h),8.33(s,1h),8.09
–
7.88(m,3h),7.67(dd,j＝8.9,2.1hz,1h),7.53(s,1h),6.95(d,j＝9.5hz,1h),6.80(d,j＝2.1hz,1h),2.58(s,3h).
13
c nmr(75.5mhz,cdcl3):δ162.9,150.8,149.4,148.2,142.7,141.2,140.6,139.7,135.6,133.5,132.6,127.5,125.1,122.9,121.4,120.3,118.44,113.8,21.5。hrms(esi)：c
19h13
brn3o3的m/z[m h] 计算值：410.0135；实验值：410.0132。
[0558]
9-溴-1-(2-甲基-5-硝基苯基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(6c)
[0559]
使用关于6a描述的程序准备。得到呈深棕色固体的化合物6c(165mg；68％收率)。
[0560]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ9.02(s,1h),8.45(dd,j＝8.5,2.4hz,1h),8.11
–
7.97(m,3h),7.74
–
7.68(m,2h),7.00(d,j＝9.5hz,1h),6.80(d,j＝2.0hz,1h),2.21(s,3h)。hrms(esi)：c
19h13
brn3o3的m/z[m h] 计算值：410.0135；实验值：410.0133。
[0561]
9-溴-1-(3-硝基苯基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(6d)
[0562]
使用关于6a描述的程序准备。得到呈深棕色固体的化合物6d(150mg；71％收率)。
[0563]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ9.01(s,1h),8.53(dd,j＝8.3,2.1hz,1h),8.21(t,j＝2.1hz,1h),8.00(dd,j＝10.4,9.2hz,2h),7.87(t,j＝8.1hz,1h),7.80
–
7.64(m,2h),6.97(d,j＝9.5hz,1h),6.80(d,j＝2.1hz,1h)。hrms(esi)：c
18h11
brn3o3的m/z[m h] 计算值：395.9978；实验值：395.9976。
[0564]
9-溴-1-(4-甲氧基-3-硝基苯基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(6e)
[0565]
使用关于6a描述的程序准备。得到呈深棕色固体的化合物6e(255mg；65％收率)。
[0566]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.17(s,1h),8.32(d,j＝9.5hz,1h),8.17(d,j＝2.5hz,1h),7.98(d,j＝8.9hz,1h),7.82(m,2h),7.69(d,j＝9.0hz,1h),6.96(d,j＝9.4hz,1h),6.83(d,j＝2.0hz,1h),4.07(s,3h)。hrms(esi)：c
19h13
brn3o4的m/z[m h] 计算值：426.0084；实验值：426.0090。
[0567]
8-溴-1-(4-甲基-3-硝基苯基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(6a’)
[0568]
使用关于6a描述的程序准备。得到呈棕色固体的化合物6a’(220mg；96％收率)。
[0569]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.17(s,1h),8.31(d,j＝9.5hz,1h),8.23(m,2h),7.81
–
7.68(m,2h),7.39(dd,j＝9.4,2.3hz,1h),6.94(d,j＝9.5hz,1h),6.73(d,j＝9.4hz,
1h),2.68(s,3h)。hrms(esi)：c
19h13
brn3o3的m/z[m h] 计算值：410.0135；实验值：410.0134。
[0570]
8-溴-1-(3-甲基-5-硝基苯基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(6b’)
[0571]
使用关于6a描述的程序准备。得到呈棕色固体的化合物6b’(345mg；81％收率)。
[0572]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.18(s,1h),8.36
–
8.27(m,3h),8.24(d,j＝2.3hz,1h),7.76(brs,1h),7.36(dd,j＝9.5,2.3hz,1h),6.95(d,j＝9.4hz,1h),6.69(d,j＝9.4hz,1h),2.48(s,3h)。hrms(esi)：c
19h13
brn3o3的m/z[m h] 计算值：410.0135；实验值：410.0132。
[0573]
8-溴-1-(3-硝基苯基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(6d’)
[0574]
使用关于6a描述的程序准备。得到呈棕色固体的化合物6d’(500mg；60％收率)。
[0575]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.18(s,1h),8.49(m,2h),8.32(d,j＝9.5hz,1h),8.24(d,j＝2.3hz,1h),7.91
–
7.89(m,2h),7.34(dd,j＝9.4,2.3hz,1h),6.95(d,j＝9.5hz,1h),6.65(d,j＝9.4hz,1h)。hrms(esi)：c
18h11
brn3o3的m/z[m h] 计算值：395.9978；实验值：395.9975。
[0576]
一般程序e：suzuki偶联
[0577]
n-(4-(1-(4-甲基-3-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(7a)
[0578]
将溴-喹啉6a(280mg；0.683mmol)、4-(甲磺酰基氨基)苯基硼酸频哪醇酯(243mg；0.819mmol；1.2当量)、pdcl2(pph3)2(48mg；0.068mmol；0.1当量)和na2co3(1.025ml；2m；2.049mmol；3当量)在氩气下在二噁烷(3ml)中混合。将混合物加热至90℃过夜。16h后，tlc分析(meoh:dcm 5:95)显示反应完成。将混合物冷却至室温并通过硅藻土垫过滤。将垫进一步用etoh和meoh/dcm(10％)洗涤，直至tlc检测不到更多的产物。蒸发溶剂并将粗物质加到硅胶柱中，梯度为dcm中达2％的meoh。收集所需级分并蒸发至干，得到呈黄色固体的标题化合物(455mg；69％)。
[0579]
n-(4-(1-(3-甲基-5-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(7b)
[0580]
使用关于7a描述的程序准备。得到呈深黄色固体的化合物7b(160mg；64％收率)。
[0581]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.92(brs,1h),9.15(s,1h),8.45
–
8.28(m,3h),8.10(d,j＝8.6hz,1h),7.98(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.89(s,1h),7.20(d,j＝8.6hz,2h),7.15
–
7.02(m,3h),6.95(d,j＝9.5hz,1h),3.03(s,3h),2.5(s,3h).1h nmr(300mhz,cdcl3):δ9.01(s,1h),8.29(s,1h),8.19(d,j＝8.7hz,1h),8.09(m,1h),8.03(d,j＝9.5hz,1h),7.86(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.59(s,1h),7.19(d,j＝8.6hz,2h),7.12(d,j＝1.9hz,1h),7.04(d,j＝8.6hz,2h),6.96(d,j＝9.4hz,1h),6.57(s,1h),3.07(s,4h),2.56(s,3h)。hrms(esi)：c
26h21
n4o5s的m/z[m h] 计算值：501.1227；实验值：501.1224。
[0582]
n-(4-(1-(2-甲基-5-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(7c)
[0583]
使用关于7a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物7c(145mg；77％收率)。
[0584]1h nmr(300mhz,d
6-丙酮):δ9.14(s,1h),8.74(brs,1h),8.53
–
8.44(m,2h),8.34(d,j＝9.5hz,1h),8.15(d,j＝8.6hz,1h),8.03
–
7.91(m,2h),7.38
–
7.31(m,2h),7.23
–
7.13
(m,3h),6.95(d,j＝9.5hz,1h),3.04(s,3h),2.23(s,3h)。hrms(esi)：c
26h21
n4o5s的m/z[m h] 计算值：501.1227；实验值：501.1223。
[0585]
n-(4-(1-(3-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(7d)
[0586]
使用关于7a描述的程序准备。得到呈黄色固体的化合物7d(85mg；51％收率)。
[0587]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.93(s,1h),9.15(s,1h),8.62(s,1h),8.58
–
8.47(m,1h),8.34(d,j＝9.5hz,1h),8.10(d,j＝8.7hz,1h),7.97(m,3h),7.18(d,j＝8.2hz,2h),7.10
–
6.99(m,3h),6.96(d,j＝9.4hz,1h),3.03(s,3h)。hrms(esi)：c
25h19
n4o5s的m/z[m h] 计算值：487.1071；实验值：487.1071。
[0588]
n-(4-(1-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(7e)
[0589]
使用关于7a描述的程序准备。得到呈深黄色固体的化合物7e(120mg；42％收率)。
[0590]1h nmr(300mhz,d
6-丙酮):δ9.06(s,1h),8.83
–
8.74(brs,1h),8.24(d,j＝9.5hz,1h),8.15
–
8.09(m,2h),7.99(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.82(dd,j＝8.9,2.6hz,1h),7.64(d,j＝9.0hz,1h),7.40(d,j＝8.6hz,2h),7.30(d,j＝2.2hz,1h),7.27(d,j＝2.1hz,1h),7.21(dd,j＝1.9,0.6hz,1h),6.88(d,j＝9.5hz,1h),4.14(s,3h),3.06(d,j＝0.9hz,3h)。hrms(esi)：c
26h21
n4o6s的m/z[m h] 计算值：517.1176；实验值：517.1176。
[0591]
n-(4-(1-(4-甲基-3-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-8-基)苯基)甲烷磺酰胺(7a’)
[0592]
使用关于7a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物7a’(76mg；21％)。
[0593]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.97(s,1h),9.16(s,1h),8.33
–
8.30(m,2h),8.26(s,1h),7.84
–
7.77(m,4h),7.57(dd,j＝9.3,2.2hz,1h),7.30(d,j＝8.7hz,2h),6.92
–
6.86(m,2h),3.04(s,3h),2.69(s,3h)。hrms(esi)：c
26h21
n4o5s的m/z[m h] 计算值：501.1227；实验值：501.1227。
[0594]
n-(4-(1-(3-甲基-5-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-8-基)苯基)甲烷磺酰胺(7b’)
[0595]
使用关于7a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物7b’(400mg；95％)。
[0596]
hrms(esi)：c
26h21
n4o5s的m/z[m h] 计算值：501.1227；实验值：501.1232。
[0597]
n-(4-(1-(3-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-8-基)苯基)甲烷磺酰胺(7d’)
[0598]
使用关于7a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物7d’(90mg；31％)。
[0599]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.92(brs,1h),9.16(s,1h),8.52
–
8.49(m,2h),8.34
–
8.29(m,2h),7.95
–
7.93(m,2h),7.79(d,j＝8.8hz,2h),7.52(dd,j＝9.3,2.2hz,1h),7.29(d,j＝8.8hz,2h),6.91(d,j＝9.4hz,1h),6.76(d,j＝9.3hz,1h),3.03(s,3h)。hrms(esi)：c
25h19
n4o5s的m/z[m h] 计算值：487.1071；实验值：487.1069。
[0600]
4-(4-甲基-3-硝基苯基氨基)-6-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)喹啉-3-羧酸乙酯(中间体1-int1)
[0601]
使用关于7a描述的程序由中间体3a制备。得到呈黄色固体的化合物int1(265mg；73％)。
[0602]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ10.52(s,1h),9.29(s,1h),8.10(d,j＝8.7hz,1h),7.87(dd,j＝8.7,2.0hz,1h),7.72(d,j＝2.0hz,1h),7.67(d,j＝2.5hz,1h),7.59
–
7.41(m,2h),7.20-7.16(m,5h),4.46(q,j＝7.1hz,2h),3.03(s,3h),2.58(s,3h),1.47(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)：c
26h25
n4o6s的m/z[m h] 计算值：521.1489；实验值：521.1486。
[0603]
n-(4-(1-(4-甲基-3-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)丁烷-1-磺酰胺(7f
–
14的前体)
[0604]
使用一般程序e制备，使中间体6a与4-(丁基磺酰氨基)苯基硼酸反应。分离出呈黄色固体的化合物7f(200mg；53％收率)。
[0605]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.98(s,1h),9.13(s,1h),8.44
–
8.26(m,2h),
[0606]
8.09(d,j＝8.7hz,1h),7.98(d,j＝8.6hz,1h),7.82-7.74(m,2h),7.24(d,j＝8.2hz,2h),
[0607]
7.09(d,j＝8.2hz,2h),6.95(d,j＝8.2hz,2h),3.12(t,j＝7.9hz,3h),2.65(s,3h),1.65(m,2h),1.36(m,2h),0.84(t,j＝7.2hz,3h)。hrms(esi)：c
29h27
n4o5s的m/z[m h] 计算值：543.1697；实验值：543.1694。
[0608]
n-(3-(1-(4-甲基-3-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(7g
–
15的前体)
[0609]
使用一般程序e制备，使中间体6a与3-(甲磺酰基氨基)苯基硼酸频哪醇酯反应。分离出呈橙色固体的化合物7g(235mg；67％收率)。
[0610]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.81(s,1h),9.16(s,1h),8.34(d,j＝9.5hz,1h),8.29(m,1h),8.15(d,j＝8.6hz,1h),7.91(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.79(d,j＝1.3hz,2h),7.35(t,j＝7.8hz,1h),7.27
–
7.15(m,2h),7.05(d,j＝1.8hz,1h),6.95(d,j＝9.4hz,1h),6.58(dt,j＝8.0,1.2hz,1h),3.00(s,3h),2.66(s,3h)。hrms(esi)：c
26h21
n4o5s的m/z[m h] 计算值：501.1227；实验值：501.1228。
[0611]
4-(1-(4-甲基-3-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基氨基甲酸甲基酯(7h
–
16的前体)
[0612]
使用一般程序e制备，使中间体6a与4-(甲氧基羰基氨基)苯硼酸反应。分离出呈橙色固体的化合物7h(166mg；50％收率)。
[0613]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.82(s,1h),9.13(s,1h),8.33(dd,j＝9.4,1.5hz,2h),8.08(dd,j＝8.6,1.4hz,1h),8.04
–
7.93(m,1h),7.86
–
7.72(m,2h),7.56
–
7.46(m,2h),7.06(dd,j＝8.7,1.5hz,2h),7.03
–
6.91(m,2h),3.69(s,3h),2.68(s,3h)。hrms(esi)：c
27h21
n4o5的m/z[m h] 计算值：481.1506；实验值：481.1507。
[0614]
1-(4-甲基-3-硝基苯基)-9-(吡啶-4-基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(7i
–
17的前体)
[0615]
使用一般程序e制备，中间体6a与吡啶-4-硼酸水合物反应。分离出呈橙色固体的化合物7i(90mg；45％收率)。
[0616]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.21(s,1h),8.64
–
8.56(m,2h),8.40
–
8.31(m,2h),8.20
–
8.14(m,1h),8.11(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.87
–
7.75(m,3h),7.15
–
7.12(m,2h),6.98(d,j＝9.5hz,1h),2.66(s,3h)。hrms(esi)：c
24h17
n4o3的m/z[m h] 计算值：409.1295；实验值：409.1293。
[0617]
5-(1-(4-甲基-3-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)吡啶甲腈(7j
–
18的前体)
[0618]
使用一般程序e制备，使中间体6a与6-(氰基吡啶-3-基)硼酸反应。分离出呈橙色固体的化合物7j(92mg；44％收率)。
[0619]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.22(s,1h),8.50(m,1h),8.36(d,j＝9.5hz,1h),8.29(s,1h),8.20(d,j＝8.6hz,1h),8.16-8.14(m,1h),7.80(m,2h),7.65
–
7.52(m,3h),6.98(d,j＝9.5hz,1h),2.66(s,3h)。hrms(esi)：c
25h16
n5o3的m/z[m h] 计算值：434.1248；实验值：434.1245。
[0620]
1-(4-甲基-3-硝基苯基)-9-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(7k
–
19的前体)
[0621]
使用一般程序e制备，使中间体6a与2-三氟甲基(吡啶-5-基)硼酸反应。分离出呈橙色固体的化合物7k(110mg；47％收率)。
[0622]1h nmr(300mhz,d6-dmso):δ9.22(s,1h),8.53(d,j＝2.1hz,1h),8.36(d,j＝9.5hz,1h),8.29(s,1h),8.20(d,j＝8.7hz,1h),8.13(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.95(d,j＝8.2hz,1h),7.83(m,1h),7.65
–
7.54(m,3h),6.97(s,1h),2.62(s,3h)。hrms(esi)：c
25h16
f3n4o3的m/z[m h] 计算值：477.1169；实验值：477.1168。
[0623]
一般程序f：buchwald-hartwig偶联
[0624]
1-(4-甲基-3-硝基苯基)-9-(哌啶-1-基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(7l-20的前体)
[0625]
将溴-喹啉6a(250mg；0.609mmol)、哌啶(180μl；1.827mmol；3当量)、pd(oac)2(8.4mg；37.4μmol；0.06当量)、r-binap(46mg；73.1μmol；0.12当量)和cs2co3(595mg，1.827mmol；3当量)在氩气下在二噁烷(5ml)中混合。将混合物加热至90℃过夜。24h后，lcms分析显示反应完成。将混合物冷却至室温并蒸发溶剂。将粗物质在etoac与饱和nahco3之间分配。分离各相并用etoac(2
×
)进一步萃取水相。将合并的有机物用盐水洗涤并经mgso4干燥。过滤后，蒸发溶剂，得到呈黄色固体的标题化合物。该化合物无需进一步纯化即可使用(180mg；71％收率)。
[0626]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ8.87(s,1h),8.26
–
8.18(m,2h),7.84(d,j＝9.2hz,1h),7.76(d,j＝8.2hz,1h),7.70(dd,j＝8.2,2.1hz,1h),7.50-7.46(m,1h),6.85(d,j＝9.4hz,1h),6.23(d,j＝2.6hz,1h),2.74(m,4h),2.60(s,3h),1.45(m,6h)。hrms(esi)：c
24h23
n4o3的m/z[m h] 计算值：415.1765；实验值：415.1763。
[0627]
1-(4-甲基-3-硝基苯基)-9-吗啉代苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(7m
–
21的前体)
[0628]
使用一般程序f制备，使用吗啉作为胺。分离出呈橙色固体的化合物7m(290mg；95％收率)。
[0629]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ8.91(s,1h),8.35
–
8.17(m,2h),7.89(d,j＝9.2hz,1h),7.81
–
7.65(m,2h),7.53(dd,j＝9.2,2.6hz,1h),6.87(d,j＝9.4hz,1h),6.23(d,j＝2.6hz,1h),3.62(m,4h),2.68(m,4h),2.58(s,3h)。hrms(esi)：c
23h21
n4o4的m/z[m h] 计算值：417.1557；实验值：417.1557。
[0630]
1-(4-甲基-3-硝基苯基)-9-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(7n
–
22的前体)
[0631]
使用一般程序f制备，使用1-(甲基磺酰基)哌嗪作为胺。分离出呈黄色固体的化合物7n(285mg；95％收率)。
[0632]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.83(s,1h),8.10
–
7.86(m,3h),7.69
–
7.52(m,2h),7.35(dd,j＝9.3,2.6hz,1h),6.90(d,j＝9.3hz,1h),6.36(d,j＝2.6hz,1h),3.25(t,j＝5.0hz,4h),2.95
–
2.89(m,2h),2.85
–
2.82(m,2h),2.82(s,3h),2.71(s,3h)。hrms(esi)：c
24h24
n5o5s的m/z[m h] 计算值：494.1493；实验值：494.1492。
[0633]
9-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-1-(4-甲基-3-硝基苯基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(7o
–
23的前体)
[0634]
使用一般程序f制备，使用n,n-二甲基哌啶-4-胺作为胺。分离出呈黄色固体的化合物7o(215mg；77％收率)。
[0635]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ8.87(s,1h),8.23(m,2h),7.85(d,j＝9.2hz,1h),7.77(d,j＝8.4hz,1h),7.70(dd,j＝8.1,2.1hz,1h),7.51(m,1h),6.85(d,j＝9.4hz,1h),6.25(d,j＝2.6hz,1h),3.23
–
3.18(m,2h),2.62(s,3h),2.44
–
2.37(m,2h),2.15(s,3h),2.15(m,1h),1.66
–
1.62(m,2h),1.28
–
1.23(m,2h)。hrms(esi)：c
26h28
n5o3的m/z[m h] 计算值：458.2187；实验值：458.2185。
[0636]
8-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)-1-(3-硝基苯基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(7d’n
’‑
27的前体)
[0637]
使用一般程序f制备，使中间体6d与1-(甲基磺酰基)哌嗪反应。得到呈棕色固体的化合物7d’n’(355mg；98％)。
[0638]
hrms(esi)：c
23h22
n5o5s的m/z[m h] 计算值：480.1336；实验值：480.1330。
[0639]
一般程序g：用fe/nh4cl将硝基还原成胺
[0640]
n-(4-(1-(3-氨基-4-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(8a)
[0641]
将中间体7a(335mg；0.669mmol)悬浮在etoh(40ml)中并加热至回流。添加在h2o(20ml)中的fe(224mg；4.016mmol；6当量)和nh4cl(215mg；4.016mmol；6当量)并将混合物加热至回流。2h后，tlc分析(meoh:dcm 1:9)显示反应完成。将热混合物通过硅藻土垫过滤，并将垫进一步用etoh和meoh:dcm(2:8)洗涤。蒸发溶剂并将粗物质在h2o与etoac之间分配。分离各相并用etoac(3
×
)进一步萃取水相。将合并的有机物用盐水洗涤，经mgso4干燥并至干，得到呈灰白色固体的标题化合物(330mg；100％收率)。
[0642]
n-(4-(1-(3-氨基-5-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(8b)
[0643]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈亮黄色固体的化合物8b(85mg；70％收率)。
[0644]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.90(s,1h),9.07(s,1h),8.25(d,j＝9.4hz,1h),8.03(q,j＝8.9hz,2h),7.70(s,1h),7.35
–
7.21(m,4h),6.87(d,j＝9.5hz,1h),6.66(s,1h),6.48(s,1h),6.29(s,1h),5.40(s,2h),3.04(s,3h),2.25(s,3h)。hrms(esi)：c
26h23
n4o3s的m/z[m h] 计算值：471.1485；实验值：471.1484。
[0645]
n-(4-(1-(5-氨基-2-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(8c)
[0646]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物8c(70mg；68％收率)。
[0647]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.91(s,1h),9.11(s,1h),8.30(d,j＝9.5hz,1h),8.12
–
7.97(m,2h),7.53(d,j＝1.8hz,1h),7.32(d,j＝8.7hz,2h),7.27
–
7.16(m,3h),6.92(d,j＝9.4hz,1h),6.79(dd,j＝8.2,2.3hz,1h),6.45(d,j＝2.3hz,1h),5.29(s,2h),3.05(s,3h),1.80(s,3h)。hrms(esi)：c26h23n4o3s的m/z[m h] 计算值：471.1485；实验值：471.1485。
[0648]
n-(4-(1-(3-硝基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(8d)
[0649]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈深黄色固体的化合物8d(60mg；92％收率)。
[0650]1h nmr(300mhz,d6-dmso):δ9.91(s,1h),9.09(s,1h),8.27(d,j＝9.5hz,1h),8.11
–
7.95(m,2h),7.60(d,j＝1.9hz,1h),7.36
–
7.27(m,3h),7.23(d,j＝8.8hz,2h),6.92
–
6.79(m,2h),6.57(dd,j＝6.7,1.2hz,2h),5.55(brs,2h),3.04(s,3h)。hrms(esi)：c
25h21
n4o3s的m/z[m h] 计算值：457.1329；实验值：457.1328。
[0651]
n-(4-(1-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(8e)
[0652]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物8e(85mg；78％收率)。
[0653]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.93(s,1h),9.07(s,1h),8.26(d,j＝9.5hz,1h),8.05(d,j＝8.7hz,1h),7.97(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.37(d,j＝1.9hz,1h),7.32
–
7.18(m,4h),7.05(d,j＝8.3hz,1h),6.88(d,j＝9.4hz,1h),6.67
–
6.53(m,2h),5.11(s,2h),3.91(s,3h),3.04(s,3h)。hrms(esi)：c
26h23
n4o4s的m/z[m h] 计算值：487.1435；实验值：487.1433。
[0654]
n-(4-(1-(3-氨基-4-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-8-基)苯基)甲烷磺酰胺(8a’)
[0655]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈亮黄色固体的化合物8a’(80mg；71％收率)。
[0656]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.96(s,1h),9.10(s,1h),8.26
–
8.23(m,2h),7.84(d,j＝8.7hz,2h),7.52(dd,j＝9.4,2.2hz,1h),7.30(d,j＝8.7hz,2h),7.15(m,2h),6.84(d,j＝9.4hz,1h),6.56(d,j＝2.1hz,1h),6.48(dd,j＝7.8,2.1hz,1h),5.20(s,2h),3.04(s,3h),2.21(s,3h)。hrms(esi)：c
26h23
n4o3s的m/z[m h] 计算值：471.1485；实验值：471.1483。
[0657]
n-(4-(1-(3-氨基-5-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-8-基)苯基)甲烷磺酰胺(8b’)
[0658]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物8b’(295mg；70％收率)。
[0659]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.99(s,1h),9.09(s,1h),8.25
–
8.22(m,2h),7.86-7.81(m,4h),7.54(dd,j＝9.4,2.3hz,1h),7.30(d,j＝8.5hz,2h),7.21(d,j＝9.3hz,1h),6.84(d,j＝9.4hz,1h),6.61(s,1h),6.34(s,2h),3.04(s,3h),2.22(s,3h)。hrms(esi)：c
26h23
n4o3s的m/z[m h] 计算值：471.1485；实验值：471.1483。
[0660]
n-(4-(1-(3-氨基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-8-基)苯基)甲烷磺酰胺(8d’)
[0661]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈棕色固体的化合物8d’(140mg；85％收率)。
[0662]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.09(s,1h),8.26
–
8.22(m,2h),7.79
–
7.77(m,2h),7.50(dd,j＝9.3,2.2hz,1h),7.29
–
7.23(m,3h),7.12(d,j＝9.3hz,1h),6.85
–
6.78(m,2h),6.53
–
6.50(m,2h),5.42(s,2h),2.97(s,3h)。hrms(esi)：c
25h21
n4o3s的m/z[m h] 计算值：
457.1329；实验值：457.1329。
[0663]
4-(3-氨基-4-甲基苯基氨基)-6-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)喹啉-3-羧酸乙基酯(中间体2
–
int2)
[0664]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈黄色固体的化合物int2(190mg；88％)。
[0665]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ10.14(s,1h),9.88(s,1h),8.94(s,1h),8.08(d,j＝2.0hz,1h),8.04
–
7.96(m,1h),7.92(d,j＝8.7hz,1h),7.67
–
7.50(m,2h),7.39(d,j＝8.7hz,2h),7.23(d,j＝8.7hz,2h),6.97(d,j＝7.9hz,1h),6.45(d,j＝2.2hz,1h),6.33(dd,j＝7.9,2.2hz,1h),4.19(q,j＝7.1hz,2h),3.02(s,3h),2.11(s,3h),1.29(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)：c
26h27
n4o4s的m/z[m h] 计算值：491.1753；实验值：491.1748。
[0666]
n-(4-(1-(3-氨基-4-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)丁烷-1-磺酰胺(8f
–
15的前体)
[0667]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈亮黄色固体的化合物8f(163mg；91％收率)。
[0668]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.92(s,1h),9.06(s,1h),8.25(d,j＝9.5hz,1h),8.04(d,j＝8.6hz,1h),7.96(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.70
–
7.48(m,2h),7.39(d,j＝1.9hz,1h),7.30
–
7.13(m,5h),6.87(d,j＝9.4hz,1h),6.61(d,j＝2.1hz,1h),6.51(dd,j＝7.8,2.1hz,1h),3.12(t,j＝7.4hz,2h),2.25(s,3h),1.76
–
1.58(m,2h),1.47
–
1.29(m,2h),0.85(t,j＝7.3hz,3h)。hrms(esi)：c
29h29
n4o3s的m/z[m h] 计算值：513.1955；实验值：513.1954。
[0669]
n-(3-(1-(3-氨基-4-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-8-基)苯基)甲烷磺酰胺(8g
–
16的前体)
[0670]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈亮黄色固体的化合物8g(75mg；94％收率)。
[0671]
hrms(esi)：c26h23n4o3s的m/z[m h] 计算值：471.1484；实验值：471.1485。
[0672]
4-(1-(3-氨基-4-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基氨基甲酸甲酯(8h
–
17的前体)
[0673]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈亮黄色固体的化合物8h(147mg；100％收率)。
[0674]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.77(s,1h),9.06(s,1h),8.25(d,j＝9.4hz,1h),8.08
–
7.91(m,2h),7.51(d,j＝8.3hz,2h),7.43(d,j＝1.8hz,1h),7.22
–
7.18(m,3h),6.87(d,j＝9.4hz,1h),6.61(d,j＝2.1hz,1h),6.51(dd,j＝7.8,2.1hz,1h),5.25(brs,2h),3.70(s,3h),2.27(s,3h)。hrms(esi)：c
27h23
n4o3的m/z[m h] 计算值：451.1765；实验值：451.1763。
[0675]
1-(3-氨基-4-甲基苯基)-9-(吡啶-4-基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(8i
–
18的前体)
[0676]
使用关于8a描述的程序准备。在相分离过程中，用nahco3将水相(ph为约5)调至ph为7。得到呈橙色固体的化合物8i(75mg；100％收率)。
[0677]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.14(s,1h),8.64
–
8.55(m,2h),8.28(d,j＝9.5hz,1h),8.11(s,2h),7.51(s,1h),7.31
–
7.23(m,2h),7.20(d,j＝8.2hz,1h),6.90(d,j＝9.4hz,1h),6.66(d,j＝2.1hz,1h),6.49(dd,j＝7.8,2.1hz,1h),5.33(s,2h),2.25(s,3h)。hrms(esi)：c
24h19
n4o的m/z[m h] 计算值：379.1553；实验值：379.1552。
[0678]
5-(1-(3-氨基-4-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)吡啶甲腈(8j
–
19的前体)
[0679]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物8j(79mg；97％收率)。
[0680]
hrms(esi)：c
25h18
n5o的m/z[m h] 计算值：404.1506；实验值：404.1507。
[0681]
1-(3-氨基-4-甲基苯基)-9-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(8k
–
20的前体)
[0682]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物8k(99mg；100％收率)。
[0683]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.15(s,1h),8.67(d,j＝2.1hz,1h),8.29(d,j＝9.5hz,1h),8.13(brs,2h),7.95(m,1h),7.88(m,1h),7.33(s,1h),7.19(d,j＝7.8hz,1h),6.92(d,j＝9.4hz,1h),6.64(d,j＝2.1hz,1h),6.51(dd,j＝7.7,2.1hz,1h),5.33(s,2h),2.21(s,3h)。hrms(esi)：c
25h18
f3n4o的m/z[m h] 计算值：447.1427；实验值：447.1426。
[0684]
1-(3-氨基-4-甲基苯基)-9-(哌啶-1-基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(8l
–
21的前体)
[0685]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈黄色固体的化合物8l(134mg；85％收率)。
[0686]
hrms(esi)：c
24h25
n4o的m/z[m h] 计算值：385.2023；实验值：385.2025。
[0687]
1-(3-氨基-4-甲基苯基)-9-吗啉代苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(8m
–
22的前体)
[0688]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物8m(141mg；95％收率)。
[0689]
hrms(esi)：c
23h23
n4o2的m/z[m h] 计算值：387.1816；实验值：387.1817。
[0690]
1-(3-氨基-4-甲基苯基)-9-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(8n)
[0691]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈黄色固体的化合物8n(285mg；88％收率)。
[0692]
1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.79(s,1h),7.94(dd,j＝16.9,9.3hz,2h),7.33(dd,j＝9.2,2.6hz,1h),7.27(m,1h),6.90(d,j＝9.4hz,1h),6.78(d,j＝2.6hz,1h),6.68(d,j＝6.4hz,2h),3.83(s,2h),3.26
–
3.22(m,4h),2.99
–
2.96(m,4h),2.82(s,3h),2.26(s,3h)。hrms(esi)：c
24h26
n5o3s的m/z[m h] 计算值：464.1751；实验值：464.1748。
[0693]
1-(3-氨基-4-甲基苯基)-9-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(8o
–
23的前体)
[0694]
使用关于8a描述的程序准备。该反应需要80℃下12当量的fe和nh4cl以及5h的反应时间。在相分离过程中，用nahco3将水相(ph为约5)调至ph为8。得到呈黄色固体的化合物8o(85mg；46％收率)。
[0695]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ8.81(s,1h),8.16(d,j＝9.4hz,1h),7.79(d,j＝9.1hz,1h),7.46(dd,j＝9.4,2.4hz,1h),7.13(d,j＝7.8hz,1h),6.79(d,j＝9.4,1h),6.71(brs,1h),6.57(d,j＝1.8hz,1h),6.49
–
6.37(m,1h),5.22(s,2h),3.34
–
3.30(m,2h),2.50(s,3h),2.42
–
2.36(m,2h),2.16(s,6h),2.16(m,1h),1.70
–
1.66(m,2h),1.30
–
1.22(m,2h)。hrms(esi)：c
26h30
n5o的m/z[m h] 计算值：428.2445；实验值：428.2442。
[0696]
1-(3-氨基苯基)-8-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(8d’n
’–
27的前体)
[0697]
使用关于8a描述的程序准备。得到呈橙色固体的化合物8d’n’(225mg；71％收率)。
[0698]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.92(s,1h),8.14(d,j＝9.4hz,1h),7.28
–
7.21(m,2h),7.03
–
6.96(m,1h),6.86(d,j＝9.8hz,1h),6.77
–
6.68(m,2h),6.46(brs,2h),5.43(s,2h),3.43(m,4h,)3.20(m,4h),2.89(s,3h)。hrms(esi)：c
23h24
n5o3s的m/z[m h] 计算值：
450.1594；实验值：450.1600。
[0699]
一般程序h：用sncl2将硝基还原成胺
[0700]
1-(3-氨基-4-甲基苯基)-9-溴苯并[h][1,6]萘啶-2(1h)-酮(中间体3
–
int3)
[0701]
将中间体6a(1.03g；2.511mmol)悬浮在etoac(50ml)中并添加sncl2(2.86g；15.065mmol；6当量)。将混合物加热至85℃，2h后，将反应冷却至室温并添加饱和nahco3水溶液。分离各相并用乙酸乙酯(2
×
)进一步萃取水相。将合并的有机物用盐水洗涤，经mgso4干燥，至干，得到呈褐色固体的int3(650mg；68％收率)。
[0702]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.11(s,1h),8.25(d,j＝9.4hz,1h),7.91(d,j＝8.9hz,
[0703]
1h),7.78(dd,j＝8.9,2.1hz,1h),7.18(d,j＝7.8hz,1h),6.99(d,j＝2.1hz,1h),6.90(d,j＝9.4hz,1h),6.53(d,j＝2.1hz,1h),6.45(dd,j＝7.7,2.1hz,1h),5.24(s,2h),2.22(s,3h)。hrms(esi)：c
19h15
brn3o的m/z[m h] 计算值：380.0393；实验值：380.0390。
[0704]
一般程序i：酰化
[0705]
n-(2-甲基-5-(9-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(9a；bmx-in-1)
[0706]
将8a(90mg；0.191mmol)在无水thf(20ml)中的搅拌溶液在冰浴中冷却至-10℃保持20分钟。添加dipea(133ul；0.765mmol；4当量)并将混合物在t《4℃下搅拌10min。10min后，添加丙烯酰氯并将混合物在-10℃下进一步搅拌10min，接着在室温下搅拌1h。接着蒸发thf，将粗物质重新溶解在etoac中，并用nahco3(4％)洗涤三次。将有机物经mgso4干燥并至干。将粗物质加至硅胶柱中并以100:0至96:4的dcm:meoh的梯度洗脱。收集所需级分并使其至干，得到呈白色固体的标题化合物(20mg；20％收率)。
[0707]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.85(s,1h),9.78(s,1h),9.11(s,1h),8.30(d,j＝9.4hz,1h),8.08(d,j＝8.7hz,1h),7.98(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.69(s,1h),7.52(d,j＝8.1hz,1h),7.23-7.20(m,6h),6.91(d,j＝9.4hz,1h),6.57(dd,j＝17.2,10.2hz,1h),6.19(d,j＝17.2hz,1h),5.74(d,j＝10.2hz,1h),3.01(s,3h),2.42(s,3h)。hrms(esi)：c
29h25
n4o4s的m/z[m h] 计算值：525.1591；实验值：525.1586。hplc纯度：98.9％。
[0708]
n-(3-甲基-5-(9-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(9b)
[0709]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈淡黄色固体的化合物9b(8mg；10％收率)。
[0710]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ10.42(s,1h),9.92(s,1h),9.12(s,1h),8.31(d,j＝9.5hz,1h),8.08(d,j＝8.8hz,1h),8.00(dd,j＝8.8,1.9hz,1h),7.78(s,1h),7.57(brs,1h),7.44(d,j＝1.9hz,1h),7.20(brs,4h),7.09(s,1h),6.92(d,j＝9.4hz,1h),6.39(dd,j＝17.0,10.0hz,1h),6.22(dd,j＝17.0,2.2hz,1h),5.73(dd,j＝9.9,2.1hz,1h),3.03(s,3h),2.36(s,3h)。hrms(esi)：c
29h25
n4o4s的m/z[m h] 计算值：525.1591；实验值：525.1576。hplc纯度：93.1％。
[0711]
n-(4-甲基-3-(9-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(9c)
[0712]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈淡黄色固体的化合物9c(40mg；55％收率)。
[0713]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ10.40(s,1h),9.91(brs,1h),9.14(s,1h),8.35(d,j＝
9.5hz,1h),8.10(d,j＝8.7hz,1h),8.01(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.83(dd,j＝8.4,2.2hz,1h),7.72(d,j＝2.1hz,1h),7.55(d,j＝8.4hz,1h),7.32(d,j＝1.8hz,1h),7.19(m,4h),6.96(d,j＝9.4hz,1h),6.39(dd,j＝17.0,10.0hz,1h),6.22(dd,j＝17.0,2.2hz,1h),5.74(dd,j＝10.0,2.2hz,1h),3.03(s,3h),1.91(s,3h)。hrms(esi)：c
29h25
n4o4s的m/z[m h] 计算值：525.1591；实验值：525.1587。hplc纯度：99.5％。
[0714]
n-(3-(9-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(9d)
[0715]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈淡黄色固体的化合物9d(27mg；50％收率)。
[0716]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ10.50(s,1h),9.91(s,1h),9.12(s,1h),8.31(d,j＝9.4hz,1h),8.08(d,j＝8.7hz,1h),8.03
–
7.91(m,2h),7.83(brs,1h),7.63(t,j＝8.1hz,1h),7.34(brs,1h),7.18(m,5h),6.92(d,j＝9.4hz,1h),6.42(dd,j＝16.9,10.0hz,1h),6.26(dd,j＝16.9,2.2hz,1h),5.77(dd,j＝9.7,1.9hz,1h),3.03(s,3h)。hrms(esi)：c
28h23
n4o4s的m/z[m h] 计算值：511.1435；实验值：511.1433。hplc纯度：98.0％。
[0717]
n-(2-甲氧基-5-(9-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(9e)
[0718]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈淡黄色固体的化合物9e(38mg；43％收率)。
[0719]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.73(s,1h),9.10(s,1h),8.29(d,j＝9.5hz,1h),8.19
–
8.10(m,1h),8.07(d,j＝8.6hz,1h),7.97(d,j＝8.7hz,1h),7.36
–
7.20(m,8h),6.91(d,j＝9.4hz,1h),6.74(dd,j＝17.0,10.2hz,1h),6.13(dd,j＝17.0,2.1hz,1h),5.68(dd,j＝10.3,2.1hz,1h),4.00(s,3h),3.01(s,3h)。hrms(esi)：c
29h25
n4o5s的m/z[m h] 计算值：541.1540；实验值：541.1542。hplc纯度：97.0％。
[0720]
n-(2-甲基-5-(9-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丁-2-烯酰胺(10)
[0721]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈淡黄色固体的化合物10(30mg；41％)。
[0722]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.86(s,1h),9.55(s,1h),9.10(s,1h),8.29(d,j＝9.5hz,1h),8.02(q,j＝8.6hz 2h),7.69(m,1h),7.49(d,j＝8.1hz,1h),7.21(brs,6h),6.91(d,j＝9.4hz,1h),6.73(dd,j＝15.1,7.2hz,1h),6.27(d,j＝15.3hz,1h),3.02(s,3h),2.41(s,3h),1.83(s,3h)。hrms(esi)：c
30h27
n4o4s的m/z[m h] 计算值：539.1748；实验值：539.1746。hplc纯度：99.3％。
[0723]
3-甲基-n-(2-甲基-5-(9-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丁-2-烯酰胺(11)
[0724]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈淡黄色固体的化合物11(20mg；32％)。
[0725]
1h nmr(300mhz,d6-dmso):δ9.39(s,1h),9.10(s,1h),8.29(d,j＝9.5hz,1h),8.08
–
7.96(m,2h),7.72(brs,1h),7.47(d,j＝8.1hz,1h),7.16(m,6h),6.91(d,j＝9.4hz,1h),6.03(s,1h),2.98(s,3h),2.40(s,3h),2.04(s,3h),1.84(s,3h)。hrms(esi)：c
31h29
n4o4s的m/z[m h] 计算值：553.1904；实验值：553.1909。hplc纯度：99.3％。
[0726]
n-(5-(9-(4-(丁基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)-2-甲基苯基)丙烯酰胺(14)
[0727]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈淡黄色固体的化合物14(33mg；20％)。
[0728]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.92(s,1h),9.81(s,1h),9.11(s,1h),8.30(d,j＝9.4hz,1h),8.07(d,j＝8.6hz,1h),7.98(d,j＝9.0hz,1h),7.69(s,1h),7.50(d,j＝8.1hz,1h),7.19(brs,6h),6.91(d,j＝9.5hz,1h),6.57(dd,j＝17.1,9.4hz,1h),6.19(d,j＝17.0hz,1h),5.74(d,j＝10.1hz,1h),3.09(t,j＝7.8hz,2h),2.40(s,3h),1.74
–
1.54(m,2h),1.35(q,j＝7.4hz,2h),0.83(t,j＝7.3hz,3h)。hrms(esi)：c
32h31
n4o4s的m/z[m h] 计算值：567.2061；实验值：567.2060。hplc纯度：95.2％。
[0729]
n-(2-甲基-5-(9-(3-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(15)
[0730]
使用关于9a描述的程序准备。将化合物15通过半制备型hplc以25:75至50:50的混合物(95:5acn:nahco
3 10mm):(nahco
3 10mm)的梯度进行纯化。获得呈白色固体的标题化合物(8mg；4％)。
[0731]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.98(s,1h),8.68(s,1h),8.17(d,j＝8.7hz,1h),8.07
–
7.94(m,2h),7.88(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.54
–
7.32(m,5h),7.25(m,1h),7.09(dd,j＝8.1,2.2hz,1h),6.98
–
6.84(m,2h),6.56(dd,j＝16.9,1.3hz,1h),6.36(dd,j＝16.9,10.2hz,1h),5.85(dd,j＝10.2,1.3hz,1h),2.98(s,3h),2.34(s,3h)。hrms(esi)：c
29h25
n4o4s的m/z[m h] 计算值：525.1591；实验值：525.1594。hplc纯度：94.3％。
[0732]
4-(1-(3-丙烯酰胺基-4-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基氨基甲酸甲酯(16)
[0733]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈淡黄色固体的化合物16(55mg；36％)。
[0734]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.75(s,2h),9.09(s,1h),8.29(d,j＝9.5hz,1h),8.15
–
7.90(m,2h),7.69(d,j＝2.0hz,1h),7.53-7.46(m,3h),7.32
–
7.08(m,4h),6.90(d,j＝9.4hz,1h),6.58(dd,j＝17.0,10.1hz,1h),6.19(dd,j＝17.0,2.0hz,1h),5.73(d,j＝10.4hz,1h),3.68(s,3h),2.44(s,3h)。hrms(esi)：c
30h25
n4o4的m/z[m h] 计算值：505.1870；实验值：505.1869。hplc纯度：97.8％。
[0735]
n-(2-甲基-5-(2-氧代-9-(吡啶-4-基)苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(17)
[0736]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈黄色固体的化合物17(29mg；20％)。
[0737]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.76(s,1h),9.17(s,1h),8.56(s,2h),8.32(d,j＝9.5hz,1h),8.16-8.12(m,2h),7.73(s,1h),7.52(d,j＝8.1hz,1h),7.38(s,1h),7.26-7.20(m,3h),6.94(d,j＝9.6hz,1h),6.57(dd,j＝16.5,9.6hz,1h),6.20(d,j＝16.5hz,1h),5.74(d,j＝9.3hz,1h),2.43(s,3h)。hrms(esi)：c
27h21
n4o2的m/z[m h] 计算值：433.1659；实验值：433.1656。hplc纯度：95.8％。
[0738]
n-(5-(9-(6-氰基吡啶-3-基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)-2-甲基苯基)丙烯酰胺(18)
[0739]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈浅黄色固体的化合物18(14mg；17％)。
[0740]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.75(s,1h),9.19(s,1h),8.61(dd,j＝2.3,0.8hz,1h),8.32(d,j＝9.5hz,1h),8.16-8.13(m,2h),8.06(dd,j＝8.2,0.8hz,1h),7.85(dd,j＝8.2,2.3hz,1h),7.67(d,j＝2.2hz,1h),7.51(d,j＝8.1hz,1h),7.25
–
7.22(m,2h),6.94(d,j＝9.4hz,1h),6.55(dd,j＝17.0,10.1hz,1h),6.17(dd,j＝17.0,2.0hz,1h),5.73(dd,j＝
10.1,2.0hz,1h),2.42(s,3h)。hrms(esi)：c
28h20
n5o2的m/z[m h] 计算值：458.1612；实验值：458.1610。hplc纯度：95.3％。
[0741]
n-(2-甲基-5-(2-氧代-9-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(19)
[0742]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈黄色固体的化合物19(20mg；18％)。
[0743]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.77(s,1h),9.18(s,1h),8.66(s,1h),8.32(d,j＝9.4hz,1h),8.17-8.14(m,2h),7.87(s,2h),7.67(d,j＝2.2hz,1h),7.51(d,j＝8.0hz,1h),7.25-7.22(m,2h),6.94(d,j＝9.4hz,1h),6.55(dd,j＝17.1,10.2hz,1h),6.17(dd,j＝17.1,2.2hz,1h),5.73(d,j＝10.2hz,1h),2.39(s,3h)。hrms(esi)：c
28h20
f3n4o2的m/z[m h] 计算值：501.1533；实验值：501.1534。hplc纯度：98.3％。
[0744]
n-(2-甲基-5-(2-氧代-9-(哌啶-1-基)苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(20)
[0745]
使用关于9a描述的程序准备。将化合物20通过制备型tlc用dcm:meoh(96:4)洗脱进行进一步纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(70mg；34％)。
[0746]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.76(s,1h),8.26(s,1h),8.03
–
7.79(m,3h),7.38
–
7.27(m,2h),6.97-6.90(m,2h),6.62(d,j＝2.6hz,1h),6.33
–
6.26(m,2h),5.67(t,j＝5.9hz,1h),2.74(m,4h),2.29(s,3h),1.48(m,6h)。hrms(esi)：c
27h27
n4o2的m/z[m h] 计算值：439.2129；实验值：439.2127。hplc纯度：98.2％。
[0747]
n-(2-甲基-5-(9-吗啉代-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(21)
[0748]
使用关于9a描述的程序准备。将化合物21通过制备型tlc用dcm:meoh(95:5)洗脱进行进一步纯化，得到呈淡黄色固体的标题化合物(36mg；29％)。
[0749]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.80(s,1h),8.17(s,1h),7.97(t,j＝9.4hz,2h),7.87(s,1h),7.38
–
7.28(m,2h),6.99-6.92(m,2h),6.64(d,j＝2.6hz,1h),6.41
–
6.26(m,2h),5.70(m,1h),3.68(t,j＝4.8hz,4h),2.88
–
2.62(m,4h),2.28(s,3h)。hrms(esi)：c
26h25
n4o3的m/z[m h] 计算值：441.1921；实验值：441.1920。hplc纯度：97.0％。
[0750]
n-(2-甲基-5-(9-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(22)
[0751]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈黄色固体的化合物22(45mg；25％)。
[0752]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.83(s,1h),8.11
–
7.95(m,4h),7.35
–
7.30(m,2h),6.96(d,j＝9.3hz,2h),6.68(d,j＝2.6hz,1h),6.34
–
6.30(m,2h),5.71(m,1h),3.29
–
3.02(m,4h),2.97
–
2.93(m,4h),2.76(s,3h),2.29(s,3h)。hrms(esi)：c
27h28
n5o4s的m/z[m h] 计算值：518.1857；实验值：518.1859。hplc纯度：96.7％。
[0753]
n-(5-(9-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)-2-甲基苯基)丙烯酰胺(23)
[0754]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈浅黄色固体的化合物23(9mg；10％)。
[0755]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.77(s,1h),8.25(s,1h),8.09
–
7.84(m,3h),7.42
–
7.27(m,2h),6.96
–
6.91(m,2h),6.64(d,j＝2.6hz,1h),6.40
–
6.23(m,2h),5.75
–
5.58(m,1h),3.30(t,j＝12.1hz,2h),2.43
–
2.29(m,3h),2.29(s,3h),2.26(s,6h),1.70-1.66(m,2h),
1.44
–
1.38(m,2h)。hrms(esi)：c
29h32
n5o2的m/z[m h] 计算值：482.2551；实验值：482.2551。hplc纯度：99.5％。
[0756]
n-(2-甲基-5-(8-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(24)
[0757]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈黄色固体的化合物24(35mg；43％)。
[0758]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.98(s,1h),9.68(s,1h),9.13(s,1h),8.37
–
8.23(m,2h),7.83(d,j＝8.6hz,2h),7.67(s,1h),7.58
–
7.41(m,2h),7.29(d,j＝8.7hz,2h),7.19(dd,j＝8.0,2.2hz,1h),6.98(d,j＝9.3hz,1h),6.88(d,j＝9.4hz,1h),6.56(dd,j＝17.1,10.1hz,1h),6.19(dd,j＝17.0,2.1hz,1h),5.74(d,j＝10.1hz,1h),3.03(s,3h),2.40(s,3h)。hrms(esi)：c
29h25
n4o4s的m/z[m h] 计算值：525.1591；实验值：525.1591。hplc纯度：95.1％。
[0759]
n-(3-甲基-5-(8-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(25)
[0760]
使用关于9a描述的程序准备。将化合物25通过制备型tlc用dcm:meoh(97:3)洗脱进行进一步纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(10mg；9％)。
[0761]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ10.39(s,1h),9.98(brs,1h),9.14(s,1h),8.31
–
8.28(m,2h),7.84(d,j＝8.4hz,2h),7.74(s,1h),7.59
–
7.54(m,2h),7.28(d,j＝8.3hz,2h),7.01
–
6.96(m,2h),6.89(d,j＝9.4hz,1h),6.43(dd,j＝17.0,10.0hz,1h),6.23(dd,j＝17.0,2.1hz,1h),5.76(dd,j＝9.9,2.1hz,1h),3.03(s,3h),2.37(s,3h)。hrms(esi)：c
29h25
n4o4s的m/z[m h] 计算值：525.1591；实验值：525.1595。hplc纯度：97.1％。
[0762]
n-(3-(8-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(26)
[0763]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈浅黄色固体的化合物26(20mg；18％)。
[0764]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ10.42(s,1h),9.94(brs,1h),9.15(s,1h),8.32
–
8.28(m,2h),7.89(d,j＝8.2hz,1h),7.85
–
7.76(m,3h),7.61(t,j＝8.1hz,1h),7.52(dd,j＝9.3,2.2hz,1h),7.29(d,j＝8.7hz,2h),7.17(dd,j＝7.9,1.1hz,1h),6.91(dd,j＝9.4,8.5hz,2h),6.43(dd,j＝17.0,10.0hz,1h),6.24(dd,j＝17.0,2.1hz,1h),5.77(dd,j＝9.9,2.0hz,1h),3.03(s,3h)。hrms(esi)：c
28h23
n4o4s的m/z[m h] 计算值：511.1435；实验值：511.1439。hplc纯度：98.0％。
[0765]
n-(3-(8-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基)丙烯酰胺(27)
[0766]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈浅黄色固体的化合物27(10mg；6％)。
[0767]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ10.44(s,1h),8.97(s,1h),8.19(d,j＝9.4hz,1h),7.86(m,1h),7.74(t,j＝2.0hz,1h),7.59(t,j＝7.9hz,1h),7.30(d,j＝2.8hz,1h),7.12(ddd,j＝7.8,2.0,1.0hz,1h),6.99(dd,j＝9.9,2.9hz,1h),6.74(d,j＝9.4hz,1h),6.64(d,j＝9.8hz,1h),6.43(dd,j＝16.9,10.0hz,1h),6.24(dd,j＝17.0,2.1hz,1h),5.78(dd,j＝10.0hz,2.0hz,1h),3.45(t,j＝5.1hz,4h),3.19(t,j＝5.1hz,4h),2.89(s,3h)。hrms(esi)：c
26h26
n5o4s的m/z[m h] 计算值：504.1700；实验值：504.1703。hplc纯度：96.8％。
[0768]
4-(3-丙烯酰胺基-4-甲基苯基氨基)-6-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)喹啉-3-羧酸乙
基酯(28)
[0769]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈黄色固体的化合物28(10mg；10％)。
[0770]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ10.59(s,1h),9.20(s,1h),8.05
–
7.93(m,1h),7.85-7.75(m,3h),7.46(s,1h),7.23
–
7.06(m,5h),6.81(d,j＝7.8hz,1h),6.47
–
6.18(m,2h),5.73(d,j＝9.6hz,1h),4.44(q,j＝7.1hz,2h),3.01(s,3h),2.33(s,3h),1.45(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)：c
29h29
n4o5s的m/z[m h] 计算值：545.1853；实验值：545.1849。hplc
[0771]
纯度：95.5％。
[0772]
n-(5-(9-溴-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)-2-甲基苯基)丙烯酰胺(29)
[0773]
使用关于9a描述的程序准备。得到呈灰白色固体的化合物29(40mg；85％)。
[0774]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.68(s,1h),9.15(s,1h),8.29(d,j＝9.5hz,1h),7.94(d,j＝8.8hz,1h),7.79(dd,j＝8.8,2.1hz,1h),7.66(s,1h),7.53(d,j＝8.0hz,1h),7.19(dd,j＝8.0,2.2hz,1h),6.94(d,j＝9.4hz,1h),6.84(d,j＝2.1hz,1h),6.59(dd,j＝17.0,10.1hz,1h),6.20(dd,j＝17.0,2.1hz,1h),5.74(dd,j＝10.0,2.1hz,1h),2.42(s,3h)。hrms(esi)：c
22h17
brn3o2的m/z[m h] 计算值：434.0499；实验值：434.0497。hplc纯度：92.2％。
[0775]
一般程序j：烷基化
[0776]
4-(2-甲基-5-(9-(4-(甲基磺酰氨基)苯基)-2-氧代苯并[h][1,6]萘啶-1(2h)-基)苯基氨基)丁-2-烯酸甲酯(13)
[0777]
在0℃下，在1h内向8a(73mg；0.155mmol)和k2co3(28mg；0.202mmol；1.3当量)在dmf(2ml)中的搅拌溶液中缓慢添加含4-溴巴豆酸甲酯(28mg；0.155mmol；1当量)的dmf(2ml)，并将混合物在0℃下搅拌。使反应升温至室温过夜，20h后tlc分析(含5％meoh的dcm)显示起始物质完全消耗。蒸发溶剂，并将粗物质在etoac与饱和nahco3水溶液之间分配。分离各相并用etoac(2
×
)进一步萃取水相。将合并的有机物经mgso4干燥并至干。将粗品加至硅胶柱上，并以100:0至97:3(dcm:meoh)梯度洗脱。收集所需级分并使其至干，得到呈浅黄色固体的标题化合物(30mg；34％收率)。
[0778]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.09(s,1h),8.26(d,j＝9.5hz,1h),8.08
–
8.00(m,2h),7.48
–
7.39(m,4h),7.33(d,j＝8.6hz,1h),7.15(d,j＝7.6hz,1h),6.89(d,j＝9.4hz,1h),6.79
–
6.72(m,1h),6.66(d,j＝2.0hz,1h),6.48(dd,j＝7.7,2.0hz,1h),6.05(d,j＝15.7hz,1h),5.38(m,0.5h),5.28(brs,2h),4.57(d,j＝4.5hz,1h),4.42(dt,j＝14.3,7.3hz,0.5h),3.65(s,3h),3.10(s,3h),2.21(s,3h)。hrms(esi)：c
31h29
n4o5s的m/z[m h] 计算值：569.1853；实验值：569.1853。hplc纯度：99.5％(2种异构体为1:5.3比率)。
[0779]
n-(4-(1-(3-(3-氰基烯丙基氨基)-4-甲基苯基)-2-氧代-1,2-二氢苯并[h][1,6]萘啶-9-基)苯基)甲烷磺酰胺(12)
[0780]
使用关于13描述的程序准备。得到呈淡黄色固体的化合物12(25mg；39％)。
[0781]1h nmr(300mhz,d
6-dmso):δ9.10(s,1h),8.27(d,j＝9.4hz,1h),8.08
–
8.03(m,2h),7.47
–
7.35(m,4h),7.33(d,j＝8.5hz,1h),7.17(d,j＝7.8hz,2h),6.89(dd,j＝9.4,2.3hz,2h),6.67(m,1h),6.49(dd,j＝7.8,2.3hz,1h),5.87(dd,j＝31.2,13.6hz,0.5h),5.30(brs,2h),4.64(d,j＝6.6hz,0.5h),4.54(d,j＝5.0hz,0.5h),4.26(dt,j＝13.5,6.5hz,0.5h),3.11(s,3h),2.20(s,3h)。hrms(esi)：c
31h25
n5o3s的m/z[m h] 计算值：
536.1751；实验值：536.1751。hplc纯度：99.0％(2种异构体为1:1.65比率)。
[0782]
溶解性、亲脂性和pampa渗透性
[0783]
支架中引入的修饰还试图改善新类似物的物理化学特性。bmx-in-1是一种亲脂性分子(clogp＝3.94)，具有有限的水溶性(logs＝-5.98)(参见下表1)。磺酰胺芳环的去除使化合物的亲脂性降低，同时还增加了水溶性。更具体地，类似物20-23表明，当在喹诺酮环的7位引入环状仲胺时，所述引入具有良好的耐受性，并且能够将clogp降低多达0.7个单位并将logs增加1.6个单位。最有趣的是，在7位上安装1-(甲基磺酰基)哌嗪，得到化合物27，该类似物具有最佳的计算机模拟亲脂性和水溶性特性：clogp＝2.32和logs＝-4.36。
[0784]
考虑到bmx-in-1没有最佳物理化学特性，预计该类似物可能具有有限的膜渗透性。细胞膜通透性对任何药物分子都至关重要，如果分子靶向细胞质蛋白的话就更重要了。对于药物渗透性的评估，我们依赖于pion公司进行的平行人工膜渗透性测定(pampa)。使用pampa evolution
tm
仪器来确定渗透性，我们观察到绝大多数类似物具有高渗透性(表1)。
[0785]
再一次，在磺酰胺区域引入的增溶基序导致有效渗透性的增加。基于分子9-29的clogp计算值，据信，增加的渗透性可能多半是由于构象方面如分子内氢键合超过不考虑三维构象的clogp。
[0786]
从表2中给出的数据可看出，具有较高clogp的类似物(14、16、19、28)是具有更有限的溶解性(logs)的化合物，在pampa测定中也观察到了这一点。此外，亲脂性很强的化合物如11和13显示最高的渗透性，但亲脂性最差的化合物(21、22、26和27)显示良好的透气率，因此加强了该假设。
[0787]
总之，在大多数情况下，所引入的修饰确实改善了类似物的整体特性，包括化合物26和27。
[0788]
胶体聚集
[0789]
胶体聚集是筛选测定中假阳性读数的主要来源。为了排除化合物9-29与bmx的非特异性结合，使用动态光散射(dls)测量粒度。数据显示，尽管溶解性有限，但合成的化合物在相关抑制性浓度下不会形成聚集体(参见表1)。
[0790]
动态光散射(zetasizer nano s,malvern,uk)用于测定化合物胶体聚集。在25℃下测量粒度。在dmso中制备测试化合物的10mm储备溶液，随后用去离子水和过滤水稀释，得到10μm(0.1％dmso)的分析物溶液。通过以10μm、1μm和0.1μm连续稀释来测量胶体聚集。
[0791]
表1：计算机模拟clogp和logs计算以及体外人工膜渗透性(pampa)和胶体聚集(dls)测定.
[0792]
[0793][0794]
人工膜渗透性(pampa)
[0795]
在pion公司使用pampa evolution
tm
仪器来测定渗透性。在pampa中形成有一个夹层，使得每个复合孔被分成两个腔室，由125μm厚的微滤盘(0.45μm孔)隔开，并涂有pion git-0磷脂混合物。使用低结合、低uv prisma缓冲液在供体隔室中在ph 6.8下测量每种化合物的有效渗透性pe(
×
10-6
cm/s)。在测试开始时，无药物受体隔室填充有含清除剂的受体接收剂缓冲液。专有的清除剂模拟血清蛋白和血液循环，由此创造吸收条件。通过在600μl的prisma ht缓冲液中稀释并彻底混合3μl的dmso储备液，制备所研究化合物的水溶液。水性缓冲液中有机溶剂(dmso)的最终浓度≤0.5％(v/v)。参考溶液在时间零时与供体相同，因此塑料制品的任何表面吸附效应都得到了补偿。组装pampa夹层并使其孵育约15小时。在实验持续期间不搅拌供体隔室中的溶液。因此，水边界层的厚度预计约为1,000μm。接着分离夹层，通过与从参考标准获得的uv光谱进行比较，分析供体隔室和受体隔室的药物呈递量。使用质量平衡来测定膜过滤器和塑料上的剩余物质量(％r)。所有值均报告为四份重复
的平均值。
[0796]
计算机模拟clog和logs
[0797]
使用swissadme软件(daina等人)计算clogp和logs。clog p是作为五种可自由使用的预测模型(xlogp3(cheng等人)、wlogp(wildman等人)、mlogp(moriguchi等人；moriguchi等人)、silicos-it和ilogp(daina等人)获得的一致值，并且logs是两种拓扑方法(esol模型：delaney等人；ali等人)的算术平均值。
[0798]
pampa：pe是在ph 6.8下从测定直接测量的有效渗透性(
×
10-6
cm/s)并且％r是膜滞留。所有值均报告为四份重复的平均值。und标签是指溶解性极低的化合物，其uv限度低于检测限，因此被视为未检测到。化合物被标记为高渗透性(绿色)、中等渗透性(橙色)或低渗透性(红色)。在10μm、1μm和100nm下测量dls。指示了最大可溶浓度-未观察到聚集体-并且颜色代码指示化合物是否在ic
50
浓度下形成聚集体(绿色-在ic
50
浓度下无聚集；红色-在ic
50
浓度下有聚集)。
[0799]
结构-活性关系
[0800]
结构-活性关系(sar)范围界定旨在确定工具化学型的局限性，阐明每个位置上耐受什么样的取代基，并建立不同功能的最佳载体和定位。
[0801]
为了探索sar，在由eurofins-cerep(france)进行的针对重组bmx的ic
50
酶测定中测试了化合物文库。结果如图1所示。
[0802]
我们最初将我们的修饰集中在对应于式(ii)化合物中的-d和-r6的两个主要区域，并且还在本发明的化合物中引入了对应于-a-的微小变化区域，用于系统调节。
[0803]
bmx的共价抑制被认为是通过位于atp结合位点边缘的cys496的烷基化发生的。在逐步的方法中，研究了对应于-d和-a-的区域中不同取代基的重要性和耐受性，这调节了半胱氨酸和其他潜在亲核试剂的亲电攻击。
[0804]
环状基团-a-的取代基对活性起到了意想不到的相关作用，提供了由非共价相互作用引起的不同反应模式。引入强给电子基团如甲氧基(ome)(9e)作为亚苯基环状基团的取代基会使效力降低4倍，而弱给电子基团甲基根据其在亚苯基环周围的定位而具有不同的效果。
[0805]
将甲基取代基移动到亚苯基的6位消除了靶标抑制作用(图9c)，而将甲基定位在5位将靶标抑制作用稍微提高2倍(图9b)。更引人注目的是环中无取代基使得抑制作用增加6倍(9d)。由于预计不同位置的甲基取代基的电子影响不能解释这些差异，因此认为构象效应可能起着重要作用。6取代基可能会增加装入口袋的限制，而甲基的去除提供较少的空间限制。
[0806]
结合过程部分地由受体基团-m处的亲核攻击调节。因此，设想受体基团的修饰以确定不同的亲电试剂是否会影响结合。
[0807]
结果清楚地表明，受体基团的修饰可导致结合的消除。向烯烃受体引入一个(10)或两个(11)末端甲基可降低抑制作用。此外，反转受体部分(13)，或引入共轭烯烃和腈(12)，可限制结合。因此，在后续支架中没有修饰受体基团。
[0808]
研究的重点随后转移到-r6位置处的基团的性质。对bmx-in-1的对接研究先前表明，主要的相互作用发生在远端磺酰胺处，远端磺酰胺调节与lys445的相互作用(liu等人acs chem.biol.)。为了评估该区域在分子活性中的重要性，我们用各种替代的芳族和非芳
族取代基置换了bmx-in-1的-r6处的含苯基基团。
[0809]
制备化合物14以便了解该位置是否是放置长链取代基的良好选择。显然，结果表明长取代基是不可容忍的，最可能的原因是装入口袋的能力受损。基于这些信息，我们探索了可提供不同相互作用的新的取代基。
[0810]
将磺酰胺移动到苯基环6位的间位(15)仅提供2倍的效力增加。
[0811]
为了进一步深入了解与lys445相互作用的相关性，在喹诺酮6位提供了新模式。氨基甲酸酯官能团(16)与酰胺酯杂化物有关，因为它通过羧基和主链nh参与氢键合。它调节分子间和分子内相互作用的能力促使我们使用这一功能，这一功能也通过化学和蛋白水解稳定性以及渗透细胞膜的能力得以及加强(ghosh等人)。
[0812]
遵循相同的原理，使用4-吡啶(17)和取代的3-吡啶(18和19)试图通过用杂环置换芳基环来降低亲脂性。不幸的是，氨基甲酸酯(16)或4-吡啶(17)取代基都未实现活性的大幅增加(仅增加1倍)，并且取代的吡啶(18和19)将亲和力降低了3倍和9倍。
[0813]
研究目标之一是改善所用化合物的药物相似性。着眼于优化物理化学性质，该项目的目的是降低bmx-in-1的亲脂性并改善其有限的溶解性。在此，考虑了大量芳环和引入的还原形式的母体杂环(如哌啶和哌嗪)可能破坏π-π堆积相互作用，旨在改善药物特性。
[0814]
观察到带有哌啶(20)、二甲氨基-哌啶(23)和吗啉(21)的类似物提供了类似的抑制作用，而磺酰胺-哌嗪(22)表现稍好，活性提高了3倍。这些数据表明，在该蛋白质位点没有发生主要的相互作用，为了证实这些观察结果，制备化合物29。
[0815]
几乎去除任何能够与lys445残基相互作用的基团后，结合不受影响。这一观察结果促使我们对母体分子的替代区域进行更彻底的评估。更具体地，通过破坏中心单元来评估三环核的相关性。受体基团和磺酰胺区域没有被修饰，但稠合的吡啶酮环被裂解，留下一个游离酯官能团(28)。结果清楚地表明三环中心核是必需的，因为这种类似物失去了7倍的效力。掌握了这些信息，我们试图制备化合物24。由于在喹啉6位具有取代基的初始类似物的结合效果仅略有改善，因此考虑将在7位具有取代基的化合物作为替代品。
[0816]
其效力显著提高了14倍，清楚地表明7位是含喹诺酮核的取代基的最佳位置。还制备了类似物25、26和27，其中使用了从6-取代的类似物的结构基团，得到了具有优选的总体特性的化合物。从早期对6-取代的类似物的研究中，选择化合物9b和9b作为合适的比较物。这些是亚苯基环状基团-a-未被取代(9d)或在4位被甲基取代(9b)的化合物。核在6位具有一个苯基取代基，该苯基本身被磺酰胺取代，这大大降低了clogp，同时增加了溶解性和渗透性。
[0817]
与bmx-in-1相比，所有新的类似物展现提高的效力(化合物25、26和27分别提高了14倍、6倍和4倍)。重要的是，为了获得先导物24-27之间的直接比较，对所有化合物在同一测定中进行了测试，再次使用bmx-in-1作为实验中的对照并重新测试化合物24。这些结果表明，将取代基定位在喹啉7位为在不影响活性的情况下实现口袋中有效结合和潜在共轭开辟了新的可能性。
[0818]
配体效率(le)和亲脂效率(lipe)是“药物相似性”的两个重要量度，它们与良好药物性质(例如像生物利用度)的前景改善相关。这些取决于分子的活性和物理化学性质，并被用作在药物发现途径中最有希望的候选药物进展的标准(bembenek等人；perola；hann等人)。
[0819]
使用le来比较抑制剂/配体的相对于其大小而言的结合功效，同时考虑到分子的亲脂性，使用lipe作为比较结合功效。鉴于bmx-in-1与类似物24-26之间的结构相似性，只有27反映了lipe的重大改善，引入脂族胺所造成的clogp急剧降低增强了这一改善。在另一方面，le的改善是由所有类似物的效力增加而不是分子大小的减小所驱动的。
[0820]
迄今为止，所报告的所有bmx抑制剂也显示出抑制bruton酪氨酸激酶(btk)的能力。为了确定我们的先导物是否是bmx的选择性结合剂，我们还评估了对btk(eurofins)的结合。对于btk ic
50
测定，我们选择了具有更高bmx抑制能力的类似物24和25，以及类似物27，类似物27表现出最佳的le和lipe改善(而且也提供了衍生化的可能性)。
[0821]
结果表明，所有化合物都是低纳摩尔范围内的有效btk抑制剂(下表2)。观察到相同的抑制趋势：与bmx-in-1相比，25、24和27的效力分别增加62倍、33倍和15倍。
[0822]
有趣的是，显示bmx-in-1对btk的ic
50
相较于bmx高7倍。因此，与bmx-in-1相比，新的类似物提供了关于btk结合的le和lipe量度的更大改善。
[0823]
表2：化合物bmx-in-1和24-27对bmx和btx的生物化学ic
50
、le和lipe
[0824][0825]
le-配体效率；lipe-亲脂效率；nd-未确定
[0826]
生物化学激酶测定
[0827]
bmx激酶活性(ic
50
)在cerep-france上进行。简而言之，使用在昆虫细胞中表达的人重组酶和htrf检测方法，通过测量底物生物素基-βaβaβaeeepqyeeipiylellp的磷酸化来定量对人重组bmx激酶的抑制作用。将待测化合物在室温下孵育60min，结果表示为对照比活性的百分比。btk激酶活性(ic
50
)在discover-x上通过放射计量测定进行。
[0828]
结果如图1所示。
[0829]
差示扫描荧光测定法
[0830]
dsf是一种基于荧光的热位移测定，用于研究配体结合后的his
6-bmx热稳定性(niesen等人；fedorov等人)，从而提供对靶蛋白和所报告抑制剂之间定向相互作用的指示。
[0831]
在不存在和存在本文所述的实验化合物的情况下对纯化的重组人his
6-bmx蛋白进行热扫描，并且根据解链曲线计算蛋白质解链温度(tm)。
[0832]
如表3所示，bmx-in-1使tm值提高了8.04℃。化合物11、12和13显示蛋白质解链温度几乎没有变化，表明可能出现了低亲和力或根本没有相互作用，证实了在酶测定中获得的结果。
[0833]
化合物24和27使蛋白质稳定，tm提高了
±
11.34℃和
±
10.81℃，再次表明24和27
以更高的亲和力与bmx直接结合。
[0834]
表3：使用dsf测定计算的解链温度(tm)偏移
[0835]
[0836][0837]
使用quantstudio 7flex real-time pcr系统(applied biosystems)在microamp
tm enduraplate
tm optical 96-well clear reaction plates with barcode(applied biosystems,life technologies,california,usa)中进行dsf。在dsf实验之前，需要将蛋白质与化合物在4℃下预孵育2小时。最终的反应混合物(总体积为20μl)包含4μg的his6-bmx、protein thermal shift
tm
染料(applied biosystems)在蛋白质缓冲溶液中的4倍稀释液，以及100μm的化合物。将温度从25℃增加至90℃，增长率为0.016℃/s。将激发和发射滤光片应用于protein thermal shift
tm
染料(分别为470nm和520nm)和rox参比染料(分别为580nm和623nm)。通过取每个转变的中点获得解链温度。
[0838]
表面等离子体共振
[0839]
通过使用表面等离子体共振(spr)实时分析合成化合物与bmx的假定相互作用。spr是一种灵敏的光谱方法，可用作筛选相互作用分子的主要工具，或用作先前由其他方法鉴定的相互作用的验证工具()[55]。
[0840]
为了验证此处报告的htrf和dsf结果，将相对于对照bmx-in-1表现出显著效力增加或损失(倍数)的化合物以不同浓度注射到bmx固定化表面上(传感图未显示)。如预期的，显示bmx-in-1与bmx以高亲和力(kd＝69nm)相互作用，如在生物化学测定中观察到的。结果表明，化合物9c、10和12与靶标发生瞬时相互作用，具有快速缔合和解离动力学，因此可仅计算稳态下的亲和力(k
dss
)。这一观察结果与酶测定中观察到的抑制能力缺乏相一致，加强了空间位阻阻碍蛋白质-化合物缔合的假设。
[0841]
对9d和9e与bmx相互作用的动力学评估也支持该酶测定结果。一种化合物9d显示kd值在1位纳摩尔范围内，而化合物9e的亲和力低于对照bmx-in-1(69nm)。
[0842]
如预期的，观察到化合物24至27的更高亲和力相互作用，显示出相当的缔合速率(k
on
为5.4
×
104m-1
s-1
至1.4
×
105m-1
s-1
)，但最重要的是，解离速率非常慢(k
off
《1
×
10-4
s-1
)，这与相互作用的共价性质相一致。
[0843]
表4：根据表面等离子体共振计算动力学常数
[0844][0845]
nd
–
未确定；*由于非常长时间的解离率所致的不可计量的kd(超出仪器规格)。
[0846]
在25℃下在biacore 4000仪器(biacore ab,ge healthcare life sciences,uppsala,sweden)中进行spr实验。将his6-bmx蛋白在5μm星形孢菌素存在下在ph 5.5的乙酸钠中稀释至10μg/ml，并使用标准胺偶联程序固定在cm5(s系列)传感器芯片上。
[0847]
在固定之前，将芯片的羧甲基化表面用400mm 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺和100mm n-羟基琥珀酰亚胺激活10min。使用hbs-n(10mm hepes ph 7.4，150mm nacl)用作背景缓冲液。2至10min注射时间后，以10μl/min流速将蛋白质偶联至表面，以便达到1,500至3,500个响应单位(ru)。其余活化的羧甲基化基团用ph 8.5的1m乙醇胺注射7min来封闭。
[0848]
将化合物在dmso中预稀释至所需最高测试浓度的50倍，接着在运行缓冲液(20mm hepes ph 7.4，150mm nacl，1mm dtt，0.1mm egta，0.05％(v/v)tween-20，5mm mgcl2)中稀释，以达到2％的dmso浓度。进行dmso溶剂校正(1％-3％)来解决批量信号的变化，并获得高质量的数据。
[0849]
将每种化合物注射到固定化his
6-bmx上持续220s(30μl min-1
；缔合阶段)，接着是600至2,000s的缓冲液流(解离阶段)，对于高亲和力和低亲和力结合剂最大浓度分别为0.5μm或10μm，并以2倍稀释系列稀释五倍。通过首先减去从对照表面(参考点)记录的结合响应，然后从反应点减去缓冲液空白注射来处理所有传感图。利用所提供的4000评估软件将所有数据集拟合至简单的1:1langmuir相互作用模型，以确定动力学速率常数(k
on
，k
off
)或稳态亲和力(k
dss
)。
[0850]
天然质谱分析
[0851]
为了进一步确认蛋白质与配体之间的共价结合模式，使用化合物24作为探针进行
质谱研究。通过天然ms分析截短的人bmx，发现的蛋白质质量为30899da(参见图2(a))。
[0852]
接着将蛋白质用24处理并通过变性ms直接分析(如下文进一步详述)。与24一起孵育后发现的质量为31,424da，比hbmx的apo形式大525da(图2(b))。该结果表明24的单个分子与hbmx共价缀合。此外，药物缀合的hbmx的蛋白质组学分析表明，药物与496位的半胱氨酸残基发生共价相互作用(图2(c))。
[0853]
对于天然ms分析，将蛋白质样品的缓冲液更换为200mm乙酸铵(ph 7.6)，并在改良的q-exactive组合型四极杆-orbitrap质谱仪(thermo fisher scientific)[69]上使用镀金玻璃针(hern
á
ndez等人)进行分析。典型的天然ms设置是50v的源碎裂电压和30℃的毛细管温度。通过使用与ltq orbitrap xl组合型离子阱-orbitrap光谱仪(thermo fisher scientific)耦合的dionex ultimate 3000rslc nano系统进行液相色谱法-ms(lc-ms)对药物缀合的蛋白质进行变性ms分析。将蛋白质样品直接上样至c18捕集柱(acclaim pepmap100，c18，1mm
×
5mm thermo scientific)上，用100％缓冲液a(100％h2o和0.1％甲酸)以10μl/min的流速脱盐10min，洗脱并在c18柱(acclaim pepmap100，c18，75μm
×
15cm，thermo scientific)上分离，其中线性梯度为0％至100％缓冲液b(50％异丙醇，45％乙腈，5％h2o和0.1％甲酸)，流速为300nl/min，50min。
[0854]
典型的ms条件是1.8kv的喷雾电压和300℃的毛细管温度。ltq-orbitrap xl设置为正离子模式带离子阱扫描(m/z 335-2000)。药物缀合的蛋白质的蛋白质组学分析在相同的lc-ms系统上进行，稍作改动。将胰蛋白酶消化的肽上样至c18捕集柱上，用100％缓冲液a(100％h2o和0.1％甲酸)以20μl/min脱盐5min，并在c18分析柱上分离，其中线性梯度为0％至60％缓冲液b(80％乙腈，20％h2o和0.1％甲酸)，流速为300nl/min。
[0855]
在依赖于数据的采集模式下运行ltq-xl，先进行一次全ms扫描，然后进行5次ms/ms扫描，并伴有碰撞诱导性解离。对于全ms扫描，质量范围设置为335至2,000m/z，分辨率为60,000。对于串联ms扫描，将cid归一化能量为35％。
[0856]
bmx与抑制剂的复合物的结晶和结构测定
[0857]
为了进一步表征本文所述化合物的抑制机制和结合模式，测试了多种商业结晶筛选以获得适于x射线衍射的蛋白质晶体。
[0858]
通过bmx蛋白与抑制剂24的共结晶来生长晶体(详情如下)。bmx与抑制剂24的复合物的x射线晶体结构经测定为分辨率，在bmx atp结合口袋周围有明确的电子密度图，所述结合口袋中结合有抑制剂。口袋内配体原子的等效各向同性原子位移参数值与这些配体原子所相互作用的蛋白质原子的值相当，表明配体完全占据了结合位点。不足为奇的是，在磺酰胺芳环中观察到增加，因为这个基团更多地暴露于溶剂中，因此更易流动。
[0859]
晶体结构显示了丙烯酰胺弹头(warhead)与cys496之间预期的共价结合(参见图3(a))。抑制剂与酶活性位点的其他主要相互作用是通过喹啉环中的氮与ile492之间的极性非键合相互作用以及lys445与位于稠合吡啶酮环中的氧之间的相当出人意料的极性非键合相互作用介导的(参见图3(b))。
[0860]
与bmx-in-1的对接研究所提出的相反，与lys445的相互作用不是在核的苯基取代基上提供的磺酰胺基团处观察到的，而是在三环喹啉核自身处观察到的。
[0861]
24与lys445之间的极性相互作用实际上是调节bmx活性的关键点之一。保守的β3lys与αc-螺旋glu残基相互作用，以形成atp催化所需的盐桥。24与lys445的结合改变了β
3lys和αc-螺旋glu之间的这种相互作用，从而使bmx失活。其他疏水相互作用发生在24的芳环与tyr491、ala443、val431和leu543的侧链之间(数据未显示)。化合物24通过水分子与丙烯酰胺基团的羰基氧之间的氢键进一步得到稳定。第二水分子通过氢键使第一水分子稳定，并与cys496的肽氮和asn499的末端胺基团形成氢键。
[0862]
晶体结构还表明，dfg基序采用外型构象(图3(c))，其中asp554侧链位于背裂缝，远离atp结合口袋，而phe555芳环指向阻断β3lys445-αc glu460离子对形成的看门人区域。活化环和dfg外型构象与唯一报告的bmx晶体结构与非共价抑制剂达沙替尼和pp2中观察到的相似(muckelbauer等人)。bmx dfg基序的定位让人联想到无活性构象或dfg外型，其通常在btk和其他激酶无活性结构中发现(sultan等人)，并且在ii型抑制剂复合物中也很常见(zhao等人)[58](数据未显示)。
[0863]
磺酰胺取代的苯环的定位也是最重要的。与bmx-in-1的对接结果相反，该基团没有与任何重要的残基相互作用，实际上它指向atp口袋外(参见图3(d))。这一观察结果至关重要，因为它允许在分子的这一区域引入接头或化学柄。由于它没有受到其他残基的空间阻碍，可以预期接头或柄会留在口袋之外，因此不会显著影响抑制剂的结合能力。
[0864]
muckelbauer等人描述了质粒构建和载体克隆的指南。优化使用sf-9细胞进行的bmx蛋白表达以及纯化过程，以提高纯化结束时的样品质量，以便增加蛋白质结晶的可能性(准备中的手稿)。将纯化的bmx酪氨酸激酶浓缩至最终浓度为10mg/ml(根据muckelbauer等人)并在20℃下与2倍浓度的抑制剂24一起预孵育2小时。
[0865]
这些试验是在lcp结晶机器人(tp labtech ltd,hertfordshire,uk)上使用沉滴蒸汽扩散法进行的。液滴由0.150μl的贮器溶液与等体积的蛋白质样品混合组成，针对45μl贮器进行平衡。2天后在由0.2m咪唑-苹果酸盐缓冲液(ph 5.5，含42％v/v peg 600)组成的先导条件下出现晶体。
[0866]
在grenoble,france的european synchrotron radiation facility(esrf)中分析这些形状更好的晶体。使用dectris eiger x 4m检测器在esrf光束线id30a-3处从100k的低温冷却晶体收集设置为的x射线衍射数据。使用autoproc和xds(r
ü
egg等人)处理衍射数据。获得了两个衍射数据集：第一，定义了分辨率为的倒易空间的球形区域；第二，使用autoproc(r
ü
egg等人)的staraniso模块选择了最大分辨率为的三轴椭球区域。hbmx与配体24的复合物的结构是通过用phaser(vonrhein等人)进行分子置换来确定的，如在ccp4程序套件(mccoy等人；potterton等人)中使用pdb条目3sxs(muckelbauer等人)作为搜索模型实施的，不包括配体和水分子。
[0867]
在晶体结构中定位两个独立的搜索模型副本，并利用bucaneer(potterton等人)和coot(cowtan)进行模型重建。使用refmac(emsley等人)进行初始结构细化。使用jligand(murshudov等人)创建配体24的立体化学约束字典，并且使用coot手动将配体拟合到电子密度中。通过phenix(lebedev等人)继续进行细化，在针对sa加权的2|fo|-|fc|和|fo|-|fc|电子密度图进行细化时，交替在coot中手动编辑模型。在最终的细化循环中，在计算位置添加并细化氢原子，细化平移-振动-螺旋刚体各向异性原子位移参数，自动添加水分子，并优化结晶能项与立体能项之间的相对权重。
[0868]
每个bmx分子被分成4个刚体段，这些刚体段是从tlsmd服务器(adams等人)使用来
自先前细化运行的各向同性原子位移参数估计出来的。对staraniso数据集进行的最终细化。用pymol(painter等人)制作图形。
[0869]
激酶选择性
[0870]
如前所述，迄今为止报告的大多数bmx抑制剂所提供的选择性都很差，因为它们同时是bmx和btk抑制剂。它们的细胞效应通常归因于bmx信号传导通路上游或下游的脱靶活性。为了研究我们的新类似物在哪些靶标上可以发挥作用，我们在eurofins discoverx的kinomescan平台中以1μm的浓度针对一组36种bmx相关激酶测试了最有效的类似物(25)。
[0871]
从分布在整个激酶组的大量可接近的半胱氨酸残基来看，并不是所有残基都可用于共价修饰[11-13]。bmx属于一个受限组，包括其他10种激酶，这些激酶在atp结合口袋中共享一个等效放置的半胱氨酸。该组包括来自tec家族(btk、itk、txk和tec)、egfr家族(egfr、her2、her4)、jak3、blk和双特异性丝裂原活化蛋白激酶激酶7(map2k7)的成员。因此，将tec、egfr和jak家族纳入了筛选范围，同时纳入的还有src家族和lkb1，它们在相同的序列比对中也有一个半胱氨酸。还包括参与bmx信号传导通路上游(src、fak、pi3k、mtor、pdk1)和下游(akt、pak1、tam)调节的激酶和非受体酪氨酸蛋白激酶abl。kinomescan平台是一种结合测定，筛选表明化合物25对tec家族的所有成员都表现出很强的结合亲和力，这些成员共享一个等效放置的半胱氨酸，在这些成员中，观察到对bmx、btk和tec的亲和力更高(参见下表5)。
[0872]
表5：使用kinomescan技术的化合物25的激酶选择性.
[0873]
[0874][0875]
1μm浓度下初级筛选结合相互作用的结果报告为dmso对照的％。
[0876]
如上所述，tec家族具有高度的序列相似性，特别是atp结合激酶结构域中的残基具有40％-65％的同一性和60％-80％的相似性。tec和src家族之间的atp结合位点也是高度保守的，其中组成atp结合口袋的18个残基中有14个相同。更具体地，bmx与src有57％的相似性，最重要的是，激酶选择性的关键决定因素之一——看门人残基——在src家族和tec家族成员(itk除外)中都是thr[56]。因此，25也与blk(和jak3)结合，而没有观察到与其他靶标的亲和力，这并不令人惊讶。这些结果表明，化合物25是良好的tec激酶探针分子，且表明由25介导的任何细胞活性可能是由于对tec激酶的抑制，而不是由于对bmx上下游调控因子的任何脱靶抑制。
[0877]
细胞活性测定
[0878]
lncap和pc-3细胞生长测定
[0879]
bmx在不同病理中的作用尚未得到充分验证。尽管如此，它已经涉及到许多调节机制，尽管缺乏bmx依赖性疾病模型，但前列腺癌细胞系已被用于评估细胞环境中抑制剂的抗增殖作用。响应于pi3k信号传导，bmx的活化只是前列腺癌中bmx水平升高的机制之一(chau等人；guo等人)。
[0880]
为了确定最有效的类似物在前列腺癌细胞中的作用，使用测试了化合物24-27抑制lncap和pc-3前列腺癌细胞系增殖的能力。
[0881]
雄激素受体阴性pc-3细胞对治疗具有抗性，在最大测试浓度(10μm)下没有显著的抗增殖作用。在lncap-雄激素受体阳性细胞中观察到不同的特性。bmx-in-1和24的gi50分别为1.4μm和2.8μm。化合物27的活性最低(gi
50 10μm)，而25和26的gi
50
约为5μm，如表6所示。
[0882]
表6：化合物bmx-in-1和24-27对lncap和pc-3前列腺癌细胞系的抗增殖活性.
[0883]
细胞系bmx-in-124252627lncap1.7
±
0.71.5
±
2.36.6
±
2.37.7
±
1.49.3
±
0.4pc-311.5
±
2.211.4
±
4.112.1
±
0.710.1
±
1.3nd
[0884]
在与药物一起孵育96h后测量lncap和pc-3的增殖。gi
50
值以μm为单位报告并且是以三份重复进行的三个单独实验的平均值。
[0885]
将细胞以5,000个细胞/孔(lncap)或2000个细胞/孔(pc-3)接种在白色不透明底96孔板中的总体积为100μl的培养基中。24小时后，将在100μl培养基中连续稀释的化合物(2倍)添加至细胞中。孵育96小时后，根据制造商的说明，通过celltiter-glo(promega)评估细胞活力。将这些值针对媒介物归一化，并使用graphpad prism软件计算ic
50
。
[0886]
碘化丙啶测定
[0887]
为了确定生长抑制是否是由于细胞凋亡，我们使用碘化丙啶染色(pi)进行了荧光辅助细胞分选(facs)分析。将lncap细胞与bmx-in-1和24-27以10μm孵育64h，结果显示，与媒介物对照相比，未观察到坏死事件的百分比有显著差异，表明在这些条件下，这些类似物不会导致细胞死亡增加(参见图4)。
[0888]
并不令人惊讶的是，所有化合物在前列腺癌细胞系中都表现出低增殖抑制潜力，而单独调节bmx是否与抗增殖作用相关仍然值得怀疑(price等人)。事实上，文献中有大量证据表明选择性或双重性bmx/btk抑制剂在bmx依赖性模型中的抗增殖作用很差，这很可能来自信号机制的动态补偿。重点关注bmx活性的调节以使细胞对其他治疗剂敏感，因为只有
与相关通路的抑制剂结合时才能观察到抗增殖作用(fox等人；fox等人)。
[0889]
bmx-in-1对rv-1细胞的作用只能通过akt抑制剂mk2206增强(liu等人)；另一种抑制剂abt-737仅在与pi3k抑制剂进行共同处理时才诱导细胞凋亡(li等人)；双重bmx/btk抑制剂ctn06需要与自噬抑制剂氯喹(cq)或多西他赛进行共同处理来抑制pc-3细胞生长(guo等人)，而对与cq和紫杉醇协同发挥作用的双重bmx/src抑制剂cta095也观察到类似的特性(guo等人)。现有数据表明bmx是一种关键的调节蛋白，但不是一种效应物，并且组合方法被认为是最有效的。因此，化合物的这种集合可成为用于组合治疗的有用分子。
[0890]
将lncap细胞以8,000细胞/孔接种在24孔板中的总体积为500μl的培养基中并孵育24小时以允许附着。此后，将在培养基中稀释的5μm各化合物添加到细胞中。处理64小时后，将细胞在胰蛋白酶消化(tryple express,lifetechnologies,usa)后收集到圆底fac管中，并用含10％pbs的fbs洗涤。然后将细胞重新悬浮在稀释于洗涤缓冲液中的5μg/ml碘化丙啶中并在15分钟后使用配备488nm激光和670lp和695/40bp过滤器组合的lsr fortessa x-20流式细胞仪直接进行分析。化合物24-27和bmx-in-1的结果以对照(即媒介物)的百分比示于图4中，并代表平均值
±
sd(三份重复)。
[0891]
其他数据
[0892]
相对于bmx-in-1的不可逆结合功效
[0893]
bmx的失活发生在两步过程中，该过程由两个参数控制：初始非共价结合的亲和力ki，以及随后与半胱氨酸残基的硫醇形成共价键的反应的速率k
inact
。失活率(k
inact
/ki)是二阶的，它描述了共价键形成的效率。因此，我们对设计合理的化合物的不可逆结合效率进行了评估。动力学分析呈现于表7中，表明化合物25与靶标的结合拟合最佳，结合亲和力为323pm。这表示相对于bmx-in-1(ki：4.07nm)增加了10倍以上。其他先导物之间显示出相似的结合亲和力(1.93-2.52nm)，低于25，约为bmx-in-1的2倍。然而，结合抑制剂的共价键形成速率(由kk
inact
确定)表明，与bmx-in-1(0.217min-1
)和27(0.166min-1
)相比，化合物24、25和26的效率略有提高(分别为0.335、0.378和0.443min-1
)。因此，25的不可逆结合效率(19.4μm-1
s-1
)是该系列中最高的，而bmx-in-1显示出相对于其余抑制剂最低的结果(0.89μm-1
s-1
)。总的来说，这些结果提供了定量证据，表明活性的提高主要是由化合物和靶标之间结合互补性的变化而不是更快的共价结合率驱动的。因此，考虑到所有类似物都具有相同的迈克尔受体部分，增强的活性一定是在支架中引入结构修饰的结果。
[0894]
表7.动力学参数ki、k
inact
、k
inact
/ki的测定.a[0895]
化合物ki[nm]k
inact
[min
–1]k
inact
/ki[μm
–1s
–1]25b0.32
±
0.050.378
±
0.03419.4
±
1.5526b1.93
±
0.180.443
±
0.0033.86
±
0.34242.52
±
0.010.335
±
0.0012.22
±
0.01272.15
±
0.130.166
±
0.0031.29
±
0.10bmx-in-14.07
±
0.060.217
±
0.0050.89
±
0.20c[0896]a以两份重复测试结果，显示平均值
±
s.d.。
[0897]b从两项独立研究中获得的结果，显示平均值
±
s.d.。
[0898]c与公布的结果有0.06μm-1
s-1
偏差的值。(wang等人)。
[0899]
细胞内bmx抑制
[0900]
为了验证25的靶标亲和力和识别，我们使用表达融合载体的hek293细胞以及promega的nanobret
tm
te细胞内激酶测定进行了细胞内靶标接合激酶测定。细胞增殖取决于用于监测化合物的细胞活性的bmx激酶活性(ic
50
)。如表8所示，ic
50
测定显示25的抑制能力(ic
50
：44.8nm)是bmx-in-1(ic
50
：495nm)的10倍，这与之前观察到的在活性差异相似的情况下生物化学效力有所增加相一致。
[0901]
在reaction biology corporation(usa)进行测定，以两份重复测试浓度，显示平均值
±
s.d.。将细胞处理1h，通过使用graphpad prism8基于s形剂量反应曲线计算ic
50
值并绘图。
[0902]
表8：表达的经bmx瞬时转染的hek293细胞中的细胞内靶标接合.
[0903]
化合物ic50(nm)bmx-in-1495
±
35.72544.8
±
5.4
[0904]
在reaction biology corporation(usa)使用nanobret
tm
技术进行细胞内靶标接合。非常简单地说，将购自atcc的hek296细胞用bmx转染，并用测试化合物bmx-in-1或js25和参考化合物达沙替尼以两份重复处理，孵育1小时。从1μm开始，用3倍稀释将化合物稀释10倍。仅在最高化合物浓度时nanobret信号％小于55％时进行曲线拟合。使用graphpad prism 8(usa)测定ic
50
值。
[0905]
bmx抑制剂的癌细胞生长抑制.
[0906]
bmx在不同病理中的作用尚未得到充分验证。尽管如此，它已经涉及到许多调节机制，尽管缺乏bmx依赖性疾病模型，但前列腺癌细胞系已被用于评估细胞环境中抑制剂的抗增殖作用。在之前的实验(结果未发表)中，我们在代表前列腺、脑、血液、乳腺、卵巢、肺、骨髓和淋巴肿瘤组织的细胞系集合中筛选了几种抑制剂。将化合物与细胞在386孔板格式中孵育72h，通过使用发光测定来监测对活细胞生长的剂量依赖性影响，所述测定可定量atp和代谢活性细胞的存在。该研究包括24、bmx-in-1以及不与bmx结合的结构相似的化合物10和11(图1)。
[0907]
表9中显示的结果表明，10和11(非结合剂)对大多数测试细胞系的活细胞生长几乎没有影响。bmx-in-1相对于24在小组中所包括的四种前列腺癌细胞系22rv1、pc3、lncap和du145中显示出更有效的抑制作用，特别是在依赖于雄激素受体信号传导的那些细胞系(lncap和22rv1)中。相比之下，雄激素受体阴性细胞(du145和pc3)总体上对治疗更有抗性。此外，24对lncap和22rv1以及pc3显示出有效的抑制作用，这些细胞是雄激素受体阴性细胞。此外，这两种化合物也是rs4(11)(淋巴母细胞)和daudi(t淋巴母细胞)细胞的活细胞生长的有效抑制剂，在这些细胞中btk高度过表达。总之，这些结果表明bmx抑制会影响前列腺癌细胞的活细胞生长，并促使我们进一步研究雄激素受体和相关bmx通路在这些细胞系中的重要性。
[0908]
表9：化合物bmx-in-1、10、11和24在前列腺、脑、血液、乳腺、卵巢、肺和淋巴样癌细胞小组中的活细胞生长抑制.
[0909][0910]
使用半自动系统在384孔格式、不透明白色测定板中以每孔500-1000个细胞对来自不同组织的14种人细胞系进行化合物活性分析。在37℃和5％co2下孵育细胞。将化合物储备液以11点和2倍浓度范围铺在384孔格式中。将化合物针式转移到两份重复的测定板中并孵育72h。根据制造商的说明，通过(promega)评估atp水平。将这些值针对媒介物归一化，并使用graphpad prism 8计算gi
50
。当观察到不明确的拟合时，约束曲线顶部(100％)和底部(0％)并用4-p最小二乘法拟合确定gi
50
。在这些情况下，不通过graphpad prism 8计算sd。
[0911]
24-26和雄激素受体拮抗剂pi3k和akt抑制剂对lncap细胞的共同处理.
[0912]
如上所示，由于信号传导通路中补偿机制的存在，单独的bmx抑制在表达bmx的细胞系中诱导有限的细胞死亡。为了评估bmx抑制剂在联合治疗方案中的用途，检查了bmx抑制剂与其他治疗剂结合时的协同抗增殖作用，这些治疗剂对前列腺癌细胞进行预致敏。为此，将lncap细胞用化合物24-26、akt1/2(akt抑制剂)、氟他胺(雄激素受体拮抗剂)和ly294002(pi3k抑制剂)以组合方式进行共同处理。5天后用评估细胞活力，并与单独使用化合物时的整体抗增殖作用进行比较。通过筛选几种浓度来进行优化研究，以确定理想的条件，从而获得单独使用个别抑制剂时80％以上的初始活力。基于这些结果，我们测试了24(3μm)、25(5μm)和26(6μm)，以及akt1/2(1μm)、氟他胺(50μm)和ly294002(3μm)。
[0913]
将lncap细胞以5000细胞/孔接种在96板中的总体积为100μl的培养基中并孵育24
小时以允许附着。孵育后，将细胞用24(2μm和3μm)、25(5μm和6μm)、26(6μm)、akt1/2(1μm和2μm)、氟他胺(25μm和50μm)和pi3k抑制剂(3μm和3.5μm)以组合方式以三份重复进行处理。结果如图5所示。
[0914]
尽管24-26和抑制剂的对照浓度在共同处理时对降低细胞活力没有影响，但在所有测试条件下都观察到显著的活力下降。相对于对照akt1/2，关于akt1/2观察到细胞活力下降48％(与24)至63％(与26)。关于氟他胺，最有效的组合是与化合物25(细胞活力降低63％)，而效果最差的是与24(降低44％)。最后，与ly294002共同处理使细胞活力下降35％(与24和26)和59％(与25)。总体而言，这些结果表明24-26和akt1/2、氟他胺和ly294002在癌细胞增殖中具有协同作用，能够克服bmx抑制的补偿机制，并揭露了成为可用于药物组合方法的分子的可能性。
[0915]
患者样品中的靶向细胞毒性
[0916]
通过来自医院患者的11个弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)样品对化合物25进行了测试，以定量其对b癌细胞部分与非转化细胞诱导靶向细胞毒性的能力。cd20 cd79a 标志物(双阳性细胞和单阳性细胞)用于确定目标癌症分数。结果如图6所示。图6a显示了在增加dmso中25的浓度时活靶细胞的相对细胞分数(rcf)。相对细胞分数《1.0(虚线)表示中靶细胞毒性反应，》1.0表示一般细胞毒性或脱靶细胞毒性反应。图6b显示了在增加dmso浓度时归一化为靶细胞群的分数的值。图6c显示了根据按rcf的1-平均值计算的化合物25的药物反应评分(drs)排列的11个初级患者样品。
[0917]
数据为11次生物学重复，在单个72h孵育时间点，对每个样品的每个浓度点进行4次重复。先前已证明药物反应评分(drs)与晚期血液学癌症患者的临床反应相关(snijder等人)。活靶细胞被定义为细胞毒性标志物阴性的和诊断性标志物(cd19、cd20和/或cd79a)阳性的b细胞。从图6中可看出，化合物25在11个患者样品中的7个中具有“中靶”效应。
[0918]
序列表
[0919]
seq id no.1：bmx氨基酸序列
[0920][0921]
》sp|p51813|bmx_人细胞质酪氨酸蛋白激酶bmx os＝智人ox＝9606gn＝bmx pe＝1sv＝1
[0922]
参考：uniprot(https://www.uniprot.org/uniprot/p51813)
[0923]
seq id no.2：btk序列-同种型btk-a：规范序列
[0924][0925]
》sp|q06187|btk_人酪氨酸蛋白激酶btk os＝智人ox＝9606gn＝btk pe＝1sv＝3
[0926]
参考：uniprot(https://www.uniprot.org/uniprot/q06187#sequences)
[0927]
seq id no.3：btk序列-同种型btk-c
[0928][0929]
》sp|q06187-2|btk_人酪氨酸蛋白激酶btk同种型btk-c os＝智人ox＝9606gn＝btk
[0930]
参考：uniprot(https://www.uniprot.org/uniprot/q06187#sequences)
[0931]
seq id no.4：tec激酶
[0932][0933]
》sp|p42680|tec_人酪氨酸蛋白激酶tec os＝智人ox＝9606gn＝tec pe＝1sv＝2
[0934]
参考：uniprot(https://www.uniprot.org/uniprot/p42680#sequences)
[0935]
seq id no.5：itk激酶
[0936][0937]
》sp|q08881|itk_人酪氨酸蛋白激酶itk/tsk os＝智人ox＝9606gn＝itk pe＝1sv＝1
[0938]
参考：uniprot(https://www.uniprot.org/uniprot/q08881#sequences)
[0939]
seq id no.6：txk激酶
[0940][0941]
》sp|p42681|txk_人酪氨酸蛋白激酶txk os＝智人ox＝9606gn＝txk pe＝1sv＝3
[0942]
参考：uniprot(https://www.uniprot.org/uniprot/p42681#sequences)
[0943]
参考文献
[0944]
本说明书中提及的所有文件均以引用方式整体并入本文。
[0945]
adams et al.acta crystallogr.sect.d biol.crystallogr.2010，d66，213
[0946]
ali et al.j.chem.inf.model.2012，52，420
[0947]
bagheri-yarmand et al.j.biol.chem.2001，276，29403
[0948]
barf et al.j.med.chem.2012，55，6243
[0949]
bembenek et al.drug discovery today 2009，14，278
[0950]
bourne et al.drug discov.today 2018，23，727
[0951]
byrd et al.n.engl.j.med.2015，374，323
[0952]
chalmers et al.arthritis res ther 2018，20，10
[0953]
chau et al.oncogene 2002，21，8817
[0954]
chen et al.oncogene 2004，23，1854
[0955]
cheng et al.j.chem.inf.model.2007，47，2140
[0956]
chaikuad et al.angew.chem.int.ed.2018，57，4372
[0957]
cohen et al.plos one 2010，5，e11135
[0958]
cowtan acta crystallogr d biol crystallogr.2006，d62，1002
[0959]
dai et al.cancer res.2006，66，8058
[0960]
dai et al.cancer res.2010，70，5587
[0961]
daina et al.j.chem.inf.model.2014，54，3284
[0962]
daina et al.scientific reports 2017，7，42717
[0963]
delaney et al.j.chem.inf.model.2004，44，1000
[0964]
emsley et al.acta crystallogr.sect.d biol.crystallogr.2004，d60，2126
[0965]
fedorov et al.kinase inhibitor selectivity profiling using differential scanning fluorimetry.
[0966]
in：kinase inhibitors.methods in molecular biology(methods and protocols)，ed：kuster b.，2012，vol 795，humana press
[0967]
fox cell signal 2017，2，156
[0968]
fox et al.cancer res.2015，75，7，1345
[0969]
fox et al.，embo j.2010，29，3853
[0970]
ghosh et al.j.med chem.2015，58，2895
[0971]
gilbert et al.pharm.pat.anal.2014，3，375
[0972]
guo et al.cell death diseas.2014，5，e1409
[0973]
guo et al.plosone 2013，8，e70910
[0974]
guryanova et al.cancer cell 2011，19，498
[0975]
hann et al.nat.rev.drug discovery 2012，11，355
[0976]
hern
á
ndez et al.nat.protocols 2007，2，715
[0977]
honigberg et al.pnas 2010，107，13075
[0978]
horwood et al.int.rev.immunol.2012，31，2，87
[0979]
hur et al.bioorg.med.chem.lett.2008，18，5916
[0980]
jarboe et al.recent patents on anti-cancer drug discovery 2013，8，1
[0981]
kaukonen et al.br.j.haematol.1996，94，455
[0982]
lagoutte et al.curr opin chem biol 2017，39，54
[0983]
lanning et al.nat.chem.biol.2014，10，760
[0984]
lebedev et al.acta crystallogr.sect.d biol.crystallogr.2012 d68，431
[0985]
li et al.oncotarget 2017，8，49238
[0986]
liang et al.eur.j.med.chem.2018，151，315
[0987]
liang et al.acs med.chem.lett.2017，8，344
[0988]
lin et al.j.med chem.1978，21，268.
[0989]
liu et al.acs chem.biol.2013，8，1423
[0990]
liu et al.chem.biol.2013，20，146
[0991]
mano et al.cytokine growth factor rev 1999，10，267
[0992]
mccoy et al.j.appl.crystallogr.2007，40，658
[0993]
miller et al.lancet oncol.2012，13，528
[0994]
moriguchi et al.chem.pharm.bull.1992，40，127
[0995]
moriguchi，i.，shuichi，h.，nakagome，i.，hirano，h.，chem.pharm.bull.1994，42，976
[0996]
muckelbauer et al.chem.biol.drug des.2011，78，739
[0997]
murshudov et al.acta crystallographica section d：biol.crystallography 1997，d53，240
[0998]
niesen et al.nat.protoc.2007，2，2212
[0999]
painter et al.j.appl.crystallogr.2006，39，109
[1000]
perola j.med.chem.2010，53，2986
[1001]
potter et al.mol cancer ther 2016，15，1248
[1002]
potter et al.neoplasia 2014，16，147
[1003]
potterton et al.acta crystallogr.sect.d biol.crystallogr.2003，d59，1131
[1004]
potterton et al.acta crystallogr.sect.d biol.crystallogr.2004，d60，2288
[1005]
price et al.j.amer.chem.soc.1946，48，1204
[1006]
qiu et al.oncogene 2000，19，5651
[1007]
rabindran et al.cancer res.2004，64，3958
[1008]
rajantie et al.mol.cell biol.2001，21，4647
[1009]
ramsey et al.j.amer.chem.soc.1947，69，1659
[1010]
rankin et al j.immunol.2013 191，4540
[1011]
reis et al.eur.j.med.chem.2011，46，1448
[1012]
rivilli et al.tetrahed.lett.2010，51，478
[1013]rü
egg et al.trends pharmacol.sci.1989，158，105
[1014]
singh et al.nat.rev.drug discov.2011，10，307
[1015]
singh et al.drug discov.today 2018，23，727
[1016]
soria et al.n.eng.j.med.2017，378，113
[1017]
smith et al.bioessays 2001，23，5，436
[1018]
snijder et al.lancet haematol.2017，4，12，e595
[1019]
sultan et al.sci.rep.2017，7，15604
[1020]
vonrhein et al.acta crystallogr.sect.d biol.crystallogr.2011，d67，293
[1021]
wang et al.eur.j.med.chem.2017，137，545
[1022]
wen et al.j.biol.chem.1999，274，38204
[1023]
wildman et al.j.chem.inf.model.1999，39，868
[1024]
wo 2014/063054
[1025]
wu et al.acs chem.biol.2014，9，1086
[1026]
wu et al.scientific reports 2017，7，466
[1027]
xia et al.oncol letters 2015，10，3339
[1028]
zhang et al.nat.rev.cancer 2009，9，28
[1029]
zhao et al.acs chem.biol.2014，9，1230
[1030]
zhao et al.j.med.chem.201760，2879