一种黑芝麻抗菌肽组合物及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于抗菌肽制备技术领域，尤其涉及一种黑芝麻抗菌肽组合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.近年来，抗生素的滥用致使超级耐药细菌的出现，临床上急需新的抗菌药物，有研究者发现一些天然的活性肽对耐药菌也有抑制作用，这些天然的活性肽被称为抗菌肽(amps)。抗菌肽是一大类化合物，是由不同种类的氨基酸构成的多肽化合物。抗菌肽存在于所有形式的生命中，是物种天然免疫系统的重要组成部分。抗菌肽在进化上的保守性和耐药倾向有限性，使得被认为是处理细菌抗药性的有前途的化合物。抗菌肽的来源有动物、植物和微生物。一些微生物产生的多肽可以增强对宿主的侵袭能力，会存在一些安全隐患。而植物抗菌肽是植物免疫系统中最重要的组成部分之一，植物抗菌肽由于其在使植物茁壮成长方面的重要意义致使其在农业和医药领域的巨大潜力。植物蛋白活性肽具有抗氧化、调节免疫、降血压、抗衰老以及抗菌的功能等，而且有些活性肽在植物的落花过程中发挥重要作用，植物蛋白活性肽相比动物蛋白活性肽更容易被人体吸收，所以植物蛋白活性肽在未来临床抗菌作用方面具有极大的潜力。
3.黑芝麻是胡麻科胡麻属植物芝麻的黑色种子，也叫胡麻，油麻，巨胜，脂麻。黑芝麻含有大量的脂肪和蛋白质，还含有糖类、维生素a、维生素e、卵磷脂、钙、铁、铬等营养成分，有健胃、保肝、促进红细胞生长的作用及乌发、美容等功效。目前对黑芝麻的研究大多数是聚焦于其油脂类成分的活性研究，对芝麻蛋白成分的活性研究大多数是围绕着抗氧化活性开展，对于芝麻蛋白活性肽的抗菌活性研究较少。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有显著抗菌活性的黑芝麻抗菌肽组合物。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种黑芝麻抗菌肽组合物，所述组合物至少包括氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3中所示的任意两种抗菌肽。
7.本发明还提供了一种上述黑芝麻抗菌肽组合物的制备方法，包括如下步骤：去除黑芝麻中的油脂后，用tris-hcl溶液提取黑芝麻蛋白，得黑芝麻蛋白粗提液，将硫酸铵固体与黑芝麻蛋白粗提液混合，直至硫酸铵的饱和度达到78-82％，停止加入硫酸铵，取沉淀干燥得粗制黑芝麻蛋白，超滤截留分子量《5kd的样品组分，即得。
8.优选的，所述tris-hcl溶液提取的时间为6-40h。
9.优选的，所述tris-hcl溶液的ph值为7-9。
10.优选的，所述tris-hcl溶液的离子强度为100-200mol/kg。
11.优选的，黑芝麻与tris-hcl溶液的料液比为1：10-15。
12.优选的，所述超滤的操作压力为0.8kg/cm2。
13.优选的，超滤截留分子量《1kd的样品组分。
14.本发明还提供了一种上述黑芝麻抗菌肽组合物或上述制备方法制备所得的黑芝麻抗菌肽组合物在制备抗菌产品中的应用。
15.优选的，所述菌包括白色念珠菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。
16.本发明的有益效果：
17.本发明提供的黑芝麻抗菌肽组合物对白色念珠菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均具有显著抑菌作用。
18.本发明提供的黑芝麻抗菌肽组合物的制备方法，具有较高的黑芝麻蛋白提取率。本发明提供的制备方法不仅仅局限于实验室提取工艺的研究，还可用于工业化生产。
附图说明
19.图1为不同浓度各组分对4种微生物的抑菌率；
20.图2为中压制备液相s组分的分离纯化图谱。
具体实施方式
21.本发明提供了一种黑芝麻抗菌肽组合物，所述组合物至少包括氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3中所示的任意两种抗菌肽。
22.在本发明中，所述抗菌肽组合物可仅由至少氨基酸序列为cqrpsgtwsgvcgnnnacknqcirlekarhgscnyvfpahkcicyfpc、mneiiryleqgtlpsdsiagkrvkfraarftllegqlykrtvegpllkcldeeralyvmreihegscgnh和sgarslaqkvmrqgyfwptlvedsknlvrkcescqkyaslihqpatpmepikiacpfdqwginivgpfppaqaqkkfiivaiehfskwveaeavakiserevinfiwkniicrfgiprilisdngtqfqgkkitewckel中所示的任意两种抗菌肽组成，也可包含其他物质，本发明对于所述抗菌肽组合物中所包含的其他物质没有特殊限定。
23.本发明还提供了一种上述黑芝麻抗菌肽组合物的制备方法，包括如下步骤：去除黑芝麻中的油脂后，用tris-hcl溶液提取黑芝麻蛋白，得黑芝麻蛋白粗提液，将硫酸铵固体与黑芝麻蛋白粗提液混合，直至硫酸铵的饱和度达到78-82％，停止加入硫酸铵，取沉淀干燥得粗制黑芝麻蛋白，超滤截留分子量《5kd的样品组分，即得。
24.本发明对于黑芝麻的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本发明中，优选的采用粉碎后的黑芝麻进行去油脂操作，本发明对于粉碎的具体方式没有特殊限定，采用本领域常规粉碎方法均可。粉碎后，优选的采用丙酮法去除油脂，所述黑芝麻与丙酮的料液比优选为1：2-4，更优选为1：3，将丙酮与黑芝麻混合后，优选的需搅拌过夜，然后离心弃上清，晾干去除丙酮。
25.在本发明中，用tris-hcl溶液提取黑芝麻蛋白时，黑芝麻与tris-hcl溶液的料液比优选为1：10-15，更优选为1：12-13；所述tris-hcl溶液提取的时间优选为6-40h，更优选为18-24h；所述tris-hcl溶液的ph值优选为7-9，更优选为8；所述tris-hcl溶液的离子强度优选为100-200mol/kg，更优选为140-160mol/kg。采用本发明tris-hcl提取溶剂提取法，可达到最佳的黑芝麻蛋白提取率。在本发明中，所述离子强度指的是tris-hcl溶液中离子浓度的量度，是溶液中所有离子浓度的函数，离子强度(i)为溶液中每种离子i的质量摩尔浓
度(ci)乘以该离子的价数(zi)的平方所得诸项之和的一半。
26.在本发明中，获得黑芝麻蛋白粗提液后，优选的采用硫酸铵沉淀法获得粗制黑芝麻蛋白，本发明对于硫酸铵固体的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在黑芝麻蛋白粗提液中添加硫酸铵固体，优选的直至硫酸铵的饱和度达到80％，停止加入硫酸铵。结束添加硫酸铵后，优选的需4℃搅拌过夜，离心，取沉淀干燥得粗制黑芝麻蛋白。所述离心的条件优选为12000g离心10min，所述干燥之前，优选的需用tris-hcl溶液对沉淀进行复溶，然后再进行干燥，所述干燥优选为冷冻干燥。
27.在本发明中，对粗制黑芝麻蛋白进行超滤处理时，截留分子量《5kd的样品组分时，超滤的操作压力优选为0.8kg/cm2。在本发明中，优选的超滤截留分子量《1kd的样品组分，超滤的操作压力优选为1kg/cm2。
28.本发明还提供了一种上述黑芝麻抗菌肽组合物或上述制备方法制备所得的黑芝麻抗菌肽组合物在制备抗菌产品中的应用。
29.在本发明中，所述菌优选的包括白色念珠菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，所述产品优选的包括药品和食品。
30.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
31.实施例1
32.将黑芝麻粉碎后，按1：3料液比加入分析级丙酮，4℃搅拌过夜；采用离心机4℃、12000g离心10min，弃上清。将去油的芝麻粉放置在冰上自然晾干，去除丙酮。称取晾干的黑芝麻粉，按照料液比为1：10的比例添加ph值为9、离子强度为150mol/kg的tris-hcl溶液提取10h，得黑芝麻蛋白粗提液。
33.将硫酸铵固体加入到黑芝麻蛋白粗提液中，硫酸铵达到80％的饱和度时，停止加入硫酸铵，4℃搅拌过夜，4℃离心机12000g离心10min，弃上清，沉淀用tris-hcl复溶，冷冻干燥机干燥成粉末，得到粗制黑芝麻蛋白。
34.将粗制黑芝麻蛋白溶于tris-hcl中，取1kd规格的超滤内管，在超滤管的内管中加入样品，14000g离心20min后，取芝麻蛋白样品进行超滤，操作压力为1kg/cm2，得到分子量《1kd的黑芝麻抗菌肽组合物(s组)。
35.实施例2
36.与实施例1的区别在于tris-hcl溶液的提取时间为30h，按照料液比为1：15的比例添加tris-hcl溶液，tris-hcl溶液的离子强度为200mol/kg，其余均同实施例1。
37.实施例3
38.与实施例1的区别在于tris-hcl溶液ph值为7，tris-hcl溶液的提取时间为12h，tris-hcl溶液的离子强度为100mol/kg，其余均同实施例1。
39.实施例4
40.与实施例1的区别在于tris-hcl溶液ph值为8，tris-hcl溶液的提取时间为40h，tris-hcl溶液的离子强度为200mol/kg，其余均同实施例1。
41.实施例5
42.与实施例1的区别在于tris-hcl溶液ph值为7，tris-hcl溶液的提取时间为6h，tris-hcl溶液的离子强度为200mol/kg，其余均同实施例1。
43.对比例1
44.与实施例1的区别在于tris-hcl溶液的提取时间为10h，tris-hcl溶液的离子强度为60mol/kg，其余均同实施例1。
45.对比例2
46.与实施例1的区别在于tris-hcl溶液ph值为8，按照料液比为1：20的比例添加tris-hcl溶液，tris-hcl溶液的提取时间为6h，tris-hcl溶液的离子强度为150mol/kg，其余均同实施例1。
47.对比例3
48.与实施例1的区别在于tris-hcl溶液ph值为3，tris-hcl溶液的提取时间为18h，其余均同实施例1。
49.实施例6
50.使用bca法分别测定实施例1-5和对比例1-3各组黑芝麻蛋白粗提液中的蛋白浓度，每组3次重复，蛋白浓度取平均值，结果如表1所示。
51.表1不同组别蛋白浓度
[0052][0053][0054]
实施例6
[0055]
将实施例1所得的粗制黑芝麻蛋白溶于tris-hcl中，取1kd、5kd和10kd规格的超滤内管，在超滤管的内管中加入样品，14000g离心20min后，取芝麻蛋白样品进行三级超滤，一级超滤截留分子量《10kd的样品组分，操作压力为0.5kg/cm2；二级超滤截留分子量《5kd的样品组分，操作压力为0.8kg/cm2；三级超滤截留分子量《1kd的样品组分，操作压力为1kg/cm2。经过超滤得到4组组分：l组分分子量》10kd，5kd《m1组分《10kd，1kd《m2组分《5kd，s组分分子量《1kd(s组分即为本发明黑芝麻抗菌肽组合物)。
[0056]
分别取l、m1、m2和s组的样品溶于无菌的pbs中，分别配制成1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、16mg/ml的浓度用于药敏实验。将白色念珠菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌指示菌种从液氮取出后，4℃冰箱内融化，用接种环挑取一环菌液后采用三区划线法接种于琼脂平板上，过夜培养。蘸取单菌落加入5ml的液体培养基中震荡培养8h，将不同的菌液稀释至一定的倍数，通过测其定吸光度od
600
值来估算细菌数量。
[0057]
取稀释至10
3-104cfu/ml的菌悬液100ul，加入待测样品100ul，混匀，置于气浴恒温振荡器中，37℃，150r/min孵育1h，取100ul倾注于琼脂平板培养基，co2培养箱培养37℃过夜培养，计算菌落数，以无菌的pbs溶液为对照组，计算抑菌率。
[0058]
结果如图1所示。由图1可以看出，s组分对四种菌的抑制效果表现最好，当在4mg/ml时出现较强的抑菌效果，在16mg/ml时抑菌效果最强，并有抑菌率明显随浓度变化而出现依赖性趋势变化。但l组分及m1组分即分子量大于5kd的蛋白组分均未表现出明显的抑菌效果，m2组分对四种不同的病原菌表现出较强的抑制作用，分子量越小的蛋白组分其抑菌作用就越强。
[0059]
实施例7
[0060]
取实施例6od
600
值为0.1-0.2的稀释倍数下菌液，取100ul菌液接种于琼脂平板。将直径6mm的空白药敏纸片灭菌后，分别加入浓度为16mg/ml的实施例6所得的l、m1、m2和s组黑芝麻蛋白组分的溶液中浸泡30min以上,取出滤纸片放置于琼脂平板，浸有无菌pbs和双抗的2组为对照，各纸片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃温箱，培养16h～18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录。试验重复3次。抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌效果。抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌效果。结果如表2所示。
[0061]
表2各组分对四种微生物的抑菌环大小
[0062][0063]
由表2可以看出，s组分是抑菌效果最好的，其中对大肠杆菌抑制效果最佳；m2组分对白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌有抑菌效果，而l与m1组分并无明显的抑菌效果。
[0064]
实施例8
[0065]
使用中压制备液相技术对实施例6所得的抗菌活性最强的s组分进行分离纯化，制备色谱条件：有机相b相为0.1％的tfa乙腈，水相a相为0.1％的tfa水，检测波长为254nm和214nm，得到3个主要肽峰s
‑ⅰ
、s
‑ⅱ
和s
‑ⅲ
(如图2所示)，将3个主要成分进行富集纯化，进行
质谱检测鉴定，得s
‑ⅰ
氨基酸序列为：
[0066]
cqrpsgtwsgvcgnnnacknqcirlekarhgscnyvfpahkcicyfpc，
[0067]s‑ⅱ
氨基酸序列为：
[0068]
mneiiryleqgtlpsdsiagkrvkfraarftllegqlykrtvegpllkcldeeralyvmreihegscgnh，
[0069]s‑ⅲ
氨基酸序列为：
[0070]
sgarslaqkvmrqgyfwptlvedsknlvrkcescqkyaslihqpatpmepikiacpfdqwginivgpfppaqaqkkfiivaiehfskwveaeavakiserevinfiwkniicrfgiprilisdngtqfqgkkitewckel。
[0071]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。