一种人胰岛素单链前体残留检测控制方法与流程

1.本发明属于生物制药领域分析检测技术，具体地，涉及一种人胰岛素单链前体残留检测控制方法。


背景技术：

2.糖尿病是由于多种原因引起胰岛素分泌不足和靶细胞对胰岛素敏感性降低而使糖、蛋白质、脂肪和水电介质代谢异常的一种综合征。胰岛素是由β细胞受内源性或外源性物质如葡糖糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等刺激而分泌的一种蛋白类激素，是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。
3.胰岛素是具有划时代意义的降糖药物，自1982年礼来的人胰岛素被批准上市以来，便被广泛应用于ii型糖尿病的临床治疗。人胰岛素为重组dna技术生产的由51个氨基酸残基组成的蛋白质，宿主细胞为大肠杆菌。按干燥品计算，每1mg含人胰岛素不得少于27.5单位。
4.人胰岛素的生产方式主要分为2种：一是以基因工程大肠杆菌分别发酵生产人胰岛素的a、b链，然后经过化学氧化法，使得a、b链在一定条件下形成二硫键，从而得到人胰岛素；二是用基因工程大肠杆菌或酵母菌发酵生产胰岛素前体，经过酶切、纯化等步骤形成有活性的胰岛素。第二种方法是现在生产胰岛素最常用的手段。
5.然而，目前，中国药典、欧洲药典以及美国药典中对人胰岛素单链前体的检测均未规定明确的检定方法，各生产企业采用合适的方法进行检测，对于本公司生产工艺过程中工序产品和原料药而言，液相法分离效果与灵敏度较差。因此，提供一种灵敏度高、特异性强、重复性好的单链前体残留检测方法，以便准确地检测出工艺过程中工序产品和原料药中的单链前体残留量尤为重要，以保障生物制品的安全性以及生产过程中质量控制。
6.因此，本发明需要开发一种有效检测人胰岛素前体的方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种能够抗人胰岛素单链前体单克隆抗体，所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体能够作为酶联免疫检测(elisa)方法中的包被抗体或检测抗体，用于人胰岛素单链前体快速准确检测。
8.本发明第一方面，提供一种抗人胰岛素单链前体单克隆抗体，所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体特异性识别和结合具有seq id no:1所示的蛋白。
9.在另一优选例中，所述的抗人胰岛素单链前体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
10.本发明第二方面，提供一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株用于产生如本发明第一方面所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156。
11.本发明第三方面，提供一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
12.(i)如本发明第一方面所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体；和
13.(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
14.本发明第四方面，提供一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
15.(a)如本发明第一方面所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体；和
16.(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
17.在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
18.本发明第五方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码如本发明第一方面所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体或本发明第三方面所述的重组蛋白。
19.本发明第六方面，提供一种药物组合物，其特征在于，它含有：
20.(i)如本发明第一方面所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体、或如本发明第三方面所述的重组蛋白、或如本发明第四方面所述的免疫偶联物；和
21.(ii)药学上可接受的载体。
22.在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
23.本发明第七方面，提供一种如本发明第一方面所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体、或如本发明第三方面所述的重组蛋白、或如本发明第四方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
24.所述试剂、检测板或试剂盒用于：
25.(1)检测样品中具有seq id no:1所示的蛋白。
26.在另一优选例中，所述的样品包含人胰岛素单链前体。
27.在另一优选例中，所述的样品含有人胰岛素单链前体和人胰岛素，所述的人胰岛素单链前体具有seq id no:1所示氨基酸序列。
28.在另一优选例中，所述的人胰岛素与人胰岛素单链前体的重量比(0.5x10
5-50x105)：1，较佳地(1x10
5-10x105)：1。
29.本发明第八方面，提供一种产生如本发明第一方面所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
30.(1)以具有seq id no:1所示的人胰岛素单链前体作为抗原，免疫哺乳动物；
31.(2)将免疫后的哺乳动物的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，培养；筛选得到分泌对seq id no:1所示的蛋白有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
32.在另一优选例中，所述融合比率是脾细胞：骨髓瘤细胞sp2/0为4.5—5.5:1。
33.本发明第九方面，提供一种检测含人胰岛素单链前体样品的酶联免疫检测(elisa)方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
34.(1)将包被抗体包被在elisa板上，加入人胰岛素单链前体样品，形成包被抗体-人胰岛素单链前体复合物，其中，所述的人胰岛素单链前体具有seq id no:1所示的氨基酸序列，所述的包被抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产
生的单克隆抗体；
35.(2)向包被抗体-人胰岛素单链前体复合物中加入检测抗体，形成包被抗体-人胰岛素单链前体-检测抗体复合物，通过检测包被抗体-人胰岛素单链前体-检测抗体复合物对人胰岛素单链前体进行检测，其中，所述的检测抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，且所述的检测抗体与所述的包被抗体为不同的抗体。
36.在另一优选例中，所述的方法包括定量或定性方法。
37.在另一优选例中，所述的方法为体外方法。
38.在另一优选例中，所述的方法为非诊断和/或非治疗性方法。
39.在另一优选例中，所述的样品包含人胰岛素单链前体。
40.在另一优选例中，所述的样品含有人胰岛素单链前体和人胰岛素，所述的人胰岛素单链前体具有seq id no:1所示氨基酸序列。
41.在另一优选例中，所述的人胰岛素与人胰岛素单链前体的重量比(0.5x10
5-50x105)：1，较佳地(1x10
5-10x105)：1。
42.在另一优选例中，所述的检测抗体偶联有可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶等。
43.在另一优选例中，所述的酶包括辣根过氧化物酶。
44.在另一优选例中，所述的检测包被抗体-人胰岛素单链前体-检测抗体复合物包括步骤：
45.向包被抗体-人胰岛素单链前体-检测抗体复合物中加入酶底物，通过酶标仪读取od值；
46.其中，所述的检测抗体偶联酶。
47.在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
48.将包被抗体包被在elisa板上，洗板，封闭，加入人胰岛素单链前体样品，孵育后，加入检测抗体，形成包被抗体-人胰岛素单链前体-检测抗体复合物，通过检测包被抗体-人胰岛素单链前体-检测抗体复合物对人胰岛素单链前体进行检测。
49.在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
50.将包被抗体包被在elisa板上，洗板，封闭，加入人胰岛素单链前体样品，孵育后，加入偶联有辣根过氧化物酶的检测抗体，形成包被抗体-人胰岛素单链前体-检测抗体复合物，洗板，加入酶底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺酶)，孵育，加入终止液，读取酶标仪od值。
51.本发明第十方面，提供一种检测人胰岛素单链前体样品的酶联免疫检测(elisa)试剂盒，所述的试剂盒包括：
52.包被抗体，所述的包被抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体；和
53.检测抗体，所述的检测抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，且所述的检测抗体与所述的包被抗体为不同的抗体。
54.在另一优选例中，所述的酶联免疫检测试剂盒还含有反应板(检测板)，所述反应板上设有微孔，所述微孔包被或固定有包被抗体，
55.在另一优选例中，所述的反应板为酶标板。
56.在另一优选例中，所述的酶联免疫检测试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测人胰岛素单链前体。
57.在另一优选例中，所述的样品包含人胰岛素单链前体。
58.在另一优选例中，所述的样品含有人胰岛素单链前体和人胰岛素，所述的人胰岛素单链前体具有seq id no:1所示氨基酸序列。
59.在另一优选例中，所述的人胰岛素与人胰岛素单链前体的重量比(0.5x10
5-50x105)：1，较佳地(1x10
5-10x105)：1。
60.本发明第十一方面，提供一种抗体组合，其特征在于，所述的组合包括：
61.包被抗体，所述的包被抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体；和
62.检测抗体，所述的检测抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，且所述的检测抗体与所述的包被抗体为不同的抗体。
63.在另一优选例中，所述的包被抗体和检测抗体是各自独立的，
64.本发明第十二方面，提供一种如本发明第十一方面的抗体组合的用途，用于制备检测人胰岛素单链前体的检测试剂或酶联免疫检测(elisa)试剂盒。
65.在另一优选例中，所述的酶联免疫检测(elisa)包括双抗夹心法elisa。
66.本发明第十三方面，提供一种免疫复合物，所述的免疫复合物包括：
67.a-b-c
68.其中，a包括一抗，所述的一抗包括17h3抗体；所述的17h3抗体为保藏号为cctcc no:c2020138杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体；
69.b包括人胰岛素单链前体，所述的人胰岛素单链前体具有seq id no:1所示的氨基酸序列；
70.c包括二抗，所述的二抗包括4b1抗体，所述的4b1抗体为保藏号为cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
71.在另一优选例中，所述的一抗偶联有可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
72.在另一优选例中，所述的二抗偶联有可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
73.在另一优选例中，所述的酶包括辣根过氧化物酶。
74.在另一优选例中，所述的人胰岛素单链前体具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。
75.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
76.本发明人通过长期而深入的研究，经过大量的筛选，意外地发现了一种抗人胰岛素单链前体单克隆抗体，所述抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。本发明所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体作为包被抗
体和检测抗体用于elisa法检测样品中的人胰岛素单链前体，具有灵敏度高、重复性好、线性良好和准确度高等优势，从而能够有效检测样品中的人胰岛素单链前体。在此基础上，发明人完成了本发明。
77.术语
78.除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
79.如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由
……
构成”、“基本上由
……
构成”。
80.如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
81.如本文所用，术语“人胰岛素单链前体”与“单链前体”可互换使用。代表性地，人胰岛素单链前体包括如seq id no:1所示的氨基酸序列：
82.mvskgeelftgvkltlkficttyvqertisfkdtyktraevkfegdenlyfqgrfvnqhlcgshlvealylvcgergffytpk(boc)trgiveqcctsicslyqlenycn(seq id no:1)。
83.如本文所用，人胰岛素的氨基酸序列为seq id no:2。
84.fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt-giveqcctsicslyqlenycn(seq id no:2)。
85.如本文所用，前导肽的氨基酸序列为如seq id no:3所示：
86.mvskgeelftgvkltlkficttyvqertisfkdtyktraevkfegdenlyfqgr(seq id no:3)
87.在本发明中，除非另有定义，否则氨基酸序列从n端到c端进行编号。
88.抗人胰岛素单链前体单克隆抗体
89.本发明提供一种抗人胰岛素单链前体单克隆抗体，所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体特异性识别和结合seq id no:1所示的蛋白。
90.本发明中所述“特异性”是指单克隆抗体对相应抗原(如蛋白)或近似抗原物质的识别能力。特异性高，对抗原(如蛋白)的识别能力就强。在本发明中，抗人胰岛素单链前体单克隆抗体能够特异性识别和结合seq id no:1所示的蛋白。seq id no:1所示的蛋白可以直接合成，也可以通过基因工程方法制备。
91.制备本发明的单克隆抗体所用的人胰岛素单链前体可以通过基因工程的方法获得，利用在原核生物中表达含有编码本发明的人胰岛素单链前体的多核苷酸。本领域的技术人员通常熟知适用于表达本发明的人胰岛素单链前体的载体。可根据所选用的适当启动子和待表达的目的基因序列来选择适当的载体。可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的人胰岛素单链前体。适当宿主的例子包括：原核细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等。转导、转化或转染的方法是本领域已知的，包括，但不限于，病毒感染、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。为了活化启动子、选择转化体或扩增所需的基因，可以在适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、ph值等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。为了大量获得重组蛋白，可以采用诱导型启动子，并利用诱导物诱导基因的表达。实质上，“诱导物”可以是任何能诱导宿主中基因表达的物质，可以是
化学物质或环境刺激。
92.较佳地，所述抗人胰岛素单链前体单克隆抗体是采用seq id no:1所示的蛋白与已知标签形成的重组蛋白作为抗原免疫动物得到的。较佳地，所述重组蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对seq id no:1所示的蛋白有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从所述杂交瘤细胞的培养上清液中或从注射所述杂交瘤细胞后的动物腹水中获取所述抗人胰岛素单链前体单克隆抗体。
93.更佳地，所述已知标签是，但不限于，组氨酸标签(his标签)、谷胱苷肽s-转移酶(gst标签)、trx标签、s-tag标签、ha标签、hsv标签、myc标签或vsv-g标签。在本发明的一具体实施例中，所述已知标签是gst标签，与seq id no:1所示的蛋白形成重组蛋白。
94.更佳地，所述单克隆抗体是采用所述重组蛋白作为抗原免疫小鼠得到的。
95.较佳地，所述单克隆抗体由保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生。
96.如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
97.如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等,nih publ.no.91-3242,卷i，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
98.脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：iga,igd,ige,igg和igm，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如igg1,igg2,igg3,igg4,iga和iga2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
99.如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，本文中的兔单克隆抗体是通过噬菌体文库筛选后通过分子生物的方法构建全长兔单克隆抗体基因表达载体，将该载体转入真核表达系统，培养后收取细胞上清而获得，不会被其它免疫球
蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
100.本发明还包括具有所述的抗seq id no.1所示蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗seq id no.1所示蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，cdr)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
101.如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗seq id no.4所示蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗seq id no.1所示蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
102.本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如fab或(fab')2片段、抗体重链、抗体轻链。
103.本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
104.一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(cdr)，将该段间隔成4个框架区域(fr)，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了fr或cdr区域。
105.本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带cdr的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其cdr与此处鉴定的cdr具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。本发明提供了保藏编号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156的杂交瘤细胞株及其所产生的单克隆抗体，本领域技术人员可以采用本领域中常规技术对获得该单克隆抗体的cdr区及其完全的氨基酸序列和编码基因序列进行鉴定。因此，本发明的抗体，包含了具有与保藏编号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体相同的cdr区的单克隆抗体。
106.本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的重组蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
107.如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前
导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6his标签形成的重组蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
108.本发明抗体指具有seq id no.1所示蛋白结合活性的、包括上述cdr区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述cdr区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
109.该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
110.本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的重组蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
111.在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表a进行氨基酸替换而产生。
112.表a
[0113][0114][0115]
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其重组蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
[0116]
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
[0117]
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0118]
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少
70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2
×
ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。
[0119]
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6his)融合在一起，形成重组蛋白。
[0120]
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
[0121]
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0122]
本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0123]
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞的动物细胞等。
[0124]
用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
[0125]
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0126]
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0127]
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、pk(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
[0128]
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
[0129]
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(koppe等，2005，癌转移评论(cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(chaudhary等，1989，自然(nature)339，394；epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(cancer immunology and immunotherapy)51，565)；3.细胞因子如il-2等(gillies等，1992，美国国家科学院院刊(pnas)89，1428；card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(cancer immunology and immunotherapy)53，345；halin等，2003，癌症研究(cancer research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(lapotko等，2005，癌症通信(cancer letters)239，36；huang等，2006，美国化学学会杂志(journal of the american chemical society)128，2115)；5.病毒颗粒(peng等，2004，基因治疗(gene therapy)11，1234)；6.脂质体(mamot等，2005，癌症研究(cancer research)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
[0130]
包被抗体
[0131]
如本文所用，“包被抗体”又称为“捕获抗体”或“固相抗体”，指是包被在固相载体的抗体。包被抗体可以非特异性的吸附或物理性吸附在聚苯乙烯(酶标板)、硝酸纤维素膜等材料上，成为固相抗体，并且仍保持其免疫学活性。包被抗体与抗原具有高亲和力和高特异性，但不影响所述抗原与检测抗体的结合。加入待检样本，若样本中含有目的抗原，则会被包被抗体捕获。本发明所述的抗原(目的抗原)优选为人胰岛素单链前体。在本发明的优选例中，包被抗体能与人胰岛素单链前体高亲和力和高特异性地结合。在另一优选例中，所述包被抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。较佳地，所述包被抗体为保藏号为cctcc no:c2020138杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0132]
检测抗体
[0133]
如本文所用，“检测抗体”又称为“标记抗体”，指用于检测样本中是否含有目的抗原的抗体。检测抗体通常带有可检测标记，包括生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。检测抗体与抗原具有高亲和力和高特异性，但不影响所述抗原与包被抗体的结合。利用检测抗体与目的抗原特异性结合的特性，通过标记物的检测，从而确定抗原的存在和数量。本发明所述的抗原(目的抗原)优选为人胰岛素单链前体。在本发明的优选例中，检测抗体能与人胰岛素单链前体高亲和力和高特异性地结合。在另一优选例中，所述检测抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。较佳地，所述检测抗体为保藏号为cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0134]
组合物
[0135]
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有本发明所述的抗体或其活性片段或其重组蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
[0136]
本发明的药物组合物可直接用于结合人胰岛素单链前体，因而可用于检测样品中的人胰岛素单链前体。此外，还可同时使用其他治疗剂。
[0137]
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明所述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0138]
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0139]
杂交瘤细胞株
[0140]
本发明提供两种杂交瘤细胞株，其特点是，所述杂交瘤细胞株用于产生本发明所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156，其中，保藏号为cctcc no:c2020138的杂交瘤细胞株产生的抗体为17h3抗体(简称17h3)，保藏号为cctcc no:c2020156的杂交瘤细胞株产生的抗体为4b1抗体(简称4b1)。
[0141]
标记的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体
[0142]
在本发明的一个优选例中，所述抗人胰岛素单链前体单克隆抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的可检测标记物包括(但不限于)：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
[0143]
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单克隆抗体。
[0144]
本发明的单克隆抗体具有很好的特异性，很高的效价。
[0145]
酶联免疫检测(elisa)方法
[0146]
本发明所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体能够作为酶联免疫检测(elisa)方法中的包被抗体或检测抗体，用于人胰岛素单链前体的定性或定量检测。
[0147]
代表性地，本发明一种检测含人胰岛素单链前体样品的酶联免疫检测(elisa)方法，所述的方法包括步骤：
[0148]
(1)将包被抗体包被在elisa板上，加入人胰岛素单链前体样品，形成包被抗体-人胰岛素单链前体复合物，其中，所述的人胰岛素单链前体具有seq id no:1所示的氨基酸序列，所述的包被抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体；
[0149]
(2)向包被抗体-人胰岛素单链前体复合物中加入检测抗体，形成包被抗体-人胰岛素单链前体-检测抗体复合物，通过检测包被抗体-人胰岛素单链前体-检测抗体复合物对人胰岛素单链前体进行检测，其中，所述的检测抗体为保藏号为cctcc no:c2020138或cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，且所述的检测抗体与所述的包被抗体为不同的抗体。
[0150]
在另一优选例中，所述的方法包括定量或定性方法。
no:c2020138杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体；
[0176]
b包括人胰岛素单链前体，所述的人胰岛素单链前体具有seq id no:1所示的氨基酸序列；
[0177]
c包括二抗，所述的二抗包括4b1抗体，所述的4b1抗体为保藏号为cctcc no:c2020156杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0178]
在另一优选例中，所述的一抗偶联有可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
[0179]
在另一优选例中，所述的二抗偶联有可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
[0180]
在另一优选例中，所述的酶包括辣根过氧化物酶。
[0181]
在另一优选例中，所述的人胰岛素单链前体具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。
[0182]
本发明的主要优点包括：
[0183]
本发明的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体能够与人胰岛素单链前体特异性结合，本发明所述的抗人胰岛素单链前体单克隆抗体作为包被抗体和检测抗体用于elisa法检测样品中的人胰岛素单链前体，具有灵敏度高、重复性好、线性良好和准确度高等优势，从而能够有效检测样品中的人胰岛素单链前体。
[0184]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0185]
实施例1
[0186]“人胰岛素单链前体”与“单链前体”可互换使用，人胰岛素单链前体为如seq id no:1所示的氨基酸序列：
[0187]
mvskgeelftgvkltlkficttyvqertisfkdtyktraevkfegdenlyfqgrfvnqhlcgshlvealylvcgergffytpk(boc)trgiveqcctsicslyqlenycn(seq id no:1)。
[0188]
将人胰岛素单链前体的dna片段，克隆至表达载体质粒pbad/his a(购自ntcc公司，卡那霉素抗性)的arabad启动子下游ncoi-xhoi位点，得到质粒pbad-fp-tev-r-miniins。再将pylrs的dna序列，克隆至表达载体质粒pevol-pbpf(购自ntcc公司，氯霉素抗性)的arabad启动子下游spei-sali位点，同时在prok启动子下游，以pcr方法插入赖氨酰-trna合成酶的trna(pyltcua)的dna序列。该质粒命名为pevol-pylrs-pylt。
[0189]
将质粒pbad-fp-tev-r-miniins和质粒pevol-pylrs-pylt转化大肠杆菌菌株，筛选获得表达boc-人胰岛素单链前体的重组大肠杆菌菌株。后经发酵培养，得到人胰岛素单链前体。
[0190]
人胰岛素的氨基酸序列为如seq id no:2所示：
[0191]
fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt-giveqcctsicslyqlenycn(seq id no:2)。
[0192]
前导肽的氨基酸序列为如seq id no:3所示：
[0193]
mvskgeelftgvkltlkficttyvqertisfkdtyktraevkfegdenlyfqgr(seq id no:3)。
[0194]
1.实验原理
[0195]
本实施例采用双抗体夹心elisa法：用抗人胰岛素单链前体的单克隆抗体(包被抗
体，一抗)包被酶联反应板，加入含人胰岛素单链前体待检样品反应后，洗涤除去未结合物，加入hrp(辣根过氧化物酶)标记的抗人胰岛素单链前体的另一株单克隆抗体(检测抗体，二抗)，孵育后形成了包被一抗-人胰岛素单链前体-hrp二标记抗体复合物，通过tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色程度指示样品中单链前体含量。
[0196]
2.抗人胰岛素单链前体的制备和不同的抗体配对筛选评价
[0197]
分别将人胰岛素单链前体、前导肽与佐剂混合，制备两种免疫原；分别免疫小鼠3只，尾血使用间接elisa(酶联免疫吸附测定)方法进行抗体效价的评价。
[0198]
分别使用人胰岛素单链前体、前导肽包被酶标板(1μg/ml)，每孔加入100μl，4℃过夜反应；使用pbs溶液洗板3次，使用5％milk-pbs(磷酸缓冲盐溶液)在室温封闭1h；然后使用pbs溶液洗板1次后，加入梯度稀释的小鼠尾血，室温反应1h；然后使用pbs溶液洗板3次，拍干后，加入1:2000稀释的hrp标记的山羊抗小鼠fc二抗，室温反应1h，pbs溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的底物a液和b液，避光、室温条件下反应20min；然后加入50μl终止液；小鼠尾血间接elisa评价结果见表1、表2。
[0199]
表1单链前体免疫组小鼠尾血抗体效价评价
[0200][0201]
注：nc为阴性对照，pc为阳性对照13#小鼠尾血。
[0202]
表2前导肽免疫组小鼠尾血抗体效价评价
[0203][0204][0205]
注：nc为阴性对照，pc为阳性对照27#小鼠尾血。
[0206]
单链前体免疫组30#小鼠和前导肽免疫组27#小鼠尾血滴度最高，挑选血滴度最高的免疫小鼠，处死后分别取脾细胞与sp2/0细胞融合，在选择培养基中培养为单克隆细胞株后挑克隆，各挑取6个96孔板的克隆。分别使用人胰岛素单链前体和前导肽包被酶标板(1μg/ml)，每孔加入100μl，4℃过夜反应；使用pbs溶液洗板3次，使用5％milk-pbs在室温封闭1h；然后使用pbs溶液洗板1次；另外，将单克隆细胞上清与5％milk-pbs 1:1混合，室温反应1h后加入孔中，接着室温反应1h；然后使用pbs溶液洗板3次，拍干后，加入1:2000稀释的hrp标记的山羊抗小鼠fc二抗，室温反应1h，pbs溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的a液和b液，避光、室温条件下反应20min；然后加入50μl终止液。
[0207]
单链前体免疫组从6个96孔板共564个克隆中初筛共保留9个od≥1.0的阳性克隆；前导肽免疫组从6个96孔板共564个克隆中初筛共保留16个od≥0.5的阳性克隆；阳性克隆检测结果见表3、表4。
[0208]
表3单链前体初筛阳性克隆检测结果
[0209]
clone#4b13e45g15g66b84a24e64e116c4pcncod(450nm)》4.000》4.000》4.0003.1322.5152.4812.0031.1381.0183.1190.021
[0210]
注：nc为阴性对照，pc为阳性对照30#小鼠心脏血。
[0211]
表4前导肽初筛阳性克隆检测结果
[0212]
clone#12f311h39a812h712g1012g612h512g712h49a38h812g5od(450nm)3.6882.1271.8681.8431.3501.3280.9920.9700.8170.6540.5630.526clone#12e49a28f912h10pcnc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
od(450nm)0.5220.5130.5110.508》4.0000.007
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
[0213]
注：nc为阴性对照，pc为阳性对照27#小鼠心脏血。
[0214]
对初筛阳性克隆进行复筛，检测结果见表5、表6，融合蛋白免疫组初筛9个阳性克隆中复筛保留3个识别单链前体的阳性克隆；前导肽免疫组初筛16个阳性克隆中复筛保留2个识别前导肽的阳性克隆。
[0215]
表5单链前体初筛阳性克隆复筛检测结果
[0216][0217][0218]
注：nc为阴性对照，pc为阳性对照30#小鼠心脏血。
[0219]
表6前导肽初筛阳性克隆复筛检测结果
[0220][0221]
注：nc为阴性对照，pc为阳性对照27#小鼠心脏血。
[0222]
对复筛阳性克隆进行特异性筛选，检测结果见表7、表8，单链前体免疫组3个识别单链前体的阳性克隆中，3e4和4b1仅识别单链前体，不识别前导肽和胰岛素，5g1识别单链前体和胰岛素，不识别前导肽；前导肽免疫组2个识别前导肽的阳性克隆都识别单链前体和前导肽，不识别胰岛素。
[0223]
表7单链前体复筛阳性克隆特异性筛选
[0224][0225]
注：nc为阴性对照，pc为阳性对照30#小鼠心脏血。
[0226]
表8前导肽复筛阳性克隆特异性筛选
[0227][0228]
注：nc为阴性对照，pc为阳性对照27#小鼠心脏血。
[0229]
挑选出合适的阳性克隆及其单克隆抗体。其中，保藏号为cctcc no:c2020138的杂交瘤细胞株kps001-7 17h3产生的抗体为17h3抗体(简称17h3)，保藏号为cctcc no:c2020156的杂交瘤细胞株kps001-6 4b1产生的抗体为4b1抗体(简称4b1)。
[0230]
将制备不同的单克隆抗体进行两两配对，采用上述双抗体夹心elisa法检测识别人胰岛素单链前体的灵敏度，使用样品稀释液将人胰岛素单链前体稀释为1792、896、448、224、112、56、28、14、7、3.5ng/ml作为标准品。如表9所示，包被抗体为17h3、检测抗体为4b1-hrp，和包被抗体为18f3、检测抗体为5g1-hrp这两个抗体对标准曲线梯度明显，显色时间和信号值合适，适合进行试剂盒开发。
[0231]
表9不同的抗体配对筛选
[0232]
[0233]
3.特异性
[0234]
调整标曲浓度后(人胰岛素单链前体浓度调整为：224、112、56、28、14、7、3.5ng/ml)对17h3-4b1-hrp和18f3-5g1-hrp两个配对进行灵敏度检测，如下表2所示，两个配对的灵敏度均能达到3.5ng/ml。使用样品稀释液将人胰岛素稀释为5mg/ml、5μg/ml和5ng/ml，检测配对抗体与人胰岛素的交叉情况。18f3-5g1-hrp与人胰岛素有交叉，17h3-4b1-hrp特异性好，仅识别人胰岛素单链前体，不识别人胰岛素，详见表10，因此确定使用17h3-4b1-hrp配对。
[0235]
表10配对抗体灵敏度及特异性检测
[0236][0237][0238]
注：17h3和18f3为包被抗体，4b1和5g1为检测抗体。
[0239]
4.包被抗体为17h3和检测抗体为4b1-hrp的elisa试剂盒的性能测定
[0240]
4.1elisa试剂盒的使用步骤
[0241]
平衡：将所需试剂移到室温(18-25℃)平衡30min。
[0242]
配液：
[0243]1×
稀释液：取1瓶20
×
稀释液，用去离子水稀释至1000ml,混匀备用。
[0244]1×
洗涤液：取1瓶20
×
pbst(磷酸盐吐温缓冲液)洗液，用去离子水稀释至1000ml,混匀备用。
[0245]
样品稀释液(0.5％casein)：将casein(干酪素)(0.5g/袋)完全溶解到100ml已配置好的1
×
稀释液溶液中，充分混匀备用。
[0246]
酶结合物稀释液(3％bsa)：将bsa(牛血清蛋白)(3g/袋)完全溶解到1
×
稀释液溶液中，充分混匀备用。
[0247]
酶结合物工作液：取所需酶结合物用酶结合物稀释液(3％bsa)配制的稀释液100倍稀释，充分混匀备用。
[0248]
加样：将包被板从密封袋中取出，将配置好的标准品及样品，每孔加入100ul,同时设阴性对照，用封板膜封板后置37℃恒温震荡培养箱，200rpm，温育60min。
[0249]
洗涤：弃去各孔内液体，用1
×
洗液注满微孔(350μl/孔)，静置30秒后弃去孔内液体；重复6次，最后一次洗板完成后在面积纸上拍干。
[0250]
加酶结合物工作液：每孔加酶结合物工作液100μl,用封板膜封板后置37℃恒温震荡培养箱，200rpm，温育60分钟。
[0251]
洗涤：弃去各孔内液体，用1
×
洗液注满微孔(350μl/孔)，静置30秒后弃去孔内液体；重复6次，最后一次洗板完成后在面积纸上拍干。
[0252]
显色：每孔分别加单组分显色液100μl,轻微振荡混匀后用封板膜封板置25℃显色10min。
[0253]
测定：每孔加终止液50μl，轻微混匀。选择酶标仪主波长450nm，测定各孔吸光值(od值)，采用双对数的拟合方式进行线性拟合计算。
[0254]
4.2准确性和精密度验证
[0255]
使用单抗17h3生产包被板，检测抗体为4b1-hrp，根据定量范围确定质控品浓度并进行准确性和精密度验证。标准曲线见表11，质控品准确性和精密度分析结果见表12。
[0256]
表11标准曲线
[0257][0258]
表12质控品准确性和精密度
[0259]
[0260][0261]
从表11、12中可以看出，试剂盒(包被抗体为17h3、检测抗体为4b1-hrp)线性范围为5～160ng/ml，各浓度质控品(不同浓度的单链前体稀释在5mg/ml的人胰岛素(人胰岛素使用样本稀释液稀释)中)的准确性re％介于-19.97％～2.08％，精密度cv％介于0.34％～11.56％，满足接受标准：准确性(re％)
±
20％，精密度(cv％)≤20％。
[0262]
3.5供试品(人胰岛素)检测
[0263]
在elisa方法中，17h3为包被抗体，包被在酶标板上，4b1为检测抗体。
[0264]
日期编号分别为1、2、3，分析人员编号分别为y和q，试剂盒编号为a和b(同批试剂盒的不同编号)。实验安排见表13。
[0265]
单链前体标准溶液：分别取0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、120ng/ml。
[0266]
每个分析人员每日检测1次，向供试品溶液加入一定量的标准品溶液使得加标供试品溶液中的标准品浓度分别为10ng/ml(低，20％规格)、50ng/ml(中，100％规格)、100ng/ml(高，200％规格)(每个规格浓度的供试品配置3份)。
[0267]
供试品溶液：精密称取供试品50mg至10ml容量瓶中，加1
×
稀释液使其溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(配制两份)。
[0268]
加标供试品储备液：精密称取供试品60mg至10ml容量瓶中，加1
×
稀释液使其溶解并稀释至刻度。
[0269]
加标低浓度规格供试品溶液配制：分别精密移取417μl供试品储备液与离心管中，加入10μl500ng/ml标准品溶液和73μl 1
×
稀释液，混匀(配制3份)。
[0270]
加标中浓度规格供试品溶液配制：分别精密移取417μl供试品储备液与离心管中，加入50μl500ng/ml标准品溶液和33μl 1
×
稀释液，混匀(配制3份)。
[0271]
加标高浓度规格供试品溶液配制：分别精密移取834μl供试品储备液与离心管中，加入100μl 1000ng/ml标准品溶液和66μl 1
×
稀释液，混匀(配制3份)。
[0272]
计算每天每个规格浓度点回收率的rsd和三个规格浓度点回收率的rsd以及三天回收率的rsd，均应≤25.0％。
[0273]
按照下式计算回收率：
[0274][0275]
式中：
[0276]
c1
----
为回归方程计算得到的加入标准品的实测浓度(ng/ml)；
[0277]
c2
----
为加入标准品的理论浓度(ng/ml)。
[0278]
cp
----
为回归方程计算得到的供试品溶液的单链前体浓度(ng/ml)；
[0279]
每日检测结果见表14、表15、表16、表17、表18、表19、表20、表21、表22、表23、表24、表25，中间精密度结果见表26。
[0280]
表13中间精密度实验安排
[0281][0282]
表14第1天标准品测试结果
[0283][0284]
表15第1天供试品测试结果
[0285][0286][0287]
表16第1天加标供试品测试结果
[0288][0289]
表17第1天加标回收率测试结果
[0290][0291][0292]
表18第2天标准品测试结果
[0293][0294]
表19第2天供试品测试结果
[0295][0296]
表20第2天加标供试品测试结果
[0297]
[0298][0299]
表21第2天加标回收率测试结果
[0300][0301]
表22第3天标准品测试结果
[0302]
[0303][0304]
表23第3天供试品测试结果
[0305][0306]
表24第3天加标供试品测试结果
[0307]
[0308][0309]
表25第3天加标回收率测试结果
[0310][0311]
表26中间精密度结果
[0312][0313]
第1天不同规格浓度点回收率rsd分别为7.1％、4.5％、8.5％，三种规格rsd为12.2％，均小于25.0％；第2天不同规格浓度点回收率rsd分别为5.1％、3.7％、2.4％，三种规格rsd为22.7％，均小于25.0％；第3天不同规格浓度点回收率rsd分别为9.7％、8.7％、4.5％，三种规格rsd为21.1％，均小于25.0％；连续3天不同规格浓度点回收率rsd分别为6.6％、5.7％、6.3％，三种规格总rsd为1.5％，均小于25.0％；因此，中间精密度符合规定。
[0314]
菌种保藏
[0315]
本发明的产生抗人胰岛素单链前体单克隆抗体的杂交瘤细胞株kps001-7 17h3，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc，中国，武汉)，保藏日期：2020年09月16日，保藏编号：cctcc no:c2020138。
[0316]
本发明的产生抗人胰岛素单链前体单克隆抗体的杂交瘤细胞株kps001-6 4b1，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc，中国，武汉)，保藏日期：2020年09月16日，保藏编号：cctcc no:c2020156。
[0317]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。